JPH03500601A - ウィルス中和及び保護モノクローナル抗体により認識されるｉｂｄｖ ｖｐ２エピトープ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス　び　百モノクローナル によ　：η；されるＩＢＤＶ　ＶＰ２エピトープ新しく認識されたビル　ビリ　 °工（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のメンバーである感染性嚢疾患ウィルス（ ＩＢＤＶ）は、鳥類の２種の主要な免疫器官の１つであるファブリーキウス嚢に おける抗体−産生Ｂｆａ胞の前駆体を破壊することによってひよこに重い免疫欠 損を引き起こす。

ビルナウィルスは、ＶＰＩ（９０〜１００ＫＤ）、ＶＦ６　（４〜５４ＫＤ）　 、ＶＦ６　（３２〜３５ＫＤ）及びＶＦ６（２４〜２９ＫＤ）と呼ばれル４１ｆ ！（７）　ホ’Ｊ　ヘア”チ）−ヲ含ｂ　ＣＤｏｂｏｓナト、、　１９７９）　 。ＩＢＤＶのＶＰＩ、ＶＦ６及びＶＦ６は、それぞれ約９０ＫＤ　、　３２ＫＤ 及び２８ＫＤの分子量を有する（Ｄｏｂｏｓなど、、１９７９　；　Ｆｌａｈｅ ｙなど、、１９８５ａ）。

ＩＢＤＶのオーストラリアン株のＶ　Ｐ　２　（Ｆｉｒｔｈ、　１９７４）は、 配列決定研究から約５２ＫＤの計算された分子量を有するが（Ｈｕｄｓｏｎなど 、、　１９８６）、しかしＬａｅｍｍｌ　ｉゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０ ）上では約４１ＫＤ及び３７ＫＤの２種のバンドとして移動する（Ｆａｈｅｙな ど、。

１９８５ａ）。減じられた見掛の分子量は、タンパク質の高い疎水性特性による であろう（第２図を参照のこと）。ペプチドマツピング研究（Ｎｅｉｌ　Ｍｃｋ ｅｒｎ、公開されていないデータ）は、ウィルスの４１ＫＯ及び３７ＫＤのポリ ペプチドが前駆体−生成物の関係を有し、そして従ってＶＰ２ａ及びＶＰ２ｂと 呼ばれることを示す。

感染性嚢疾患ウィルスの大きなゲノムセグメントは、そのウィルスポリペプチド が次の順序： Ｎ−ＶＦ６−ＶＦ６−シＰ３−Ｃで存在するポリタンパク質をコードする。その 大セグメントの一旦一エＱ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）における発現は、ポリタンパク質 のプロセッシングをもたらす０発現生成物は、ウィルスの表面上で構造的エピト ープを認識するウィルス中和及び保護モノクローナル抗体と反応する。大ゲノム セグメントの異なった領域の欠失、続く旦−二ユにおける発現は、このモノクロ ーナル抗体により認識される構造的エピトープがＶＰＺ内に存在することを示す 。（国際特許出願番号ＰＣＴ／Ａｔ１８６１００１５６）。

ウィルスから単離された活性ＶＰ２は、ウィルスを中和し、そしてＩＢＤＶ感染 から鶏を受動的に保護する、Ｉ　ＢＤＶに対して生ぜしめられた鶏抗体により沈 殿せしめられる。鶏中に注入される場合、その活性ＶＰ２は、ウサギ及び鶏の両 者にウィルス中和抗体を産生ずる。後者は、ＩＢＤＶ感染から鶏を受動的に保護 する（Ｆａｈｅｙなと、、提出された原稿）。Ｅ、コリ中に産生される組換えＶ Ｆ６はまた、鶏中にウィルス中和及び保護抗体を産生ずる。これらの結果は明ら かに、ＩＢＤＶの主要な宿主−保護免疫原としてＶＦ６を確立する。

本発明は、ウィルスに対して生ぜしめられた多くのウィルス−中和モノクローナ ル抗体（ＶＮ　ＭＡｂ）により認識されるＶＰＺ内の構造的エピトープの同定に 由来する。

本発明によれば、ＩＢＤＶのＶＰ２ポリペプチドの構造的エピトープをコードす るヌクレオチド配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子が提供される。この分子の発 現は、ＩＢＤウィルスに対して生ぜしめられたウィルス中和モノクローナル抗体 により認識されるペプチドの発現を誘導する。

特に、本発明は、ＶＰ２ポリペプチドをコードするＩＢＤＶゲノムセグメントの Ａｃｃ　Ｉ　−Ｓｐｅ　Ｉフラグメント（場合によってはＳｃａ　Ｉ　−Ｘｈｏ 　Ｉフラグメントと一緒に）に対応するヌクレオチド配列を含んで成る組換えＤ ＮＡ分子を提供する。

本発明のヌクレオチド配列は、天然、合成又は半合成源から、又は天然材料の操 作により得られ；さらにこのヌクレオチド配列は天然に存在する配列であり、又 はそれは、そのような天然に存在する配列に対する突然変異、たとえば単−又は 複数の塩基の置換、欠失、挿入及び逆位により関係づけられ得、但し、この場合 、そのような配列を含むＤＮＡ分子は、ＩＢＤＶのＶＰ２ポリペプチドの構造的 エピトープとして発現され得る。

ヌクレオチド配列は、それに隣接して位置する発現制御配列を有することができ 、そのような制御配列は、ＩＢＤＶの核酸又は異種源のいづれかに由来する。

本発明はまた、プロモーター配列及びイニシェークー配列を含む発現制御配列、 及びＩＢＤＶのＶＰ２ポリペプチドの構造的エピトープをコードするヌクレオチ ド配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子を提供する。

さらにもう１つの観点においては、本発明は、プロモーター配列及びイニシエー ター配列を有する発現制御配列、及びＩＢＤＶのＶＰ２ポリペプチドの構造的エ ピトープをコードするヌクレオチド配列を含んで成る。Ｉ　ＢＤＶのＶＰ２ポリ ペプチドの構造的エピトープを発現することができる組換えＤ　Ｎ　Ａクローニ ングビークルを提供する。

もう１つの観点においては、上記のような組換えＤＮＡクローニングビークル及 び／又は組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞を提供する。

さらにもう１つの観点においては、上記の組換えＤＮＡクローニングビークルに より形質転換され又は感染された宿主細胞により産生され得る、ＩＢＤＶ抗原性 を示すポリペプチドが提供される。そのような発現されたポリペプチドは、ＶＦ ６をコードするＩＢＤＶゲノムセグメントのＡｃｃ　Ｉ　−Ｓｐｅ　Ｉフラグメ ント（及び場合によっては、Ｓｃａ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉフラグメント）によりコ ードされるポリペプチドを含有することができる。

本発明はまた、ＩＢＤＶのＶＰ２ポリペプチドの構造的エピトープの抗原性を示 す合成ペプチド又はポリペプチドにも関する。

本明細書に使用される場合、用語“合成′”とは、ペプチド又はポリペプチドが 、化学的及び／又は生物学的手段、たとえば化学合成の手段により又は生物学的 合成を導びく組換えＤＮＡ技法により合成されることを意味する。もちろん、そ のようなポリペプチドは、正しく処理され、そして正しく折りたたまれたタンパ ク質の宿主細胞による直接的発現により、又は当業界において良く知られている 方法による。宿主細胞により生成される融合ポリペプチドの分離及び宿主細胞又 はクローニングビークルのＤＮＡをコードする追加のポリペプチドから所望する ポリペプチドの分離により得られる。他方、いったん所望するポリペプチドのア ミノ酸配列が、たとえば所望するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の 決定により確立されれば、そのポリペプチドは、たとえば良く知られているＭｅ ｒｒｉｆｉｅｌｏｌ固相合成方法により合成的に生成され得る。

ＩＢＤＶのＶＰ２ポリペプチドの構造的エピトープの抗原性を示すポリペプチド は、血清学的診断において、及びワクチン製造の業界において良く知られている 方法による、ＩＢＤＶに対する単−又は多価のワクチンの調製において使用され るであろう。さらにそのようなワクチンの詳細、及びその使用方法並びに定量及 び定性アッセイの方法は、国際特許明細書ＰＣＴ／ＡＵ８４１００２５６に開示 されている。

■よ 次の詳細な説明は、ウィルス中和モノクローナル抗体により認識されるＶＦ６内 の構造的エピトープの同定に関する。

添付図面においては： 星１区は、ＭＡｂ　１７／８２及びＭＡｂ　６により認識される抗原領域の同定 を示す。ＶＦ６の異なった領域が欠失されているクローンからのタンパク質が、 非変性条件下で単離され、ニトロセルロースフィルター上にスポットされ、そし てモノクローナル抗体によりプーブされた。ぬりつぶされたボックスは、ＭＡｂ １７　／８２により認識されるＶＦ６の領域を示す。Ａｃｃ　ｌ−５ｐｅ　Ｉフ ラグメントによりコードされる１４５個のアミノ酸ペプチドは、Ｍａｂ　１７／ ８２及びＭＡｂ　３／１．３２／３．３９Ａ　、　９／６　、３３／１０及び４ ４／１８との反応から必要とされるＶＦ６の最小領域である。空白のボックスは 、ＭＡｂ６により認識される６８個のアミノ酸ペプチドを示す。

第１凹は、クローンＰＯΔＸｈｏ　Ｉ　−Ｐｓｔ　ＩによりコードされるＶＦ６ 上の親水性プロフィールを示す。親水性の計算は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓ　（ １９８１）により記載されるようにヘキサペプチドセグメントの平均をとること によって容易にされた。

林ｌ」己Ｕ法 ＩＢＤＶに・　るモノクロ−ル−　のＥ告ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、完全なウィル スにより免疫化し、そして肺臓細胞を５Ｐ−２又はＮ５−１骨髄腫細胞により融 合せしめた。ハイブリドマ−を、複数ウェルトレーにプレートし、そしてニトロ セルロースシート上への完全なウィルスの免疫ドツトにより、上滑物をスクリー ンした。陽性のウェルを３度、限界希釈法によりクローン化し、そしてウィルス 中和、完全なウィルスのウェスターンプロット及び生来の及び変性されたウィル スタンパク質の免疫沈殿法によりスクリーンした。

「−よりＤｖモノクローナル　の、 モノクローナル抗体を、ｐａｈｅｙなど、、　（１９８５ａ）により記載される 方法に従って、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、そしてニトロセルロース紙に 移されたウィルスタンパク質と反応せしめた。モノクローナル抗体培養物の組織 培養上漬物のＩｇＧ画分を、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、 そして生まれて３日目の鶏の腹腔内に注射し、次に６時間後、ビルレントウイル スの１００　ＣＩＤ５０に眼内攻撃した。鶏を３日後、検死し、そして血清及び ファブリーキウス嚢を、残留モノクローナル抗体活性及びＩＢＤウィルス抗原に ついてＥＬＴＳＡにより評価した（Ｆａｈｅｙ’＋など、　、　１９８５ｂ）。

生来のＶＰ２ａ／２ｂを免疫沈殿せしめるＭＡｂの能力を評価するために、プロ ティンＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、正常なウサギ血清及び正常 なマウス血清によりブロックされる前、ウサギＩｇＧ抗−マウスＩｇ及びマウス モノクローナル抗体により活性化した。次に、その活性化されたセファロースを 、ウィルスタンパク質と反応せしめ、洗浄し、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で 分析した。沈殿せしめられたウィルスタンパク質を、ＶＰ２ａ／２ｂ及びＶＦ６ をウェスターンプロットするモノクローナル抗体の混合物により検出した。モノ クローナル抗体のインビトロでのウィルス中和活性を、組織培養に適合され、そ して鶏の腎臓細胞中で増殖されたＩＢＤＶの株ＧＴ　１０１を用いて評価しくＦ ａｈｅｙなど、　、　１９８５ｂ）、そして付加性ＥＬＩＳＡを用いてＭＡｂの 特異性を評価した（Ｆｒｉｇｎｅｔなど、　、　１９８３　）文土灰ス抹 これらの研究に使用されるＩＢＤＶ株（００２−７３）は、オーストラリア野外 単離物である（Ｆ　ｉｒ　ｔｈ　、　１９７４）。ヨーロッパ株及び北アメリカ 株に関する主な構造的差異は、主な４１ＫＤの構造タンパク質（ＶＰ２ａ）がオ ーストラリア株の３７ＫＤ種（ＶＰ２ｂ）に実質的に分離される事実であるよう 思われる。ＩＢＤＶのＧＴ　１０１株が、組織培養で増殖するために野外株から 適合せしめられた。

発Ｊは七り外二 ｐＥＸ　１−３ベクター（Ｓｔａｎｌｅｙ　ａｎｄ　Ｌｕｚｉｏ＋　１９８４） 及び旦。

２４　ｐｏｐ　２１３６を叶、Ｋｅｉｔｈ　５ｔａｎｌｅｙから得た。ＰＵＲ２ ９０〜２９２ベクター（Ｒｕｔｈｅｒ　ａｎｄＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉ１１＋　１９ ８３）及びｐＣＱＶ　２ベクタ（Ｑｕｅｅｎ、　１９８３）を、それぞれＤｒｓ 、Ｂ８Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ及びＣａｒｙＱｕｅｅｎから得た。ｐＰＬベクタ ーをＰｈａｒｍａｃｉａから得た。

プロセッシング　び　７、を　−するために　されるえクローン ＩＢＤＶゲノムの大ＲＮＡセグメントは、大セグメントによりコードされるウィ ルスタンパク質が次の順序：Ｎ−ＶＦ６−ＶＦ６−ＶＦ６−Ｃで配列されている 長い読み取り枠を含む（ｌ（ｕｄｓｏｎ、など、、１９８６）　。Ｖ　Ｐ　３コ ード領域を含むクローンは、Ｄｎと命名される。それぞれ完全なＶＦ６又はその セグメントをコードする発現クローンＤ６及びＤＩは、前に説明された（Ａｚａ ｄ、など、　、　１９８６）。

ＶＰ３コード領域及びその上流の配列を含むクローンは、Ｐｎ（Ｖ　Ｐ　３への 前駆体）と命名される。ＩＢＤＶゲノムのクローニングのために使用される手段 （Ａｚａｄ、など、、１９８５）は、完全なゲノムを包含するオーバーラッピン グフラグメントから成るｃＤＮＡライブラリィ−を生ぜしめた。従って、大ＲＮ Ａセグメントに相当するｃＤＮＡフラグメントは、前に記載されたように、共通 する制限部位を通してｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリィ−（Ａｚａｄ、など、　、　 １９８５）からの小さなオーバーラッピングフラグメントを連結することによっ て構成され得た（Ｈｕｄｓｏｎ、など、、１９８６）。

びＬ　６　（Ａｚａｄ、など、　、　１９８５）をｐＵＲベクターに連結するこ とによって構成され、従って、それはβ−ガラクトシダーゼに融合されたＶＦ６ 及びＶＦ６　（残基１２５〜１０１１．）と共にＶＦ６の主要部分を発現する（ 第１図を参照のこと）。クローンＰＯが、β−ガラクトシダーゼに融合された完 全なＩＢＤＶの大セグメントコード領域（残基５〜１０１１）を実質的に発現す るために、クローンＧ　６　（Ａｚａｄ、など、　、　１９８５）の挿入体によ りＰ１挿人体を拡張することによってｐＥＸ　３ベクター中に構成された。

クローンＰ２〜Ｐ４の構成のためには、クローンＰＯからの挿入体を、Ｓｍａ　 Ｉ及びＰｓｔＩにより切断した。クローンＰ２〜Ｐ４の構成のためには、ＰＯ挿 入体を、ユニーク制限部位で５′末端から徐々に欠失し、適切な末端フィルイン 反応の後、これらの種々の大きさのフラグメントを、Ｈｐａ　Ｉ　−切断ｐＰＬ ベクター中にプラント末端連結した。クローンＰ７を構成するために、Ｓｃａ　 Ｉ　−Ｓｃａ　Ｉフラグメントを、クローンＰＯから切断し、そして発現ベクタ ーｐＥＸ　１のＳｍａ　Ｉ部位中に再連結した。これらのすべてのクローンにお いては、ＩＢＤＶのポリペプチドのＮ−末端を７ＫＤフラグメントのＮタンパク 質に相で融合せしめた。

欠失が、融合の部位の下流の２種の制限部位の間で行なわれたＰＯに由来するク ローンを、ＰＯΔｘ、ｙ（ここでＸ及びｙは制限部位である）と命名する。たと えば、ＶＰ２コード領域からのフラグメントがｐＥＸベクターに直接クローン化 される場合、そのクローンはｐＥＸｘヨアとして命名される。これらのすべての ベクターは、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生じた。

クローンｐＥＸ　Ｓａｃ　Ｉ　−Ｓｐｅ　Ｉを、ＩＫｂのＳａｃ　Ｉフラグメン トを除き、そしてプラスミドを再連結することによって構成した。これは、β− ガラクトシダーゼのＮ−末端部分と共にＩＢＤシタンパク質を保持するが、しか しその酵素の第三〇−末端の欠失をもたらした。

異なったクローンに存在するＩＢＤＶＯ大ＲＮＡセグメントの正確な領域は、第 １図に示される。宿主−ベクター系並びに増殖及び誘発条件は、第１表に要約さ れる。

生成される融合タンパク質の量は、ＩＢＤＶポリペプチドが１１０ＫＤのβ−ガ ラクトシダーゼにより先行されているクローン中における合計のＥ、コリタンパ ク質の約２０％〜７ＫＤのＮ−末端融合体を有するクローン中における合計タン パク質の約５％の範囲であった。クローンＤ２（第２図）に産生されル予想サイ ズの非融合タンパク質の量は、合計タンパク質の１％以下であった。１００ＫＤ のβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質は、１２．　ＯＯＯｒｐｍで定量的にペ レット化される不溶性封入体を形成した。他方、７ＫＤのＮ−タンパク質融合ポ リペプチドは、１２．　ＯＯＯｒｐｍで回転する場合、上滑液中に存続した。

第１表　宿主−ベクター系、並びに増殖及び誘発条件の要約Ｄ２　ｐＣＱＶ２　 ＲＲＩ　融合されなかった　３２＠４２°、２時間■換久旦Ｎへ及迭 プラスミドＤＮＡ及び制限フラグメントの単離、分子ハイブリダイゼーション、 Ｅ、コリ形質転換及び他の一般的な分子生物学技法を、前記論文（Ａｚａｄ、な ど、　、　１９８５）に記載されるようにして行なった。

されたタンパク　の八 組換えコロニーにおける発現されたタンパク質のイムノアッセイ及びイムノドッ トアンセイ、ＰＡＧＥ及びウェスターンブロッティングによる単離されたタンパ ク質の特徴化を、前記（Ａｚａｄ、など、、１９８６）のようにして行なった。

猪−一来 多くのウィルス中和モノクローナル抗体により認識されるＶＰ２以内の最小領域 を定義するために、ＶＦ６のＶＦ６−コード領域を、特定の制限部位（第１図） で５′及び３′末端の両者から欠失せしめ、そしてＩＢＤＶポリペプチドがＮ− 末端融合クンバク質と共に存在することを確保する五−ユ丈発現ベクター中に連 結した。Ｅ、コリに発現されるタンパク質を、異なったＭＡｂによる反応により 非変性条件下で分析した。５′末端からＶＰＺ−コード領域の前進性欠失は、Ａ ｃｃ１部位の方への５′側配列の損失がウィルス中和ＭＡｂ（第１、図）との反 応に影響を及ぼさないことを示す。Ｓａｃ　Ｔ部位の方への追加の欠失がこの反 応を完全に廃止する。従って、反応部位のＮ−末端は、３′末端〜Ａｃｃ　１部 位及び５′末端〜Ｓａｃ　１部位に存在する。３′末端からの類似する前進性欠 失は、３′末端からＳｐｅ　Ｉ部位への欠失がＭＡｂ　１７／８２との反応に影 響を及ぼさないが、しかしその反応はＮａｅ　Ｉ部位の方への追加の欠失により 廃止されないことを示す。従って、反応性ペプチドのＣ−末端は、５′末端〜Ｓ ｐｅ　１部位及び３′末端〜ＮａｅＩ部位に存在する配列によりコードされる。

従って、ウィルス中和ＭＡｂ　１７／８２により認識される構造的エピトープが 、Ａｃｃ　Ｉ　−Ｓｐｅ　Ｉフラグメント（黒くぬりつぶされたボックス、第１ 図）によりコードされる１４５個のアミノ酸ポリペプチドと共に含まれる。これ はまた、ＭＡｂ　３９Ａ　、　３／１　。

３２／３　、９／６　、３３／１０及び４４／１８との反応のために必要とされ る最小領域でもある。このフラグメントの発現生成物（クローンｐＥＸ　Ａｃｃ 　Ｉ　−Ｓｐｅ　Ｉ　）　は、ＭＡｂ　１７／８２とひじように強く反応する（ 第１図）。このＶＰＺの領域内に半分のシスティンが存在しないので（Ｈｕｄｓ ｏｎ、など、　、　１９８６ｂ）、ジスルフィド結合は、この構造的決定基のた めに重要でないと思われる。ＭＡｂ　１７／８２と反応するＶＰＺの領域は、ひ じように疎水性であり、そして小さな親水性領域がそれぞれの末端で存在する（ 第２図）。Ｎ−末端領域はＡｃｃ　Ｔ　−Ｓａｃ　Ｉフラグメントによりコード され、そしてＣ−末端はＮａｅ　Ｉ　−Ｓｐｅ　Ｉフラグメントによりコードさ れる。Ａｃｃ　Ｉ−＋Ｓａｃ　Ｉからの５′欠失及びＳｐｅ　Ｉ→１ζａｅｌか らの３′欠失は肛ｂ　１７／８２との反応を完全に廃止するので、２つの親水性 領域が、１１Ａｂ　１７／８２により認識される構造的エピトープ内の重要な決 定基である。

類似する欠失発現研究は、ＭＡｂ　６により認識されるエピトープがＶＰＺのＣ −末端で存在する２０４個のす、ｐ、のＳｃａ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉフラグメント によりコードされることを示す（第１図）。

これらの結果は、ＶＰ２ａ　（４１ＫＤ）をＭＡｂ　６ウエスターンプロツトす るが、しかしそれに由来するＶＰ２ｂ　（３７ＫＤ）はプロ・ントしない前の観 察（Ｆａｔ＋ｅｙ＋など、、調製の写し）に一致する。

モノクローナル　の 完全なＩ　ＢＤＶのウェスターンプロントは、モノクローナル抗体を下記４種の グループに分離した： ｉ　ＶＦ６と反応するＭＡｂｌ／１及び１７／８０、ｉｉ　ＶＰ２ａと反応する が、しかしＶＰ２ｂとは反応しない？ＩＡｂ６／１． １）変性されたνＰ２ａ及びＶＰ２ｂと反応するＦＸＡｂ　９／６．３３／ｉ。

及び４４／１８、及び ｉｖ　いづれのウィルスタンパク質もウェスターンプロ・ノドしないＭＡｂ　３ 　／　１　、１７／８２　、３２／　３及び３９Ａ。

これらのＭＡｂのうち６個のＭＡ、ｂ　（３／１　、９／６．１７／８２　、３ ２／　３　、３３／１０及び３９Ａ）はインビトｔ：ｌ　テＩＢＤＶを中和し、 そして１７／８２及び３９Ａはまた、感染しやすい鶏を感染から受動的に保護し た（他も試験された）。ウェスターンプロットにより９／６及び３３／１０に似 ているＭＡｂ　４４／１８は、ウィルスを中和しなかった。同様に、ｒ＋ａｂ　 １／１　、６／１及び１７／８０はインビトロでウィルスを中和せず、そして１ ７／８０は感染しやすい鶏を受動的に保護しなかった。

ＭＡｂ　９／６　、３／１　、３２／３　、１７／８２及び３９Ａは、生来のＶ Ｐ２ａ及びＶＰ２ｂを特異的に免疫沈殿せしめ、そしてＥＬＴＳＡにおいてＩＢ ＤＶと反応するために鶏の免疫血清の能力をほとんど完全にブロックする。

追加ＥＬＩＳＡは、ＭＡｂ　３／１　、９／６．１７／８２．３２／３．３３／ １０及び３９Ａが、同じ結合部位のためにお互いとの競争をもたらすウィルス上 のエピトープと反応することを示した。非中和性抗−ＶＰ２ａ　／　２ｂ　ＭＡ ｂ　、　４４／　１８は、他のウィルス中和ＭＡｂと単に部分的に競争した。

これらの抗−ＩＢＤＶ　ＭＡｂは、血清における特異的鶏抗体を検出し、そして 感染された嚢におけるウィルス抗原を定量化するために使用され、これによって 診断又は定量試薬としてのそれらの潜在価値を示した。鶏免疫血清はウィルス中 和ＭＡｂを用いて競争ＥＬＩＳＡで定量化され得るが、これらの同じ。

ＭＡｂは、ワクチンとしてのそれらの配合の前、診断用サンプル及びウィルス又 は組換えタンパク質のバッチにおけるウィルス抗原を定量化することができる。

ＭＡｂ　６／１　、９／６及び３３／１０は、ウィルス又は組換えウィルスタン パク質の変性された／溶解された調製物における特定のタンパク質の合計量を定 量化することに特に有用であった。

第２表　ＩＢＤＶに対するモノクローナル抗体の特異性及び生物学的活性 ＊完全なウィルスに対するイムノド・ント（変性されたウィルス）。

＊＊完全なウィルスから単離された生来のＶＰＺ−／□１タンノ々り質の免疫沈 殿。

炭１ 次の詳細な説明は、感染性嚢疾患つイＪレス（ＩＢＤＶ）による感染から感染性 鶏を受動的に保護する、鶏におしするウィルス中和抗体を誘発するＶＰＺ内の臨 界的な保護エピトープの存在され、そして０及び２８日目に注射される、クロー ンＰＯΔχｈ。

Ｉ−ＰｓｔＩ（第１図）からのタンパク質１■に対する生まれて３週間目のＳＰ Ｆ鶏の応答を示す。ウィルス中和及びＥＬＩＳＡ応答は、無関係な構造体と共に 同様に注射される、実験グループ及び対照の鶏のグループに対して決定された。

第４表は、ビルレントＩＢＤＶによる攻撃の後、鶏７２４２　（第３表）からの ＩｇＧ又はＩｇＭ抗体により受動的に保護された大部分の鶏のファブリーキウス 嚢におけるＩＢＤＶ抗原の不在を示す。嚢のおけるウィルス抗原及び個々の鶏か らの一組の血清における残留受動抗体を、攻撃的感染の後、３日で、ＥＬＩＳＡ によりアッセイした。

材！支でヲＬ汰 えＶＦ６による′５の　疫ヒ ｐＥＸベクターに発現されルクｏ−７ＰＯΔＸｈｏｌ　−Ｐｓｔｌの不溶性融合 タンパク質（２■／ｍ１）を同体積の完全フロインドアジュバントに乳化し、そ して生まれた６３週間目の３羽の特別な病原体を有さない（ＳＰＦ）鶏にいくつ かの部位で筋肉内注射した。鶏の羽の静脈から定期的に放血し、そして生まれて １００回目不完全にフロインドアジュバントに乳化された同じ量の融合タンパク 質により注射した。鶏を再び放血し、そして抗体応答を、ＥＬＩＳＡ及びウィル ス中和アッセイにより測定した。３羽の対照の鶏のグループを同じ態様で正確に 処理した。但し、無関係なりローンを含む融合タンパク質を受けた。

感汎パの二　・　ｉ ウィルス中和抗体の最高力価を有する鶏７６４２からの血清をプールし、そして ０．ＯＩＭのリン酸緩衝液（ｐ）１７．６　）を用いてＳ３００（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）カラムによるクロマトグラフィーにより１９Ｓ及び７Ｓグロブリンに分 離した。２種の両分をＸＭ１００Ａ膜（Ｄｉａｆ　ｌｏｗ）を用いて濃縮し、そ して０．２２μの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して滅菌濾過した。生まれて３ 日目の８羽の鶏のグループを、グロブリン溶液１　ｍｌにより腹腔内（ｉ、ｐ、 ）注射し、そして次ニ２４時間後、ビルラフトＩＢ［ＩＶ（００２／７３株）の １００匹の感染性投与量（ＣＩＤｓ。）により攻撃した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ ）のｉ、ｐ、注射を受けた対照の鶏のグループを、同様に攻撃した。

３日後、鶏を殺し、そしてファブリーキウス嚢を除いた。

その嚢をＰＢＳ１ｍＲ中で音波処理し、均質懸濁液にした。個々の鶏からの組に された血清及び嚢均質物を、それぞれ残留抗体及びウィルス抗原についてＥＬＩ ＳＡによりアッセイした。

片−−−来 えＶＦ６に・するＳＰＦ′の心１ ｐＥχ融合タンパク質としこのクローンＰＯΔＸｈｏ　Ｉ　−ＰｓｔＩからのタ ンパク質により注射されたすべての３羽の鶏は、接種後３週までにウィルス中和 及びＥＬＩＳＡ抗体を産生じた。

融合タンパク質の２回目の投与は、力価、特にＥＬｒＳＡにより検出される抗体 をさらに高めた（第３表）。対照の鶏における抗体の力価は、ウィルス中和アッ セイにより、及びＥＬＩＳＡによるバックグラウンドレベル近くで一様に陰性で あった。

鶏７６４２は、最高で最長に持続する抗体力価を生成し、そしてこの鶏からの血 清をプールし、そして続く受動的保護研究に使用した。

えｖｐ２に・　る」Ｊヂ」ｊメ？９　の８Φ・Ｉ鶏７６４２からの血清の１９３ グロブリン（ＩｇＭ）及び７Ｓグロブリン（ＴｇＧ）画分の両者は、ビルレント ＩＢＤＶによる感染から、生まれて４日目の鶏を受動的に保護した。ＩｇＧを受 けた８羽の鶏のうち６羽及びＩｇＭを受けた８羽の鶏のうち７羽が、完全に保護 された。すべての対照の鶏は、一様に感染性であった。Ｉ　’ｇ　Ｇ抗体を受け る鶏における残留ＥＬＥＳＡ抗体の最低力価は、次の攻撃に負ける、このグルー プにおける２羽の鶏の感受性について説明することができる。それにもかかわら ず、組換えＶＦ６に対する抗体を含む血清の両分を受ける１６羽の鶏のうち合計 １３羽は、ビルレント感染攻撃に対して保護された。

第３表 組換えＶＦ６　（実験ｌ）又は無関係なタンパク質（対照）により注射された鶏 からの血清におけるライスル中和（ＶＮ）及びＥＬＩＳＡ抗体の相互力価 第４表 ｎ７６４２からのＩｇＧ及びＩｇＭ抗体による怒染生鶏の受動的保護７６４２　 ＩｇＧ　７６４２１ｇＭ　ＰＢＳ鶏の　ＡＧ　ＡＢ　鶏の　ＡＧ　ＡＢ　鶏の　 ＡＧ　ＡＢ番号°　番号”　番号” １　＜１　６０　９　ｄ　１２０　１？　＞１２８　＜４２　＜１　４０　１０ 　＜１　８０　１８　＞１２８　＜４３　＜１　３０　１１　＜１　１２０　１ ９　＞１２８　＜４４　ｄ　６０　１２　＜１　８０　２０　＞１２８　＜４５ 　＜１　６０　１３　２４　８０　２１　＞１２８　＜４６　６４　６０　１４ 　ｄ　１２０　２２　＞１２８　＜４７　＞１２８　６０　１５　ｄ　１２０　 ２３　＞１２８　＜４８　＜１　６０　１６　＜１　１２０　２４　＞１２８　 ＜４＊鶏は、ＩＢＤＶ　（００２／７３）により攻撃され、そして嚢中のウィル ス抗原（ＡＣ）及び血清中の残留抗体（ＡＢ）が相互力価として表わされる。

文藍工 １、Ａｚａｄ、Ａ、Ａ、、　Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｓ、Ａ、及びＦａｈｅｙ、　Ｋ、 Ｊ、　（１９８５）、、感染性嚢疾患ウィルスのオーストラリアン株の二本鎖Ｒ Ｎ　Ａゲノムの特徴及び分子クローニング。■ｒｏｌｏ■、　１４３：３５−４ ４゜２、Ａｚａｄ、Ａ、Ａ、、　Ｆａｈｅｙ、に、、　Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｓ、、 　Ｅｒｎｙ、に、及びＨｕｄｓｏｎ＋Ｐ、　（１９８６）。感染性嚢疾患ウィル スの宿主保護抗原のための遺伝子をコードするｃＤＮＡフラグメントのＥ、コリ における発現。

■皿旦■、に則：１９０−１．９８゜ ３、Ｂｏｂｏｓ、Ｐ、、　Ｈｉｌｌ、Ｂ、Ｊ、、　Ｈａｌｌｅｔｔ、Ｒ，、Ｋｅ ｌｌｓ、Ｄ、Ｔ、Ｃ，。

Ｂｅｃｈｔ、Ｈ，及びＴｅｎｎｉｎｇｅｓ、Ｄ、　（１９７９）。ビセグメント 化された二本鎖ＲＮＡゲノムを有する５種の動物ウィルスの生物理学的及び生化 学的特徴化。Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　３２：５９３〜６０５゜４、Ｆａｈｅｙ、に、 Ｊ、、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１．Ｊ、及びＡｚａｄ’、　Ａ、Ａ、　（１９８５ ａ）。

感染性嚢疾患ウィルスの免疫原のウェスターンプロットによる特徴化。Ｊ、Ｇｅ ｎ、νｉｒｏ］、　６６：１４７９−１４８８゜５、Ｆａｈｅｙ、Ｍ、Ｊ、＋Ｏ ’Ｄｏｎｎｅｌｌ、１．Ｊ、及びＢａｇｕｓｔ、ＴＪ、　（１９８５ｂ）。

感染性嚢疾患ウィルスの３２ＫＤの構造タンパク質に対する抗体はインビトロで ウィルス感染を中和し、そして若い鶏に対して保護を付与する。Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖ ｉｒｏｌ、　６６：２６９３〜２７０２゜６、Ｆｉｒｔｈ、Ｇ、Ａ、（１９７４ ）。オーストラリアン家禽類内での感染性嚢症候群の発生、　Ａｕ５ｔ、Ｖｅｔ 、Ｊ、　５０：１２８〜１３０　。

７、Ｆｒｉｇｕｅｔ、Ｂ、＋　Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅ、Ｌ、＋　 Ｐａｇｅｓ＋Ｊ、、　Ｂｕｓｓａｒｄ。

Ａ、及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、Ｍ、（１９８３）　。Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　６０：３１５〜３５Ｂ。

３、）Ｉｏｐｐ、Ｔ、Ｐ、及びＷｏｏｄｓ、　Ｋ、Ｒ，（１９８１）。アミノ酸 配列からのタンパク質抗原決定基の推測。Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ＵＳＡ。

邦：　３８２４〜３８２８゜ ９、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｐ、Ｊ、、　Ｍｃｋｅｒｎ、Ｎ、Ｍ、Ｐｏｗｅｒ、Ｂ、Ｅ、 及び八ｚａｄ、Ａ、Ａ。

（１９８６）。感染性嚢疾恵ウィルスの大ＲＮＡセグメントのゲノム構造。Ｎｕ ｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、　１４：５００１〜５０１２゜１０、　Ｋｉｎｇ、Ｐ 、Ｖ、及びＢｌａｋｅｓｌｅｙ、　Ｒ，Ｗ、　（１９８６）。形質転換のた１１ 、　Ｌａｅｎ＋＋ｎｌｉ、Ｕ、に、（１９７０）。バタテリオファージＴ４のヘ ッドの集合の間での構造タンパク質の分割。Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０〜６ ８５　。

１２、　Ｑｕｅｅｎ、Ｃ，（１９８３）。旦−ユユにおけるタンノくり質の効果 的合成のためにファージシグナルを使用するベクター、Ｊ、Ｍｏｌ。

卸坦」ｙム？：１〜１０゜ １３、　Ｒｕｔｈｅｒ、Ｖ、及びＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ、Ｂ、　（１９８３） 。ｃＤＮＡクローンの容易な同定。ＥＭＢＯＪ、　２　：　１７９１〜１７９４ ゜１４、５ｔａｎｌｅｙ、に、に、及びＬｕｚｉｏ、　Ｊ、　Ｐ、　（１９８４ ）。高０効能の細面発現ベクターの新しい種類の構成：ヒト肝臓タンノくり質を コードするｃＤＮＡクローンの同定、ＥＭＢＯＪ、旦：　１４２９〜１４３４゜ 匡際調査報告 １＋１＋−Ｈ１１１＋＋ｌＡ＋ｅｂ＋−嗜−１１″′″′ＰＣＴ／ＡＵ８８１０ ０２０６Ａｔｌ　３７４８７／８５　ＷＯ８５０２５４Ｓ　ＥＰ　１９８８２Ｂ 八Ｕ　５９６６８／８６　讐０　８６０７０６０　ＥＰ　２２２Ｂ４２

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ＩＢＤＶのＶＰ２ポリペプチドの構造的エピトープをコードするヌクレオチ ド配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子。
2. ２．ＶＰ２ポリペプチドをコードするＩＢＤＶゲノムセグメントのＡｃｃＩ−Ｓ ｐｅＩフラグメント（場合によっては、ＳｃａＩ−ＸｈｏＩフラグメントと一緒 に）に実質的に対応するヌクレオチド配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の 組換えＤＮＡ分子。
3. ３．発現制御配列に操作的に結合される請求の範囲第１又は第２項記載のヌクレ オチド配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子。
4. ４．ＩＢＤＶのＶＰ２構造タンパク質の構造的エピトーブのすべて又は一部、又 はその抗原性を示すポリペプチドを発現することができ、そして請求の範囲第１ 又は２項記載のヌクレオチド配列（該配列は発現制御配列に操作的に結合される ）をその中に挿入している組換えＤＮＡクローニングビークル又はベクター。
5. ５．請求の範囲第３項記載の組換えＤＮＡ分子又は請求の範囲第４項記載の組換 えＤＮＡクローニングビークル又はベクターを含む宿主細胞。
6. ６．ＩＢＤＶのＶＰ２構造タンパク質の構造的エピトーブのすべて又は一部の抗 原性を示す合成ペプチド又はポリペプチド。
7. ７．ＶＰ２ポリペプチドをコードするＩＢＤＶゲノムセグメントのＡｃｃＩ−Ｓ ｐｅＩフラグメント（場合によっては、ＳｃａＩ−ＸｈｏＩフラグメントと一緒 に）によりコードされるポリペプチドの抗原性を示すことを特徴とする請求の範 囲第６項記載の合成ペプチド又はポリペプチド。
8. ８．ＩＢＤＶのＶＰ２構造タンパク質の構造的エピトーブのすべて又は一部の抗 原性を示すポリペプチド配列を、Ｃ−末端配列として、及び追加のポリペプチド をそこに融合されるＮ−末端配列として含んで成る融合ポリペプチド。
9. ９．前記ポリペプチド配列が、ＶＰ２ポリペプチドをコードするＩＢＤＶゲノム セグメントのＡｃｃＩ−ＳｐｅＩフラグメント（場合によってはＳｃａＩ−Ｘｈ ｏＩフラグメントと一緒）によりコードされるポリペプチドの抗原性を示す請求 の範囲第２０項記載の融合ポリペプチド。
10. １０．請求の範囲第６又は７項記載の合成ペプチド又はポリペプチド、又は請求 の範囲第８又は９項記載の融合ポリペプチドを調製するための方法であって、請 求の範囲第５項記載の宿主細胞の発現、及び合成ペプチド又はポリペプチド、又 は融合ポリペプチドの回収を含んで成る方法。
11. １１．ＩＢＤＶに対する免疫応答を刺激するための組成物であって、ＩＢＤＶの ＶＰ２構造タンパク質の構造的エピトーブのすべて又は一部の抗原性を示す少な くとも１種の合成ペプチド又はポリペプチド、及び医薬的に許容できるそのため のキャリヤーを含んで成る組成物。
12. １２．請求の範囲第６又は７項記載の合成ペプチド又はポリペプチド、又は請求 の範囲第８又は９項記載の融合ポリペプチドを含んで成る請求の範囲第１１項記 載の組成物。
13. １３．アジュバントをさらに含んで成る請求の範囲第１１又は１２項記載の組成 物。
14. １４．家禽類においてＩＢＤＶに対する免疫応答を刺激するための方法であって 、前記家禽類に請求の範囲１１〜１３項のいづれか１項記載の組成物を投与する ことを含んで成る方法。