JPH03501209A - 抗ヒト高分子量メラノーマ関連抗原に対する抗イディオタイプ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗ヒト高分子量メラノーマ関連抗原に対する抗イデイオタイプ抗体これは、１９ ８８年５月１７日付けの出願第１９５５７７号の一部継続出願である。

発明の分野 この発明は、腫ように対する宿主による免疫学的活性の強化を目的として特に設 計された抗体の開発に関するものである。さらに詳しく述べると、研究者らによ り、メラノーマ細胞に含まれる抗原を指向する抗体を用いてメラノーマ患者の処 置が行なわれた。高分子量メラノーマ関連抗原（以後、ｒＨＭＷ−ＭＡＡＪと称 す）は、メラノーマに対するそれらの免疫治療方法における適当な標的である。

２２５．２８は、ＨＭＷ−ＭＡＡ分子上の不確定構造のエピトープを認識するモ ノクローナル抗体である。この発明は、抗ＨＭＷ−ＭＡＡ抗体２２５．２８およ びその免疫学的均等物質に対する抗イデイオタイプ抗体の分野に存する。抗体２ ２５．２８に対する抗イデイオタイプ抗体ＭＦＩＩ−３０およびＩ　Ｍｅｌｐｇ 　１は、動物モデルシステムにおいて発見され、評価されｆこ。ＭＦＩＩ−３０ はまた、悪性メラノーマにかかった患者において評価された。この発明はまた、 前記抗イデイオタイプ抗体を投与および適用することによる、腫よう、例えばメ ラノーマ、または抗体２２５．２８により認識されるＨＭＷ−ＭＡＡエピトープ を発現する他の病的細胞の診断、モニターおよび処置の分野に存する。

抗原は、免疫反応を誘導し得る物質である。代表的な一免疫反応は、抗体産生で ある。抗体は、Ｂ細胞リンパ球により産生される。

別の代表的な反応は、Ｔ細胞の刺激である。（Ｔ細胞は、胸腺において分化が行 なわれるリンパ球の別のタイプである）。Ｔ細胞は、異常細胞、例えばある種の タイプのウィルスまたは他の病原体に感染した細胞を破壊し得る。Ｔ細胞はまた Ｂ細胞による抗体産生に関与する。従って、抗原は、抗体、またはそれが刺激す るＴ細胞上のレセプターと反応し得る。抗体およびＴ細胞レセプターは、誘導抗 原に特異的である。

抗体およびＴ細胞レセプター分子は、特異抗原認識に関与する可変領域を有する 。実際に抗体またはＴ細胞レセプターと結合する抗原領域は、抗原決定基または 「エピトープ」と呼ばれる。抗体およびＴ細胞レセプターの可変領域は、決定基 、または同じく免疫原性であり、抗イデイオタイプ（「抗−４ｄＪ）免疫反応を 開始させる「イディオタイプ」を含む。

さらに詳しくは、イディオトーブは、抗体およびＴ細胞レセプターの可変領域と 関連している。これらの可変領域は、抗体およびＴ細胞レセプターに抗原特異性 を与える。イディオタイプは、抗体およびＴ細胞レセプターにおける免疫系マー カーである。イディオタイプは、所定のイディオタイプ内のイディオトープ決定 基またはイディオトーブを認識する複数の抗イデイオトープ抗体との反応性によ り免疫学的に定義される。すなわち、イディオタイプは、イディオトープの集ま りにより構成される。イアイオトープは、最も適切にはそれらのモノクローナル 抗イデイオタイプ抗体への結合性により定義される。

また、イディオトープは、アイソタイプ（免疫グロブリン類特異的）、ゼノタイ プ（種特異的）およびアロタイプ（ある種の集団サブグループ特異的）決定基と は異なるものとする。

各抗体およびＴ細胞レセプターは、抗原決定基（エピトープ）に関する結合部位 である少なくとも１つのパラトープ（抗体結合部位）を有する。パラトープはイ ディオトープとして機能し得、すなわち、パラトープは、元の抗原と同様に抗イ デイオタイプ抗体がパラトープに結合する、抗イデイオタイプ応答を刺激し得る 。抗−パラトープ・抗イデイオトープ抗体のサブセットは、元の抗原の免疫学的 特性を模倣し得る。元の抗原を模倣する抗−パラトープ抗イデイオタイプに加え て、他の抗イデイオタイプ抗体も、同じく免疫反応の調節に関与する抗体および Ｔ細胞レセプター・イディオトープを定める。これらのイディオタイプは調節イ ディオタイプと呼ばれ、それらは必ずしも元の抗原の「内的イメージ」ではない 。これらの基礎原理の全般的な検討については、プルプツチ、Ｓ、およびシュバ ルッ、Ｒ１「ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メデイシン」３１７：２ １９（１９８７）参照。

イディオタイプ・ネットワーク 所定の種類または個体において、相異なる抗体およびＴ細胞レセプターの数は膨 大（＞１０’）である。各抗体およびＴ細胞レセプターは、調節ネットワークを 通じて相補的な抗イディオトープに結合する幾つかのイディオトーブを発現する 。シャーン、Ｎ８、「アナルス・オブ・イミュノロジーＪｌ　２５６：３７３（ １９７４）により、免疫系は、イディオタイプおよび抗イデイオタイプから成る ネットワークにより調節されることが提案された。イディオタイプ・ネットワー クの機能は免疫系のホメオスタシスの維持および免疫反応の調節であることを示 す、大量の実験証拠が存在する。イディオタイプはＢ細胞およびＴ細胞により発 現されるたぬ、イディオタイプ・ネットワークは、体液性（抗体）および細胞性 （Ｔ細胞介在）の両免疫反応を包含する。特異免疫応答は、１対１の関係または 共有のイデイオトープによりグループで、特異的抗イデイオタイプ抗体により調 節される。これらの抗イデイオタイプ抗体は、「調節抗イデイオタイプ」と呼ば れ、それらは必ずしも標的抗原の内的イメージを示さない。ゴールトバーグ、Ｂ 等、「ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディシンＪｌ　５８：５１５ （１９８３）参照。

抗イデイオタイプ療法 最近、治療における「内的イメージ」抗イデイオタイプの使用が、幾つかの実験 システムにおいて示唆および立証されている（ＥＰＯ出願第８４８１０５１６９ 号、１９８４年１０月１５日付、公開第０１４１７８３号、ニソノフ、Ａ３、お よびラモイ、Ｅｏ、「クリニカル・イミュノロジー・アンド・イミュノバソロジ ーＪ２１：３９７（１９８１）、ケネディ、Ｒ，Ｃ，等、「バイオテクニクスｊ ３：４０４０　９１９８５））。これらの内的イメージ抗イデイオタイプは、ウ ィルス、細菌および寄生虫感染症および癌に対する特異的免疫応答の誘発におけ る抗原の代替物として使用されている（）翫−リン、Ｄ。

等、「サイエンスｊ２３２：１００（１９８６）、ライチャラブユリ、Ｓｏ等、 「ジャーナル・オブ・イミュノロジーＪｌ　３７：１７４３（１９８６））。

目下、内的イメージ・ポリクローナルおよびモノクローナル抗イデイオタイプは 、動物およびヒトにおける能動免疫療法に使用されている。内的イメージ抗イデ イオタイプを生じさせるプロセスは次の通りである。ｌ）腫よう抗原または感染 源に対して抗体が産生される。この抗体をｒＡｂｌｊと呼ぶ。２）最初の抗体に 対して抗イデイオタイプ抗体（ｒＡｂ２．、ｌ）が産生される。これらの抗イデ イオタイプ（Ａｂ２）を、元の抗原の免疫学的特性（例えば腫ようまたは感染源 により発現される特性）を模倣するイディオタイプの発現についてスクリーニン グする。このスクリーニングは、元の抗原によるＡｂｌ−Ａｂ２結合の阻止、お よびインビボ抗原代替物としての抗イデイオタイプ（Ａｂ２）の生物学的試験に より構成される。この試験は動物において行なわれ、腫よう抗原および感染源を 示す内的イメージ抗イデイオタイプについては以前に立証されている。（ケネデ ィ、Ｒ１Ｃ０等、「バイオテクニクスｊ３：４０４０（１９８５）、バーリン、 Ｄ。

等、「サイエンスＪ２３２：１００（１９８６）、ライチャラブユリ、Ｓ９等、 「ジャーナル・オブ・イミュノロジーＪｌ　３７：１７４３（１９８６）。

しかしながら、先行技術による有用な能動腫よう免疫療法を生み出す努力により 、予測不能な結果が得られた。先行技術において見られた限られた成果および予 測不能な結果に関して幾つかの理由が想定され得る。

第一に、多くの腫よう抗原は単離されにくい。腫よう抗原は、腫ようの集まりま たは個々の培養腫よう細胞に顕著な濃度では存在しないことが多い。第二に、腫 よう抗原は免疫原性の低いことが多い。

低い免疫原性は、免疫反応性を抑制する腫よう細胞の他の成分の存在の結果、ま たは抗原が腫よう細胞により固有の形では発現されないためであり得る。一般に 、免疫系が「自己」として認識する抗原は、顕著な免疫応答を誘発しない。先行 技術による一腫よう免疫療法は、大量生産され得、天然抗原よりも免疫原性の高 いものであり得る内的イメージ抗イデイオタイプ抗体の使用であった。

しかしながら、先行技術による有用な内的イメージ抗イディオタイブを生み出す 努力はまた、予測不能な結果に遭遇した。イディオタイプ・ネットワークに関し て、多くの抗イデイオタイプ抗体は、不明確な理由により、それらが元の抗原の 特性を模倣することを示す分析結果にも拘わらず、有効なインビボ免疫応答を簡 単には誘発し得ない。インビトロまたは部分的でもインビボで特有な特徴を示す 抗イデイオタイプ抗体でさえ、多くの場合、免疫ネットワークを刺激して治療上 有効な免疫応答を発生させることができない。恐らく、これらの非有効的内的イ メージＡｂ２は、イディオタイプ／抗イデイオタイプ相互作用の免疫ネットワー クの適当な調節回路を誘導して有効な免疫を引き出すことはないと思われる。こ の予測不能性および不確定性のバックドロップに対して、この明細書に記載され ている本発明抗イデイオタイプ抗体は、進行性メラノーマ患者における試験で好 結果をもたらした。

メラノーマに対する免疫療法の開発に適当な一標的は、高分子量メラノーマ関連 抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡＸメラノーマ関連コンドロイチン・スルフェート・プロテ オグリカン抗原（ｒＭ　Ｐ　Ｇ　ｊ）ともいう）である。当方の結果は、ＨＭＷ −ＭＡＡに対して細胞性および体液性応答を誘導する試みが、腫よう増大の妨げ となり得ることを示している。ＨＭＷ−ＭＡＡは、非共有結合した２つのグリコ ポリペプチドにより構成される。一方は見かけ上の分子量が２８０にであり、他 方は見かけ上の分子量が４４０により大きい。ＨＭＷ−ＭＡＡは、ヒト・メラノ ーマ細胞において合成および発現される（スパイク、Ｒ，Ｃ，等、「ジャーナル ・イブ・バイオロジカル・ケミストリー」２６４：１７７９（１９８９）、エス コ、’Ｊ、Ｄ、等、「サイエンス」２４１：１０９２（１９８８））。プロテオ グリカンは、それらのコアにおいてセリン残基に共存結合したグリコサミノグリ カン（ＧＡＧ）多糖績を存する糖蛋白質である。ＨＭＷ−ＭＡＡコア蛋白質は、 最初、高マンノース・タイプのアスパラギン−Ｎ−結合オリゴ糖を有する分子質 量２４０にの前駆体として翻訳される。Ｎ−結合オリゴ糖の「複合体」形態への トリミングおよびそれに続くプロセッシングの結果、２４０に成分から２５０に 形態への変換が行なわれる。２５０にコア蛋白質へのコンドロイチン・スルフェ ートＧＡＧ側鎖の付加により、それは高分子量（＞４５０Ｋ）プロテオグリカン 形態に変換される。２５０におよび＞４５０にの両形態は、共にメラノーマ細胞 表面において発現される（スパイク、Ｒ，Ｃ，等、「ジャーナル・イブ・バイオ ロジカル・ケミストリーＪ２６４　：１７７９（１９８９））。

ＭＰＧは、腫ようの増大および転移の運命を決定するのに重要な役割を演じる（ バーリン、Ｍ６等、「アニュアル・レビュー・イブ・イミュノロジーＪ６：２８ ３（１９８８）、ロバートソン、Ｎ、Ｐｏ等、「キャンサー・リサーチＪ４９： １８１６（１９８９））。細胞表面蛋白質分子は、近接細胞との相互作用に関与 し、基底と接触する複合体フットパッドを形成する（バーリン、Ｍｏ等、「アニ ュアル・レビュー・イブ・イミュノロジーＪ６　：２８３（１９８８））。ＨＭ Ｗ−ＭＡＡに対する抗体は、細胞の走化的および速動的運動性をブロックする（ バーリン、Ｍ８等、「アニュアル・レビュー・イブ・イミュノロジー」６：２８ ３（１９８８）、ド・ブリエ、Ｊ、Ｅ、等、［インターナショナル・ジャーナル ・イブ・キャンサーＪ３８：４６５（１９８６））。抗ＨＭＷ　ＭＡＡ抗体は、 軟寒天においてメラノーマ・コロニー形成の減少を誘発する（ハーバ−１Ｊ、Ｒ ，、「ジャーナル・イブ・ナショナル・キャンサー・インスティテユートＪ７１ ：２５９（１９８３））。

［発明の要旨］ この発明では、２種の新規抗イデイオタイプ抗体、ＭＦ１］３０およびＩ　Ｍｅ ｌｐｇ　１並びにそれらの均等物質を開示しており、それらは、（１）ネズミ・ モノクローナル抗体２２５．２８およびその誘導体またはそれらの免疫学的均等 物質のイディオトープ、または（２）２２５．２８と同じ免疫学的特徴を有する 種類からのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、または（３） ２２５．２８と同じ免疫学的特徴を有する種類からのポリクローナル抗血清と反 応することができる。この２’２５．２８は、高分子量メラノーマ関連抗原（Ｈ ＭＷ−ＭＡＡ）の特定決定基（エピトープ）と反応性を示す。

抗イデイオタイプ抗体ＭＦＩＩ−３０およびＩ　Ｍｅｌｐｇ　１は２２５゜２８ に対して生成され、２２５．２８とヒト・メラノーマ・セルラインＣｏ１ｏ３８ および他のセルライン（データは示されず）との結合を阻止することが示された 。我々は、ＭＦＩＩ−３０およびＩＭｅｌｐｇｌが、適切な抗腫よう応答を誘導 し得ることを見出した。

この発明の別の態様は、メラノーマおよび２２５．２８抗体により認識されるエ ピトープと関連した他の疾患状態の診断、モニターおよび処置を含む、能動およ び受動免疫療法における新規抗イデイオタイプ抗体の使用方法に関するものであ る。

例えば、我々は、腫よう患者における抗腫よう応答の能動免疫治療的誘導を目的 として抗イデイオタイプ抗体を有効に使用した。ここ−に、メラノーマ患者にお ける腫よう特異的ＢおよびＴ細胞応答を強化するために免疫活性剤として抗イデ イオタイプ抗体（Ａｂ２）を用いた試験の結果を示す。

［図面の記載］ 第１図は、２種のグラフにより構成される。培養Ｃｏ１ｏ３８メラノーマ細胞へ の１０Ｉ−標識抗ＨＭＷ−ＭＡＡモノクローナル抗体２２５．２８の結合に対す る抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体ＭＦ１１−３０の阻害をグラフＡに示 す。グラフＢは、Ｃｏ１ｏ３８メラノーマ細胞への異なる″′Ｉ標識抗ＨＭＷ− ＭＡＡモノクローナル抗体（ＴＰ４１．２）の結合に対しテＭＦ　ｌ　１−３０ ニよる顕著な阻害が存在しないことを示す。これは、２２５．２８抗体に対する ＭＰＩＩ−３０の特異性を示している。これらのグラフは、抗イデイオタイプ・ モノクローナル抗体の濃度（μ９／２ρ）係数として阻害パーセントを示す。

第２図は、反復免疫後のＩＭｅｌｐｇｌによる抗メラノーマ抗体の誘導を示す。

Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１またはＩＣ０ｆにより免疫化したウサギから集めた血清を、 第■部の「原材料および方法」の項に記載されているＥＬ　Ｉ　ＳＡにより、Ｃ ｏ１ｏ３８細胞との結合について第２および第４ブーストの７日後に試験した。

異なる血清に対応する記号を図に示す。アイソタイプ適合ＩＣ０Ｉによる免疫化 は、検出可能な抗メラノーマ体液応答を全く誘導しなかった。

第３図は、ＫＬＨ−コンジュゲートＩＭｅｌｐｇｌにより誘導されたたはＫＬＨ 単独による免疫化により得られたウサギ血清を、第■部の「原材料および方法」 の項で記載されているＥＬＩＳＡにより、３Ｔ３細胞への吸着の前（第３ａ図） および後（第３ｂ図）にＣｏ１ｏ３８細胞において検定した。また、異なる血清 に対応する記号を図に示す。

第４図は、Ｃｏ１ｏ３８細胞へのアフィニティー精製Ａｂ３の結合を示す。Ｉ　 Ｍｅｌｐｇｌ　−ＫＬＨによる免疫化により得られたウサギ血清をアフィニティ ー精製し、第■部の「原材料および方法」の項で記載されている放射線免疫検定 法により、Ｃｏ！ｏ３８細胞（第４ａＥＩ）またはＫＬＨ（第４ｂ図）への結合 について試験した。２羽のウサギにより得られた代表的な結果を示す。２０ナノ グラムの精製２２５．２８は、Ｃｏ１ｏ３８細胞プレートにおける直接結合検定 で１２００ｃｐｍを与える。

第５図は、ウサギＡｂ３による腫ようセルラインＣｏ１ｏ３８へのＡｂｌ”Ｊ− ２２５，２８の結合の阻害を示す。Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１　、Ｉ　Ｍｅｌｐｇｌ− ＫＬＨまたはＩＣ０Ｉにより免疫化したウサギから集めた血清を、第２および第 ４ブーストの７日後にＩＭｅｌｐｇ１カラムにおいてアフィニティー精製し、第 ■部の「原材料および方法」の項に記載されている放射線免疫検定法により、Ａ ｂｌ　”Ｊ−２２５，２８のＣｏ１ｏ３８細胞への結合阻害能について試験した 。阻害パーセンテージをコンピューター処理し、２羽のウサギにより得られた代 表的結果を示す。

［好ましい実施態様の詳細な記載コ この明細書（請求の範囲を含む）において使用されている下記の語は、次の通り 定義される。

受動免疫療法：患者または動物への抗体の受動性転嫁。

能動免疫療法：患者または動物における抗体および／またはＴ細胞応答の誘発。

抑制：免疫応答の阻害またはイディオタイプ応答の発現の阻害。

刺激：免疫゛応答の誘発またはイディオタイプ応答の発現の誘発。

腫よう退行：腫ようの全体的な３０％またはそれを越える減少。

この明細書に引用された参考文献の全てを引用して説明の一部とする。

１、ＨＭＷ−ＭＡＡに対して産生されたモノクローナル抗体２２５゜２８に対し て産生された抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体（ＭＦＩＩ−３０）の開発 および特性検定。

モノクローナル抗体ＭＦ　１１−３０（ＡＴＣＣ，ロックビル、メリーランド、 寄託番号ＨＢ１０１３３）は、ネズミ抗ＨＭＷ−ＭＡＡモノクローナル抗体に対 するシンジエネイック抗イディオタイプ抗血清の開発に関する車間、Ｍ６、カゲ シタ、Ｔ１、ベローサ、Ｆ。

およびフェローネ、Ｓ、（１９８７）、「ネズミ抗ヒト高分子量メラノーマ関連 抗原モノクローナル抗体に対するシンジエネイツク抗イディオタイプ抗血清」、 「キャンサー・リサーチ」、４７：４３１２−４３１７（１９８７）に記載され た方法と似た方法に従い、抗）（ＭＷ−ＭＡＡモノクローナル抗体２２５．２８ により免疫化されたＢＡＬＢ／Ｃマウスからのひ臓細胞により構築されたハイブ リドーマにより分泌される。抗体２２５．２８の記載については、ウィルソン、 Ｂ。

Ｓｌ、「インターナショナル・ジャーナル・イブ・キャンサー」、２８：２９３ −３００（１９８１）参照。抗体２２５．２８は、寄託番号ＨＢ１０１４１）と してＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド）から入手可能である。簡単に述べる と、グルタルアルデヒド固定によりキーホール・リンペット・ヘモシアニン（こ の明細書では、時々「ＫＬＨＪとして示されている）に結合された精製モノクロ ーナル抗体２２５．２８（２００ｕ９）を、免疫原として用いるためにＢＡＬＢ ／ｃマウスに腹腔内注射した。完全および不完全フロインドアジュバントをアジ ュバントとして用いることにより、各々０日目および７日目にマウスをプライム （ｐｒｉｍｅ）およびブーストした。１４４日目、マウスを、ｐＨ７，２での燐 酸緩衝食塩水中モノクローナル抗体２２５．２８によりブーストした。３日後、 マウスを殺し、ひ臓を個々に摘出した。

当業界で公知の標準的方法（コーラ−１Ｇ１、ミルスタイン、Ｃ１、「予め定義 された特異性を有する抗体を分泌する融合細胞の連続培養」、「ネイチャー」、 １９７５．２５６：４９５−４９７Ｘこれを引用して説明の一部とする）に従い 、ネズミ・ミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）とひ臓細胞のハイ ブリダイゼーションおよびサブクローニングを行った。この融合により、２９３ の異なるハイブリドーマが生成された。血清学的検定におけるモノクローナル抗 体２２５．２８による上清のスクリーニングは、１６コロニーがＦ（ａｂ’）＝ 結合検定において反応し、４コロニーがサンドイッチ検定において反応し、４コ ロニーが、元の抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）をもつメラノーマ細胞へのモノクローナ ル抗体２２５．２８の結合を阻害することを示した。このことは、これらの後者 の抗体産生コロニーが、元の抗体の抗体結合部位に向けて抗体を産生ずることを 示している。添付図面の第１図および第１表で示されている通り、モノクローナ ル抗体ＭＦＩＩ−３０は、３種の検定全てにおいて強い反応性を生じた。第１図 は、１′Ｉ−標識抗ＨＭＷ−ＭＡＡモノクローナル抗体２２５．２８の培養メラ ノーマ細胞Ｃｏ１ｏ３８への結合の抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体ＭＦ ＩＩ−３０による阻害を示す。

第１図に示されているＭＦＩＩ−３０抗ｉｄ抗体の特異性は、下記の要領で達成 された。ＩｔＪ−抗ＨＭＷ−ＭＡＡモノクローナル抗体２２５．２８（第１図、 グラフＡ）、および対照として＋′ｌ−抗ＨＭＷ−ＭＡＡモノクローナル抗体Ｔ Ｐ４１．２（第１図、グラフＢＸＩＸ　Ｉ　Ｏ’ｃｐｍ）を、２時間４℃で抗イ デイオタイプ・モノクローナル抗体ＭＦＩ　１−３０（０−０）および抗ＨＭＷ −ＭＡＡモノクローナル抗体ＴＰ４１．２に特異的な対照抗イデイオタイプ・モ ノクローナル抗体ＴＫ６−７４（・−・）とインキュベーションした。（抗イデ イオタイプ・モノクローナル抗体ＴＫ６−７４は、抗ＨＭＷ−ＭＡＡモノクロー ナル抗体ＴＰ４１．２により免疫化されたＢＡＬＢ／Ｃマウスからのひ臓細胞に より構築された）＼イブリドーマにより分泌される）。次いで、混合物を培養Ｃ ｏ１ｏ３８メラノーマ細胞に加えた（２ｘｌＯ’″／ウエル）。４℃で１時間の インキュベーションの最後に、標的細胞を燐酸緩衝食塩水により５回洗浄し、結 合した放射能をガンマ・カウンターで測定した。

抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体ＭＦＩＩ−３０の生物活性および反応性 を試験する血清学的検定の結果を下記第１表に示す。

抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体ＴＫ６−７４を抗ＨＭ　Ｗ−ＭＡＡモノ クローナル抗体ＴＰ４１．２により選択した。これらの試験に用いられた結合検 定方法は、「キャンサー・リサーチ」、４７：４３１２−４３１７（１９８７） に記載されている（これを引用して説明の一部とする）。これらの試験に用いら れたサンドイッチ検定の手順は、辻崎、Ｍｏ、車間、Ｍｏ、板目、Ｋ３、ベロー サ、Ｆ、およびフエローネ、ｓ、、ｒア・サンドウィッチ・アッセイ・トウ・デ ィテクト・アンド・キャラクタライズ・レンジエネイック・アンティーイディオ ティピック・アンティボディーズ・トウ・ムリーン・アンティーＨＬＡ・アンド ・チューマー・アソーシエイテイツド・アンティゲン・モノクローナル・アンテ ィボディーズ」、「ジャーナル・イブ・イミュノロジカル・メソッズＪ、９５： ４７−５５（１９８６）に記載されている。

第１表 抗ＨＭＷ　ＭＡＡモノクローナル抗体による血清学的検定における抗イデイオタ イプ・モノクローナル抗体ＭＦＩＩ−３０の反応性ＭＦＩＩ−３０１３０００１ ３９００９’２°、６ＴＫＧ−７４３２８２００＜５ ＭＦＩＩ−３０６００１２８１１，０ ＴＫＧ−７４１５０００９０５３９１，０μＭＷ−ＭＡＡの種々の抗原決定基に 対する一部のモノクローナル抗体によるモノクローナル抗体ＭＦＩＩ−３０の試 験は、２２５゜２８以外については重要な反応性を示し得ず、すなわち、ＭＦＩ Ｉ−３０抗体における結合部位は、同じ抗原へ指向した他の抗体により共有され ていない２２５．２８抗体のイディオトーブへ指向することが示された。また、 種々のメラノーマ関連抗原並びにＨＬＡのクラスＩおよびクラス■の単形態およ び多形態決定基に対するＭＦｌｌ−３０抗体試験では、モノクローナル抗体２２ ５．２８によってのみ反応性が検出された。

これらの分析は、次の要領で行なわれた。ポリビニルクロリド・マイクロタイタ ー・プレート（ダイナチク・ラボラトリーズ、アレキサンドリア、バージニア） を、５０μＩｓ／ウエルのモノクローナル抗体溶液１００μｇ／所ρ、０．１モ ル重炭酸緩衝液（ｐＨ９、５）と−夜インキユベーションすることにより、試験 モノクローナル抗体で被覆した。０．０５％トウィーン２０含宵燐酸緩衝食塩水 （Ｐ　Ｂ　Ｓ　−丁２０）で３回洗浄後、１′Ｉ−標識抗マウスＩｇ異種（ゼノ ）抗体を用いて試験することにより、モノクローナル抗体によるマイクロタイタ ー・プレートの被覆をモニターした。モノクローナル抗体被覆プレートを、＋′ ■−モノクローナル抗体ＭＦ　１１−３０（２Ｘ　１０’ｃｐｆｆｌ／ウエル） と４℃で１６時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔ２Ｏにより５回洗浄後、 結合した放射能をガンマ・カウンターで計数した。実験用ウェルにおけるｅｐｍ から対照ウェルにおけるｃｐ＋ｎを減することにより、特異結合を計算する。結 果を第２表に示す。

第２表 抗ＨＭＷ−ＭＡＡモノクローナル抗体２２５．２８’により顕現化された抗イデ イオタイプ・モノクローナル抗体＼ＩＦＩＩ−３０の抗′：、ＩＡＡおよび抗Ｈ ＬＡモノクローナル抗体との反応性。

０ｖ１ Ｒ，Ａ、ミラー博士（ＩＤＥＣファーマシューテイカルズ・コーポレーション、 マウンテン・ビュー、カリフォルニア）による予備試験結果は、モノクローナル 抗体ＭＦＩＩ−３０により免疫化したラットから採取した血清は、免疫能血清と 比較する血清学的検定において培養ヒト・メラノーマ細胞と高い反応性を呈する ことを示した。

またＳ、ライチャウデウーリ博士（ＩＤＥＣファーマシューティカルズ・コーポ レーション、ラジョラ、カリフォルニア）による予備試験結果は、マウスのシン ジェネイック系統におけるＭＦＩＩ−３０が、培養ヒト・メラノーマ・セルライ ンに結合する２２５．２８イディオタイプ担持抗体を誘導し得ることを示した。

すなわち、これらの結果は、モノクローナル抗体ＭＦＩＩ−３０が、ヒト・メラ ノーマ細胞と反応する抗体の形成を誘発し得ることを示している。予備試験結果 は、ＭＦＩＩ−３０抗体を投与することにより、悪性メラノーマ患者によっては 腫ようの負担が減じられることを示した。

この発明はＭＦＩＩ−３０に限定されない。事実、ネズミ・モノクローナル抗体 ２２５．２８のイデイオトープへ指向する多くの抗イデイオタイプ抗体が製造さ れ得る。あらゆる種類からのハイブリドーマにより分泌される任意のモノクロー ナル抗体並びに同じ免疫学的特徴を有する任意のポリクローナル抗体（すなわち 、あらゆる種類からの慣用的抗血清）が使用され得る。また、当業界の熟練者に は、ネズミ・モノクローナル抗体２２５．２８の誘導体も使用され得ることは明 白なはずである。ここで使用されている「誘導体」という語は、関連セルライン 並びにＨＭＷ−ＭＡＡへの結合に関してモノクローナル抗体２２５．２８と完全 または部分的に競合し得る合成ペプチドを含む抗体および抗体フラグメントを包 含する（限定するわけではない）。

ＭＦＩＩ−３０と均等な抗イデイオタイプ抗体を用いてこの発明を実践する場゛ 合、第一段階は、高分子量メラノーマ関連抗原の特定決定基（エピトープ）と反 応性を有するイディオタイプ成分の同定である。これは、当業界の熟練者に周知 の幾つかの方法のいずれかにより達成され得る。例えば、２２５．２８により認 識される高分子量メラノーマ関連抗原エピトープに対して特異性を有する類似抗 体（Ａｂｌ）は、メラノーマ患者、ヒト・メラノーマ細胞により免疫化した実験 動物、市販の供給材料または当業界の熟練者が実際に常用している方法により得 られる。この発明の目的の場合、Ａｂｌはポリクローナルまたはモノクローナル 抗体であり得る。ポリクローナル抗体は、リアル、Ｆ、Ｘ、等、「ジャーナル・ イブ・エクスベリメンタル・メディシンＪ１６０：１２１９（１９８４）および 「ハンドブック・イブ・エクスペリメンタル・イミュノロジー」（編集、ウェア 、Ｄ、Ｍ、等、１９８６Ｘ以後、「ハンドブック」と称する）に記載された固定 疾病関連抗原を用いたアフィニティー精製により患者または動物の血清から単離 され得る。モノクローナル抗体は、先行技術において実践されている標準技術（ 「ハンドブック」（前出）およびキャロル、Ｗ、Ｌ、等、「ジャーナル・イブ・ イミュノロジカル・メソッズ」、８９：６１（１９８６）参照）を用い、患者の 周辺Ｂ細胞、または高分子量メラノーマ関連抗原に感作した他のＢ細胞を利用す ることにより、標準体細胞ハイブリダイゼーション・レスキュー融合（「レスキ ュー融合」）により生成され得る。

ポリクローナルおよびモノクローナル抗体はまた、ヒト対象または腫よう、腫よ う抽出物、精製ＨＭＷ−ＭＡＡまたはＨＭＷ−ＭＡＡから誘導したペプチドを接 種した実験動物から前記技術を用いて生成され得る。

これらの２２５．２８均等Ａｂｌ抗体（すなわち、ＨＭＷ−ＭＡＡへの結合に関 してＭＦＩＩ−３０と競合する抗体）を利用して、ＭＦｉｌ−３０と同一または 類似した特徴を有する抗１ｄＡｂ２の生成および同定を行うことができる。

Ｉｔ、ＨＭＷ−ＭＡＡに対して産生されたモノクローナル抗体２２５゜２８に対 して産生される抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体（Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１　 ）の開発および特性検定。

我々は、第二の抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体ＩＭｅｌｐｇ１（ＡＴＣ Ｃ（ロックビル、メリーランド）に寄託、寄託番号はＨＢ１０１３４）を発見し 、高度に精製した。この抗体は、現在までの我々の証拠に基づくと、純度が高く 、抗腫よう応答を誘導する点でＭＦＩＩ−３０よりも優れていると思われる。抗 イデイオタイプ抗体ＩＭｅｌｐｇｌは、モノクローナル抗体２２５．２８により 免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスから得たひ臓細胞およびネズミ・ミエローマ・セ ルラインＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３の融合から構築されたハイブリドーマに より製造される（カゲシタ、Ｔ１等、「ピグメント・セル・リサーチ」、１：１ ８５（１９８８））。

Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１は、製造側の提供した使用説明書に従いＭＦＩＩ−３０セル ラインを８Ｍサイクリン（ボーエリンガーーマンハイム）で処理することにより 製造された。処理の最後に、遺伝子プローブ・キット（ジエン−プローブ、サン ディエゴ、カリフォルニア）を用いてマイクプラズマ試験を行うと、このセルラ インは検出可能なマイコプラズマ混入物を全く含まないことが見出された。残留 マイクプラズマから親セルラインを精製するため、その後マウスに腹腔内注射を 行った。それを腹水中で生長させた後、細胞を再びマウス中に通すことにより、 ＭＦＩＩ−３０セルラインがマイクプラズマを完全に含まないという確証を得た 。

第二群のマウスからの腹水中で生長させ？＝ＭＦ１１−３０ハイブリドーマを取 り出し、抗生物質を一切含まない組織培養培地においてインビトロ培養した。４ 週間の培養後、細胞培養上清をマイクプラズマ試験のためコリエルに送った。コ リエル・マイクプラズマ試験の結果は陰性であった。

１５％全牛血清、グルタミンおよびゲンタマイシンを含むＲＰＭ■を用いて０． ３細胞／ウエル（３０細胞／９６ウエル・プレート）での制限希釈下、マイクプ ラズマ不含有ＭＦＩＩ−３０をサブクローニングした。２週間後、生長を示すウ ェルを採取し、それらの培養上清を、それらの２２５．２８への結合能について 試験した。また、”Ｊ　−２２５，２８のメラノー’ｖ−セルラインＣｏ１ｏ３ ８への結合に対するそれらの阻害能について上清を試験した。陽性生長を含む５ ０−６０ウエルを全て試験し、１５−２０ウエルは上記検定について陽性である ことが見出された。陽性サブクローンのうち一つはＩ　Ｍｅｌｐｇ　１であり、 これを伸長させ、将来の分析用とした。

Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１により誘導されたＡｂ３応答の特異性および生物学的役割を 試験した。具体的には、（ｉ）異なる種類におＬ）て、ＩＭｅｌｐｇｌがメラノ ーマ特異的体液性免疫応答を誘導するか否力）を測定しくＡｂ３）、（ｉｉ　） 　Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１−誘導Ａｂ３が、放射線免疫沈降方法１こより測定された ２２５．２８と生化学的に似ているか否かを測定し、（ｉｉｉ　）ＩＭｅｌｐｇ ｌの種々の製剤を調べることにより、Ａｂ３誘導の最適条件を決定した。

ここに示されたデータは、マウスにおける同種間系では、Ａｂ２の担体へのコン ジュゲーションが、ヒト・メラノーマ細胞における［を認識する抗体の誘導に必 要とされたことを示す。しかじな力く怠、異種間系（ウサギ）では、非コンジュ ゲートおよびコンジュゲー）Ａｂ２は共に抗腫よう抗体を誘導した。Ａｂ２のみ の場合の４回のワクチン接種と比べ、２回の免疫化しか必要とされなかったため 、コンジュゲートＡｂ２の方がより有効であった。Ａｂ３応答をさら１こ詳細に 分析すると、メラノーマ抗原を担う細胞へのモノクローナル抗メラノーマ抗体の 結合に対するＡｂ３の阻害能が示すところで１よ、イディオタイプ応答の一部分 は腫よう特異的であること力（示される。

Ａｂ２およびＡｂ３がメラノーマ細胞由来の同一種の分子を免疫沈降させるとい う事実は、Ａｂ２誘導体液性応答の抗腫よう特異性を強化する。さらに、Ａｂ２ により誘導される抗腫よう抗体は、ヘモシアニン（担体）交差反応性ではない。

集合的に、この文書に示されているデータは、好結果をもたらすイディオタイプ 免疫療法に関する先行条件を示し、ヒト・メラノーマにおける能動免疫治療剤と してのＩＭｅｌ郊１の有望な用途を立証している。

Ａ、原材料および方法 セルライン。ヒト・メラノーマ・セルラインＧｏｌｏ３８を、ｌＯ％牛血清、１ ％グルタミンおよび１０μ９／１ｒＱのゲンタマイシン・スルフェートを補った ＲＰＭ１１６４０培地において生長させた。

モノクローナル抗体。モノクローナル抗体２２５．２８（ｒ　２ａ。

Ｋ）を、蛋白質Ａ−セファロース４Ｂカラムにおいて精製した。モノクローナル 抗体ＩＭｅｌｐｇ１を、２２５−セファロース・アフィニティー・カラムにおい て精製した。免疫臨床抗体Ｉ　Ｃｏ１（ｒ　１、Ｋ）を、ＩＭｅｌｐｇｌに関す るアイソタイプ適合対照として使用した。

ＫＬＨへの抗−１ｄ　Ｉ　Ｍｅｌｔ）ｇ　１のコンジュゲーション。カップリン グは、ライチャウデューリ、Ｓｌ等、「ジャーナル・イブ・イミュノロジー」、 １３７：１７４３（１９８７）に記載された方法に従しへ行なわれた。簡単に述 べると、４ｘＱの抗体ストック溶液（１ｘｙ／　３１７りを、ＰＢＳ中でＫＬＨ （ｌｘｌ？／πＱ）と混合した。希釈したばかりのグルタルアルデヒド溶液（１ ％）を抗体およびＫＬＨ混合物に加えて、０゜０５％の最終濃度とした。混合物 を室温で１時間インキュベーションし、−夜ＰＢＳに対して透析した。

マウスの免疫化。マウス１匹当たり、５０μ９のトレオニルＭＤＰを含むＳ　Ａ 　Ｆ　−Ｍアジュバントにより乳化したヘモシアニン（ＫＬＨ）と非コンジュゲ ートまたはコンジュゲートしたｌ　Ｍｅｔｐｇ　１　。

５０μ９により、８週令Ａ／Ｊマウス（各群３匹）を免疫化した（アリソン、Ａ 、Ｃ，等、「ジャーナル・イブ・イミュノロジカル・メソツズＪ９５：１５７（ １９８６））。注射を足（フットバッド）、尾の基部に行い、また多数の部位に 皮下注射を行った。２週間毎に同じ濃度の抗原により免疫化を２回皮下注射によ り反復した。対照として、同数のマウスを、５０μ９のコンジュゲートまたは非 コンジュゲートＩＣ０Ｉ、非関連アイソタイプ適合抗体または５０μ９のＫＬＨ （単独）により免疫化した。各免疫の７および１４日後に、マウスから採血した 。

ウサギの免疫化。成熟ＮＺＷウサギ（各群２羽）を、ウサギ１別当たり、２５０ μ９のトレオニルＭＤＰを含むＳＡＦ−Ｍアジュバント中ＫＬＭと非コンジュゲ ートまたはコンジュゲートしたＩＭｅｌｐｇ１５００μ９により異なる部位で皮 内的に免疫化した。２週間毎に同じ抗原濃度でウサギをブーストし、各免疫化の ７および１４日後に採血した。各ウサギを最大４回免疫化した。５００μ９のＩ Ｃ０１またはＫＬＨ単独により対照ウサギを免疫化した。

イディオタイプ（Ａｂ３）応答の分析。ライチャウデューリ、Ｓｌ等、「ジャー ナル・イブ・イミュノロジーＪ１３７：１７４３（１９８７）に記載された放射 線免疫検定法（ＲＩ　Ａ）により、ＩＭｅｌｐｇｌにより誘導されたイディオタ イプ応答を分析した。簡単に述べると、１１００ｎのＩ　Ｍｅｌｐｇ　１−　Ｆ 　（ａｂ）”フラグメントを、マイクロタイター・プレート上に室温で２時間被 覆した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡと１時間インキュベー ションした。異なる実験および対照群から得られた系列希釈血清を、１８時間２ ００００ｃｐｍの”Ｊ−２２５，２８の存在下、ウェルにおいてインキュベーシ ョンした。プレートを充分に洗浄し、各ウェルの放射能をガンマ・カウンターで 計数しに。結果を、Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１−　Ｐ　（ａｂ）’フラグメントに結合 する”！　−２２５，２８の阻害パーセンテージとして表す。

血清におけるＡｂｌの応答の分析。メラノーマ特異抗体応答を測定するため、ま ずウサギ血清を、４℃で３時間非関連３Ｔ３細胞（１０６）に吸着させることに より、非特異的反応性を除去した。次いで、非吸収および３Ｔ３吸収血清を１％ ＢＳＡ中で系列希釈し、メラノーマ抗原を発現するメラノーマ・セルライン（Ｃ ｏｌｏ３８およびＭｇ２）へのそれらの結合能についてＥＩＡにより試験した。

細胞をマイクロタイター・プレートにおいて培養し、１５分間ＰＢＳ中０．０５ ％グルタルアルデヒドにより固定した。その後、０．１モルのグリシンを含む１ ％ＢＳＡにより４０分間プレートをブロックした。

プレートを異なる希釈率の血清と２時間インキュベーションし、ＰＢＳで洗浄し 、次いでペルオキシダーゼにコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧと１時間イ ンキュベーションした。プレートを充分に洗浄し、ペルオキシダーゼ基質ＡＢＴ Ｓを加え、光学濃度を４０５ナノメートルで測定した。

Ａｂ３のアフィニティー精製。メラノーマ抗原に結合し得るＡｂ３抗体（Ａｂｌ の抗体）のフラクションを正確に概説するため、血清をアフィニティー精製にか けた。まず、血清を、通常のマウスＩｇ−セファロース４Ｂカラムに通すことに より吸収させて、抗アイソタイプ抗体を排除した。次に、吸収された試料をＩ　 Ｍｅｌｐｇ　１−セファロース４Ｂアフイニテイー・カラムに適用した。結合し た抗体を０゜１モル酢酸により溶離し、直ちに中和した。これらの抗−抗イデイ オタイプ抗体を、メラノーマ抗原を担う細胞へのそれらの結合能について詳細に 調べた。

アフィニティー精製抗体におけるＡｂｌの応答の分析。アフィニティー精製した Ａｂ３を、ＲＩＡによりそれらの抗メラノーマ活性について分析し、メラノーマ 細胞へのそれらの結合能を試験した。

異なる濃度の精製抗体を、生長させたメラノーマ細胞において２時間インキュベ ーションし、上記と同様マイクロタイター・プレ・−ト上で固定した。

さらに阻害検定により、精製Ａｂ３の抗メラノーマ活性の特異性を立証した。そ の検定では、Ｃｏ１ｏ３８細胞への”！−２２５の結合に対するアフィニティー 精製Ａｂ３の阻害能を測定した。一定濃度のＩ９Ｊ　−２２５（２００００ｃｐ ｍ）を異なる濃度の精製Ａｂ３と混合し、次いてマイクロタイター・プレートに 固定したＣｏ１ｏ３８細胞に加えた。−夜インキュベーション後、プレートを洗 浄し、保持された放射能をガンマ・カウンターで計数した。結果を阻害のパーセ ンテージとして表す。対照として、同様にＣｏ１ｏ３８細胞への１２５Ｉ−ＭＥ ＭＩ　３６の結合に対する血清の阻害能を評価した。ＭＥＭ１３６は、２２５． ２８とは異なる部位でＨＭＷ−ＭＡＡに結合するモノクローナル抗−ＭＰＧ抗体 である。すなわち、ＭＥＭ１３６および２２５．２８は、メラノーマ・セルライ ンへの結合に対して互いに交差阻・害することはない。

抗ＫＬＨ抗体の交差反応性の試験。ＫＬＨにコンジュゲートした抗イデイオタイ プにより誘導された抗腫よう抗体がＫＬＨ交差反応性であるか否かを調べるため 、次の実験を行った。Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１−　ＫＬＨにより免疫化したウサギか ら集めた血清を、１時間静かに混合しながらエッペンドルフ管中でＫＬＨ−セフ ァロース４Ｂカラムに別々に吸着させた。管をエッペンドルフ遠心機中で２分間 遠心分離にかけて、抗ＫＬＨ抗体を分離した。次いで、ＫＬＨ−セファロース消 耗抗体を、前述のＲＩＡによりＣｏ１ｏ３８細胞へのそれらの結合能について評 価した。

推論的実験として、ＫＬＨへの結合についてアフィニティー精製Ａｂ３をまたＲ ＩＡにより試験した。ｌウェル当たりＰＢＳ中１１００ｎのＫＬＨを、４℃で１ ８時間マイクロタイター・プレート上に被覆した。プレートを洗浄し、次いで１ ％ＢＳＡと１時間インキュベーションした。アフィニティー精製Ａｂ３を室温で ２時間プレート上でインキュベーションした。プレートを洗浄後、２００００ｃ ｐｍのヨー素処理したヤギ抗ウサギＩｇを加え、４℃で一夜インキユベーション した。プレートを洗浄し、放射能を計数した。

ＨＭＷ−ＭＡＡの免疫沈降。Ｃｏ１ｏ３８細胞（１，５ｘｌＯ’）を、Ｉｎ（ｌ のメチオニン不含有ＲＰＭＩ培地中２００μＣｉの３ＳＳ−メチオニンにより３ 時間生合成的に標識した（ネポム、Ｇ、Ｔ、等、「プロシーディンゲス・イブ・ ザ・ナショナル・アカデミ−・イブ・サイエンシーズ・イブ・ザ・ニー・ニス・ ニーＪ８１：２８６４（１９８４）参照）。細胞を遠心分離にかけ、沈澱物をＲ ＩＰＡ溶菌緩衝液（ｌＯミリモルのトリス、１５０ミリモルＮａＣ］、１％デオ キシコレート、１％トリトンｘ−ｔｏｏ、０．１％ＳＤＳ、１ミリモルのアプロ チニン、１０ミリモルＰＭＳＦ、５ミリモルＮ−エチルマレイミド）に氷上で１ 時間可溶化した。リゼイトを４５分間１１００００ｇでの遠心分離により透明に した。５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃｐｍに対応するリゼイトを、１００μＱの容量で１０ ％プロティンＡ−セファロースに吸着させた１００μこのＡｂ２アフィニティー 精製Ａｂ３を含む予め調製した免疫吸着剤に加えた。対照として、通常のマウス ＩｇＧ溶離抗体をプロティンＡ−セファロースに加えた。穏やかに混合しながら ４℃で１８時間インキュベーション後、免疫吸着剤を、１％卵アルブミンおよび ０．５％トウィーンー２０を含むＰＢＳにより３回洗浄した。試料緩衝液中で２ 分間沸騰させることにより、抗原をプロティンＡ−セファロースから放出させ、 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ（６％）に適用した。ゲルを乾燥させ、４８時間−７０℃で補 力スクリーンによるフィルムに暴露した。

Ｂ、結果 マウスにおけるＡｂ３誘導。前部床ネズミ試験において、我々は、Ｂ　Ａ　Ｌ　 Ｂ　／　ｃ−誘導ＩＭｅｌｐｇｌを異型系統のマウスに注射することにより、Ａ ｂ２−誘導免疫応答を最大にした。Ａ／Ｊマウスをこの試験に使用した。下記に 示す通り、我々の発見は、ＩＭｅｌｐｇｌが、異種間設定（すなわち、メラノー マ患者）において抗メラノーマ応答を誘導し得ることを示している。

非コンジュゲートＩＭｅｌｐｇｌにより免疫化したマウスは、４回の免疫後でも Ａｂ３応答を全く発しなかった（データは示さず）。ＫＬＨ−コンジュゲートＩ Ｍｅｌｐｇｌを投与されたマウスは、イディオタイプ担持抗腫ようＩｇＧ応答を 発した。第３表は、Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１−　ＫＬＨにより各マウスにおいて誘導 されたＡｂ３応答を示す。ＫＬＨ単独で免疫化した対照マウスにおいては、顕著 な抗腫よう応答は観察されなかった。第３表で示す通り（右＠）、Ｃｏ１ｏ３８ 結合抗体の２０−３０％は２２５．２８により阻害され得る。

第３表 Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１抗イデイオタイプによる抗腫よう抗体の誘導。

抗体力価（９／７１Ｉ２） 抗Ｃｏ１ｏ３８　（ａ）　２２５イデイオタイプ（ｂ）ＫＬＨｌ：１００（１， ６）　− １：１００（１，６）　− １：２００（３，２）　− ＩＭｅｌｐｇｌ−ＫＬＨ１：１６００（２５，６）　２０−３０％１：　８００ （１２，８）　２０−３０％１：１６００（２５，６）　２０−３０％Ｃｍ）　 異なる・希釈率の実験的（Ｉ　Ｍｅｌｐｇｌ　−ＫＬＨ−免疫化）および対照（ ＫＬＨ−免疫化）血清（第２免疫化の７および１４日後に採血）を、Ｃｏ１ｏ３ ８セルラインにより被覆したプレートに加えた。その後、ペルオキシダーゼ標識 ヤギ抗マウスＩｇＧによりプレートを展開シた。３匹の個々のマウスから得られ たデータを示す。異なる濃度の２２５を抗体対照として用いた。

（ｂ）　Ｃｏ１ｏ３８　（メラノーマ・セルライン）および異なる希釈率の実験 的または対照血清を含む各ウェルに、２００００ｃｐｍの２２５を加える競合的 阻害検定において、２２５イデイオタイプ（抗コンドロイチン・スルフェート） 分析を行った。プレートを一夜インキ二に最大化するために、ウサギをＩ　Ｍｅ ｌｐｇ　１により免疫化し、異種間状況において、Ａｂ２が抗腫よう体液性応答 を誘導するのに担体コンジュゲーシヨンが必要または有用であるか否かを調べた 。ＳＡＰ−Ｍ中ＩＭｅｌｐｇｌ単独またはＩ　Ｍｅｌｐｇｌ　−ＫＬＨによりウ サギを免疫化した。ＫＬＨ−コンジュゲートＩ　Ｍｅｌｐｇ　１免疫群に関する 対照としてＫＬＨ単独によりウサギを免疫化し、また非コンジュゲートＩＭｅｌ ｌ）ｇｌ免疫群に関する対照としてＩＣ０Ｉにより免疫化した。

ＳＡＦ−Ｍ−１アジユバント中非コンジユゲ一トＩＭｅｌｐｇｌにより２回皮内 的に免疫化したウサギは、抗メラノーマ抗体を生じなかったが、イディオタイプ 応答は観察された。しかしながら、４回の免疫後に低レベルの抗腫よう体液応答 は観察された。データを第２図に示す。これらのデータは、対照と比較して、Ｉ Ｍｅｌｐｇ＋は、反復免疫後にウサギにおいて顕著な抗腫よう体液性応答を誘導 したことを立証している。

ＩＭｅｌｐｇｌにコンジュゲートしたＫＬＨにより免疫化されたウサギはまた、 顕著な抗腫よう体液性応答を発した。代表的実験から得られたデータを第３８お よびｂ図に示す。第３図は、非関連マウス腫よう細胞による吸収の前および後に 、ＫＬＨ−Ｉ　Ｍｅｌｐｇｌにより免疫化されたウサギから得られた異なる希釈 率の血清の腫よう結合状況を示す。これらのデータは、Ｉ　Ｍｅｌｔ）ｇｌ−Ｋ ＬＨ免疫化が、メラノーマＣｏ１ｏ３８セルラインに優先的に結合するＡｂ３応 答を誘導したことを立証している。対照血清、すなわちＫＬＨ単独により免疫化 されたウサギから得られた血清は、腫よう結合抗体を全く産生しなかつた。

血清から得られたＡｂ３のアフィニティー精製。メラノーマ・セルラインＣｏ１ ｏ３　Ｂに結合するのがＡｂ３であることを決定的に測定するために、ＩＭｅｌ ｐｇｌ−セファロース・カラムにおいてＡｂ３をアフィニティー精製した。まず 、Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　１免疫血清を通常のウサギＩｇＧカラムに通すことにより、 抗アイソタイプ活性を吸収させた。通常のマウスＩｇにより結合しなかった物質 を、Ｔ　Ｍｅｌｐｇ　１−セファロース・カラムに通した。結合した物質を溶離 し、メラノーマ・セルラインに対する抗メラノーマ活性について検定しに（第４ ａ図）。異なる濃度のＡｂ３の存在下てＣｏ１ｏ３８セルラインへの１″ｌ−２ ２５の結合を測定する阻害検定において、Ａｂ３結合の特異性を測定した。結果 を第５図に示す。これらの結果は、腫ようへのｌ２Ｊ−２２５結合が精製Ａｂ３ により阻害され得ることを立証して（する。

Ａｂ２誘導抗腫よう抗体のＫＬＨ交差反応性。抗腫よう抗体がＫＬＨ交差反応性 であるか否かを測定するために、２設定の実験を行った。第−設定では、ＫＬＨ −結合抗体を血清試料から除去した。ＩＭｅｌｐｇ　１−　Ｋ　Ｌ　Ｈ−免疫ウ サギから集められた個々の血清を、エッペンドルフ管中で１時間断続的に混合し なからＫＬＨ−セファロース４Ｂと別々にインキュベーションした。その後、管 を遠心分離にかけ、未結合物質をＣｏ１ｏ３８およびＫＬＨへのその結合能につ いて試験した。ＫＬＨ−結合抗体を除去後、ウサギ血清は依然としてＣｏ１ｏ３ ８セルラインに結合し得たが、Ｋ　Ｌ　Ｈには結合し得なかった（データは示さ ず）。第二設定の実験では、Ｉ　Ｍｅｌｐｇ　ｌアフィニティー精製Ａｂ３を、 ＫＬＨへのそれらの結合能について試験した。データを第４ｂ図に示す。これら のデータは、ＩＭｅｌｐｇ１カラムにおいて精製されたＡｂ３が、メラノーマ特 異的であり、ＫＬＨにはあまり結合しないことを立証している。

ＡｂｌおよびＡｂ３によるＨＭＷ−ＭＡＡの免疫沈降。放射線免疫沈降を行うこ とにより、ＡｂｌおよびＡｂ３が同種の分子を認識するか否かを測定した。前出 の「原材料および方法」の項の記載に従い、異なる抗体によるＣｏ１ｏ３　Ｂ細 胞のＨＭＷ−ＭＡＡの免疫沈降を行った。２２５．２８を陽性対照として使用し た。メラノーマ非関連のＣＣ９２を陰性対照として使用した。抗ｉｄ　Ｉ　Ｍｅ ｌｐｇ　１により４回免疫化された２種の異なるウサギから得られた抗ｉｄアフ ィニティー精製Ａｂ３を免疫沈降に使用した。ＡｂｌおよびＡｂ３は、大きさが 約２５０にである同種の分子を認識すると思われた。さらに、２２５．２８によ るメラノーマ・リゼイトの前処理によりかなり消耗したことから、Ａｂ３による 免疫沈降は、特異的であることが示され抗ｉｄを免疫調節剤として使用すること により、抗原特異的応答を刺激または抑制することができる（コセンザ、Ｈｌ等 、「サイエンス」１７６：１０２７（１９７２）、トーマス、Ｅ、Ｒ，等、「ジ ャーナル・イブ・イミュノロジーＪｌ　３０：２０７９（１９８３）参照）。こ こで、我々は、Ａｂ２により誘導される抗腫よう免疫応答を検討した。特に、こ れらの検討事項は、Ａｂ２により誘導されるＡｂ３応答の特異性および生物学的 役割について述べている。我々のデータは次のように要約され得る。（ｉ）マウ スにおいて抗腫よう体液性応答を効果的に誘導するためには、ネズミＡｂ２を担 体にコンジュゲートする必要がある、（ｉｉ）非コンジュゲートＡｂ２は、反復 免疫後のウサギにおいて抗腫よう体液性応答を誘発し得るが、担体コンジュゲー トＡｂ２は、僅か２回の免疫後に抗腫よう体液性応答を誘発する、（ｉｉｉ）全 イディオタイプ応答の一部分は腫よう特異的である（第３ａ図、メラノーマ・セ ルラインに結合する２　２５．２８およびＡｂ３参照）、（ｉｖ）メラノーマ・ セルラインへのモノクローナル抗メラノーマ抗体の結合は、Ａｂ３により阻害さ れ得る、（％＝）Ａｂ２により誘導される抗腫よう抗体は、ヘモシアニン交差反 応性ではない、および（ｖｉ）ＡｂｌおよびＡｂ３は、メラノーマ・セルライン から似た分子質量の種類を沈降させる。

ＡｂｌもＡｂ３も、補体依存性細胞毒性または抗体依存性細胞毒性を仲介しない （データは示さず）。殺す活性が欠乏しているのは、大部分細胞外マトリックス （ＥＣＭ）における抗原の位置？こ起因するものと思われる。従って、Ａｂ３誘 導およびメラノーマ増大の間に陽性の関連性があるとしても、Ａｂ３の介在によ り腫よう細胞が殺されるためではあり得ない。他方、Ａｂ３は、基底膜への腫よ う細胞結合の生態を妨害する、すなわちメラノーマ細胞の転移の可能性を最小限 にするより一層深遠な機能に介在し得る。

腫よう細胞は、侵入および転移プロセスの間にＥＣＭをトラバースすることが知 られている。最も転移に関連したＥＣＭは、基底層または基底膜である。基底膜 は、主にコラーゲン■型メツシュ状ラミニン、エンタフチン、フィブロネクチン およびプロテオグリカンにより構成される。実験証拠の大多数は、細胞外膜減成 および腫よう細胞の侵入および転移間における密接な相関関係を示唆している。

従って、Ａｂ３のＥＣＭへの結合は、腫よう細胞とＥＣＭの結合を阻止すること により、腫ようの増大およびに一移の生態を干渉し得る。

−まとめにして考えると、我々のデータは、能動的メラノーマ免疫治療剤として のＩ　Ｍｅｌｐｇ　１の有用性を立証している。ＩＭｅｌｐｇｌはまた、保護免 疫性の誘発に有用であり得る。

■８診断、モニターおよび免疫療法における抗イデイオタイプ抗体の用途。

この発明の抗イデイオタイプ抗体は、病気の診断およびモニター並びに下記方法 による能動または受動免疫療法において使用され得る。（下記検討事項は、病気 の診断およびモニター並びに能動または受動免疫療法におけるＭＦＩＩ−３０の 用途について記載しているが、当業界の熟練者であれば、これらの方法はまたＩ Ｍｅｌｐｇｌにも当てはまることを認めるはずである）。病気の診断およびモニ ターでは、ＭＦＩＩ−３０をインビトロ検定（例えばＥＬＩ　ＳＡまたはＲＩＡ ）に組み入れることにより、免疫治療の前、途中および後、例えば能動免疫治療 におけるＭＦＩＩ−３０の多重投与のブースター効果の測定時に、ＭＦｌｌ−３ ０と反応性を示す血清イディオタイプのレベルを測定することができる。

能動免疫療法では、ＭＦＩＩ−３０を投与することにより、免疫応答を高めて免 疫系の有益な成分を刺激することができる。例えば、悪性メラノーマの処置では 、メラノーマ関連抗原に対して指向した体液性および細胞性応答を引き出すのが 望ましい。

能動免疫療法で使用される場合、この発明の抗イデイオタイプ抗体は、当業界の 熟練者により開発されたかまたは公知のアジュバント、担体、賦形剤およびコン ジュゲーション技術を組み入れたアジュバント製剤で投与され得る。（これはＩ Ｍｅｌｐｇｌの場合が好ましい）。

それらの製剤には、シンテックス・アジュバント・フォーミュレーション−１（ ＳＡＦ−１）、ムラミル・ジペプチド誘導体、リボ多糖類、プルロニック・ポリ マー、バチルス・カルメットーゲラン（ＢＣＧ）、リポソーム、鉱油エマルジョ ン、ミョウバン・アジュバント、例えば水酸化アルミニウムおよび燐酸アルミニ ウム、サポニン類、例えばキルＡ、免疫刺激性複合体（Ｉ　ＳＣ０Ｍ５）、リピ ドＡ１キーホール・リンベット・ヘモシアニン（ＫＬ）（）、肝炎コア抗原、破 傷風トキソイド、油中水エマルジョン、グルタルアルデヒド架橋および抗イデイ オタイプ抗体をアジュバントまたは担体にコンジュゲートするための他のコンジ ュゲーション方法が組み入れられ得る。これらの原材料および方法を組み入れた アジュバント製剤の例は、スタインバーガー、Ａ３等、「エクスペリメンタル・ パラシトロジー」５８：２２３−２２９（１９８４）、モレイン、Ｂｏ、「ネイ チャー」３３２：２８７−２８８（１９８８）、アリメン、Ａ、Ｃ，、「ジャー ナル・イブ・イミュノロジカル・メソッズＪ９５：１５７−１６８（１９８６） 、クラーク、Ｂ、Ｅ、等、「ネイチャーＪ３３０：３８１−３８４（１９８７） 、ライチャウデューリ、Ｃ３等、「ジャーナル・イブ・イミュノロジーＪｌ　３ ７：Ｉ　７４３（１９８６）、ニスコーラ、Ｊｌ等、「ニューイングランド・ジ ャーナル・イブ・メディシンＪ３１７：７１７−７２２（１９８７）、アリメン 、Ａ、Ｃ，、「バイオ／テクノロジー」５：１０４１（１９８７）、レオナード 、Ｊ、Ｅ、等、「ブラッド」６５：１１４９−１１５７（］　９８５）、「プラ クティカル・ガイド・フォー・ユース・イン・アフィニティー・クロマトグラフ ィー・アンド・リレイテッド・テクニクス」（リアクティブＩＢＦによる第２版 、１９８３Ｘソシエテ・キミク・ボワンツーギラール出版、フランス）に記載さ れている。

能動免疫療法で使用される場合、これらの抗体は、腫よう退行を誘導する方法お よび用量で患者に投与される。それらは、通常皮下または筋肉内（ＩＭ）注射に より投与される。特定患者に投与されるＡｂ２の適切な用量は、患者の体格およ び患者の免疫系機能の状態により異なる。用量は５００μ９〜５ｘｇの範囲であ り得る。好ましいと思われる投与用量範囲は、ｌ注射部位当たり１００μ９〜５ ２９である。勿論、目標は、宵効な体液性および／または細胞性抗腫よう応答を 提供させるべく示された最小用量を使用することである。

多数の注射部位が使用され得る。

能動免疫療法におけるこの発明の抗体の使用については、ＨＭＷ−ＭＡＡが、健 康な組織を攻撃している心身に有害なり細胞またはＴ細胞免疫応答の標的である 疾患（例えば、自己免疫疾患）の症例が存在し得る。受動免疫療法は、この疾病 環境で使用され得る。受動免疫療法で使用される場合、この明細書に開示されて いる抗体は、アジュバント製剤では使用されない。投与方法は静脈内注射であり 、一般に大量の抗体が与えられるＣＣ５０ｘ〜５ｇの範囲）。受動免疫療法にお けるこれらの抗体の他の用途は、当業界の熟練者には明白である。一般に、ＨＭ Ｗ−ＭＡＡが、抑制したいと思われる免疫応答の標的である場合は常に、これら の抗体の受動免疫治療用途は適当である。

■、進行した悪性メラノーマ患者の処置におけるＭＦＩＩ−３０を用いた臨床試 験の結果。

Ｂ−細胞リンパ腫患者において好結果が得られた臨床試験が報告されている。こ こに示されたデータは、固体腫ようを有する患者における第一臨床試験を表す。

再発性の切除不可能な悪性メラノーマの患者３４名に対して２種。

の臨床試験を開始した。第一試験では、皮下注射により精製抗イデイオタイプ・ モノクローナル抗体を０　、５　ｘｇから４　、０　ｍｇに増量させて投与する ことにより、１２名の患者を処置した。第二の試験では、第０，７および２８日 目に抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体を２　、０　ｘｇのみ皮下投与した 。両試験とも、抗−抗イデイオタイプ抗体（Ａｂ３）の産生に基づいて後続の注 射を決定した。両試験とも、抗マウスｒｇ抗体の産生にも拘わらず、毒性は観察 されなかった。

−患者は、多数の腹部リンパ節の減少をもたらす完全な緩解を達成した。皮膚並 びに肺および肝臓転移の大きさが減少した３患者においては、僅かの応答が観察 された。血清分析は、全患者が抗マウスＩｇＡｂを産生することを示した。１９ 名の患者のみ、抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体と対応する抗ＨＭＷ−Ｍ ＡＡモノクローナル抗体との結合を阻害する抗体を産生じており、生存上の有利 さは、特異的Ａｂ３の産生、ＨＭＷ−ＭＡＡレベルの減少および高いＡｂ３レベ ルに関連していると思われた。これらの結果は、ＨＭＷ−ＭＡＡモノクローナル 抗体７こ対するネズミ抗イディオタイプ・モノクローナル抗体が、悪性メラノー マ療法においである役割を有し得ることを示唆している。

試験の詳細を下記に示す。

Ａ、原材料および方法 これらの臨床試験では、モノクローナル抗体ＭＦＩＩ−３０を使用した。ＭＦＩ Ｉ−３０は、下表に記載されている通り、３種の検定において強い反応性を示し た。

第４表 段階＋患者特性 ０．５　４　男性／女性＝５／７ ２．０　３　年齢　＝５８範囲（３８−７２）３．０　４　先行療法　＝無し　 −４ ４、Ｏｌ　免疫療法　−６ 放射線療法　−２ 化学療法　−Ｉ ＨＭＷ−ＭＡＡの異なる決定基および異なるメラノーマ関連抗原に対する１群の モノクローナル抗体によるモノクローナル抗体ＭＦ’１１−３０の試験を行った 結果、モノクローナル抗体２２５．２８のみとの反応性が検出された。これは、 モノクローナル抗体ＭＦＩＩ−３０が、モノクローナル抗体２２５．２８の抗原 結合部位内に位置する私的イディオタイプを認識することを確認している。

Ｂ、抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体ＭＦＩＩ−３０にょるＩ段階臨床試 験。

進行性悪性メラノーマ患者１２名に、ＭＦ１１３０モノクローナル抗体を投与し た。この試験における初回用量は、１注射当たり０　、５　Ｈであり４！９に増 量させた。この試験のスケジュールには、第０．７および２８日目におけるＭＦ ＩＩ−３０の投与が含まれた。

後続の注射については、Ａｂ３の産生により決定した。Ａｂ３の存在レベルが減 少すると、追加ブーストを投与した。１週間毎のスケジュールで血清分析を行い 、Ａｂ３力価および抗マウスＩｇ力価についても分析した。この試験に参加した 患者を第５表に示す。この試験では、治療の初期段階でマウスＩｇが検出された 。力価１：３２０の抗マウス！ｇ抗体が全患者において見られ、抗体力価の上昇 割合は、治療の開始段階後２週間で増加した。参加した１２ｔ’、者のうち、６ 患者は、モノクローナル抗体ＭＦＩＩ−３０に対する抗−抗イデイオタイプ抗体 を産生じた。これは、モノクローナル抗体ＭＦＩＩ−３０のモノクローナル抗体 ２２５．２８への結合に対する患者血清の阻害能により示された。ｌ：２ないし １：１２８の範囲の力価において、９０％の阻害レベルが達成された。抗−抗イ デイオタイプ抗体の産生は、抗マウスＩｇ抗体よりも遅いと思われた。０．５π ９用量レベルでは、Ａｂ３レベルは非常に低い力価であった。０．５から２゜Ｏ ｒｉｇにＭＦＩＩ−３０を増量させた患者のうちの一名は、僅が２゜０！９レベ ルで、ＭＦｌｌ−３０とモノクローナル抗体２２５．２８との結合の９０％阻害 を達成するＡｂ３レベルの顕著な増加を示した。

同様に２　、０　Ｒ９により処置された他の患者もまた、高レベルのＡｂ３を生 じた。３，０および４　、　Ｏｘｇの用量レベルでは、同様にＡｂ３レベルを生 じる患者もあったが、Ａｂ３発生の時間推移は、２　、０　Ｈ用量レベルによる 処置群とは相異しなかった。この試験中、いがなる用量レベルでも毒性は観察さ れなかった。

２　、　Ｏｚｇは、処置される患者において首尾よ＜Ａｂ３の発生を誘発する最 小用量であるという結論に達した。これらの発見に基づいて、ＭＦＩＩ−３０の 有効性の測定を意図した臨床試験を開始し、上記スケジュールで参加患者を２　 、０　ｘｇにより処置した。

Ｃ０患者集団（存効性試験） 進行性第■期悪性メラノーマ患者をこの臨床試験に参加させた。

試験に参加した全患者について、他の物理処置療法、放射線療法、化学療法およ び免疫療法並びに他のモノクローナル抗体（Ｒ２４）を排除した。この臨床試験 における治療スケジュールは、第一試験で使用したスケジュールと似たものであ った。第０，７および２８日目に患者を処置した。Ａｂ３抗体の産生に基づいて 後続注射を投与した。

この臨床試験に加わったのは２２名の患者であり、女性１０名および男性１２名 であった。結果を下記第５表に示す。カルノフスキーのメジアン年齢は、５４の 範囲（２７−７４）であった。パフォーマンス（目標達成）状態は７０％であり 、５０−９０％の範囲であった。この試験に参加した２２患者の中で、６患者は 以前から未処置であり、９患者は、Ｉｆ−２、Ｒ２４モノクローナル抗体および メラノーマ関連ワクチンを含む先行免疫療法を受けていた。７患者は、シスプラ チン、ニドロスラスおよびＤＴＩＣを含む化学療法により処置されていた。７患 者は放射線療法を受けており、そのうち３名は脳転移に関するものであった。患 者には、】注射当たり２　、　Ｏｍｇの量で合計９３の注射を行った。この臨床 試験に参加した２２患者のうち、これらの抗体投与の５時間後、ｌ患者にしん麻 疹が現れ、自然に消散した。これらのしん麻疹は、ネズミ抗メラノーマ抗体によ る先行治療を受けた叡者に発生した。この試験に参加した他の叡者で、ネズミ抗 メラノーマ抗体、例えばＲ２４を以前に投与された患者は、ＭＦＩＩ−３０の反 復投与にも拘わらず、毒性もアナフィラキシ−反応も示さなかった。

第５表 ｎ＝２２ 男性／女性　−１２／１０ 年齢　−５４（２７−７４） パフォーマンス状態　−７０％（６０−９０％）段階　−■ 先行療法　−無し　−６ 免疫療法　−９ 化学療法　−７ 放射線療法−７ ２２患者のうちの１９名において、Ａｂ３レベルおよびこの特異性（抗マウスＩ ｇ）、ＨＭＷ−ＭＡＡレベルを含む広範な免疫学的評価を行い、また数名の患者 において細胞性刺激を行った。ＨＭＷ−ＭＡＡ反応速度論に基づくと、Ａｂ３の 特異性およびこれらの患者において生じるＡｂ３のレベルは、ＭＦｌｌ−３０お よび抗イデイオタイプ抗体で処置した患者の生存率と相関関係を示すと思われる 。

モノクローナル抗体２２５．２８へのＭＦＩＩ−３０の結合の阻害により分析し た場合、６名の患者が特異的Ａｂ３を発現した。これらの患者はＨＭＷ−ＭＡＡ 力価の減少を示し、１０患者は低レベルのＡｂ３を示した。

Ｄ、検討 試験に参加した２２患者のうち、ｌ患者は完全な緩解を達成したが、他の３患者 は僅かの応答を達成した。僅かの応答は重要であるとは考えられないが、■期疾 病の存在にも拘わらず、これらの患者集団における病状安定の持続性は、上記パ ラメーターに関連していると思われた（第５表）。

また、ネズミ抗イディオタイプ・モノクローナル抗体による臨床試験は、Ｂ細胞 リンパ腫患者においても行なわれた。ここに記載されている臨床試験は、固体腫 ようの患者におけるネズミ抗イディオタイプ・モノクローナル抗体による第一臨 床試験を表す。後者のこれらの患者における、腫よう関連抗原に対するモノクロ ーナル抗体により発揮された抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体の治療効果 の基礎をなす原理および機構（複数も可）は、Ｂ細胞リンパ腫患者の場合とは相 異する。これは、後者の場合、受動免疫療法形態であり、前者の場合、能動免疫 療法であるためである。具体的には、抗イデイオタイプ・モノクローナル抗体は 、Ｂ細胞リンパ腫患者では腫よう細胞と直接相互作用すること？こよりそれらの 効果を発揮するが、固体腫よう患者では、宿主の免疫系を刺激することにより、 腫よう細胞に対する免疫応答を高めると思われる。

我々の研究の最も安心できる面は、抗マウス！ｇ抗体の発生にも拘わらず、■期 メラノーマ患者に対するネズミ抗イディオタイプ・モノクローナル抗体ＭＦＩＩ −３０の反復注射の副作用が欠如していることであった。４患者が、抗腫よう応 答並びに皮膚および視覚的病変の退行の証拠を示した。しかし、さらに重要なこ とに、特異的Ａｂ３を発現する能力およびＨＭＷ−ＭＡＡレベルの低下は、治療 に対する応答の機構を表し得る。ＭＦＩＩ−３０の投与に伴うメラノーマ病変の 退行と考え合わせると、この発見は、請求の範囲を含めてこの明細書に記載され ている抗イデイオタイプ抗体、関連化合物および方法の有用性および有効性を立 証している。

ｒ！ＧｔＪＲＥ　１ ２２５．２８　π４１．２ ぐ皓訝徒寸Ｏｈ く檗＠−実−寸ｑム く采−５！＋Ｊ＄聴φｏｔｎ 鵬　揶　ベ 国際調査報告

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. （１）高分子量メラノーマ関連抗原の特定決定基（エピトープ）と反応し得る、 （ａ）ネズミ・モノクローナル抗体２２５．２８およびその誘導体のイディオト ープ、または （ｂ）抗体２２５．２８と同じ免疫学的特性を有するモノクローナル抗体、また は （ｃ）抗体２２５．２８と同じ免疫学的特性を有するポリクローナル抗血清 と反応し得る抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは抗血清 。
2. （２）高分子量メラノーマ関連抗原の特定決定基と反応し得る、ネズミ・モノク ローナル抗体２２５．２８のイディオトープと反応し得る抗イディオタイプ抗体 。
3. （３）ネズミ・モノクローナル抗体２２５．２８または抗体２２５．２８の免疫 学的均等物質のイディオトープと反応し得る抗イディオタイプ抗体。
4. （４）２２５．２８として知られている高分子量メラノーマ関連抗原抗体のイデ ィオトープまたはＨＭＷ−ＭＡＡ抗原との結合に関して抗体２２５．２８と競合 し得る抗体に対してモノクローナルまたはポリクローナル系において産生される 抗イディオタイプ抗体。
5. （５）高分子量メラノーマ関連抗原抗体２２５．２８またはＨＭＷ−ＭＡＡ抗原 との結合に関して抗体２２５．２８と競合し得る抗体に結合し、同種または異種 においてメラノーマに対する抗体の形成を誘導し得る抗イディオタイプ抗体。
6. （６）ネズミ抗イディオタイプ抗体ＭＦ１１−３０および抗体ＭＦ１１−３０と 同じ免疫学的特性を有する抗体。
7. （７）ネズミ抗イディオタイプ抗体ＩＭｅｌｐｇ１および抗体ＩＭｅｌｐｇ１と 同じ免疫学的特性を有する抗体。
8. （８）高分子量メラノーマ関連抗原から誘導されたペプチドに対して産生された 抗体またはＭＦ１１−３０に結合し得、同種または異種においてメラノーマに対 する抗体の形成を誘発し得る抗イディオタイプ抗体。
9. （９）高分子量メラノーマ関連抗原から誘導されたペプチドに対して産生された 抗体またはＩＭｅｌｐｇ１に結合し得、同種または異種においてメラノーマに対 する抗体の形成を誘発し得る抗イディオタイプ抗体。
10. （１０）疾患の能動または受動免疫治療における請求項１、２、３、４、５、６ 、７、８または９記載の抗イディオタイプ抗体の用途。
11. （１１）疾患が癌である、請求項１０記載の用途。
12. （１２）癌が悪性メラノーマである、請求項１１記載の用途。
13. （１３）病気の診断、モニターまたは治療における、請求項１、２、３、４、５ 、６、７、８または９記載の抗イディオタイプ抗体の用途。
14. （１４）疾患の能動免疫治療における筋肉内または皮下注射による請求項１、２ 、３、４、５、６、７、８または９記載の抗体の投与。
15. （１５）疾患の能動免疫治療における１注射部位当たり１００μｇ〜５０ｍｇの 用量範囲での筋肉内または皮下注射による請求項１、２、３、４、５、６、７、 ８または９記載の抗体の投与。
16. （１６）疾患の受動免疫治療における静脈内注射による請求項１、２、３、４、 ５、６、７、８または９記載の抗体の投与。
17. （１７）疾患の受動免疫治療における１注射部位当たり５０ｍｇ〜５ｍｇの用量 範囲での静脈内注射による請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載 の抗体の投与。
18. （１８）疾患の受動免疫治療における静脈内注射による請求項１、２、３、４、 ５、６、７、８または９記載の高度精製抗体の投与。
19. （１９）インビトロ検定における請求項１、２、３、４、５、６、７、８または ９記載の抗イディオタイプ抗体の用途。
20. （２０）アジュバントを用いた請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９ 記載の抗イディオタイプ抗体の用途。
21. （２１）アジュバントが、ムラミル・ジペプチド誘導体、リポ多糖類、バチルス ・カルメット−ゲラン（ＢＣＧ）、ミョウバン・アジュバント、水酸化アルミニ ウム、燐酸アルミニウム、サポニン類、キルＡおよびリピドＡから成る群から選 ばれる、請求項２０記載の用途。
22. （２２）アジュバント製剤による請求項１、２、３、４、５、６、７、８または ９記載の抗イディオタイプ抗体の用途。
23. （２３）アジュバント製剤が、シンテックス・アジュバント・フォーミュレーシ ョン−１（ＳＡＦ−１）および免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）から成る群か ら選ばれる、請求項２２記載の用途。
24. （２４）担体を用いた請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の抗 イディオタイプ抗体の用途。
25. （２５）担体が、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、肝炎コア 抗原、破傷風トキソイドから成る群から選ばれる、請求項２４記載の用途。
26. （２６）賦形剤を用いた請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の 抗イディオタイプ抗体の用途。
27. （２７）賦形剤が、油中水エマルジョン、鉱油エマルジョン、リポソームおよび プルロニック・ポリマーから成る群から選ばれる、請求項２６記載の用途。
28. （２８）グルタルアルデヒド架橋または共有結合コンジュゲーション方法を用い た請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載の抗イディオタイプ抗体 の用途。
29. （２９）受入番号ＨＢ１０１３３でＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド）に寄 託されている抗イディオタイプ抗体。
30. （３０）受入番号ＨＢ１０１３４でＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド）に寄 託されている抗イディオタイプ抗体。