JPH03500879A - ｃ―ｆｍｓ癌原遺伝子の過剰発現によって特徴づけられた癌の処置用組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｃ−ｆｆｆｉｓ癌原遺伝子の過剰発現によって特徴づけられた癌の処置用組成物 および方法 本発明は一般的に蛋白レセプター、ｃ−ｆ’ｍｓの過剰発現によって特徴づけら れた様々な癌の処置に関連する。さらに特に、本発明は細胞毒性剤に結合したＭ −ＣＳＦポリペプチドを含むこのような処置に対する組成物に関連する。

［発明の背景コ 様々な癌遺伝子が特定の癌と結びつけられてきた。癌遺伝子ｆｍｓは、胸、肺膵 臓、卵巣、腎臓およびおそらく急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む他の腫瘍に関 連するものとして最近の研究対象になっている。例えばり、Ｊ、スラモン等、サ イエンス２２４巻２５６−２６２頁（１９８４年）、Ｃ，ウォーカー等、ブロシ ーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ ニーニスエイ１８０４−１８０８頁（１９８７年４月）参照。さらに、Ｊ、Ｈ， オーヤシキ等、カンサー・ジェネティックス・アンド・サイトジェネティックス ２５巻３４１−３５０頁（１９８７年）、ＨｌＤ、プレイスラー等、カンサー・ リサーチ４７巻８７４−８８０頁＜１９８７年２月）、Ｃ，Ｗ、レッテンマイヤ ー等、ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー３３巻１０９−１１５ 頁（１９８７年）およびＲ，サッカ等、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・才ブ・ニーニスエイ８２巻３３３１−３ ３３５頁（１９８６年）参照。ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子の生成物はマクロファージ コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）のレセプターと関係がありおそらく同一である と考えられている。例えばＣ６Ｊ、シェアー等、セル４１巻６６５−６７６頁（ １９８５年）参照。

ほかの点では患者に大きな副作用を起こさずに腫瘍細胞を破壊できる治療用生成 物が、上記癌の処置において必要である。

［発明の詳細な説明］ 本発明はひとつの態様として、ｃ−ｆｏｓ癌原遺伝子／Ｍ−ＣＳ　Ｆレセプター 遺伝子の高水準発現によって特徴づけられた癌の処置用組成物を提供する。その 組成物は細胞毒性剤に架橋したＭ−ＣＳＦポリペプチド（またはその活性フラグ メント）を含み、これはＣｆａｎｓ遺伝子生成物／Ｍ−ＣＳＦレセプターを有す る細胞膜を通過し、細胞質内で作用して細胞を破壊することが可能である。好ま しい細胞毒性剤としては、ＡおよびＢ鎖毒素、Ａ鎖毒素および遺伝子操作技術毒 素を含んでいる。

別の態様としては、組成物は細胞毒性剤とコンジュゲートしたＣ−ｆｍｓ遺伝子 生成物／Ｍ−Ｃ３Ｆレセプターに対するモノクローナル抗体（またはその一部） を含むことができる。上記モノクローナル部分はｃ−ｆｍｓ遺伝子生成物／Ｍ− ＣＳＦレセプターを認識し、結合する。抗体は標的部位への化合物の送達に役立 ち、その製造方法は当業者によく知られた方法である。アメリカ特許第４，６７ １，９５８号参照。

さらに本発明の別の態様では、Ｍ−ＣＳ　Ｆ／細胞毒性剤組成物を作る方法を含 む。Ｍ−ＣＳＦおよび毒素は１つまたはそれ以上のへテロ官能性または二価官能 性蛋白架橋剤を使用によってまたは遺伝ＳＦ／毒素組成物が標的細胞へ行く間安 定であることが確実なように選ばれる。同時に架橋剤はＭ−ＣＳ　Ｆ／毒素組成 物が細胞にはいった後毒素部分の遊離を可能としなければならない。例えばＰ、 コヘンおよびＳ、ファン・ハイニゲン等編集、エルセピア、ニューヨーク、モレ キュラー・アクション・オブ・トキシンズ・アンド・ビールス５１−１０５頁（ １９８２年）参照。

他の態様として、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子／Ｍ−ＣＳＦレセプター遺伝子の過剰表 現によって特徴づけられる癌の処置のための方法を開示している。本方法は、本 発明の組成物をこのような癌の生体内部位へ局部的に投与することまたは細胞混 合物の生体外除去処置における本組成物の投与を含む。組成物は癌上にｃ−ｆｍ ｓ蛋白を結合し、細胞膜を通って毒素を放出する作用をもち、そこで毒素が細胞 を破壊する。上記レセプター過剰発現癌の中には急性骨髄性白血病、卵巣癌、肺 癌および上記で挙げたものが含まれる。

他の態様および本発明の利点はその実施を説明する下記実施例を含む本発明の詳 細な説明を考慮すると明らかになる。

［図面の簡単な説明］ 第１図はＭ−ＣＳＦポリペプチドのＤＮＡおよびアミノ酸配夕ＩＪを示している 。

［本発明の詳細な記載］ 本発明の治療組成物は、ある種の癌細胞上のＣｆｍｓ癌原遺伝子／Ｍ−Ｃ８Ｆレ セプター遺伝子生成物に結合できるＭ−ＣＳＦと、細胞膜を通って輸送され細胞 質中で作用して細胞を破壊することができる細胞毒性剤とのコンジュゲートであ る。

本発明に用いるＭ−ＣＳＰは天然源から採取し、精製することができる（イギリ ス特許第２，０１６，４７７号およびＰＣＴ公開番号Ｗ０８６１０４５８７号参 照）。そのほかには、Ｍ−Ｃ９Ｆは組換え技術により製造することができる。本 発明において有益な組換えＭ−ＣＳＦポリペプチドの１つはＰＣＴ公開番号第Ｗ Ｏ／８６０４６０７号に記載されている。別のＭ−Ｃ９Ｆポリペプチドは、係属 中の同一人が所存するアメリカ特許出願第９４０．３６２号およびＧ、Ｇ、ウォ ング等、サイエンス、２３５巻１５０４−１５０８頁（１９８７年）に記載され ている。記載されたＭ−ＣＳＦのアミノ酸およびＤＮＡ配列は、第１図に表され ている。活性部位を有するＭ−ＣＳＦの他の形も、合成的に製造されたポリペプ チドまたは組換え技術によって修飾されたポリペプチドを含めて、本組成物に使 用することができる。

ｒＭ−ＣＳＦＪという語は、天然に産生ずるひとポリペプチドＭ−ＣＳＰおよび 天然に産生ずるポリペプチドの対立遺伝子変異を含むと定義されている。対立遺 伝子変異は種集団における自然発生的塩基変化であり、ポリペプチドまたは蛋白 におけるアミノ酸変化をもたらすものもそうでないものもある。上記定義に付加 的に含むものてしてはポリペプチドＭ−ＣＳＦの組換え体および合成的変形があ り、これらはペプチドおよびそれらのＤＮＡ配列における誘導修飾を含むことが できる。

例えば、本発明の組成物におけるＭ−ＣＳＦポリペプチドは、第１図に示すアミ ノ酸配列と同一または実質的に相同であるペプチド配列によって特徴づけられる 。これらの配列は第１図に描かれたＤＮＡ配列または塩基またはアミノ酸配列に おける対立遺伝子変異を含む配列またはＭ−ＣＳＦの生物学的特性をもつポリペ プチドをコード化する意図的修飾構造によりコード化することができる。

本発明の組成物に使用する合成Ｍ−ＣＳＰ蛋白は第１図のアミノ酸残基の連続配 列を全部または部分的に複製することができる。例えば第１図のポリペプチドの 活性部位のようなＭ−ＣＳＦポリペプチドの構造的および形態的特性を共有する ことにより、これらの配列はまたＭ−ＣＳＦの生物学的特性をも持つことができ る。こうしてそれらの合成または組換えポリペプチドまたはそのフラグメントは 本発明の組成物および方法におけるＭ−ＣＳＦポリペプチドの生物学的または免 疫学的均等物として使用され得る。

本発明で使用するＭ−ＣＳＦは第１図に類似しているが、修飾が自然に実施され るか故意に操作された配列によってコード化される因子を含む。Ｍ−ＣＳＦのペ プチドまたは配列における修飾は既知技術を使用して当業者が行なうことができ る。Ｍ−ＣＳＦに関連した配列における興味ある特定の修飾はコード配列におけ る９個のシスティン残基の１つまたはそれ以上を他のアミノ酸で置きかえること を含む、好ましくは各々の配列における数個のシスティンは例えばセリンなどの 別のアミノ酸で置換され、蛋白におけるそれらの点でのジスルフィド架橋が排除 される。例えば、アミノ酸位置１６３でのリジン（第１図）は、トリプシン様プ ロテアーゼに対するＭ−ＣＳＦｔｌ域の感受性を排除するために欠失または別の アミノ酸で置換することができる。上記置換の突然変異原性技術は、当業者によ く知られている（アメリカ特許第４，５１８，５８４号参照）。

Ｍ−ＣＳＦ配列の他の具体的変異は、配列中のグリコジル化部位の１つまたはそ れ以上の修飾を含む。グリコジル化の欠如または部分的グリコジル化は、Ｍ−Ｃ ＳＰ配列に存在するアスパラギン結合グリコジル化認識部位の１．２．３または 全てでのアミノ酸の置換または除去により生じる。アスパラギン結合グリコジル 化認識部位は適当な細胞性グリコジル化酵素により特異的に認識されるトリペプ チド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニン またはアスパラギン−Ｘ−セリン（式中、Ｘは通常任意のアミノ酸である）のい ずれかである。グリコジル化認識部位の第１または第３アミノ酸位置の１つまた は両方の多様なアミノ酸置換または除去（および／または第２位置でのアミノ酸 除去）は修飾コシル化部位に結合するオリゴ糖の型の修飾および変異は哺乳類、 細菌、酵母または昆虫細胞のいずれかにおいて配列を産生させることによりおこ すことができる。上記蛋白における修飾はＭ−ＣＳＦという語に含まれる。

さらに別のＭ−ＣＳＦポリペプチド修飾は、例えばポリエチレングリコールなど により薬物動態掌上の改善を目的としてデザインされた配列を使用することがで きる。そのほかには成熟蛋白の最終２５−３５アミノ酸は適当な遺伝子除去技術 によって脱離することができ、本発明で用いる別のＭ−ＣＳＦ型が提供される。

上記の除去Ｍ−ＣＳＦは細胞毒性剤の遺伝子融合に使用することができる。アミ ノ酸残基４６４−４８５は強力な疎水性膜浸透領域を含む。本配列を含むＭ−Ｃ ＳＦ分子は本発明の組成物を使用することが好ましいが、その理由はこれらの残 基は細胞膜において接合体をうめこみそれによって細胞毒性剤の細胞質ゾルへの 輸送を促進するからである。

様々なＭ−ＣＳＦペプチドの生成における代表的なりＮＡ配列は、メリーランド 、ロックビル、パークラーン・ドライブ　１２３０１番のアメリカン・タイプ・ カルチャー・コレクションに寄託されている。ベクターｐ３ＡＣＳＦ−６９にお ける以下に示す第１図のｃＤＮＡ配列はＥ、コリＨＢＩＯＩに含まれ、１９８６ 年４月１６日に寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６７０９２が与えられた。この寄託 は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびそれに 従う規則（ブダペスト条約）の下で行なわれた。

Ｍ−ＣＳＦポリペプチドと結合した細胞毒性剤は細胞質中で作用することのでき る毒素または化学薬品であることが好ましい。毒素は、細胞膜を通って移動させ る輸送物性および殺す能力を与える細胞溶解ドメインを有するものを使用するこ とができる。本組成物によく適した毒素の好ましい群の１つはＡおよびＢと呼ば れている２つの機能的に相違する部分であり、ジスルフィド結合によって結ばれ ているものからなる。ＡＭ部分は、細胞質ジノ圀二人り込みおよび細胞を死亡さ せる酵素活性を含む。Ｂ鎖部分は細胞へ毒素を結合する役目をもち、Ａ鎖を細胞 膜に通すのに役立つドメインを含むと推測できる。上記用途に良好な毒素の例に は、天然または遺伝学的に操作したりシン、アブリン、モデシン、ビスクミン、 シュードモナス・エルギノーサ外毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素、シゲラ毒 素およびＥ、コリ熱不安定毒素が含まれる。本発明により製造された接合体の毒 素部分は細胞毒性Ａ鎖部分単独、天然ホロ毒素、または操作したホロ毒素すなわ ちレシチン結合特性を欠如した毒素を含む。

単鎖（Ａ鎖部分）だけを含む他の毒素もまた使用される。これらの毒素の例はア メリカヤマゴボウ抗ウイルス蛋白およびゲロニンのようなりボゾーム不活性化蛋 白である。Ｌ、バルビエリ等、カンサー・サービース、１巻４８９−５２０頁（ １９８２年）を参照するとりボゾーム不活性化蛋白のより完全なリストがある。

変異毒素または遺伝子操作した毒素もまた使用される。さらに微生物が産生する 細胞毒性剤および他の非蛋白有機分子も細胞毒性剤として使用することができる 。Ｍ−ＣＳＦリガンドは、例えばドキソルビシン、ドーノマイシンなどのような アンスラサイクリン類およびビンデシン、ビンブラスチン、ビンクリスチンのよ うなビンカアルカロイド類のような細胞毒性薬に結合することもできる。メタト レキサートおよびその誘導体もまた細胞毒性として使用できる。

より効果的な剤は多分子の薬剤（５−５０の間）が例えばデキストランのような ポリマー担体によりＭＣ５Ｆを結合したものである。

担体に薬剤が連結する結合は細胞内の化学的環境により開裂するものでなければ ならない。

Ｍ−ＣＳＦおよび細胞毒性剤は、様々な方法で連結することができる。これらの 成分の連結方法の一つは、例えばサクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはサクシンイミジルーアセチルチオプロブリ エート（ＳＡＴＰ）などのような１つまたはそれ以上の標準二価性蛋白架橋剤を 使用することによルモノである。これらの架橋剤は、Ｍ−ＣＳＦおよび毒素また は他の細胞毒性剤の間で安定なジスルフィド結合を形成し、例えば細胞内グルタ チオンのような細胞内化学物質によってジスルフィド結合が開裂し細胞内で組成 物の毒素部分を遊離することができる。これらの連結方法は当業者に既知である 。例えばＪ、カールソン等、バイオケミカル・ジャーナル、１７３巻？２３−７ ３７頁（１９７８年）およびＮ、藤井等、ケミカル・アンド・ファーマシューテ ィカル・ブレタン、３３巻３６２−３６７頁（１９８５年）参照。また、毒素が 蛋白に共役する他の一般的方法については、Ａ、Ｊ、クンバー等、メソッズ・イ ン・エンザイモロジー、ｌ１２巻２０７−２２５頁（１９８５年）を参照。

例えば本発明による１つの方法は、両方およびＡおよびＢ鎖を有する毒素を使用 するＭ−Ｃ９Ｆ−毒素組成物を作ることを含む。

方法は次の段階、 （ａ）Ｍ　−ＣＳ　Ｆ分子あたり１−６個の反応基を導入するに充分な架橋剤と Ｍ−ＣＳＦを反応させること。本目的で使用することのできる架橋剤の充分な量 はＭ−Ｃ６Ｐ２ｊｉ体のモルあたりおよそ６−５０モルの範囲である。

（ｂ）少なくとも１つのジスルフィド結合で接続するＡおよびＢ鎖すブユニット を有する毒素蛋白を常用還元剤と反応させ、それにより鎖を互いに遊離させるこ と （ｃ）還元毒素の遊離Ａ鎖すブユニットと段階（ａ）の誘導Ｍ−ＣＳＦを反応さ せること、および （ｄ）　Ａ　Ｉサブユニットにジスルフィド結合により連結されたＭ−Ｃ９Ｆを 含むコンジュゲートを反応混合物から分離することを含む。典型的な成長因子／ 毒素共役体の１つはＭ−ＣＳＦを５ＰＤＰで修飾してこの方法により製造され、 続いてジスルフィド結合によりリシンＡ鎖を結合させる。

本発明の組成物を作る別の方法は次の段階（ａ）Ｍ　−ＣＳ　Ｆ分子あたり１− ６個の反応基を導入するに充分な架橋剤とＭ−Ｃ９Ｆを反応させること。

（ｂ）少なくとも１つのジスルフィド結合により結合したＡおよびＢサブユニッ トを有するホロ毒素を段階（ａ）の誘導Ｍ−ＣＳＰと反応させる（ホロ毒素はＢ サブユニットに結合しているのが好ましい蛋白架橋剤で官能化されている）、お よび（ｃ）反応混合物中の遊離Ｍ−ＣＳＦおよび毒素から、Ｂサブユニットに結 合するようになったＭ−ＣＳＦに上り形成されたコンジュゲートを分離すること を含む。

本発明の組成物の成分を連結する別の方法は、遺伝的融合方法による。例えばア メリカ特許第４，６７５．３８２号参照。

Ｍ−ＣＳＦおよび毒素の両方を含む本発明の組成物は、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子／ Ｍ−ＣＳＦレセプター遺伝子の過剰発現により特徴づけられる癌の処置に関する 方法に使用することができる。上記癌の中には急性骨髄性白血病、卵巣癌、乳癌 、肺癌、膵臓癌および腎臓癌がある。本発明の組成物は、組成物のＭ−ＣＳＦ部 分によりｃ−ｆＩＩｌｓ癌原遺伝子を標的にすることによって作用する。このレ セプターに■度結合すると、Ｍ−ＣＳＦ分子は細胞膜を通り細胞質ゾルの中へ毒 性剤を輸送するのを助ける。細胞内では、Ｍ−ＣＳＦに毒性剤が連結する結合は 自然に細胞内で化学物質によって開裂し、剤は遊離され癌細胞を死亡させる。

本発明の組成物は全身的、局所的または分野的を含む様々な方法で投与される。

本組成物は腫瘍部位に分野的に生体内で投与されることが望ましい。例えば腹腔 内に投与することができ、もし望まれる場合例えば卵巣癌のような適当な癌の処 置に使用するため腹膜分布を含む。肺癌の処置の場合、同様に、組成物は吸入剤 の形で放出することができる。もし望ましいなら、組成物を、例えば乳癌の場合 腫瘍の外科的除去後生じた組織浴のように皮下内に投与することができる。組成 物は、例えば膀胱内へ、裏白投与するのが好ましい場合がある。さらに組成物は 、例えば患者から除去された細胞混合物の「浄化」のような生体外適用に使用す ることができ、これは分野的適用がふされしくない全身癌を有する患者に対する ものである。

例えば急性骨髄性白血病の患者の処置は、体からの骨髄細胞の除去を含む。これ らの細胞はその後ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子を過剰発現する細胞のサブセットを破壊 する本発明の組成物で体外で処理する。「浄化」細胞はその後患者に再導入され る。それによって、本発明のＭ−ＣＳＦ／ＳＦ／成物は自己骨髄移植を受けよう としているＡＭＬ患者の骨髄において白血病細胞を破壊する浄化剤として役立つ 。他の生体外浄化作用にも本発明の組成物を使用することができる。

本発明に用いる治療組成物は発熱物質のない非経口に許容される水性溶液の形で あり得る。ｐ）（、等張、安定化およびその他に関して上記非経口に許容される 蛋白溶液は当業者には既知である。

本発明による組成物での患者の処置を含む薬剤養生法は、例えば患者の状態、体 重、性および食品、感染の重さ、投与時間および他の臨床的因子などの薬剤活性 を修飾する様々な因子を考慮して主治医によって決定される。さらに、投与方式 は例えば生体外または生体内での薬剤投与を可能にする。一般的に、日用量は体 重に９あたり２−２０００マイクログラムの範囲のポリペプチドである。

次の実施例はＭ−ＣＳＦポリペプチドの製造および本発明のＭ−〇ＳＦ／毒素共 毒素共役鎖を明らかにしている。

実施例Ｉ Ｍ−ＣＳＦの組換え体製造 組換え体力法による組換え体Ｍ−ＣＳＰポリペプチドを発現するため、ポリペプ チドをコード化したＤＮＡを適当な発現ベクターに移入し、常法の遺伝子操作技 術により選択された宿主細胞に導入した。

例えばｐ３ＡＣＳＦ−６９のようなＭ−ＣＳＦ製造用哨乳類細胞発現ベクターは 当業者によく知られている技術によって合成することができる９例えばレプリコ ン、選択遺伝子、エンハンサ−、プロモーターおよび同類のようなベクターの成 分は既知の製法によって天然源または合成により得ることができる。カウフマン 等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１５９巻５１１−５２１ 頁（１９８２年）およびカウフマン、プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスエイ、８２巻６８９−６９３頁（ １９８５年）参照。これらの組換え体Ｍ−ＣＳＦの発現に適当な細胞またはセル ラインは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、さるＣＯ５−１または ＣＶ−１細胞である。適当な暖乳類主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、 スクリーニングおよび生成物製造および精製方法の選択は当業者に知られている 。例えばケシングおよびサムプルツク、ネイチャー、２９３巻６２０−６２５頁 （１９８１年）、またはそのほかにはカウフマン等、モレキュラー・アンド・セ ルラー・バイオロジー、５（７）巻１７５０−１７５９頁（１９８５年）または ホーシー等、アメリカ特許第４．４１９，４４６号参照。他の典型的な晴乳類主 細胞は、特に霊長類セルラインおよびげっ書類セルラインを含み、これらは形質 転換したセルラインを含む。正常な二倍体細胞、−次組縁の生体外培養から誘導 された細胞株および一次外植片も適当である。候補の細胞は、選択遺伝子が優勢 に作用している限り選択遺伝子が遺伝子型的に欠如している必要はない。ＣＨＯ 細胞は、ベクターＤＮＡの安定統合、および統合したベクターＤＮＡのそれにつ づく増幅（何れも常法）に使用することができる。他の適当な哺乳類セルライン は、Ｈｅ　Ｌ　ａ　％マウスＬ、−９２９細胞、スイス、Ｂａ１ｂ−ＣまたはＮ ！Ｈマウスにより誘導された３Ｔ３ライン、ＢＨＫまたはＨａＫハムスターセル ラインを含むが限定されるものではない。

安定な形質転換体はその後標準免疫学的または酵素的検定により生成物。発現ｊ ユつぃてスクリーニングする。変異蛋白をコード化したＤＮＡの存在は例えばサ ザンプロット法のような標準法により検出できる。ｃｏｓ−ｉさる細胞のような 適当な宿主細胞の中へ発現ベクターＤＮＡ導入後、数日間変異をコード化するＤ 　Ｎ　Ａの一過性発現は、培養培地中の蛋白の活性または免疫学的検定による選 択なしで測定する。適当な宿主細胞の中へのこれらのベクターの形質転換はＭ− ＣＳＦの発現を起す。

同様に、当業者は、細菌細胞によるＭ−ＣＳＦの細胞内または細胞外発現用細菌 ベクターをつくる細菌配列で、コード化した配列の側面にある哺乳類調節配列を 脱離または変換することによって第１図の配列を操作することができる。因子を コード化するＤＮＡはさらに当業者に知られている細菌発現の異なったコドンを 含むように修飾することができる。配列は、当業者に知られた方法により、細菌 発現、分泌および成熟変異蛋白のフロセシングを可能とする、分泌リーダーペプ チドをコード化するヌクレオチド配列に枠内で操作可能に連結するのが好ましい 。細菌宿主細胞中で発現した化合物はその後既知方法により採取、精製され、お よび／または物理化学的、生物化学的および／または臨床的パラメーターにより 特徴づけられる。例えば、コード化したＭ−ＣＳＦ配列はＴ、タニグチ等、プロ シーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニー ニスエイ、７７巻５２３０−５２３３頁（１９８０年）に記載された方法を使用 して、既知の細菌ベクターの中に挿入することができる。この典型的な細菌ベク ターはその後細菌宿主細胞に形質転換され、それによってファクターが発現する 。Ｅ、コリの様々な株（例えばＨＢＩＯＩ、ＭＣ１０６１）が生物工学の分野に おいて宿主細胞としてよく知られている。バチルス・スブチリス、シュードモナ ス、他の桿菌および同類の様々な株も本方法に使用することができる。細菌細胞 における上記因子の細胞外発現の製造計略についてはヨーロッパ特許出願ＥＰＡ 　１７７，３４３号参照。

同様な操作は昆虫細胞中の発現に対する昆虫ベクター（例えばヨーロッパ特許出 願１５５，４７６号に記載された方法を参照）の構築のために実施することがで きる。例えば、ミラー等、ジエネティック・エンジニアリング、８巻、２７７− ２９８頁（ブレナム版１９８６）およびその引用例を参照。

酵母ベクターは酵母細胞？こよるＭ−ＣＳＦの細胞内または細胞外発現に対する 酵母調節配列を使用して組み立てることができる。当業者によく知られている多 くの株が本発明に使用するポリペプチドの発現用宿主細胞として使用することが できる。（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ３６００６３９号およびヨーロッパ特許出願Ｅ Ｐ１２３，２８９号に記載された方法を参照）。

実施例２ Ｍ−ＣＳＰ毒素コンジュゲート 本発明によるＭ−ＣＳＦ１１素コンジュゲートの組み立てのため、成長因子Ｍ− ＣＳ　Ｐをアメリカ特許出願第９４０，３４６号（その開示を引用して本書に包 含させる）およびＧ、Ｇ、ウォング等、サイエンス、２３５巻前掲に記載された ように哺乳類細胞で産生させた。

０．１Ｍ　ＮａＨＣＯｓ（２（ｌｔ（りのＭ　Ｃ５Ｐ（５ｚ９．５ナノモル）を エタノール中の５ＰＤＰの２０倍モル過剰と反応させた。反応は摂氏４度で５時 間続け、Ｍ−Ｃ８Ｐ二量体の分子あたりおよそ４−６スルフヒドリル基を導入し た。過剰の５ＰＤＰを除去後、導入した成長因子を市販のりシンＡＣ１５ｍ９． ５００ナノモル）と、ＮａＨｚＰＯ，Ｐ、１１７．５１０　ＩＭ　ＮａＣｌ３０ ｍＭ中で反応させた。ジスルフィド結合は摂氏４度で１晩で形成された。生じた Ｍ−ＣＳＦ−リシンＡ鎖コンジュゲートが、セファロゲル（商標）ＴＳＫ−３０ ００高速液体クロマトグラフィーでのゲル濾過によって過剰のりシンＡ鎖から分 離し、コンジュゲートおよびＭ−ＣＳＦ（７，５ｘ９）の混合物を得た。Ｐ、Ｐ 、ノウルズおよびＰ、Ｅ、）−プ、アナルズ・オブ・バイオケミストリー、１６ ０巻４４０−４４３頁（１９８７年）に記載されたＮａＣ］勾配で展開しブルー セファロースカラムを２回通した後、コンジュゲート（７２０χ９）がＭ−ＣＳ 　Ｆを含まない形で得られ、主としてＭ−ＣＳＦ二量体あたり１つのりシンＡ鎖 の種からなるものであった。

実施例３ Ｍ−ＣＳＦ毒素共役体のインビトロ細胞毒性Ｍ−ＣＳ　Ｆ／リシンＡ＠コンジュ ゲートの毒性および特異性の水準は、ＮＩＨ３Ｔ３およびＮＩＨ３Ｔ３−ｃ−ｆ ｍｓセルラインを用いてストロング等、ブラッド、６５巻６２７−６３５頁（１ ９８５年）によって記載された方法と類似した方法で標準軟寒天クローン遺伝子 検定により測定された。後者のラインは、Ｍ、Ｆ、ロセル等、ネイチャー、３２ ５巻５４９−５５２頁（１９８７年）が、Ｍ−ＣＳ　Ｆレセプター陽性であるこ とを記載している。各々のセルラインは寒天およびペトリ皿の薄層でコンジュゲ ートとまたはコンジュゲートなしの培地（対照）と混合した。１４日間標準ＣＯ ７大気中３７℃でインキュベートした後、各々の皿のコロニーの数を視覚的に数 えた。

コンジュゲートを受入れなかったＮＩＨ３Ｔ３−Ｃ−ＦＭＳ細胞対照皿は、皿あ たり１０３コロニーを示したが、４　ｘ　１０−”Ｍｓ度のコンジュゲートで処 理した同じ細胞はたった３コロニーであった。

媒地と混合したコンジュゲート処理Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ　３細胞および未処理対照細 胞はそれぞれ皿あたり７６および７８コロニーであった。

実施例４ Ｍ−Ｃ５Ｆ毒素共役体の生体外検定 生体外骨髄浄化に関するＭ−ＣＳ　Ｆ／リシンＡ鎖コンジュゲートの効果はスト ロング等、前掲により記載された類似方法で試験された。メリーランド、ロック ビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションで得られるＭ１骨髄白血 細胞（１０”）にマウス骨髄細胞（１０’）を加え、その後３７℃およそ４時間 １０−’−１０°ｌｔＭ範囲のＭ−ＣＳ　Ｆ／リシンＡコンジュゲートで処理し た。白面細胞および一分化能および多分化能骨髄始原細胞の生存パーセントは、 Ｔ、Ｒ，ブラッドレイおよびり、メットカルフ、オーストラリアン・ジャーナル ・オブ・イクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディカル・サイエンス 、４４巻２８７頁（１９６６年）の標準コロニー形成検定により測定され、効果 および特異性がそれぞれ測定された。

本発明の方法および成分に対して多くの修飾が本書の開示に基づいて当業者によ り可能である。上記修飾は添付の請求項に含まれる。

微生物 寄託機関の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託機関の住所 アメリカ合衆国２０８５２メリーランド、ロックビル、パークラーン・ドライブ 　１２３０１番寄託物の名称　ＡＴＣＣ番号　引用した　寄託日２　本書は出願 時に国際出願と共に受付けた（受理官庁記載欄）（署　名） Ｆｉｇｕｒｅ　１ ｈ罪３１　（つブミ） ８５０　８６５　８８０　８り５ ＧＩ’ＣＡＡＧ　ＧＡＣＡＧＣλＣＣχＬ’ＣＱ７１’　ＧＧＣ’に７ｔ　ＣＯ ｉ　ＣＸ；αゴα℃αＤ　ＴＣＴ　ＧＩ’Ｃｅ　ＣｍＶａｌ　Ｘｙｔ、　Ａｓｐ 　５ｅｒ　’Ｉｈｒ　ｎａ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ 　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｖａ戟@（、ｌｙ　Ａｌａ ＩｊｕＳａｒ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　）ｘｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｑｌｙ　Ｓ ｅｒ　ンコＧｉｎ　計Ｑｕ　Ｐｒｏに４１　Ａｒｇ　Ｐｒ。

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Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞毒性剤に結合したＭ−ＣＳＦポリペプチドおよびその医薬担体を含む ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子／Ｍ−ＣＳＦレセプター遺伝子の過剰発現によって特徴づ けられる癌の処置用治療組成物。
2. （２）細胞毒性剤が、二重鎖リシン、リシンＡ鎖、アブリン、アブリンＡ鎖、モ デシンおよびモデシンＡ鎖、シュードモナス・アエルギノーサ外毒素、コレラ毒 素、 シゲラ毒素、エシェリヒア・コリ熱 不安定毒素およびジフテリア毒素、それらの変異毒素およびそれらの組み換え変 形体からなる群から選択された毒素である、請求項１記載の組成物。
3. （３）細胞毒性剤が、リボゾーム不活化蛋白、アメリカヤマゴボウ抗ウイルス性 蛋白およびゲロニンおよびそれらの変異毒素およびその組み換え変形体からなる 群から選択されたものである、請求項１記載の組成物。
4. （４）細胞毒性剤が、アンスラサイクリン類、ドキソルビチン、ド ーノマイシン、ビンカアルカロイド類、ビンデシン、ビンブラスチン、ビンクリ スチン、メトトレキサートおよびそれらの誘導体からなる群から選択されるもの である、請求項１記載の組成物。
5. （５）Ｍ−ＣＳＦポリペプチドがヘテロ官能蛋白架橋剤により細胞毒性剤と結合 している、請求項１記載の組成物。
6. （６）架橋剤が、サクシンイミジル−３−（２−ビリジルジチオ）プロピオンネ ートまたはサクシンイミジルアセチルチオプロプリエートからなる群から選択さ れたものである、請求項５記載の組成物。
7. （７）ＳＰＤＰにより完全なリシン分子に結合しているＭ−ＣＳＦを含む、請求 項１記載の組成物。
8. （８）癌の部位に、レセプターを有する細胞膜を通り、細胞中に入り、細胞を殺 すことのできる細胞毒性剤と結合したＭ−ＣＳＦを含む組成物を生体内で区域的 に投与することからなる、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子／Ｍ−ＣＳＦレセプターの過剰 発現によって特徴づけられた癌の処置方法。
9. （９）レセプターを有する細胞膜を通り、癌細胞中に入り、細胞を殺すことので きる細胞毒性剤と結合したＭ−ＣＳＦを含む組成物で、患者からとり出した癌細 胞を含む細胞混合物を生体外で浄化することからなる、ｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子／ Ｍ−ＣＳＦレセプターの過剰発現によって特徴づけられた癌の処置方法。
10. （１０）細胞毒性剤に結合したモノクローナル抗体であってｃ−ｆｍｓ遺伝子生 成物／Ｍ−ＣＳＦレセプターに対するモノクローナル抗体およびその医薬担体を 含むｃ−ｆｍｓ癌原遺伝子／Ｍ−ＣＳＦレセプター遺伝子の過剰表現により特徴 づけられた癌の処置用組成物。