JPH03500841A - 好中球および好酸球の共通決定部位に対して特異的な単クローン性抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、前記抗体生成細胞をヒト顆粒球で免疫したマウス牌細胞とした請求の範囲１ 記載の細胞系。

４、　前記単クローン性抗体を更に他のヒト末梢血液細胞による反応性を示さな いように特徴づけた請求の範囲１記載の細胞系。

５、好中球および好酸球におけるＫＣ−４８抗原に対する抗体を生成するアメリ カン　タイプ　カルチュア　コレクションＮｏ。

ＨＢ９５８４で寄託した試料の主特性を有するハイブリドーマ技術によって生成 した細胞系。

６、ＫＣ−４８として確認された好中球および好酸球の表面における抗原に特異 的に結合する単クローン性抗体で、更に前記ＫＣ−４８単クローン性抗体が： Ａ、ヒト急性白血病細胞 Ｂ、他のヒト末梢血液細胞 に結合しなく、かつヒト骨髄における顆粒球前駆体に有意に結合しないように特 徴づけられた単クローン性抗体。

７、　マウス牌細胞をヒト顆粒球で免疫したハイブリドーマ技術によって誘導し た請求の範囲６記載の単クローン性抗体。

８、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，寄託Ｎｏ、　ＨＢ９５８６の主特性を有する雑種細胞系に よって作った請求の範囲６記載の単クローン性抗体。

９、前記ＫＣ−４８抗原を、更に抗原に適用した電気泳動方法学によって定めて １７０，０００　、１３５，０００および９９，０００ダルトンの分子量を有し 、かつ既知分子量の既知タンパク質の抗原移動に匹敵するように特徴づけられた 請求の範囲１記載の細胞系。

１０、前記方法学を還元条件下で調製した放射性同位体標識付けした顆粒球膜を 用いる抗原に適用した請求の範囲９記載の細胞系。

１１、９９，０００ダルトン　バンドが測定された３つのバンドの一番暗いバン ドである請求の範囲１０記載の細胞系。

１２、前記ＫＣ−４８抗原が、更に抗原に適用した電気泳動方法学によって定め て１７０，０００　、１３５，０００および９９，０００ダルトンの分子量を存 し、かつ既知分子量の既知タンパク質の抗原移動に匹敵するように特徴づけられ た請求の範囲６記載の単クローン性抗体。

１３、前記方法学を還元条件下で調製した放射性同位体標識付けした顆粒球膜を 用いる抗原に適用した請求の範囲１２記載の単クローン性抗体。

１４、　９９，０００ダルトン　バンドが測定された３つのバンドの一番暗いバ ンドである請求の範囲１３記載の単クローン性抗体。

明　細　書 好中球および好酸球の共通決定部位 に対して特異的な単りローン性抗体 且」［」Σ団 、　本発明は、白血球の好中球および好酸球集団に結合する単り１　ローン性抗 体を生ずるハイブリドーマ細胞系に関する。これにより、本発明は単一手順にお いて末梢血液試料がら好中球および好酸球を選択的に減少することができ、これ により存意な臨床的関連データを他の技術によるリンパ球、好塩基球および単球 の残留する白血球集団に関して誘導することができる。また、選択的に減少した 好中球および好酸球を、更に分析することができる。

ＦＪＬＪＬ玉 ヒトの循環系における末梢血液の細胞成分は主として赤血球細胞、すなわち、赤 血球、および白血球細胞、すなわち、白血球を含んでいる。白血球およびその臨 床関係の相関関係は科学社会において極めて大切である。白血球の科は好中球、 単球。

好酸球、好塩基球およびリンパ球を含んでいる。多（のこれらの細胞タイプは多 くの機能サブセットを有している。

好中球、単球、好酸球および好塩基球は、ヒト免疫系におけるこれらの主な機能 が細菌および他の微生物を食作用または摂取するために、食細胞として知られて いる。これらの細胞はヒトの骨髄において生ずる。しかしながら、これらの各食 細胞は異なる機能を有し、かつ関連するが、しかし個々の系として挙動する。骨 髄に生ずるけれども、食作用細胞は末梢血液に進入し、かつ循環する。

食細胞系の一般的な機能は、食作用を他の物質に対する免疫学的応答によって達 成する。好中球は、抗体で被覆された細菌に対する食細胞として極めて有効であ るが、抗体被覆しない細菌に対しては有効でない。好中球の主な機能は病原性（ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）微生物の局在化および死滅によるかかる微生物の侵入を 防止することである。

食細胞系における好酸球機能は、挙動において好中球の機能に類似する。試験管 内試験において、２種の白血球は同じ抗原攻撃に応答する。しかしながら、一般 に好酸球の応答は細菌の食作用および死滅によって好中球のように効果的でない 。最近の研究では、好酸球が好中球に効果的でない慢性寄生的感染に対する予防 に重要であることを報告している。

好中球は骨髄においてもっとも共通の細胞であり、かつ末梢血液においてもっと も共通の白血球である。１マイクロリツトルの正常な全白血球試料は平均５Ｘ１ ０”個の白血球を含んでおり、そのうち３，０７５個が好中球であり、１５０個 が好酸球であり、２５個が好塩基球であり、２５０個が単球であり、および１　 、５００個がリンパ球である。末梢血液における正常濃度の好中球の離脱は容認 された臨床関係を存している。それ故、しばしば「好中球増多症」と称される好 中球の高められた濃度はある疾病または物理的条件を示すと共に、しばしば「好 中球減少症ｊと称される末梢血液における好中球の減少された濃度は異なる臨床 関係を有している。好酸球の場合には、血液試料における好酸球の正常濃度以上 の増加を「好酸球増多症」と称されており、および血液試料における好酸球の正 常濃度の減少を「好酸球減少症」と称されている。好酸球増加症はアレルギー条 件、薬物過敏症反応および白血病様疾患のような臨床条件に関連する。例えば、 好酸球減少症は、しばしば前進性炎症過程と関連する。

好中球に特に結合する多くの単クローン性抗体は開発されている（レインヘルツ 氏ほかｒＬｅｕｋｏｃｙｔｅ　ＴｙｐｉｎｇＩＩ　Ｊ　＋第３巻。

ヒト　ミコロイダンス造血細胞、スプリンガーーベルラグ出版。

Ｎ、Ｙ　（１９８６）　；ジラルデト氏はかｒＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａ ｌ　Ｃａｎｃｅｒ　ＪＶｏｌ、３２　、　ｐ、１７７〜１８３　（１９８３）　 ；ベルシンステ４フ氏ほかｒ　ｔｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｌｒｎｍｕｎｏｌ ｏｇｙ　ＪＶｏｌ、１２８　＋　Ｎｏ、２　、　ｐ、８７６＝８８Ｎ１９８２年 ２月）ニスキュビッツ氏ほかｒＢｌｏｏｄ　ＪＶｏｌ、６１　＋　Ｎｏ、１　＋ ｐ、１７〜２６　（１９８３年１月）；マジジク氏ほかｒＢｌｏｏｄ　Ｊ　Ｖｏ ｌ、５８゜Ｎｏ、６　、　ｐ、１１２７〜１１３３　（１９８１年１２月））。

これらの文献に記載されている単クローン性抗体は成熟および未成熟の好中球に 対する結合特異性を示すが、しかし好中球および好酸球における唯一の決定部位 に結合しないことが示されている。

、、？ＪＪ口Ｊ示 独特の表面タンパク質抗原に対する単クローン性抗体を生ずる細胞系はヒトの末 梢血液に循環する好中球および好酸球に発現される。かかる特異的な単クローン 性抗体の検定適用からの付随的利益が得られる。

単クローン性抗体は他の白血球または他のヒト末梢血液細胞による反応性を示さ ない。単クローン性抗体は、融合に対する１つのパートナ−をヒト顆粒球の使用 による免疫感作から誘導されたハイブリドーマ細胞系によって生成する。

■　を　る　゛ 本発明の単クローン性抗体を呼称ＫＣ−４８として確認する。コーラ−およびミ ルスティン氏により報告された標準手順（’Ｎａｔｕｒｅ＊　２５６．４９５〜 ４９７　（１９７５））により、ヒト顆粒球およびマウス骨髄腫細胞によって免 疫したマウス肺臓細胞の融合から展開した。

特に、使用するヒト顆粒球を調製した。血液はヒトから静脈穿刺によって得、お よび単核細胞を顆粒球および赤血球細胞からフィコルーハイバク（Ｆｉｃｏｌｌ −Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配密度沈降によって分離した。次いで、赤血球細胞および 顆粒球を通常の技術によって分離した。顆粒球を回収し、任意の残留赤血球を低 張緩衝液で溶解した（ｌｙｓｅｄ）。免疫処理の場合、顆粒球をリン酸緩衝溶液 （ＰＢＳ）に懸濁した。

］、Ｘ１０６個のヒト顆粒球を雄のＢＡＬＢ／Ｃマウスに２週間間隔で３回腹膜 内的に注射した。３回目の注射後、１０日にして、５×１０６個の細胞で４回目 の注射を行った。４回目の注射後、３日にして、１匹のマウスの肺臓を回収し、 牌細胞を通常の技術により採集し、単細胞懸濁物を作った。

ハイブリドーマを形成する融合を次のように行った。牌細胞を血清を含まない媒 質（ｓｅｒｕｍ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ）において２個の肺細胞対１個の骨髄 腫細胞比でマウス骨髄腫細胞系５ｐ２１０−　Ａｇ１４で洗浄した。細胞をペレ ット形態に遠心処理し、４０％ポリエチレン　グリコール（１５００ＭＷ）に８ 分間にわたり３７°Ｃで懸濁させた。次いで、ポリエチレン　グリコールを除去 し、細胞をＨＡＴ媒質に稀釈し、微量滴定プレートに分布した。

培養物を２週間後注意深くふるい分けして好中球に発現された抗原と反応し、か つ好塩基球、単球、リンパ球、小板または赤血球と反応しない単クローン性抗体 を同定した。サイトスピン生成によるふるい分け（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、除 去された抗体が紫外線螢光顕微鏡の制限内で検定できる所望の特異性を示さなか った。更に、流動血球計算技術を用いる培養物のふるい分けは、顆粒球の表面に のみ発現された抗原に結合する抗体の同定に、およびかかる特異的結合能力を示 さない他の抗体の同定に成功した。最後に、単クローン性抗体を、好中球に対す る強く、かつ見かけ上の選択結合のために、他の特性について同定した。

単クローン性抗体はオフテルロニー二重拡散法によってマウス１ｇＭ免疫グロブ リンを生成することによって確めた。

本発明の実施による単クローン性抗体は、抗体に関連する試験データがＣＸ−７ ）１１２−４としての単クローン性抗体と同一であるけれども、ＫＣ−４８とし て確認している。顆粒球の細胞表面抗原はラクトペルオキシダーゼ　ヨウ素化に よって標識付けした。

ヨウ素化後、細胞をＮｏｎ　１ｄｅｔ　Ｐ−４０溶解緩衝液（ｌｙｓｉｎｇ　ｂ ｕｆｆｅｒ）に溶解し、および粒子の含まない上澄みを回収し、細胞タンパク質 を精製抗体またはイソタイプ対照（ｉｓｏｔｙｐｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ）で免疫 沈降した。ラビット　アンチ−マウス１ｇＭに接合したタンパク質Ａを用いて生 成抗原−抗体複合体を沈殿させた。次いで、試料を５〜１５％ＳＤＳ　−ＰＡＧ Ｅゲル上で電気泳動し、放射標識付けしｌこタンパク質をＸ−線フィルムで検定 した。ＫＣ−４８抗体は、１７０．０００　、１３５，０００および９９，００ ０ダルトンの分子量を有するタンパク質を還元条件下で調製したヨウ素標識顆粒 球膜から沈殿した。一番暗いバンドは９９．０００ダルトン　バンドであった。

ＫＣ−４８は血液細胞群の流動血球計算分析によって好中球および好酸球につい ての特異性であることを定めた。１つの試験において、単クローン性抗体をクー ルター　コーボレション、バイアレア、フロリダ州のエビクス＠（Ｅｐｉｃｓ） 流動血球計算器において１４６の平均チャンネルを示す、顆粒球と強く反応する ことによって定めた。１０％の正細胞（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）だけが 流動血球計算器の１４６チヤンネル以上に輝いた。相対細胞大きさにおけるゲー ）　（ｇａｔｉｎｇ）による血液細胞群の分析はＫＣ−４８抗体が血小板、赤血 球、リンパ球または単球を結合しないことを示した。ときたま、単球に対するゲ ートは少量の単球／ＫＣ−４８結合のデータを与えたが、しかしながらこの事は 光散乱による単球領域から顆粒球を完全にゲート　アウトするのに流動血球計算 器が無力であることによることが証明された。

ＫＣ−４８抗体の他の特定の結合特性を確める試験を行った。この試験では、Ｋ Ｃ−４８が好中球特性を有するＨＬ−６０として確認される骨髄性白血病細胞系 に結合することを確めた（ジラルデト氏ほかｒｌｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、 　Ｊ　３２．１７７　（１９８３）参照）。抗原の形質発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉ ｏｎ）は極めて強く、ＫＣ７４８抗体による細胞の集合は極めて明白であった。

Ｒａｊｉ（Ｂ−細胞　白血病）　、　Ｎａ１ｎ＋−１（ヌル細胞　白血病）。

Ｋ−５６２（赤血球　白血病）、ＨＥＬ（赤血球　白血病）および）１ｓＢ−２ （Ｔ−細胞　白血病）を試験し、ＫＣ−４８単クロ一ン性抗体により確認された 抗原を発現しないことを確めた。

更に、ＫＣ−４８単クロ一ン性抗体による反応性試験を、流動血球計算器を用い てＫ（−４８抗体で陽性に染色した細胞の細胞選別によって行った。細胞をその 相対螢光強さによって分離し、前方角光散乱（ｆｏｒｗａｒｄ　ａｎｇｌｅ　ｌ ｉｇｈｔ　５ｃａｔｔｅｒ）にゲートした。これらの試験では好中球および好酸 球についてのＫＣ−４８単クロ一ン性抗体の特異性を確め、ＫＣ−４８がリンパ 球、単球および好塩基球に発現する抗原に結合しないことを確めた。

ＫＣ−４８単クロ一ン性抗体で被覆した磁性微小球を用い、どんな細胞群がこの 被覆抗体によって消耗されるかを調べる試験を行った。最初に、小球を滴定して 単球のような他の食作用細胞を除去することなく好中球を最大除去するための最 適量の微小球を定めた。この滴定は他の測定についても用いた。

単クローン性抗体磁性ビーズ複合体 による末梢血液集団の減少 示差係数　対　照　ＫＣ−４８ リンパ球　２４．８　（５，０）”　７９．４　（５，７）単球　７．４　（２ ，５）　１８．０　（５，５）好中球　６３．７　（５，７）　０．０　（０， ０）好酸球　３．３　（１，２）　０．０　（０，０）好塩基球　０．７　（０ ，６）　２．０　（１，７）ａ−平均（標準偏差）、５００細胞／差ｎ＝９ 個々の試験を表１の結果に示すように行った。これらの結果はＫＣ−４８抗体被 覆磁性ビーズが他の白血球を有意に消耗しまたは結合することなく末梢血液細胞 群から好中球および好酸球を消耗することを示している。ＫＣ−４８抗原は消耗 試料中に約３倍のファクターで高められた。

ＫＣ−４８単クロ一ン性抗体を生成することのできる１例の雑種細胞はメリーラ ンド化２０８５２　、ロックビレ、パークラウンドドライブ１２３０１のアメリ カン　タイプ　カルチュア　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，）に１９８７年１１月 ６日に寄託し、Ｎｏ、　ＨＢ９５８４を指定した。

ＫＣ−４８単クロ一ン性抗体は、ヒト好中球および好酸球に対する例外的な特異 性のために独特のものである。抗体は他のヒト末梢血液細胞に対する特異性を発 現しない。抗体が好中球に対して極めて特異的であり、また好酸球により発現さ れる同じ抗原を容認するから、免疫螢光または免疫組織化学のような任意の方法 による顆粒球の検出を極めて容易にする。単クローン性抗体は、流動血球計算技 術により正常な全血液および白血病患者における好中球および好酸球の検出およ び計数することに便利である。単クローン性抗体はある白血病に対する結合に幾 分有益である。好中球および好酸球におけるＫＣ−４８抗原の強い形質発現は、 抗体をヒト末梢血液集団から好中球および好酸球を減少するのに効果的に用いる ことができ、高められたリンパ球集団の試料を他の手順により正確に数えるよう にできる。このリンパ球、好塩基球および単球集団を高めることは、特に好塩基 球に通用する場合に重要である。好塩基球は極めて少なく、全血液の細胞成分を 検出するのに困難である。それ故、好中球および好酸球を取出すことによって、 残留試料における好塩基球をあらかじめ未検出分量から高めることによって、全 血液試料中、全細胞の２．１％のように多くすることができる。

実際上、報告されている好中球と反応するすべての単クローン性抗体は好酸球に よる反応性を示さない。それ故、ＫＣ−４８抗体は独特の単クローン性抗体であ る。

国ｐＱ調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１２９３ Ａｔｔａｃｈｍｅｎセ　ｔｏ　ＰＣＴ／ＩＳＡ／２ｉ０Ｐａｒｔ　Ｉｌ、Ｆｘｅ １６ｓ　５ｅａｒｃｈｅａＣＡＳ　５ｕｂｊｅｃｔ　Ｉｎｄｅｘ、１Ｏ−ｉｌｔ ｈ　ＩＪ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．好中球および好酸球のＫＣ−４８抗原に特異的に結合する単クローン性抗体 を生成するハイブリドーマ技術によって生成した細胞系。
2. ２．前記抗体生成細胞をヒト顆粒球で免疫したマウスから誘導した請求の範囲１ 記載の細胞系。
3. ３．前記抗体生成細胞をヒト顆粒球で免疫したマウス脾細胞とした請求の範囲１ 記載の細胞系。
4. ４．前記単クローン性抗体を更に他のヒト末梢血液細胞による反応性を示さない ように特徴づけた請求の範囲１記載の細胞系。
5. ５．好中球および好酸球におけるＫＣ−４８抗原に対する抗体を生成するアメリ カンタイプカルチュアコレクションＮｏ．ＨＢ９５８４で寄託した試料の主特性 を有するハイブリドーマ技術によって生成した細胞系。
6. ６．ＫＣ−４８として確認された好中球および好酸球の表面における抗原に特異 的に結合する単クローン性抗体で、更に前記ＫＣ−４８単クローン性抗体が： Ａ．ヒト急性白血病細胞 Ｂ．他のヒト末梢血液細胞 に結合しなく、かつヒト骨髄における顆粒球前駆体に有意に結合しないように特 徴づけられた単クローン性抗体。
7. ７．マウス脾細胞をヒト顆粒球で免疫したハイブリドーマ技術によって誘導した 請求の範囲６記載の単クローン性抗体。
8. ８．Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託Ｎｏ．ＨＢ９５８６の主特性を有する雑種細胞系によ って作った請求の範囲６記載の単クローン性抗体。
9. ９．前記ＫＣ−４８抗原を、更に抗原に適用した電気泳動方法学によって定めて １７０，０００，１３５，０００および９９，０００ダルトンの分子量を有し、 かつ既知分子量の既知タンパク質の抗原移動に匹敵するように特徴づけられた請 求の範囲１記載の細胞系。
10. １０．前記方法学を還元条件下で調製した放射性同位体標識付けした顆粒球膜を 用いる抗原に適用した請求の範囲９記載の細胞系。
11. １１．９９，０００ダルトンバンドが測定された３つのバンドの一番暗いバンド である請求の範囲１０記載の細胞系。
12. １２．前記ＫＣ−４８抗原が、更に抗原に適用した電気泳動方法学によって定め て１７０，０００，１３５，０００および９９，０００ダルトンの分子量を有し 、かつ既知分子量の既知タンパク質の抗原移動に匹敵するように特徴づけられた 請求の範囲６記載の単クローン性抗体。
13. １３．前記方法学を還元条件下で調製した放射性同位体標識付けした顆粒球膜を 用いる抗原に適用した請求の範囲１２記載の単クローン性抗体。
14. １４．９９，０００ダルトンバンドが測定された３つのバンドの一番暗いバンド である請求の範囲１３記載の単クローン性抗体。