JPH03500847A - 生物の成長プロセスを調整する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物の成長プロセスを調整する方法および装置本発明は、請求の範囲第１および 第５項の記載に従った生物の成長を調整する方法および装置に関するものである 。

多くの生命工学プロセスにおいては、微生物によって消費される基質（炭素源） あるいはその他の物質（ここではこれらを「基質」と略称する）を、連続的に、 あるいはある一定の間隔をおいてくり返し反応器に加える必要がある。高収率す なわち高生産性を達成するためには、この基質添加のタイミングを微生物の変化 しやすい性質や基質の品質の変化や反応器中での濃度変化や操作パラメーター等 に適合させる様にしなくてはならない。

生物成長プロセスにおいて反応器に基質を供給する場合は、これまでは連続調整 手段、すなわち、成長プロセスの進行状況に応じて基質を連続的に供給する手段 を使用するのが常であった。

本発明の目的は、生物成長プロセスを弾力的にかつ高い操作信顧性を以って調整 することの出来る、生物成長プロセスの調整法ならびにその装置を提供すること である。

特に、本発明の方法および装置によれば基質の反応器への添加を自動制御可能で ある。

本発明の目的は、上記した様な方法および装置により、基質の反応器への供給を 比較的速い基質流速の期間と比較的遅い基質流速の期間とから成る一連のサイク ルにおいてパルス制御して行なうことにより達成可能である。成長プロセスの理 論モデルを使用して、微生物の増殖期を１サイクル中自動的に認識し、そして成 長プロセスをそれらの増殖期に応じて調整する。

本発明の１つの好ましい態様として、増殖期を、ある１つの増殖期から他の増殖 期への移行によって認識する。

基質供給のパルス変動は、成長プロセスの特性変数および（または）微生物の種 類に応じて設定する。

本発明の装置は、理論構造によって成長プロセスモデルと実際の成長プロセスの 進行状況とを比較することにより成長プロセスを調整する調整回路を有して成る 。

この調整回路は、プロセスに関連する変数を検出するセンサーと、１つのサイク ル中において理論モデル構造によって微生物の特性増殖期を検出する解析および 判定ユニットと、増殖期の進行状況に応じて供給装置からの基質の供給を調整す る調整ユニットを含んで成る。

本発明のその他の好ましい態様は、請求の範囲の他の各項に記載しである。

本発明のパルス制御された供給法により、従来の連続調整手段では全（不可能で あったかあるいは可能であったとしても困難であったことが新たに可能となりそ して種々の利益がもたらされた。すなわちそれらは下記の様なものである。

ＯｔおよびＣＯ□の排ガス濃度、ｐＨ，ＰＯ□や蛍光等の容易に検知出来る変数 を専ら使用する。

調整システムが主として１つのサイクル中の経時変数の傾向と基本的パターンと を評価するものであるから、測定精度に関しての要件が非臨界的である。

同じ様な経時パターンの変数の選択が弾力的に行なえる。

これにより、プロセスの進行中においても、例えばｐＨからＰＯ□へという様に ある変数を他の変数に変えることが可能であるから、操作信頬性がかなり上昇す る。

調整のために同時にそして実際に使用される変数の数はその特定の方法に依存す るものである。本発明の方法の特に有利な点は、非常に複雑な成長プロセスにお いても、適当に選択した単一の変数のみで普通信頼出来る調整を行なうのに充分 であるということである。しかしながら、操作の信頼性を上げるために、あるい は調整の隙の速度を速めるために、更に他の変数を使用して理論モデル構造にお けるその同時評価を行なうことも有利なことである。

下記の実施例においては最大２つの変数を使用した。しかしながらこの数は本発 明方法における限定パラメーターではない。

呼吸作用や最下成長速度の様な変動し得る生物的特性への適合。

弾力的な生物条件下での操作。

収率や特異的成長速度や細胞濃度の様な生物学的パラメーターの簡単な測定評価 。

本発明の調整手段は大規模な生命工学法においても有利に使用することが出来る 。

本発明の方法によれば、高い生産性および高収率が可能である。

本発明の具体的態様を添付の図面に示しそして下記の実施例に詳しく記載した。

次に図面について説明する。

第１図は本発明により調整された成長プロセスの模式図である。

第２〜４図は本発明の調整成長プロセスの操作の別の態様第６図は解析および判 定ユニットの基礎となる理論モデルの模式図であり、調整期を遂行する関連順序 を一緒に示しである。

第７図は解析および判定ユニットの模式的ブロック線図である。

第８図は調整ユニットの模式的ブロック線図である。

第９図はケモスタット中で酵母を培養するのに本発明の系を使用した例を示す。

第１０および１１図は供給バッチ中でパン酵母を培養するのに本発明の系を使用 した例を示す。そして第１２および１３図は２．３−ブタンジオールの供給バッ チ製造において本発明の系を使用した例を示す。

第１図に示す生命工学法において、微生物ＭＯはバイオリアクターＢＲ中で培養 される。周知の様にこの反応器はモーターで駆動する撹拌装置Ｍを有している。

例えば糖蜜の様な基質を基質ポンプＰにより供給容器■から反応器ＢＲ中へ供給 し、これは微生物により消費される。培養液ポンプＭＰにより反応器ＢＲ中のバ イオマスを吸引することが出来る。センサー要素（測定変換器）ＦｌおよびＦ２ をプロセスに関連する値をモニターする様に設置し、この測定変換器Ｆ１は、例 えば排ガス中の二酸化炭素濃度の様な変数１を検出する。

又測定変換器Ｆ２は培養液のｐＨ値の様なもの等の変数２を検出する。こうして 測定された値を調整装置Ｒへ供給する。

この調整装置Ｒは基質ポンプＰを介して基質の供給を調整する。

周知の様に、生物の成長プロセスを遂行する方法は種々の方法がある。そしてこ れらは大別すると、バッチ操作法、供給バッチ操作法、および連続又はケモスタ ットによる操作法に分けることが出来る。

バッチ操作法においては、基質はかなり高濃度のものをそのプロセスの初めに１ 回だけ発酵槽中に導入する。原則としてこのバッチ法では微生物が基質を完全に あるいは可能な限りの量を消費した時点が終点である。

供給バッチ法とは、基質を連続的に発酵槽中に導入するが但し相当量の培養液を 除去することをしない方法である。従ってこの方法では内容積が連続的に増加す ることとなる。そして供給バッチ法の場合は反応器中の基質濃度が通常は非常に 低い。

連続的あるいはケモスタット操作法とは、基質を連続的に発酵槽中に導入しそし て相当量の培養液を同時にとり出す方法であり、従って内容積は一定である。連 続操作法の場合は、反応器中の基質濃度は一般に低い。

第２〜４図に示す様に、本発明の方法においては特に作動期に図示の方法を使用 することが出来る。第２図に示した半連続調整供給バッチ又はケモスタット法（ ここでは「半連続供給バッチ又はケモスタット」を略称する）は、基質を連続的 でなくてパルス間隔を以って供給する操作態様である。しかしながらこのパルス 間隔は非常に短いので、そのプロセス自体ならびにその調整の様子は視覚的には あたかも連続的である様に感じられる。ケモスタットの場合は、通常の連続操作 と区別するために、「バルソスタント」という語句を使用する。

第３図に示した適当に制御された供給バッチ又はケモスタット法は、基質を選択 された制御機能に従ってかなり長期間の間（開ループ期）調整シスを介在させる ことなく連続的に添加する操作態様による方法である。この方法ではこの後で基 質流がわずかの間中断する。この両方の期間を合わせてパルス期を形成するもの であり、ここではこれを「サイクル」と称する。後述する様に、この両方の期間 ともに理論モデルによって調整装置中でモニターされる。従ってこの調整は培養 の限界の程度を認識して、これにより次のサイクルの流速を再計算することが出 来る。従ってこの開ループ制御機能はプロセスの実際の進行状況に周期的に適合 させる様にする。

ケモスタットの場合には、通常の連続操作から区別するために、ｒ半連続ケモス タット」の語句を使用する。

第４図に示した自動反復バッチは、いくつかのバンチサイクルを経時的に次から 次へと遂行する操作態様のものであり、この場合、１つのバッチサイクルの終り に、短い時空間に基質を添加することによりその基質濃度を再度高レベルに調節 しておく。こうして培養物はかなり長期間にわたりそしてそれが再び基質限界と なるまでの間成長する。この雨期間を一緒にしてパルス期間を形成する。又後述 する様に、これらは調整装置により決定されるものである。従って調整系は培養 物の限界点を認識し、そして次のサイクルのための新たなる基質の添加を指示す ることが出来る。添加される基質の量は各回ともに一定であっても良く、あるい は調整装置によりプロセスの進行状況に合わせて変えても良い。

従ってこの反復バンチ法においては、調整の結果基質が反応器に周期的に加えら れることになる。しかしながら、これに加えて、新たなる基質の添加の前に一定 量の培養液を反応器からとり出すことも出来る。そしてこの除去は培養液ポンプ により単に排出するか、あるいは別の適当な手段により行なっても良い。又この 操作は、各サイクルにおける反応器中の培養液の体積が同じであるか、あるいは 予じめ定められたパターンに従う様に、調整ユニットにより制御されるものであ る。

しかしながら、このプロセスを行なうための図示した方法は通常、基質を一連の サイクル（Ｚ）に従ってパルス様にくり返しバイオリアクターＢＨに添加する本 発明の調整手段を有している。１サイクルすなわち１パルスサイクル（第２〜４ 図）は、基質流がかなり高い値を有する第１ピリオドＴ１と、基質流が比較的低 い値を有するひき続いての第２ピリオドＴ２とから成る。特殊な態様として、基 質流を各ピリオド間に完全に止めることも可能である。２つのピリオドの間の経 時的流速のパターンは後述する様な調整法によって決定する。（ＴＩと７２）と に対する（Ｔ１）の比（Ｔ　１　／Ｔ　Ｉ　＋Ｔ２）は走査比（パルス反復比） と称され、そしてＴ１とＴ２の合計はパルスサイクルのピリオドと称される。Ｔ １とＴ２のピリオドの大きさの順序は、生物系の要件、プロセスを行なう上での 所望の態様、ならびに所望の調整特質等に従って決定される。従ってこれらの大 きさの順序は調整のための設定パラメーターでもある。第２〜４図に示した方法 を行なう種々の態様に関連する数値は次の通りである。

半連続調整供給バッチ： Ｔ１、Ｔ２は分ないし１０分単位の変動幅。

半連続調整ケモスタット（パルス反復比）：Ｔ１、Ｔ２は分ないし１０分単位の 変動幅。

適当に制御された供給バッチ： ＴＩは時間単位、Ｔ２は１０分単位の変動幅。

適当に制御された（半連続）ケモスタット：Ｔ１は時間単位、Ｔ２は１０分単位 の変動幅。

反復バッチ： Ｔ１は秒ないし分単位、Ｔ２は時間単位の変動幅。

実時間は、与えられた時間における制御系（バイオリアクターおよび培養物）の 動的応答に関連した調整により決定され、そして与えられた時間よりも長くても 又は短かくても良い。

１サイクルＺの間、培養物は種々の成長期を変遷する。１つの成長期は培養物の ある特定の代謝活性期のことである。

そしてそれぞれの成長期は各々の主たる代謝反応に従って、例えば基質を消費し てバイオマスを生産する反応あるいは生成物を合成する反応、あるいは高度な呼 吸作用を共なう酸化的代謝、あるいは低度な呼吸作用を共なう発酵的代謝、ある いは細胞構造を維持する代謝、あるいは変更された発酵条件に対する代謝適合、 等に従って区別される。そして特定のプロセスにおいて起る実際の成長期は、そ のプロセスを行なう特殊な方法として使用した微生物に依存するものである。こ こに述べた調整の概念の場合には、少なくとも２つの成長期が起り、すなわち、 １つは多い基質供給での代謝であり、もう１つは少ない基質供給あるいは不充分 な基質供給における代謝である。

培養物の各主要成長期には基本的に１つの調整遂行期（ｔｌないしｔ５、第６図 ）がある。調整構造を簡明にするために、いくつかの成長期を単一の調整遂行期 として表わしても良い。又逆に、変数評価を筒素化するために、又は調整操作信 頼性を高めるために、又は調整の仕方を改善するために、いくつかの連続した調 整遂行期を１つの成長期とすることも出来る。

又それぞれの成長期は代謝活性やそこで行なわれる特殊な反応等によって異なる から、各成長期は代表的な変数パターンを持つことになる。従って、成長期は原 則として変数により認識されそして決定される。

例えば、酵母生産からの代表的な例は次の通りであると考えられる。

グルコース基質上の定義「酸化的代謝」＝成長期「強グルコース限定」。

特異的酸素吸収速度は速くて、特異的二酸化炭素生産に等しい。呼吸指数＝１゜ エタノール基質上の定義「酸化的代謝」−成長期「エタノール成長」。

特異的酸素吸収速度は速く、そして特異的二酸化炭素生産は低い。呼吸指数は１ 未満。

グルコース基質上の定義「発酵的代謝」−成長期「グルコース過剰」。

特異的酵素吸収速度は遅く、そして特異的二酸化炭素生産は高い。呼吸指数は１ より大きい。

しかしながら、本発明の調整法においては、調整遂行期を決定する成長期は変数 によって直接認識されるのではなく、それらの動的応答により認識されるのであ る。

プロセスの理論モデルにより、本発明の調整法では１つの成長期から次の成長期 への移行を認識し、そしてその成長期自体は１フの成長期から他の成長期への移 行期と称される。

この調整構造において使用されるモデル構造は、通常の変数の決められたモデル パターンを与えられた種々の決められたモデル期構造から成るものである。

本発明の調整プロセスにおいては、種々のモデル構造を次々と各期毎に走査し、 そして現実の通常の変数パターンと比較する。この比較の結果、成長期は動力学 的に認識されこうして調整遂行期が決定される。そしてこの結果から調整装置に より次のサイクルの走査速度（パルス反復速度）、期間（ピリオド）およびポン プ速度が算出される。こうして経時のポンプ速度ＰＲの変動が決定される。ポン プ速度ＰＲ（これは瞬間流速とも称される）は、特定の時期に単位時間当り発酵 槽に添加された基質の量であり、例えばＰ／時又は８７時の様な適当な物理単位 で表わされる。経時調整の出力量（補正変数）はこの瞬間流速である。

しかしながら、使用する理論モデル構造／調整遂行期の数は、複雑な成長プロセ スならびに付加的な安定性チェックの範囲に依存するものであると言わねばなら ない。本文中に記載した以外の方法では、理論モデルや規則の数や又それに共な う種々の成長工程の数を広げたりあるいは狭くしたりすることが必要であろう。

従って規則の数は本発明方法においては固定パラメーターではない。

次に本発明の調整系を第５図に示したブロック線図を参照して詳しく説明する。

使用する成長プロセスの性質に応じて、交換器により供給される変数は変数選択 手段ＭＳにより選択することが出来る。

選択した変数は測定値解析および予備処理ユニッ）ＭＢにおいて正規化され、そ して平均値を見つけ出す。これらの正規化された測定値および見出された平均値 を解析および判定ユニッ）ＡＢに供給する。理論モデル構造の補助の下で、この 解析および判定ユニットは１つの成長期から次の成長期への移行を認識し、そし てこれにより１サイクルの各期間とそれぞれの成長期の持続期とを決定する。各 期間は調整遂行期の持続期間であり、従ってそれぞれの成長期は調整遂行期を有 することになるので、該期間は成長期の持続期間、すなわち遂行期によって表わ される成長期群を有することになる。

理論モデルにより１つの成長期から次の成長期への移行から決定された期間は調 整ユニットＲＢへ供給される。

調整ユニットＲＢは、基質ポンプＰ（位置１）のポンプ速度ＰＲ用に設定される 新しい値をこれらの期間から算出する。

基質ポンプＰは調整系の調節要素を形成する。しかしながらこのポンプの代りに 、流速に影響を与える様な他の装置を考えることも出来る。調整の出力信号に相 当する調節要素の作動信号とその調節要素の出力信号との関係を、調節要素の特 性曲線から見つけ出す。例えば、反復バッチ法の場合の様な非常に短かい基質パ ルスを望む場合には、例えば供給容器を空にすることにより特定量の基質を突然 反応器ＢＲに加える様な、不連続調節要素を使用することも出来る。バイオマス および特異的成長速度（μ）、すなわちバイオマスにおける増加を決定するため に、バイオマス測定あるいは判定装置ＺＭを調整ユニッ）ＲＢおよび変数選択手 段ＭＳの間に配置することが出来る。

このバイオマス測定又は判定装置ＺＭは変数選択手段ＭＳにより選択された変数 を考慮に入れて該バイオマスおよびバイオマスにおける増加（μ）に関して計算 されそして決定された値を調整ユニットＲＢへ供給する。この計算および決定プ ロセスの間、バイオマス測定又は判定装置ＺＭは又ポンプ速度ＰＲ又は流速をも 考慮に入れる。

調整系の個々のユニットについて次に詳しく説明する。

解析および判定ユニット。

解析および判定ユニットＡＢを形成するマイクロプロセッサ−制御コンピュータ ーは、プロセスの異なる成長期におけるプロセスパターンの理論モデルを表わす 理論規則の形の理論構造を有して成る。これらの理論モデルにより、調整系は１ つの成長期から次への移行を認識する。第７図に示す様に、そうする内に、プロ セスの開始の理論規則すなわち理論構造（バッチルール）と調整された、すなわ ち作動する操作の規則あるいは理論構造（操作工ないし５）との間の基本的区別 がなされる。

第６図に示した解析および判定ユニッ）ＡＢの筒路線図は作動操作の理論構造の みを含んで成る。この構造は第７図により詳しく示した。

理論モデルは例えばプロセスの開始用の４つの理論構造のバラチェないしバッチ ４と、作動状態用の５つの理論構造の操作工ないし操作５から成っている。しか しながら理論構造の数はプロセスの特質に依存するものである。理論構造の背後 の規則を次に更に詳しく説明しよう。これらの理論構造は基本的にモデルに従っ て生物成長プロセスの特異的成長期を描くソフトウェア構造である。この理論構 造のバッチ１ないしバッチ４および操作ｌないし操作５は１つのサイクルにおい て次から次へと調べられ、そしてこの様にして成長期の個々の期間ならびにそれ と共に調整期の持続期間が決定される。

変数の値による成長期の記述に対して、理論モデルのこれらの理論規則は１つの 調整期から次への移行を限定しそしてこれにより又その調整期自身をも限定する 。この様に解析および判定ユニットＡＢは１つの成長期から次の成長期への移行 を認識する。

個々の理論構造バラチェないしバッチ４および操作工ないし操作５の基礎となる 理論指定命令（ここでは「規則」を略称する）を以下に詳しく説明しよう。

構造のバラチェないしバッチ４はバッチプロセスの時間ｔＢ１ないしｔＢ４、す なわち該プロセスの開始時間を確認する。構造の操作１ないし操作４は調整操作 における時間ｔ２１ないしｔ２４を確認する。調整期５の持続期間Ｔ１は基質流 が高い値を有する期間である（第２図）。調整期工ないし４の合計、すなわち時 間ｔ２１ないしｔ２４の合計は基質流が低い値を有する時間Ｔ２である。

経時調整の実行は従って、ポンプ速度ＰＲを低速値から高速値に、あるいはその 逆に変えなくてはならない時期を認識する分析および判定ユニットＡＢの結果と して、このユニットＡＢにより制御されることとなる。

図示した場合においては、この調整を１サイクルＺの間に２回行なっている。期 間１ないし４を遂行すると、時間ｔ２１ないしｔ２４に基づいて適当に再計算さ れた値を持つ基質流速が期間５の初期において活性化される。又期間５を遂行す ると、すなわち期間Ｔ１の経過の後には（第２図）、低い基質流速がこの調整期 ５の終期に開始される。

しかしながら、解析および判定ユニッ）ＡＢは、警告状態が検出された場合は１ サイクル中に再び作動してポンプ速度を変更することが出来ることに留意しなく てはならない。

指示した規則において、定数ＩＮＩＭＩＢ１　ＩＮ２ＭＩＢ、ＩＮＩ　ｌＮＣ５ ＩＮＩＭＩＮ、ＩＮ２ＭＩＮ、ＩＮＩＬＩＭ。

ｉＮ２ＬＩＭ、、ＴＩＭＬＩＭ、ＴＩＭＭＩＮおよびＫＴＩならびにＢＡＩＡＫ ＴないしＢＡ４ＡＫＴおよびＢＥＩＡＫＴないしＢ　Ｅ　４　ＡＫＴは調整設定 パラメーターである゛。これらにより本発明の調整法を特殊なプロセスの変数の 特異パターンに適合させることが出来る。

バッチ操作から供給バッチ又は連続操作（ケモスタット）への移行は、最初に基 質限定を開始するちょうどその時に基質流のスイッチを入れることにより行なう 。原則としてこの移行はパルスサイクル中の通常の再入力に相当し、従ってパル ス操作に使用したのと同じ解析および判定ユニットにより認識可能である。実際 には、別の解析および判定ユニットを最初の入力用に使用することがしばしばよ り有利である。従ってこの後者のユニットは、例えば規則のバッチ１ないしバッ チ４の様なバッチ作動を信頼性をもってモニターし得る様な特異的な理論構造を 含有していても良い（第７図）。

プロセスの終点の条件は、特異的な反応器内体積の達成、あるいは流速又は特異 的な反応器内濃度の達成であれば良い。

又簡単な時間の条件はプロセスの終点を限定するものとじても可能である。

成長期から生産期への自動移行の一般的な基準を与えることは可能でない。これ は使用する微生物に著しく依存するものである。しかしながら解析および判定ユ ニシトはこの工程を自動化し得る様な情報を提供する。しかしながら、このプロ セスの理論モデルはこの場合付加的な規則により相応に拡大されなければならな い。例えば、この移行は簡単な時間条件により、あるいは発酵槽中の特異的濃度 の達成により限定することが出来る。個々の場合、例えば酵母プロセスの場合、 その成長期および生産期は又バッチ操作および供給バッチ操作と一致する。

バッチとしてのプロセスの開始の際の規則：バッチ期１：第１基質上での成長。

規則バッチ１：第１基質上での成長から誘導期への移行。

調整期の開始時間の確認。

ＢＡＩＡＫＴがＯ（ゼロ）の場合、 ｔＢ１＝ｏに設定し、そして規則バッチ２を作動させる。

あるいは又、正規化された値１がＩＮＩＭＩＢになるまで待あるいは又、基質流 を手動操作に切り換えて、次いで、ｔＢ１＝（実時間−開始時間）であることを 確認して規則バッチ２へ移行する。

バッチ期２：誘導期 規則バンチ２：誘導期から第２基質上での成長への移行調整期の開始時間の確認 。

ＢＡ２ＡＫＴがＯの場合、 ｔＢ２＝ｏに設定し、そして規則バッチ３を作動させる。

あるいは又、（実時間−開始時間）がＫＴＩＭ２ＸｔＢ１よりも大きくなるまで 待つ。

あるいは又、正規化された値２がＩＮ２ＭＩＢとなり、又は基質流を手動操作に 切り換えて、次いで、ｔＢ２＝　（実時間−開始時間）であることを確認して規 則バッチ３へ移行する。

バッチ期３：第２基質上での成長 規則バッチ３：第２基質上での成長から代謝維持又は制限への移行。

調整期の開始時間の確認。

ＢＡ３ＡＫＴが０の場合、 ｔＢ３＝ｏに設定し、そして規則バッチ４を作動させる。

あるいは又、スライドする平均値に基づく正規化された値１がＩＮＩＩＮＣにま で上昇するまで待つか、あるいは又正規化された値がＪＮＩＭＩＮに下降するか 、あるいは又基質流を手動操作に切り換えて、次いで、ｔｂ３＝（実時間−開始 時間）であることを確認しそして規則バッチへ移行する。

バッチ期４：限定 規則バッチ４：バッチ操作から調整操作への移行、安全走査および移行条件。

プロセス終点条件に到達したら、そのプロセスを終了する。

あるいは又、調整期の開始時間を確認する。（実時間−開始時間）がＴＩＭＬＴ Ｍより大きくなるまで待つ。

次いでＢＡ４ＡＫＴがＯとなったら、ｔＢ４＝ｏに設定し、そして調整期５を作 動する。

あるいは又、正規化された値がＩＮ２ＭＩＮとなるまで待つ。

あるいは又基質流を手動に切り換えて、次いで、ｔＢ４＝　（実時間−開始時間 ）であることを確認しそして規則バッチ５へ移行する。

反復バッチ、供給バッチ又はケモスタットとしてのプロセスの自動（調整）操作 の規則： 調整期１：第１基質（過剰基質）上での成長規則操作１：第１基質上での成長か ら誘導期への移行。

調整期の開始時間の確認。

Ｂ　Ｅ　Ｉ　ＡＫＴがＯの場合は、 ｔ２１＝０に設定しそして調整期２を作動させる。

あるいは又、正規化された値１がＩＮＩＭＩＮとなるのを待あるいは又、基質流 を手動操作に切り換えて、次いで、ｔ２１＝（実時間−開始時間）であることを 確認しそして調整バッチ２へ移行する。

調整期２：誘導期 規則操作２：誘導期から第２基質上での成長に移行。

調整期の開始時間を確認する。

Ｂ　Ｅ　２　ＡＫＴがＯの場合は、 ｔ２２＝ｏに設定しそして調整期３を作動させる。

あるいは又、（実時間−開始時間）がｔ２ＸＴＩＭＭＩＮより大きくなるまで待 つ。

あるいは又、基質流を手動操作に切り換え、そして次いで、ｔ２２＝（実時間− 開始時間）を確認しそして調整期３へ移行する。

調整期３：第２基質上での成長。

規則操作３：第２基質上での成長から代謝維持への移行。

調整期の開始時間を確認する。

ＢＥ３ＡＫＴがＯの場合は、 ｔ２３＝ｏに設定しそして調整期４を作動させる。

あるいは又、スライドする平均値に基づく正規化された値１が１ｌｌｌＮｃとな るのを待つ。

あるいは又、スライドする平均値に基づく正規化された値１がＩＮＩＬＩＡとな るのを待つか、 あるいは又、基質流を手動繰作に切り換え、そして次いで、ｔ２３＝（実時間− 開始時間）であることを確認して、調整期４へ移行する。

調整期４：限界。

規則操作４：限界から第１基質上での成長への移行。高速基質流に切り換える。

調整期の開始時間を確認する。

ＢＥ４ＡＫＴが０の場合、 ｔ２４＝ｏに設定しそして調整期５を作動させる。

あるいは又、正規化された値ｌがＩ　Ｎ　Ｉ　Ｌ　Ｉ　Ｎとなるまで待つ。そし て（あるいは）又（実時間−開始時間）がＴ　Ｉ　Ｍ　ＬＩＭより大きくなるま で待つか、 あるいは又、基質流を手動操作に切り換える。

そして次いで、ｔ２４＝（実時間−開始時間）であることを確認しそして調整期 ５へ移行する。

調整期５：基質流の入力期ならびに第１基質上での成長期の達成をモニターする 。

規則操作５：限界から成長への移行。

プロセス終点条件が満足されたならば、そのプロセスを終了する。

あるいは又、Ｔ２＝　（ｔ２１＋ｔ２２＋ｔ２３＋ｔ２４）を確認しかつ調整期 の開始時間を確認する。

次いで正規化された値１がｒＮＩＭＩＮにまで上昇しそして正規化された値２が ＩＮ２ＬＩＭにまで下降するのを待つか、あるいは又、基質流をピリオドｔｌｌ に切り換えるか、あるいは又、この調整期を手動操作により終了させる。

測定値条件が満足されていなく、そしてこの調整期が手動操作により終了しない 場合には、警告を発するか、あるいは基質流を増加させるか、 あるいは数値チャンネル（センサー）を変更するか、して、そして次いで調整期 ５をくり返す。

あるいは又、ＴＩ＝（実時間−開始時間）であることを確認しそして調整Ｍ１へ 移行する。

調整ユニット。

調整ユニットＲＢを形成するマイクロプロセッサ−制御コンピューターユニット は、各サイクルの開始時におけるポンプ速度開始値を算出する機能を有する第１ の理論構造Ｌ１から成っている（期５）。この目的のために、分析および判定ユ ニットＡＢにより決定された期間を理論ユニットＬ１に供給する。後者は又、期 間および走査比（パルス反復速度）の設定値又は設定値プロフィールも計算する 。

又別の理論構造Ｌ２およびＬ３は、分析および判定ユニットにより決定された期 変更からポンプ速度プロフィールを決定する作用を有する。これらの期変更は再 計算された値を存する高速基質流速度の作動を共なう期４から期５への移行、な らびに低速基質流速度の作動を共なう期５から期４への移行である。こうして理 論構造Ｌ２およびＬ３は第２〜４図に従ってポンプ速度ＰＲのパルス波型を選択 する。

パルス波型は使用する微生物あるいはプロセスの瞬間操作状態に関してパルスサ イクルの持続期間に従って選択される。

パルスパターンは経時変化する基質要件ならびに微生物の成長速度に適合させな くてはならない。しかしながら、短パルスサイクルＣ分単位の変動幅）の場合に は、プロセスを簡素化するために、一般に矩形パルスを使用することも出来る。

培養物が指数成長する場合には、下記の様な形のパルスＰｅｘｐ（Ｔ−Ｔ　Ｏ） 　＝　ａ　ｘ　ｅゝＸ　（Ｔ−ＴＯ）（ここに０＜Ｔ−ＴＯ＜ＴＩ−ＴＯである ）が望ましく、又、一方立線成長（例えば、酸素限定）の場合は、 Ｐｌｉｎ（Ｔ−ＴＯ）　＝ｃ　ｘ　（Ｔ−Ｔｏ）　＋ｄが望ましい。ここにパラ メーターａおよびｄは、基質流のスイッチを入れた時のパルス波型の高さを表わ す。この高さは調整ユニットにより決定される。パラメーターｂおよびＣはサイ クル内の基質流の増加を意味する。Ｍ単のために、これらは一定値としても良い 。しかしながら、これらは培養物の成長速度に自動的に適合させる欅にした方が より好ましい。

培養物の特異的成長速度（μ）は数学的モデルによる細胞濃度の直接測定による か、あるいはその流速から間接的に計算することが出来る。後者の場合に、簡単 のために成長の化学量論量を一定にして、下記の式があてはまる。

これからパラメーターｂおよびＣは次の通りとなる。

ｂ−μ 経時のμの傾向（最後に計算されたあるいは測定された値から決定したもの）に 基づいて次のパルスサイクルのμを推定しそしてこの推定値をｂおよびＣの決定 に使用することによってプロセスの改良をすることが出来る。

パラメーターａ、ｂ、ｃおよびｄについてぞれぞれ別の値を有する相応するパル ス波型を調整期Ｔｌ＜Ｔ＜７２において使用することが出来る。しかしながら、 例外としてａ＝ｂ＝ｃ＝ｄ＝Ｏすなわち、基質流のスイッチを切った状態に設定 することも出来る。

パルス波型の選択は調整期の設計時に即時に行なう。しかしながら、プロセス中 での自動的な選択又は時間制御された選択により実現することも可能である。

詳しくは調整ユニットＲＢにおける工程は基本的に次の通りである。

調整期５に到達するまで、すなわち規則バッチ４又は規則操作４が完了するまで 待つ。それぞれ期待間ｔＢ１ないしｔＢ４およびｔ２１ないしｔ２４．によびＴ ｌからポンプ速度を設定するための新たな値を決定する。

規則操作５が完了するか、 あるいは規則操作５の警報条件が現われるまで、所定のパルス波型に相当する高 流速を有するポンプ速度のプロフィールを実施する。この場合流速を高めそして この調整期をくり返す。

規則操作４が終了するまで所定のパルス波型に相当する低流速を有するポンプ速 度のプロフィールを実施する。全工程を（り返す。

上記した様に、経時調整は解析および判定ユニットにより該ユニットがポンプ速 度を低速値から高速値に、あるいはその逆に切り換えなくてはならない丁度良い 時点を認識する様に制御される。

培養物の特異成長速度（μ）又はバイオマス（Ｘ）も又計算される。

最初に説明した様に、平均流速、すなわちあるサイクルの特定時間のポンプ速度 は期待間Ｔ１およびＴ２により、すなわち走査比（パルス反復速度）により、そ して（または）２つの時間ピリオドＴ１およびＴ２におけるポンプ速度ＰＲの値 により設定することが出来る。この場合、期待間は解析および判定ユニットＡＢ の出力変数である。ポンプ速度ＰＲはその場合の期待間ＴＩおよびｔ２１ないし ｔ２４に依存した調整出力変数である。

この調整は、別個の期待間ｔ２１ないしｔ２４でなくてその合計Ｔ２を数えるご とにより簡素化することが出来る（第７図）。従ってこの調整を特殊な方法で実 現するものとして次の様な操作態様が可能である。

サイクル当りの平均流速をポンプ速度および時間ＴＩを変えることにより設定す る。時間Ｔ２は解析および判定ユニットに由来する。系の調整変数は走査比（パ ルス反復速度）又は時間Ｔ２である。相当する設定値は一定であるか、又は予じ め定められたパターンに従う。

流速をポンプ速度ＰＲを変えるだけで設定する。時間Ｔ２は解析および判定ユニ ットから知られる。系の調整変数は走査比（パルス反復速度）又は時間Ｔ２であ る。相当する設定値は一定であるか、又は予じめ定められたパターンに従う。

平均流速を時間Ｔ１を変えるだけで設定する。ポンプ速度は予じめ設定されたパ ルス曲線上のままとする０時間Ｔ２は解析および判定ユニッ）ＡＢから知られる 。系の調整変数は走査比（パルス反復速度）である。相当する設定値は一定であ るかあるいはあらかじめ定められたパターンに従う。

調整特性は下記の様な設計パラメーターの結果、非常に多種の要件に適合可能で ある。

制御増幅は、安定性および固定動作、走査比（パルス反復速度）と操作条件の均 一性、ピリオド持続期間と反復適合性を共なう直接調整から制御への操作モード 、パルス波型と生物系への適合性と操作モード、および期の作動／不作動と種々 の微生物および生成物の適当性に影響を与える。

次に本発明の系の使用例を第９〜第１３図を参照しながら詳しく説明する。

実施例１ ケモスタット中での酵母培養。

嫌気性連続アルコール生産においては、古い細胞は絶えず新しい細胞に再生させ るか又はこれと取り換えられなくてはならない。この場合は２工程プロセスが必 要となり、すなわち、細胞を手短かにアルコール生産工程から除去して好気性成 長工程で再生するか、あるいはその上流に設置した細胞生産工程から新鮮な細胞 を連続的に供給することを行なう。そして後者の方法の場合には高い細胞濃度と 高い細胞生産性と細胞の完全な酵素バランスとが望まれる。これらの要件は本発 明のシステムにより希釈速度を調整することにより満足させることが出来る。測 定される変数は培養液のｐＨであった。

第９図はケモスタット培養のピリオドの実験結果を示し、ＰＨはｐＨ値、ＢＴは 乾燥バイオマス濃度、ＶＤは希釈率、ＴＶはパルス様基質供給の際の走査比（パ ルス反復速度）である。細胞濃度の上昇を共なう開始期の非定常成長期の後に、 本発明の調整は高い希釈率や細胞濃度での洗い流しの危険を共なうことな（安定 操作で行なうことが出来る。この様な調整手段を使わなければ、複雑な細胞再循 還操作により同様の作業を行なわなくてはならない。

実施例２ 供給バッチにおけるパン酵母の培養。

パル酵母発酵における基質供給の最適調整は、これにより酸化的成長から発酵成 長への臨界的移行点の範囲においてその代謝が保持される様にするものでなくて はならない。これは通常非常に費用がかかるものでありそしてこの様な調整手段 としてのエタノール濃度のオンライン測定、呼吸係数の算出のための排ガス値の 正確なバランス測定あるいはモデルを利用した工程の使用等は工業的に実用化さ れにくくなっている。

本発明のシステムによれば、ｐＨ値および排ガス中の二酸化炭素の測定をするだ けでその様な調整が実現可能である。

酵母の代謝は非常に複雑であるので、１サイクル中に５つの全ての調整期を考え に入れなくてはならない。第１０および１１図は実験的に得られた結果である。

第１０図は溶存酸素濃度に加えて、更に乾燥バイオマス濃度ＢＴ、特異的成長速 度μおよびバイオマス収量ＺＡのオンライン推定結果を示す。測定値と良（対応 した数値を得ることが可能であった。第１１図は実流速および平均流速（ＰＲ， ＭＰＲ）　、液相体積ＦＰおよびパルス反復速度ＴＶの各曲線を示す。

プロセスはバッチ式に開始する。この系はバッチ式１程の部分の終了を認識しそ して次いで供給バンチ操作を開始し、その際それ自身は培養物の即時成長活性に 自動的に適合する。

成長は最初は指数的であるが次いで酸素限定の開始と共に直線的変動とな乙。に もかかわらず、全コースを通じて調整することにより、エタノール濃度の増加を 共なうことなく高い収率と生産性とを達成することが出来そしてこれらは非常に 高い細胞濃度になるまで維持される。

このパルス操作によりわずかに発酵的な成長と完全に酸化的な成長とが連続的に 交互に起る様になり、そして又エタノールはその際基質とじてに機能する。更に 又パルス反復速度およびパルス持続期間を適当に変えることによって、酵母細胞 の性質（例えば、たん白金有量）を所望の様に変えることも出来る。

実施例３ ２．３−ブタンジオールの供給バッチ製造農業廃産物や天然原料から高品位の化 学物質を抽出する分野においては、ブタンジオールの製造は重要なプロセスであ る。この場合基質濃度が高いと成長および生成物の産出が阻害されるので、くり 返し基質供給をしながら、あるいは供給バッチ式にプロセスを遂行する方法がこ の場合にも望ましい。

さらに又、微好気性条件下のみで高い生産性を達成することが出来る。第１２図 は、本発明方法による調整供給バッチプロセスの流速（ＰＲ，ＭＰＲ）　、液相 体積（Ｆ　Ｐ）および走査比（パルス反復速度）（ＴＶ）についての実験結果を 示す。問題の生物を使用しての調整の際に成長期２を考慮に入れる必要はない。

培養物への基質の供給は、酸素限定の程度や微生物の発酵活性により決定される 実際の要件に自動的に適合する。この場合に調整に使用する変数は排ガス中の二 酸化炭素濃度ＣＯである。これは第１３図に呼吸係数Ｒと生成物濃度ＰＫと一緒 に示しである。７０　ｇ　／　ｆ以上の溶媒濃度が達成された。

記号リスト ＢＲバイオリアクター ＭＯ微生物 Ｍ　撹拌装置 Ｐ　基質ポンプ ■　貯蔵容器 ＭＰ　培養液ポンプ Ｆｌ　変換器変数１ １　変数１ Ｆ２　変換器変数２ ２　変数２ Ｒ調整装置 Ｚ　サイクル Ｔｌ　高基質流ピリオド Ｔ２　低基質流ピリオド Ｌ１〜ｔ５　調整遂行期（成長期） ＰＲポンプ速度（実流速） ＭＳ　変数選択手段 ＭＢ　測定値解析および前処理ユニットＡＢ　解析および判定ユニット ＲＢ　調整ユニット ＺＭ　バイオマス測定装置 μ　特異成長速度 Ｘ　バイオマス バッチ１〜バツチ５　プロセス開始の理論構造操作１〜操作５　作動操作の理論 構造 ｔＢ１〜ｔＢ４　バッチの期待間 ｔ２１〜ｔ２４　作動操作の期時間 期１〜期５　調整期 Ｌ１〜Ｌ３　調整ユニットの理論構造 ＰＨｐＨ ＢＴ　乾燥バイオマス濃度 ＶＤ　希釈速度 ＴＶ　走査比（パルス反復速度） ＯＸ　溶存酸素濃度 ＺＡ　バイオマス収量 ＭＰＲ平均流速 ＦＰ　液相体積 Ｃｏ　２酸化炭索漠度 ＲＰ　呼吸係数 ＰＫ　生成物濃度 第　１　図 」（連番包倶Ｂ、ｘ’ンテＪｈ己ケモ、スタット連仲］御乱た便給〆仔 第　６　図 庄析−ス゛よゼ゛や」定システムの７゛ロア７０第　７　図 第　８　図 氷ν渣仝 生り号 手続主甫正書（方式） ％式％ １、事件の表示 国際出願番号　ＰＣＴ／ＥＰ８９１００６２０２、発明の名称 生物の成長プロセスを調整する方法および装置３、補正をする者 羽生との鼎系：特許出願人 名　称　ゲゲルシャフト・フェア・ビオテクノロギッシェ・フォルシュンク・ミ ツト・ベシュレンクテル・ハフラング住所〒１ｏ。

東京都千代田区霞が関３丁目８番１号 虎の門三井ビル１４階　電話（５８１）−９６０１（イｄす５、補正命令の日付 ：平成２年１０月２５日　（発送旧：平成が１１１月６日）６、補正の対象：（ １）発明者の住所を正確に記載した特許法第１８４条の５第１項の規定による書 面 （２）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告 国際調査報告 ＥＰ　８９００６２０

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．基質を微生物の成長に応じて反応器（ＢＲ）中の微生物に供給することから 成る生物の成長プロセスを調整する方法であって、 該基質を比較的高基質流のピリオド（Ｔ１）と比較的低基質流のピリオド（Ｔ２ ）とから成る一連のサイクル（Ｚ）として供給し、そして 成長プロセスの理論モデル（ＡＢ）により該微生物の成長期を１サイクル（Ｚ） 中自動的に認識しそしてその成長プロセスをこれに応じて調整する、 ことを特徴とする前記方法。
2. ２．調整の間中の基質供給をパルス的に行なう、請求の範囲第１項に記載の方法 。
3. ３．１つの成長期から他の成長期への移行により成長期を認識する、請求の範囲 第１又は２項に記載の方法。
4. ４．成長プロセスの特性変数および（または）微生物の種類に依存して基質供給 のパルス的変更を設定する、請求の範囲第２項に記載の方法。
5. ５．基質を供給装置（Ｐ）により反応器（ＢＲ）中の微生物に供給することから 成る生物の成長プロセスを調整する装置であって、理論構造（ＡＢ）により成長 プロセスモデルと該成長プロセスの実際の進行状況とを比較することによりその 成長プロセスを調整する調整回路（Ｒ）を備えていることを特徴とする前記装置 。
6. ６．該調整回路（Ｒ）が、理論モデル構造によりサイクル）（Ｚ）中に起る微生 物の成長期（バッチ１ないしバッチ４、操作１ないし操作５）を検出し、そして それに基づいて次のサイクルにおける基質供給のコースを決定するものである、 請求の範囲第５項に記載の装置。
7. ７．プロセスに関係する変数を検出するためのセンサー装置（Ｆ１、Ｆ２、ＭＳ ）と、サイクル（Ｚ）の間中理論モデル構造により微生物の特性成長期を検出す る解析および判定ユニット（ＡＢ）と 決定された成長期に従って供給装置（Ｐ）を介して基質の供給を調整する調整ユ ニット（ＲＢ）とから成るものである、請求の範囲第５又は第６項に記載の装置 。
8. ８．所望により調整ユニット（ＲＢ）に結合している装置（ＺＭ）を有して成り 、そして該装置は微生物のバイオマス（Ｘ）および（または）微生物のバイオマ スの特異的増加（μ）に関するデータを決定してこれを調整ユニット（ＲＢ）へ 供給するものである、請求の範囲第７項に記載の装置。
9. ９．該解析および判定ユニット（ＡＢ）は、成長期（期１ないし期５）に関与し 、使用する成長プロセスに従って調節可能であり、該成長期を検出するために次 から次へと走査可能であり、そして個々の成長期の持続期間（ｔＢ１ないしｔＢ ４、ｔ２１ないしｔ２４、Ｔ１）を決定する一連のモデル構造（バッチ１ないし バッチ４、操作１ないし操作５）から成るものである、請求の範囲第７項に記載 の装置。
10. １０．該解析および判定ユニット（ＡＢ）は、プロセス開始時のための理論モデ ル構造の第１の（バッチ）系と作動プロセス操作のための理論モデル構造の第２ の（操作）系とから成るものである、請求の範囲第９項に記載の装置。
11. １１．該調整ユニット（ＲＢ）が基質をサイクル（Ｚ）でパルス制御されている 反応器（ＢＲ）に供給する様に該供給装置（Ｂ）の供給出力（ＰＲ）を指示する ものであり、そして第１の理論構造（Ｌ１）がサイクルの開始時に供給装置の供 給出力（ＰＲ）を決定する様に設けられており、そして 第２の理論構造（Ｌ２，Ｌ３）がパルス波型の選択により経時の供給出力〔ＰＲ ）の作動状況（ポンプ速度プロフィール）を決定する様に設けられているもので ある、請求の範囲第７〜１０項のいずれかに記載の装置。