JPH03500659A

JPH03500659A - タンパク質ミセル

Info

Publication number: JPH03500659A
Application number: JP1505947A
Authority: JP
Inventors: ダスティン，マイケル・エル; スプリンガー，ティモシー・エイ
Original assignee: ダナ‐ファーバー・キャンサー・インスチチュート・インコーポレーテッド
Priority date: 1988-05-04
Filing date: 1989-05-02
Publication date: 1991-02-14
Also published as: AU3731089A; CA1338079C; AU638210B2; EP0372056A1; WO1989010938A1; EP0372056A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質ミセル〔発明の背景〕本発明は接着性タンパク質（以下に定義する）に関し、特に、単球、預粒球、細胞障害性Ｔリンパ球、Ｂリンパ芽球細胞、血小板および繊維芽細胞を含むほとんどすべてのヒト細胞表面に広く分布している糖タンパク質であるリンノく球機能付随抗原−Ｂ（ＬＦＡ　３）に、関する。

Ｌ　Ｆ　Ａ−３はＴリンパ球表面に観察される他の糖タンパク質である分化のクラスター第２成分（ＣＤ２）のリガンドである。

これらの２つの糖タンパク質は相互作用し、標的細胞ｌ＼のＴリンパ球の接着を媒介する。同様に、胸腺上皮細胞への胸腺リンパ球の結きは胸腺リンパ球上のＣＤ２および胸腺上皮細胞上のり、　Ｆ　Ａ　−３を４１要とする。精製された形のＬＦＡ−３はＴリンパ球および赤面疎開の細胞間接着を阻害し、Ｔリンパ球の凝集を媒介する。

〔発明の開示〕

本発明は接着性タンパク質（例えばＬＦＡ−３）のミセルを提供し、それはホスファチジルイノシトール脂質（“ＰＩ”）アンカーを天然に含んている；　ミセル（好適には約１０分子未満のタンパク質を含んでいる）は細胞表面上の大多数の標的分子と多価で結合できる。それ故、本発明は細胞に対するＬＦＡ−３のＫｄが約４００ｎＭと決定されている単量体ＬＦＡ−３のＫｄより低いようなＣＤ −２含有細胞に対する結合活性を持つ多量体、精製ＬＦＡ−３を提供する。より好適にはＫｄは・ぐ５０ｎＭであり、さらにより好適には＜２０ｎＭである。ここて接着性タン２（り質とは２つまたはそれ以上のヒト細胞の接触および結合と媒介する任意のタンパク質として定義され、および力子適にはそれは細胞の表面上に存在するタンパク質である。ここで標的分子とは接着性タンパク質が選択的に結合する（すなわち、他のどんな分子が結合される程度より強く結合し、好適には結合は非他的である）ような分子として定義される。

本発明のミセルは第１の細胞がその表面に、第２の細胞上に多くの形で存在する分子に結合できるＰＩアンカー運運搬タンパ資質持つ場合、第１の細胞の第２の細胞ｌ＼の接着の阻害に使用する事ができる。方法は第２の細胞と第２の細胞上の多数の分子と多価で結きできる、＠適には約１０未満のそのようなタンパク質分子のミセル（またはそのミセル−形成、結合断片）を接触することき含んでいる。

本発明の接着性タンパク質ミセルはさらに患者の活性化されたＴ細胞の他の細胞への結合を阻害するのに有効量のＬＦＡ−３血流濃度を達成するため生理学的に矛盾のない緩衝液中のＬ　Ｆ　Ａ　−３ミセルを患者に投与することにより過剰の活性化されなＴ細胞の存在により特徴付けられる医学状態の処置に使用できる：結果として生じるＬ　Ｆ　Ａ−３の血流濃度は好適には０４か４．４０ｎＭのＬ　Ｆ　Ａ−３である。過剰の活性化されたＴＭ！３胞の存在により特徴付けられる疾病状態には多発性硬化症、サルコイド−ジス、若年型真性糖尿病、全身性紅斑性狼癒、甲状腺炎、慢性関節リウマチ、強直性を椎炎、原発性胆汁末肝硬変、自己免疫溶血性貧血、免疫性血小板減少性＠斑病、筋電グラヴイス、同種移植片拒絶および移植片一対一宿主疾患が含まれる。

本発明の他の様相は、天然にＰＩアンカーを含む任意の接着性タンパク質の結合活性を増加させ、解離定数を減少させる方法を特色としている。ここで界面活性剤とは、分子中型まれるごとく空間的に離れた疎水性および親水性領域を持つ任意の小さな両親媒性分子として定義される（即ち、一方の末端が荷電するか極性であり、他の末端は非極性である）。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）とは溶液中でミセルがちょうど形成しはじめる溶液中の特定の界面活性剤の濃度のことである。

このＣＭＣは異った界面活性剤では異っている。

本発明のさらなる様相は、末梢血単核細胞またはＴリンパ球をＣＤ２に対する抗体と件にＬＦＡ−３ミセルと接触させる事によりそれらの細胞の活性化または増殖に効果を及ぼす方法を特色としている。

〔発明を実施する為の最良の形態〕

最初に図を簡単に説明する。

区図１はＬＦＡ−３の２つの型のゲル濾過の結果を示しているグラフであり；図２はＬ　Ｆ　Ａ　−３のトランスメンプラン（ＴＭ）型の略図であり；図３は接着性タンパク質ミセルの略図であり；図４はヒトＴ　Ｍ　Ｌ　Ｆ　Ａ　 −３ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡのＤＮＡ配列および推定されるアミノ酸配列であり；図５はジュルカット細胞からのＬＦＡ−３ミセルの解離の時間変化のグラフであり；図６８および６１〕は各々、ジュルカットおよび静止Ｔ細胞に対するＬＦＡ−３ミセルの平衝結合およびスキャッチャード法により分析された同しデータを示しているグラフであり；図７ａおよび７ｂはＬ　Ｆ　Ａ　−３およびＣＤ２モノクローナル抗体（ＭＡ＋））−誘導増殖の時間変化および用量応答性を示しているグラフであり：図８はＬ　Ｆ　Ａ　−３およびＣＤ２ＭＡｂにより誘導されたジャルカット細胞中での時間によるＣａ＋２の細胞質流動性を示す発光スペクトルのグラフで゛あり；図９はＬＦＡ、−３およびＣＤ２ＭＡｂにより誘導された静止Ｔ細胞中での時間によるＣ　ａ＋２の細胞質流動性を示す発光スペクトルのグラフであり；図１０ａおよび１０ｂは各々発光スペクトルグラフおよびヒストグラムの組であり、Ｃａ＋２流入の濃度依存性はジェルカット細胞中ではＣＤ２のＬＦＡ−３占有で増加していることを示している。

旦ヱノビ一旦！１１１以下の細胞株が本発明の研究に使用された。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はデキストラン沈降およびフィコール−ハイバーク（シグマ、セントルイス、ＭＯ）密度匂配遠心分離により単離された。末梢血Ｔリンパ球（ＰＢＬ、−Ｔ）はナイロンウール（ポリサイエンス、ワシントン、ＰＡ）濾過およびプラスチック接着により濃縮された。ジュルカット細胞株はＭ　、　Ｋ　、　Ｈｏ博士（デュポン、ボストン、ＭＡ）から入手した。細胞はＲＰＭ　ｌ−１６４０゜１０　％ウジ胎児血清（ギブコ、グランドアイランド、　Ｎ　Ｙ　）　５　ＩＩＩＭし一グルタミン、５０μｇ／ｗｌゲンタマイシン（完全培地）中で維持された。ＬＦＡ−３およびＣＤ２精製のためのＪＹＢリンパ芽球細胞およびジュルカット細胞はＭＩＴ細胞培養センター（ケンブリッジ、ＭＡ）で増殖した。

ＬＦＡ−３はヒト赤血球（Ｄｕｓｔｉｎ、Ｍ、Ｌ、ら、ジャーナルオブエクスベリ、メンタルメジスン、１６５：６７７（１９８７）　）またはＪ’ｌ’Ｂリンパ芽球細胞（Ｗａｌｌｅｒ、Ｂ、Ｐ、らジャーナルオブエクスペリメンタルメジスン１６６：９２３（１９８７）　）のトリトンＸ−１００溶解物、または、ホスファチジルイノシトール−特異性ホスホリパーゼＣ（ＰＴＰＬｃ）処理Ｊ’ｒ ’Ｂリンパ芽球細胞の上澄ミｉａ　カ；−，Ｔ　Ｓ　２．／９　Ｍ　Ａ　ｂ−セフ　７’　Ｄ−スＣＬ　４　Ｂ　（７７ルマシア、ヒスカタウェイ、ＮＪ）上の免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製される。後者の！４き、５０２の生きているＪ）′細胞をハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、総量で１００ｙ１で３７℃にて１時間バシラススリンジェンジス（Ｂａｃｉｌ匝工上ｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ）Ｐ　Ｉ　Ｐ　ＬＣ（Ｍａｒｔｉｎ　Ｌｏ−博士より、コロンビア大学、ＮＹ、ＮＹ）で処理する。使用された酵素濃度は０．１％デオキシコレート界面活性剤の存在下ｐＨ７で３００／ｎｍ、ｏｌ／ｌ１ｌｉｎ／ｎの３）（−ホスファチジルイノシトール３加水分解できな（Ｌｏ智、Ｍ、Ｇ、、メソッズインエンザイモロジー、７１　ニア４１　（１９８１））。

細胞を１１００Ｏｘテヘレット化し、細胞破片を１００，０ＯＯｘｙ、１時間でベレツト化する。ＬＦＡ−３を含む溶菌液または上澄み液をアフィニティ　カラムを通し、カラムを洗浄する（Ｄ　ｕｓｔ　ｉｎ　、　Ｍ　。

Ｌ、ら上記文献）。赤血球からのＬＦＡ−３は０．１°〈オクチルグルコシド（ＯＧ）界面活性剤存在下ｐＨ３で免疫アフィニティ　カラノ、から溶出される。

、ＰＩＰＬＣ上澄み液からのＬＦＡ３は界面活性剤不在下、ｐＨ３で溶出され、ＬＦＡ−３を含む分画をプールしく４　６ａｌ）、ＴＳＡで平衝化した１、１のフェニル−セファロースカラム（ファルマシア）を通す。いくつかの調製試料はＭＡＰＳ結会緩衝清く赤血球からのＬＦＡ−３では１　／６のＯＧと件に）（バイオラド、リッチモンド、ＣＡ）で１：１に希釈した？！？Ａｚ１のタンパク質入−セファロースＣＬ−４Ｂ　カラムを通した。

上記のごとくして精製されたＬＦＩ−３は２つの型を持っている：赤血球またはリンパ芽球がら単離されるＭＬＦＡ−３型、およびリンパ芽球から単離される５ＬＦＡ　３型。ｍＬＦＡ−３は無傷のホスファチジルイノシトール（Ｐ■）アンカーを持っており、脂質−結き型とも称される。５ＬＦＡ　３はＰＴＰＬＣて′ 切断されたＰＩ膜アンカーを持っていた。これら２つのうちｍＬＦＡ−３のみがミセルを形成できる。

トランスメンブランＬＦＡ−３（またはＴＭ　ＬＦＡ−３）と称される第３の型のＬＦＡ−３が存在し、それは脂質膜アンカーを持っていないが、完全ＬＦＡ− ３タンパク質の１部であるトランスメンブラン領域により細胞膜に結合して残っている。

ｍＬＦＡ−３同様ＴＭＬＦＡ−３もミセルを形成でき、以下により詳細に記載されるであろう。最初に５ＬＦＡ　３について説明する。

Ｂリンパ芽球細胞の表面上のり、　Ｆ　Ａ　−３の約半分がＰＴＰＬＣにより切断可能なＰＴグリカン部分により膜に結合しているという我々の最近の知見（ＤｕｓｔｉｎＪＬＬ、らネ・−シャー、浜旦：５４６（１９８７））から結き研究のためのＬＦＡ−３の非−凝集型（即ち、ミセル形成を行わない）を得ることが可能になった。

生きているＪ　Ｙ細胞の表面からＰＩＰＬＣにより放出されたＬ　Ｆ　Ａ　−３は免疫アフィニティ　クロマトグラフィー、フェニル−セファロース上の疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびタンパク質Ａアフイニテイ　クロマトグラフィーにより精製される。真中の工程は痕跡の膜物質または酵素処理の間に放出されるであろうＬ　Ｆ　Ａ　−３ミセルを除去するために加えである。

５０ｇの細胞からの収量は約１００μりであった。この物質がＮ−グリカナーゼで処理された場合、ＪＹ細胞および赤血球からの脂質−結合型に対応する２５．５ＫＤの単一バンドが得られた。

以下の活性化実験で使用されるごときミセルの形でのｍＬＦＡ＝３の構造がゲル沢過により研究された。結果は図１にグラフで示しである。１％ＯＧ存在下および不在下でのｍＬＦＡ−３の大きさはＨＰＬＣゲル沢過により試験された。界面活性剤不在下（実線）、ＴＳＫ　Ｇ５４０００またはゾルパックスＧＦ２５０（デュポン）カラム上、ＩＩＩＬＦＡ−３はチログロブリン（６００，０ＯＯＫ　Ｄ　）のわずかに前しかしブルーデキストランの後に溶出し、７００ＫＤの球状タンパク質と同様の拡散係数を持っていた。点線は１％ＯＧ存在下での溶出プロフィールを示している。１％ＯＧ存在下ではすべてのＬＦＡ−３がＴ　ｇＧ　（１５０Ｋ　Ｄ　）と共溶出した。

Ｌ　Ｆ　Ａ　−３は５ＤＳ−ＰＡＧＥ中では５５−７０ＫＤに移動する（Ｄｕｓｔｉｎ、Ｍ、Ｌ、ら上記文献）。界面活性剤存在下および不在下でのｍＬＦＡ　３の分子量は沈降のデータ無しては推定できない；しかしながら、これらのデータは界面活性剤不在下で約５つの単量体または二量体のタンパク質ミセルを＋ｎＬＦＡ　３が形成していることを示している。５ＤＳ−ＰＡＧＥに基づくと、＋ｎＬＦＡ　３はジスルフィド結き二量体を形成しないが、非−共有結合性二量体の形成は除外できない。さらに、界面活性剤不在下、ｓ　Ｌ　Ｆ　Ａ　−３は単量体または二量体に一致する拡散係数を持つｆ：可溶性分子として存在している。

ミセル−形成Ｉ−Ｆ　Ａ　−３の第２の型はトランスメンブラン型＜Ｔｌｌ　ＬＦＡ−３）である。、二の型のコードしているｍＲＮＡはｍ　Ｔ、　Ｆ　Ａ　Ｂ型の＋ｎ　Ｒ，Ｎ　Ａと異っているが、ただ分子中のトランスメンブランおよび細胞質領域のみである。ＬＦＡ−３の両方の型のＣＤ２結会領域（細胞外部分）は同一である。

ＴＭ　ＬＦＡ−３は脂質アンカーを持っていないが、細胞質領域は疎水性アミノ酸配列を含んでおり、そのため精製タンパク質に結合して残っている。ミセル形成は脂質−脂質相互作用というよりもむしろタンパク質−タンパク質相互作用により起こるがその結果としてのミセル形成は同じである。ＴＭＬＦＡ−３および＋ｎ　Ｌ　Ｆ　Ａ　３ミセルは匹敵する安定性および標的結合活性を持っている。

Ｌ　Ｆ　Ａ　−３のＴＭ型はほとんどの凝集された細胞中に天然に存在し、しばしば同時に脂質−結合型もまた産生されていることが観察されてきた。

互ｊＪｊＩえｍＬＦＡ　３およびＴＭＬＦＡ−３のミセルはセントリコン３０装置（アミコン、ダンバーズ、　ＭＡ　）を用い、各々のサイクルにおいて２１！ｌのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を添加し、容量を５０μｌに減じる３つのサイクルの限界濾過により調製する。Ｒ後の工程のｆ＋終限外Ｐ液は最終保持物として同一の低分子量成分分含んでいるが、ＬＦＡ−３を含んでいないので、この限外濾過が以下の実験において緩衝成分の影響をみる対照物として使用される。

ＬＦＡ−３ミセルの形成は界面活性剤が除去されるか臨界ミセル濃度以下に希釈された搗き自発的に起こる。界面活性剤の除去はいくつかの技術により達成できる。主な必要条件はタンパク質が他の物質（即ち試験管表面等）に吸着するよりむしろタンパク質凝集が最も好ましくなるように界面活性剤が除去または希釈されることである。＋ｎＬＦＡ　３でうまくいく１つの技術は限外濾過であり、１９６オクチルグルコシドのｍＬＦＡ−３溶液が２ｄから５０μｌに濃縮され、界面活性剤を含まない溶液で希釈される。この結果、オクチルグルコシドはその臨界ミセル濃度（２５ｎＭ）以下に希釈される。界面活性剤除去、／希釈のための他の技術は透析および界面活性剤を含まないショ糖匂配を通した沈降である。タンパク質ミセルの構造はタンパク質の疎水性および親水性部分の性質により決定され、界面活性剤の除去手段にはよらないので、どの技術でタンパク質ミセルが発生゛　させられても機能的には等価である。

Ｌ　Ｆ　Ａ　−３のごとく疎水性成分を持つタンパク質が精製された場きはいつもこれらのタンパク質が精製過程で使用されたガラスまたはプラスチック容器に付着する傾向がある。界面活性剤の急速な除去はこの傾向を妨げ、タンパク質− プラスチック。

タンパク質−ガラスよりむしろタンパク質−タンパク質結合と促進し、その結果精製ＬＦＡ−３をミセルの形で約１００パーセント回収できる。ミセルはＰＢＳ中活性を失うことなく少なくとも２ケ月維持できる。理論的にはもしＰＢＳに全くプロテアーゼが含まれていないと、ミセルの貯蔵可能期間はより長いべきであろう。

本発明に従って創られたミセルはミセル内に隔離された疎水性脂質または疎水性タンパク質性の尾”および外側に面した周辺部に球形の親水性領域を持っている。図３は５つの単量体単位を含むそのようなミセルの略図である。

絹換え体Ｌ　Ｆ　Ａ　−３からのミセルのり成組換え体が産生するＬＦＡ−３からもまたミセルが形成できる。組換え体Ｌ　Ｆ　Ａ　−３を産生ずる好適な方法は、酵素的にＰＩファンーを結きする真核生物発現系である（例えばチャイニーズハムスター卵巣（ｃ　ＨＯ）細胞）。

ヒトＴ　ＭＬ　Ｆ　Ａ　−３ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列および推定されるアミノ酸配列は知られており（Ｗａｌｌｕｅｒ、　Ｂ　、Ｐ　、らジャーナルオブエクスペリメンタルメジスン」現：９２３−３２（１９８７））、それは区４に示されているがそこにおいて潜在的Ｎ−グリコジル化部位は矢印で示されており、潜在的トランスメンブラン領域は破線で下線を付けである。これらの配列データはＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　、／シーンバンクデータラボラトリーから受付番号）’００６３６のもと入手可能である。ＬＦＡ−３のＰＩ型のｃＤＮＡ配列はＴＭ型とそれがわずかに短いことを除いて同一である。ＬＦＡ−３のＰＩダグリカン結合形コードしているクローン化されたｃＤＮＡは常法によりＣＨＯ細胞系で発現される。これらの細胞はトランスメンプラン領域配列を認識し、翻訳後Ｆ’　Ｉアンカー分タンパク質の残りに対し共有結合で結きする。もしくは、Ｌ　Ｆ　Ａ−３のＴＭ型はＣＨＯ細胞またはマウスＬ細胞のごときＰＩファンーを結きできない他の細胞系でも産生ずることができる（Ｆ　Ｉａｖｅｌｌら＋９８７）。

組換え体ＴＭＬＦＡ−３またはｍＬＦＡ　Ｂ型が単離され、上記のごとく、天然に存在するＬＦＡ３と同じ方法でミセルの形成を起こすことができる。

ＬＦＡ−３ミセルおよびＣＤ２八グＡｂＥの２人Ｍ　Ａ　ｂ飽和濃度でジュルカット細胞または末梢Ｔ細胞に対するｍＬＦＡ−３の結合の＠害に対する多数のＣＤ２ＭＡｂの能力が試験されたく表１）。Ｅ−ロゼツト形成を強く阻害するＣＤ２ＭＡｂカーＬＦＡ−３結合を完全に阻害できた。

この研究に使用されたＭ　Ａ　ｂは表２にリストされている。９−１はＤｕｐｏｎＬ博士から提供された（メモリアルスローンーゲッタリング癌研究所、ＮＹ）、９．６はＪ　ｏｈｎ　Ｈａｎｓｅｎ博士から提供されたくフレッドハ・ソチンソン癌研究センター、シアトル、ＷＡ）４　勺　ＣＤ２へのＩ−Ｆ　Ａ−３ミセルの壮ムトリトンＸ−１００が１５％ウシ血清アルブミンに吸着されている場合、ＣＤ２陽性細胞にヨード化ＬＦＡ−３が結合すること、およびこの結合がＣＤ２　ＭＡｂおよびＬＦＡ−３ＭＡｂにより阻害されることは示されている（Ｄｕｓｔｉｎら上記文献）。本発明に従うと、ｍＬＦＡ　３ミセルはジュルカットＴ白血病細胞または静止ＰＢＬ、−Ｔに効率よく結合することが観察された（表３）。Ｉｌｌ　Ｉ−Ｆ　Ａ　３ミセル結自はＴＳ２．／＋８ＭＡｂ、ＬＦＡ−３ＭＡｂおよび非標識ＩＩＩ　Ｉ−Ｆ　、Ａ　−３ミセルにより阻害された９図５はジュルカット細胞からのｍ　Ｌ　Ｆ　Ａ　−３の解離の時間変化のグラフである。、ｍＬＦＡ　３ミセルが結合している細胞を４℃で＋ｎＬＦＡ　３を含まない多量の培地に再懸濁した場合、結ｉ：＋ｎＬ　Ｆ　Ａ　３ミ七ルの解離は非常に遅かった（ｔｌ／２″：＝−，６００分；白ヌキ四角）、一方１０ｔ、ｔｇ、／ｚｈ７）Ｔ　Ｓ　２／ｌ５ＭＡｌ〕存在下テハ（黒四角）解離速度はより速かった（ｔｌ／２＝６０分）。１００μｇ、、／ｘｌＴｓ２／１８ＭＡＩ）を含む培地に細胞を再懸濁した場合（黒三角）ｔｌ／２は２分未満であり、１時間以内で完全に解離しな。ＴＳ２／ＩｓＭＡｂおよび＋ｎＬＦＡ　３はＣＤ２に厳密な競合的様式で結合すると考えられるのでＣＤ２ＭＡｂ存在下で解離の速度が増加したことは＋ｎ　Ｌ　Ｆ　Ａ　−３ミセルは細胞表面ＣＤ２と多価結合で結合している事を示している。

ミセルが細胞の表面と接触した場き、ミセル中のこれらのタンパク質の結合領域は多くの相互作用として関与し、それによりその標的に対するタンパク質の結合活性を徐々に増加させる。

単一のタンパク質−標的相互作用は急速に解離する傾向を持っているが、ミセルでは約５がら１ｏの相互作用を同時に起こすことができる。それ故、全体の解離定数は、この多価結合のため接着性タンパク質のミセル型に対し非常に減少している９このことを証明するため、細胞表面ＣＤ２に対する謡ＬＦＡ　３ミセルおよび非−ミセル５ＬＦＡ−３の能力を比較した。Ｊ）′細胞および赤血球からのＬＦＡ−３は異なった程度のグリコジル化を示した。それ故グリコジル化の相違により生じる結合の相違を除外するため、Ｊ　Ｙ細胞から単離された餉ＬＦＡ　３および、、Ｌ７ＦＡ−３の両者が単離された。ＪＹ細胞からの＋ｎ　Ｌ　Ｆ　Ａ−３ミセルは赤血球からの、１ＩＬＦＡ−３ミセルと類似の大きさであり・Ｌ、　Ｆ　Ａ　−３のＰＩおよびＴＭ型の混合糊であることを示している（Ｄｕｓｔｉｎらネーチャー、上記文＆＞、　ｓＬ　Ｆ　Ａ　−３は＋６Ｔ、ＦＡ−３と同一比活性までヨード化され、４℃で９０分ジュルカ、７ト白血病Ｔ細胞とインキュベーション後、オイルクッションを通してスピンさせた。ＪＹｍＬＦＡ−３ミセル結きの程度はＪＹｓＬＦ、Ａ−３結合の１５０倍であることが観察された（表４）。

このことと一致するが、非標１ｓＬＦＡ−３は重量で１００倍過’ＦＩＭ−在してもジュルカット細胞に対するｍＬＦＡ　３の結合を１２めうる程阻害しない。

それ故、多価結合は、細胞表面ＣＤ２に対する高結合活性論ＬＦＡ　３結合において重要な因子であると腎、わ！ｌる。

上記グ＋（’：Ｄ２ＭＡｂによるｍＬＦＡ−３結合の完全な逆転は、４°Ｃで９０分後ではＬＦＡ−３はエンドサイト−シスされておらず　またこの期間の間にそのＰＴグリカンアンカーを通して膜内Ｉ＼挿入されていない事を示している。

ｍＬＦＡ−３のエンドサイトシスをさらに試験するため、ＬＦＡ−３をジュルカ・・ノド細胞またはＰＢＬに３７℃にて３０分または４℃にて６０分間結合させる。細胞を冷培地で洗浄し、その後６時間１００μｇ／ｚｌのＴＳ２、／１８　ＭＡｂとインキュベートする（表５）。４℃で結合したＬ　Ｆ　Ａ　−３はほとんど完全にＴ　Ｓ　２　／　１８　Ｍ　Ａ　Ｉ）により放出されたが、３７°Ｃで結合した付随カウントのジュルカット細胞の５０％および末梢血Ｔリンパ球（ＰＢＬ−Ｔ＞の２０％はＴ　Ｓ　２．／１８　ＭＡ　ｂ存在下でも細胞に付随して残った（表５）。３７°ＣにてＴＳ２．／３３ＭＡｂがｍＬＦＡ　３と一緒に加えられたＰｊき、ＬＦＡ−３と細胞の連結は検出されず、強い連結は形質膜内へのｍＬ　Ｆ　Ａ　−３の非−特異的脂質媒介挿入または流動相ピノサイト−ジスではないことを示している。

精％ｗ＋ＬＦＡ−３のガラスカバースリップに結合したリポソーム内に再構築された精製ＣＤ２に対する結合性が試験された。ヨード化ｍＬＦＡ〜３　ミセルはこの固相に結合することが観察された（表６）。結合はＬＦＡ−３ＭＡｂおよびＴＳ２．／１８Ｍ　Ａ　ｂにより阻害されたが、ＣＤ２．１　ＭＡｂによっては阻害されず、ｍｌ−ＦＡ　３は他の細胞表面成分なしでもＣＤ２に結きすることを示している。

細胞当りに結合された＋ａＬＦＡ　３分子の数、およびジュルカ・ソト細胞および静止ＰＢＬ−Ｔ細胞上のＣＤ２との相互作用の結き活性を決定するため、平衡結合実験が実施された。結果は図６８および６ｂにグラフとして示しである９ヨード化後の活性ｍＬＦＡ　３タンパク質ミ七ルのパーセントは１０’のジュルカット細胞の３つの連続した一定分量に結きできる陪ＬＦＡ−３の比率の測定により決定された。異った調製試料に対しこの値は８５および９５％の間であった。

特異的ｍＬＦＡ　３結合は過剰のＴ　Ｓ　２／１８　Ｍ　Ａ　ｂにより阻害される結合として定義された。鎖ＬＦＡ−３の結合は対照ＭＡｂ（四角）またはＴＳ２／１８ＭＡｂ（三角）の存在下４℃にて１時間実施された。ＭＬＦＡ−３ジユルカ・ソト細胞（意中）およびＰＢ！、−Ｔ（白ぬき印）に対し飽和されるように結合する。スキャッチャードプロットはジュルカットＣＤ２に対するＫｄは１．７−２．２ｎＭてあり、一方Ｐ　Ｂ　Ｉ−−Ｔに対するＫｄは１２　１６　ｎＭであることを示している（図６ｂ）。

このＫｄ値はこれらの細胞型の各々に対するＬＦＡ−３ミセルの結合活性の程度である。飽和で測定して約４２０，０００の＋ｎＬＦＡ−３単量体がジュルカ・ソト細胞当り結きしており、一方ＰＢＬ−Ｔには約５０−８０，０００のｍＬＦＡ　３分子が結きしている。これらの値は平衡へｆｆＡｂ結合を用いて測定されたジュルカット細ｌＩ＆およびＰ　Ｂ　Ｉ−−Ｔ上のＣＤ２分子の相対数と一致している（Ｍａｒｔｉｎ、　Ｐ　、　ｊ　、ら、ジャーナル　オフ　イムノロジーＵ上＝１８０（１９ＦｉＯ）　、　Ｆ’　Ｉｕｎｋｅｔｔ、Ｍ　、　Ｌ　、らジャーナルオブイムノロジ−１３６４１８１（＋９８６））。非−阻害ＣＤ２．１が飽和濃度で存在しても、ジュルカリト細胞之）よびＰ　Ｂ　Ｌ、−Ｔの両方の結合パラメーターに有意には影響しなかった。

−１のｔＭｌの一口におけるミセルの　用Ｊ、、ＦＡ　３ミセル単独ではＰＢＬ −Ｔ増殖に対して何の効果も持たないが、抗−ＣＤ２ＭＡｂがサブマイトゲンとして働く濃度で存在するとＰＢＬ−Ｔの増殖を誘導できる。＋ｎ　Ｌ　Ｆ　Ａ− ３ミセル（４０％Ｍ）とＣＤ２．ＩＭＡｂの組合せは試験されたすべての供与者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対して強力なマイトゲンとして働くことが観察されたく表７）。ホルボルミリスタートアセタート（Ｐ　Ｍ　Ａ　）がいまだ最大の応答には４を要とされるが、この応答は通常（１０人の供与者の内９人）外因性Ｔ　Ｌ−２の不在下て′見られた。ｍ　Ｌ　Ｆ　、Ａ　−３ミセルおよびＣＤ２．ＩＭ　Ａ　ｂの組合せで誘導される増殖は一般的にフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）て得られるものより低いが、前ＬＦＡ−３，ＣＤ２．１およびＰ　Ｍ　Ａの組合せではＰＨＡ単独よりある供与者では２倍までチミジンの取込みが増加した。ｍＬＦＡ　３およびＣＤ２．ＩＭＡｂの組合せはまたナイロンウール濃縮Ｔ細胞に対し分裂を促進させたく表８）。

８００ｎＭの濃度までの５ＬＦＡ−３およびＣＤ２．ＩＭＡ）＋の組合せ＜　ｐ　ｈ、ｑ　Ａと件にまたは無しで）はＰ　Ｂ　Ｍ　Ｃに対し２回の実験において、十分な量の物質が含まれていても分裂促進を行わなかった２同一供与者での実験においてｍＬＦＡ　３にＣＤ２．１Ｍ　Ａ　ｂを加えると（ＰＭＡの有無にかかわらず）強い応答を示しｔ二。

１５°、−ヒト面清存在下、ナイロンウール濃縮ＰＢＬ−ＴまたはＰ　Ｍ　Ｂ　Ｃに対し、９−１および９．６／３５．ＩＭＡｂのｍ合せニヨル増殖の刺激が見られたく表８）。これらの条件下、９−ＩＭＡｂと４０％Ｍ　＋ｎＬ　Ｆ　Ａ　３の組合せではＰ　Ｂ　Ｍ　Ｃに対し丸底ウェルで行われた２つの実験のうち１つを除いて効果がなく、その場合においては外因性Ｉ　Ｌ−２により増加された比較的弱い刺激が見られたく刺激指標−１６，８対して１１　＋９．６ＭＡｂは１１０）。平底ウェル上のナイロンウール濃縮Ｔ細胞に対しては、１ｎＭＰ　ｙ、ｑ　Ａの存在下のみ輸１．−　Ｆ　Ａ　−３は９　ＩＭＡｂと協力し合う。

ある種の条件下、静止Ｔ細胞活性化についてｍＬＦＡ　３は９−１λ１Ａｂと協力とあうように、で、えるが、この活性化は＋ｏＬＦＡ−３およびＣＤ２．Ｉ　ＭＡｂの組合せにより達成されるものと比較すると非常に弱い。

（：Ｄ２．ＩＭＡｂを伴ったｒｒｌＬＦＡ−３での応答がｍＬＦＡ−３を伴った９−ＩＭＡｂの応答よりもより強くおよびより再現性があったので、前者について更なる特徴付けを行った。図７ａおよび７ｂはＬＦＡ−３およびＣＤ２．１　ＭＡｂ誘導増殖の時間変化オよび用量応答を示しているグラフである。Ｐ　Ｂ　Ｍ　ＣをｍＬ　ｐ　ｐ、−３（４０ｎＭ）＋ＣＤ２．１（１０μｙ／ｚ１）（白ぬき四角）；＋＊ＬＦＡ−３、ＣＤ２．１およびＩＬ−２（黒四角）；またはｍＬＦＡ　３゜ＣＤ２．１およびＰＭＡ（白ぬき丸）で０日から３日目に開始された１６時間パルス標識まで処理した。ｍＬＦＡ−３およびＣＤ２．ＩＭ　Ａ　ｂ＋、：ｍよるＤＮＡ合成の刺激は３日がら４日にかけて最大となった（図７ａ）。外から加えたＩＬ−２および１　ｎＭ　Ｐ　Ｍ　Ａ存在下での最適期間は各々３日目がら４日目および４日目から５日目であった、＋ｎＬＦＡ−３およびＣＤ２．１　ＭＡｂの用量応答性は他の試薬の飽和濃度存在下で決定された。Ｐ　Ｂ　Ｍ　Ｃを示した濃度のｍＬＦＡ−３で、添加物なしで（白ぬき四角）、またはＰＭＡ（１ｎＭ）（黒四角）、Ｄ２．１　（１０μｇ／ｚ１２＞、またはＣＤ２．１およびＰＭＡ（白ぬき丸）と件に処理した。ウェルは３日目に１６時間、パルス標識した。飽和ＣＤ２．１　ＭＡｂ（６７ｎＭ）存在下においては、ＰＢＭＣまたはＰ　Ｂ　Ｌ−Ｔの最大増殖は４ｎＭｍＬＦＡ −３で得られたく図７ｂ）、これは１２ｎＭのＰＢＬ−Ｔに結合するｍＬＦＡ− ３のＫｄの範囲である。外来性ＩＬ−２の存在は用量応答性を変え゛なかったがｌｎＭＰＭＡの添加により最大応答に対するｍＴ、ＦＡ　３濃度を１０倍減少させた。同様に、４０ｎＭの＋口Ｌ　Ｆ　Ａ　−３の存在下では最大応答を与えるＣＤ２．１　ＭＡｂ濃度は６．７ｎＭであるが１ｎＭＰＭＡ存在下ではただ０　、６７ｎ　Ｍが必要とされた。

ＬＦＡ−３”の　− 特表千３−５００６５９（５）、。Ｌ　Ｆ　Ａ　−３およびＣＤ２．１　ＭＡＩ）に対する増殖応答は抗−Ｌ　Ｆ　Ａ　−３Ｍ　Ａ　ｂおよび９．６Ｍ　Ａ　ｂの両者により完全に阻止された。９．６ＭＡｂはｍ　Ｌ　Ｆ　Ａ　−３のＣＤ２に対する結合を阻止するが、普通はＣＤ２．１　ＭＡｂの共マイトゲンではない（表９）。

＋ｎ　Ｌ　Ｆ　Ａ　−３およびＣＤ２．１　ＭＡｂに対すＺｒ　応Ｎ　ハｔ　タＣＤ　２５（抗−ＴＬ−２レセプターｐ５５鎖）ＭＡｂでも阻止され、それがＩＬ−２依存性であることを示唆している。ｍ　Ｌ　Ｆ　Ａ　３　オＪ：びＣＤ２．１ＭＡｂに対するＰＢＭＣまたはＰ　Ｂ　Ｌ　−Ｔの分裂促進応答には１６時間以内の細胞め′ａ集が伴われる。ＣＤ２．１　ＭＡｂ不在下ではｍＬＦＡ　３によるクラスターは見られないのて′、これｔ、グ）クラスターはｍＬＦＡ−３ミセルによる細胞の受動的凝集の結果ではありえない。

絹■　・（″ａ＋２に対するＬ　Ｆ　Ａ　−３ミセルの影響ｍＬＦＡ　Ｂめ活性化能力を評価するのに有益ないくつかのＴ細胞活性化の初期指標がある。いくつかの研究においてＣＤ２　Ｍ　Ａ　１１との組きせはＴｉ（Ｂ胞腫瘍株においてＣ’ａ　＋　２の流れを刺激できることが示されている。そこで、ジュルカット細胞およびＰＢＬ−ＴにおいてＣａ＋２移動を刺激する石ＬＦＡ−３（単独およびＣＤ２．Ｉ　ＭＡｂと組合せて）の能力を試験した。ＣＣａ＋２．］ｉ応答は１分以内に起き、単一の細胞で測定できるのでその検出はｍＬＦＡ　３ミセルの細胞表面ＣＤ２に対する結合がＬＦＡ−３の膜内Ｉ＼の挿入または異った細胞上のＣＤ２と架橋する機会もなく活性化信号を出していることを示している。ＰＢＬ−Ｔまたはジュルカット細胞に前駆体、インド−１アセトキシメチルエステルとインキュベーションすることにより蛍光団インド−１を積み込み、相対的１：Ｃａ”）ｉは（Ｃａ”　−、Ｉ　ｉの指示として異った波長（４１０ｎ＋ｎ／　４８０ｒ＋ｎ）におけるインド−１蛍光の比を用いてフローマイクロフルオリメトリーにより決定された。

＋ｎ　Ｌ　Ｆ　Ａ　３　（２４０ｎ　Ｍまで）がジュルカット細胞に加えられた場き（３０−６０秒で）１５分以内は比に何の変化も起きなかった（図９）。

同様に、ＣＤ　２．１　Ｍ　Ａ　ｂ（６７ｎＭ　）単独では（Ｃａ＋２１ｉに何の影響も与えなかった（図９）。しかしながら、ＩＴＩＬＦＡ　３およびＣＤ　２．１　Ｍ　Ａ　Ｉ）が同時に添加された堝き、（Ｃａ＋２）ｉの＠速で持続的な増加が起こりく図９）、それはＣＤ３ＭＡｂ（例えば０ＫＴ３）で見られたものと同程度の大きさく図８）であった。

同様の結果が１２０ｎＭの＋ｎＬＦＡ−３を使用したＰ　Ｂ　Ｌ−Ｔにおいても得られた。前方角度の光散乱に何の変化もなかったので、これらの実験の間の細胞−細胞相互作用の証拠は何もなかった。

（”　ａ　＋　：移動と平衝＋ｎＬＦＡ　３結合データの直接比較を可能にするため、細胞を異った濃度のｍＬＦＡ　３と３７℃にて３０分間インキュベートして平衡化し、その後ｒａ＋２移動を開始させるためＣＤ２．１　ＭＡｂを添加する（図１０）。これらの条件下（Ｃａ　＋　２　）　ｉの最大の半分に近い増加が約１．２ｎＭ　ＩＴＩＬ　Ｆ　Ａ　３で見られ、それは前記のごとく決定されたジュルカット（”：　ｌ’）　’）　／＼結きしているｍＬＦＡ−３のＫｄと非常に近い、２４０ｎＭのｍＬＦＡ−３およびＣＤ２．１ｆ＆にジュルカット細胞にイオノマイシンを添加すると（Ｃａ＋２）ｉの更なる増加が起こり、インド −１がこれらの実験においてＣａ　４２で飽和されていなかったことを示している。

それ故、ｍＬＦ、Ａ−３およびＣＤ２．１の組きせによりＣＤ２を通して運ばれ（Ｃａ＋２）ｉの増加を導く信号は＋ｎ　Ｌ　Ｆ　Ａ　−３によるＣＤ２の飽和の程度に比例しているように思われる。図１０ｂは活性化時間プロット中の３分における切片のヒストグラムを示すグラフである：０．０４ｎＭ（実線）、０．４ｎＭ（鎖線）、１．２ｎＭ（一点鎖線）、４ｎＭ（２点鎖線）および４０ｎＭ（点線）。

治−僚零ＪΣ顕Ｘノｌ灸看　タンパ　ミセルノ本発明のタンパク質ミセルは、標的分子上の特異的表面抗原の反応性を競合的に阻害するための治療に使用することができろ。特に　Ｌ　Ｆ　Ａ−３ミセルはＴリンパ球上の細胞表面ＣＤ２と高い結合活性で結きし、Ｔリンパ球の他の細胞への結合を阻害することにより治療上有益となる。

さらに、ＬＦＡ−３ミセルはＣＤ２と一緒に取込まれ、細胞表面からのＣＤ２の消失を起こす。この不可逆的取込みにより、Ｌ　Ｆ　Ａ　−３ミセルは治療上、単量体ＬＦＡ−３ＫｄのＫｄ以下にＣＤ２を過少制御する為の使用が可能となる。

塩溶液のごとき生理学的に矛盾のない担体中の本発明のＬＦＡ−３ミセルは、好適に投与され、血中に０．０４から４ｎＭのＬ　Ｆ　Ａ　−３の治療的に有効な濃度を得る。思考の血液容量、および血流からのミセルのクリアランスに依存して０．５から５０ｉｔ　ｌ？　、／ｋ　ｇのミセル／患者／日が静脈内へこの濃度を達成するために投与される。ミセルはＴ細胞の表面上のＣＤ２レセプター部位を効果的に飽和することにより機能し、それによりそれらのＴ細胞の他の細胞への結合を阻害する。この結合阻害はＴ細胞の他の細胞への結合が持続因子である疾病状態の効果を改善できる、例えば慢性関節リューマチのごとき自己免疫疾患；同種移植片拒絶：および移植片一対一宿主疾患。

他の実施態様も以下の請求の範囲内である。

表１ＣＤ　２　Ｍ　Ａ　ｂによる３ＬＦＡ−３結合の阻害兆毘詐去九乙二　徒皇■などとレロ≧ＦＡ−３住勉　■（ＣＰ　Ｍ　）対照ＭＡ　ｂ　２０，５３１　±５９６９．６　１７３　±　１７Ｔ　Ｓ　２．、／１８　１５３　±　５７９−２　１５４　±　８ＣＤ２．８　１７３　±　２９３５．１　７，１７１　±　９８ＣＤ２．９　１６４　±　５０ＣＤ　２，１　２２，８１７　±３６２９−１　２４，０９２　±８７８Ｄ６６　１６．０７３　±　７２０　Ｋ　Ｔ３　２１．３４２　±４８７ジユルカツト細胞への結合は４°０にて１時間行われた。投入カウント数は１００．０００／１０’細胞であった。活計およびａ離物は１５％ＢＳＡり・ソションを通しての遠心分離により分離された。

対照およびＯＫ　Ｔ　３を除きすべてのＭＡｂはＣＤ２に対するものである。結果は４回の決定の平均であり標準偏差とともに示されており、２つの実験を代表するものである。

蟲じ［ＴＳ２／Ｉｓ　ＣＤ２　マウス　ＩＥＧＩ　精製　１９−Ｉ　ＣＤ２　マウス　ｌ８Ｇ３　精製　３ＣＤ２．１　ＣＤ２　マウス　ＩＥＧＩ　精製または腹水　２ＣＤ２．８　ＣＤ２　ラット　ＩｇＧ２ａ　腹水　２ＣＤ２．９　ＣＤ２　ラット　ＩｇＧ２ａ　腹水　２９．６　ＣＤ２　マウス　ＩｇＧ２ａ　腹水　４Ｄ６６　ＣＤ２　マウス　ＩｇＧ２ｂ　腹水　５９．２　ＣＤ２　マウス　ＩｇＭ　腹水　６３５．１　Ｃ’Ｄ２　マウス　ＩｇＧ２ａ　腹水　７ＴＳ１７１８　ＬＦＡ−ＩＢ　マウス　ＩｇＧＩ　Ｊｆ！水　１Ｔ　Ｓ　２．／９　Ｌ、　Ｆ　Ａ −３マウス　ＩＥＧＩ　精製　１０　Ｋ　Ｔ　３　ＣＤ　３　マウス　ＩｇＧ２ａ　培養上澄　８］、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ、Ｆ　、ら、プロシーデイングオブザナショナルアカデミーオブサイエンスＵＳＡ、互ニア４Ｓ９（１９８２）。

２、○１ｉｖｅ、Ｄ、ら、ヨーロビアンジャーナルオブイムノロジー。

４　、　Ｋ　ａｍｏｕｎ　Ｍ　、ら、ジャーナルオブエクスペリメンタルメジスン・４１う３　：　２０７　（１９８１）。

５、　Ｂ　ｅｒｎａｒｄ　Ａ　、ら、ジャーナルオブエクスペリメンタルメジスン、至：１３１７（１，９８２）　。

６、　Ｂ　ｅｒｎａｒｄ　Ａ　、ら、（−ＨＤ２研究集会要旨：■型を代表する白血球（Ａ　、　Ｓ　、ＭｃＭｉｃｈａｅ１編、オツクスホード大学出版、オ・ンクスホード、＋１１０６＜１９８７））。

７、Ｍａｒｔｉｎ　Ｐ、Ｊ、ら、ジャーナルオブイムノロジー、１３１：１８０（１９８３）。

８、ＣｈａｎＨ，Ｔ、Ｗ、ら、プロシーデイングオブザナショナ／Ｌ　アカデミーオブサイエンスＵＳＡ、邦−：１８０５（１９８１）。

Ｌエジュルカ・ソト細胞および静止Ｔ細胞への１２５１−１１１ＬＦ八−３＋１７：）結合結合した＋２５１ｍ１．ＦＡ−３７１０’細胞（ＣＰＭ）兆ｉ■婁を４旦　茗り記り工Ｅ乱１　静止Ｔ細胞対照　Ｈへｂ　８２，５１３　３３．２６２＋１１１．ＦＡ−３４，４１４１，１５２ＴＳ２／Ｉｓ　ＣＤ２　ＭＡｂ　４４０　９３ＴＳ２／’９　ＬＦＡ−３ＭＡｂ　５１０　１９２結合は４°Ｃにて１時間行われた。投入された１２５Ｉ　−ｍＬ　Ｆ　Ａ−３は２００．ＯＯＯｃｐｍであった。結きおよび遊離放射活性は１５％ＢＳＡクッションを通した遠心分離により分離された。対照Ｔ　！？Ｇ　１．　、Ｔ　Ｓ２／１８およびＴＳ２／９は１０Ｔｇ／ｚｌで添加され、非標識＋ｎ　Ｌ　Ｆ　’　Ａ　３は５μ２７７ｄで添加された。結果は２回の平均で３つの実験を代表するものである。

表土１’１ＰＬＣ放出ＬＦＡ−３のジュルカットへの結合添加ｎ　５ＬＦＡ　３　＋ｎＬＦＡ−３対照ＭＡｂ　５，５５３±３８７　１４８．７６０±４００３Ｔ　Ｓ２．／１８　４，０３０±　１４５，０２３±　２３ジユルカント細胞（１０ ’）は各々５００．０００　＜　Ｐ　Ｍの５ＬＦＡ−３または＋ｎＬＦＡ　３（両者とも、ｒｙＭ！Ａ胞から調製された）と４℃にて２時間インキュベートし、一部がオイルクッションを通して遠心分離された。

結合ｍＬＦＡ−３の細胞外ＴＳ２／１８への到達性４℃対照　対照　１１，４４１±５００　１．５４３±２２５ＴＳ２／１８　対照　８６±　５　９５＋１４対照　ＴＳ２／１８　２９９ｔｈ２６　１１１±１３３７℃対照　対照　１０，９９０±９４１　１．３２６±８６７Ｓ２．／ｉｓ　対照　６７±１２８９±１９対照　ＴＳ２／１８　４，９７５ｉ４００　３９０±４３ジユルカ・ソト細胞およびＰ　Ｂ　Ｌ−Ｔ（５ＸＩＯ’）は１２５７−ｍＬ　Ｆ　Ａ−３（１００，０ＯＯＣＰ　Ｍ　）と４℃で６０分または３７℃で３０分間インキュベートされた。ジュルカット細胞およびＰＢＬ−ＴＣＤ２は最初的１０％がＬＦＡ−３で占有されていた。４℃での後−インキュベーション（ＴＳ２／１８とまたはなしで）は到達可能なＬＦＡ−３の解離を完全に保障するため６時間実施した。

データは４回の決定の平均値であり、標準偏差も示しである。

舷対照　ＭＡｂ　８，０４０ＴＳ２／１８　ＭＡｂ　３” ＣＤ２．１　ＭＡｂ　８・１２２ＴＳ２．９　ＭＡｂ　６１２投入されたカウント数は５０，０００であった。結合および遊Ｍ物は１５分以上５回洗浄して分離した。結果は２回の平均であり、３つの実験で得られた結果を代表するものである。

宍どＬｍＬＦＡ　３およびＣＤ２．１によるＴ細胞増殖の誘導緩衝液　５９３　３９２　４１７諭１．Ｆ八−３４１１６４５５４９ＣＤ２．１　４３７　８３９　６４６ＩＬ−２１，４５１２，１４５１，０３４ｔｎ　Ｌ　Ｆ＾−３＋　ＩＬ−２１，３４５１，３９９１，２８４ＣＤ２．１　＋　ＩＬ−２１，６０９２，０３９１，５４５ＰＨ＾　１，７１３　１．３８２　８３４ｍＬＦ八−３＋Ｐへ＾　１．５４９　９７８　８２８ＣＤ２．１＋ＰＭ＾　１．７０４　１．２５２　１．００９ｔｎＬ、Ｆ＾−３−１−ＣＤ２．］　２２，２９４　３５，４３９　４７．４７８ｍ１、Ｆ＾−３＋ＣＤ２．１＋ＩＬ−２２２，４９７３７，０６５４５，３８４翰ＬＦ八−３＋ＣＤ２．１＋ＰＨ＾　７７．７８４　１１４，３１３　１５３．２４０添加物は示されているごとく０日目に加えた：ｒＴＬ−２（０，１０２１，うＦ）、ＰＭＡ（１ｎＭ）、ＣＤ２．１（腹水の１　：５００希釈液または１０ｔｔｇｙ’ｚｌ＞およびｔｎｌ−Ｆ　Ａ　３　（４０ｎＭ）。ＰＨＡ（１ｔｔｇ／ｗＲ’）はこれらの実験において３日目から４日目に約８０，０００ −１００．ＯＯＯｃｐｍを与えた。ウェルは３日目に１６時間〔３Ｈ〕−チミジンでパルス標識された。結果は３回の平均値であり、１４の実験を代表するものである、ＬａｍＬＦＡ　３および９．１によるＴ細胞増殖の誘導緩衝液　２．０２９　２６２ＣＤ　２．１　３．０６６　５６５ＣＤ２．１−１−１−Ｐ　４，７４８　１．１５９９−１＋　Ｐ　Ｍ　Ａ　１０．５２０書ず＋ＬＦＡ　３　→−Ｐ　Ｍ　Ａ　２．４６３　２．０５２ＣＤ２．１＋ＩＩＩＬＧＡ　−３２６３，３２６２１，４７６ＣＤ２．１＋ｍＴ−Ｆ　Ａ　−３＋　Ｐ　Ｍ　Ａ　３３０，８６６　２１６．９３３９−１＋　Ｔ　Ｌ　−２＊　４，０７８９−１十論ＬＦＡ−３＊７，１９３　１．０７４９−１＋蹟ＬＦＡ−３＋ＰＭＡ　７７．５８２９−１−１−Ｉ＃ＬＦＡ　３＋　Ｉ　Ｌ　−２＊３４，０７４９−１＋９．６　＊１８１，５７０　４０．７６４ＰＢ八４Ｃおよびナイロンウール濃縮Ｔ細胞は異った供与者からのものである。Ｐ　Ｂ　Ｍ　Ｃの実験は１５％熱不活性化ヒト血清の存在下実施された。（４）を付けたものは丸底ウェル内で行われた。

平底ウェルでの対応する条件下ではより低い刺激しか得られなかった９添加物は０日目に加え、ウェルは３日目に１６時間パルスラベルされた。９−ＩＭＡｂは１μｇ／ｗｅで添加さコｔた：９．６ＭＡｂは１　：］０００腹水希釈物として添加された。他の濃度は図４のごとくである。結果は３回の決定の平均値て゛あり、２つの実験の代表となるものである。

表９Ｌ、　Ｆ　Ａ−３，ＣＤ２およびＬＦＡ〜１に対するＭ　Ａ　ｂによる増殖の阻害対照Ｍ　Ａ　ｂ　３５，４３９　］　１４．３１３Ｔ　Ｓ２．、、’９　１，６８４　１．１１６９．６＊７７６　６．３７５Ｐ　Ｂ　Ｍ　Ｃが使用された。すべての添加物は０日目に加えられ、ウェルは３日目に１６時間パルス標識された。この供与者に対し’９．６＋　ＣＤ２．１は５４９　ｃ　ｌ）＋ｎをおよび９．６＋ＣＤ２．１＋ＰＭＡは１６６３ｃｐｔａを与えた。ＴＳ２／９ＭＡｂはＩＯ，ｔｚｙ／ｚ？：’添加された。９．６＋１１　：５０００の腹水希釈液で添加された９すべての結果は１回の実験からの３回の決定の平均であり、３つの実験を代表するものである。

図　１）ζ　、出　叉　（ｍ乙）蔚閏（亦）Ｏ浄書（内容；こ１更なし）図　６−Ａ図　６−Ｂ鈴　本＋ｐＭ）図　７−Ａノルズ慈損〉日圃　７−８ｍＬＦＡ−３（ｎＭ）図　８ｍＬＦＡ−３ＣＤ２．１　両方国際調査報告゛“９′”０”°０°“°′″″パ゛゛″′″”　ｐｒＴＩＵ５　８９ノ０１８Ｍ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ホスファチジルイノシトール脂質アンカーを天然に含む接着性タンパク質のミセルであって、前記ミセルは細胞表面上の多数の標的分子に多価で結合できるもの。
２．約１０分子未満の前記タンパク質からなる請求の範囲第１項記載のミセル。
３．ＣＤ２を運ぶ細胞に対して結合活性を持ち、そのため前記細胞に対する前記ＬＦＡ−３のＫｄは単量体ＬＦＡ−３のＫｄよりも低い多量体、精製ＬＦＡ−３。
４．前記接着性タンパク質がｍＬＦＡ−３である請求の範囲第１項記載のミセル。
５．前記接着性タンパク質が組換えＤＮＡ技術により合成される請求の範囲第１項記載のミセル。
６．第１の細胞の第２の細胞に対する接着を阻害する方法であって、前記第１の細胞はその表面上に前記第２の細胞上に多くの型で存在する分子に結合でき、および天然にホスファチジルイノシトール脂質アンカーを含むタンパク質を持ち、前記第２の細胞と、約１０個未満の分子から成り、前記第２の細胞上の前記多数の分子と多価で結合できる前記タンパク質のミセルとを接触させることからなる方法。
７．過剰の活性化Ｔ細胞の存在を特徴とする医学状態の患者の処置のための方法であって、前記患者に生理学的に適切な緩衝液中のＬＦＡ−３ミセルを投与し、前記患者中の他の細胞に対する前記患者中の前記活性化Ｔ細胞の結合を阻害するのに有効な前記しＦＡ−３の血流濃度を達成することを特徴とする方法。
８．投与後のＬＦＡ−３ミセルの前記血流濃度が０．０４〜４ｎＭである請求の範囲第７項記載の方法。
９．天然にホスファチジルイノシトール脂質アンカーを含む接着性タンパク質の結合活性を増加させ解離定数を減少させる方法であって、前記接着性タンパク質を界面活性剤溶液に可溶化し、前記界面活性剤溶液中の前記タンパク質を濃縮し、および前記溶液から実質的にすべての界面活性剤を除去して、その中に隔離された前記疎水性タンパク質末端を持つ接着性タンパク質ミセルを形成することを特徴とする方法。
１０．前記タンパク質がＬＦＡ−３である請求の範囲第９項記載の方法。
１１．前記タンパク質が組換えＤＮＡ技術により産生される請求の範囲第９項記載の方法。
１２．末梢血単核細胞またはＴ細胞の活性化または増殖に効果を及ぼす方法であって、前記細胞をＣＤ２に対する抗体と一緒にしＦＡ−３ミセルと接触させることを特徴とする方法。