JPH03501251A - ラミニン活性を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ラミニン活性を有するポリペプチド この発明は、ナショナル・インスティテユート・オブ・ヘルスにより契約番号Ｃ Ａ２９９９５として政府の支援を受けて為された。

政府は、この発明においである種の権利を有する。

発明の背景 は乳類細胞の細胞外マトリックスへの接着は、成長、接着、運動性および適切な 細胞表現型の発生の調節において基本的に重要である。このことは、正常な発達 、傷の治癒、慢性炎症性疾患および腫よう転移と密接な関係を宵する。過去数年 間にわたって蓄積された証拠は、正常剖胞および形質転換細胞の両方の接着に関 する分子の基礎が複雑であり、恐らく幾つかの独特な細胞表面分子が含まれ得る ことを示唆している。細胞外マトリックスは、３タイプの巨大分子、すなわちコ ラーゲン、プロテオグリカンおよび非コラーゲン糖蛋白質により構成される。

興味の対象である一部コラーゲン接着性糖蛋白質はラミニンである。ラミニンは 、基底膜において殆ど例外なく見出される高分子量（〜８５００００）細胞外マ トリックス糖蛋白質である。（ティンプル等、「ジャーナル・オブ・バイオロジ カル・ケミストリー」、２５４：９９３３−９９３７（１９７９））。基底膜は 、マトリックスコラーゲン性間質から器官実質細胞を分離する細胞外マトリック スの一遍在性分化タイブである。このマトリックスと細胞の相互作用は、正常細 胞および新生物細胞の両プロセスの重要な一面である。正常細胞は、生存、増殖 および分化において細胞外マトリックスを必要とすると思われるが、正常および 新生物の両移動性細胞は、ある組織から別の組織へ移動する場合に基底膜を通り 抜けなければならない。

ラミニンは、３種の異なるポリペプチド鎖、すなわち分子量２１５０００のＢｌ 、分子量２０５０００のＢ２および分子量４０００００のＡにより構成される（ ティンプルおよびシアデク、インターナショナル・レビュー・エクスペリメンタ ル・バソロジ−（Ｉｎｔｅｒｎ、Ｒｅｖ、　ＥＸＩ）、　Ｐａｔｈ、）、２９： ｌ−１１２（１９８６））。回転シャドーイング技術により電子顕微鏡レベルで 検査すると、それは、各々２つの球状領域を有する３７ｎｘ長の３本の短いアー ム、および大きな末端球状領域を呈する７７ｎｚ長の１本の長いアームを有する 非対称交差形として現れる（エンゲル等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・ バイオロジー」、−り支０：９７０−１２０（１９８１））。３種の鎖はジスル フィドおよび他の結合により連結されている。構造データは、ラミニンが特定領 域に存在する特有の機能をもつ非常に複雑な多領域蛋白質であることを示してい る。

ラミニンは基底膜の主成分であり、多くの機能に関与する。ラミニンは、他の基 底膜巨大分子との結合能を有するため、基底膜の構造特性の一因を担っている。

ラミニンは、少なくとも２つの結合領域を呈する（チヤロニス等、「ジャーナル ・オブ・セル・バイオロジー」、１０３：１６８９−１６９７（１９８６）、テ ラノーバ等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニーｊ、８０：４４４−４４８（１ ９８３））タイプ■コラーゲンに結合することが示された（チャロニス等、「ジ ャーナル・オブ・セル・バイオロジーＪ、１００：１８４８−１８５３（１９８ ５）、ローリ−等、「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、１８ ９：２０５−２１６（１９８６））。

ラミニンはまた、エンタクチン／ニドゲン（ティンプルおよびシアデク、前出） および基底膜−誘導ヘパリン表面プロテオグリカン（口−り一等、「ジャーナル ・オブ・モレキュラー・バイオロジー」、１８９：２０５−２１６（１９８６） ）に結合する。ラミニンはまた、自己会合能並びにオリゴマーおよびポリマー形 成能を有する。ユルチェンコ等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス トリー」、２６０ニア６３６−７６４４（１９８５）。ラミニンの別の重要な機 能面は、その細胞表面分子レセプターとの会合能力、従って様々な方法による細 胞表現型修飾能力である。約６８０００の分子量を有するラミニンのレセプター は、様々な細胞タイプにおいて観察されている（レゾット等、ｒＥＭＢｏジャー ナル」、２：８６１−８６５（１９８３）、マリノフおよびライチャ、「ジャー ナル・オブ・セル・バイオロジー」、９６：１４７５−１４７９（１９８３）） 。しかしながら、ラミニンの場合、少なくとも１つの他の、そして恐らくは複数 の細胞表面レセプターが存在し得る［ティンプルおよびシアデク、前出、ホルビ ッツ等、「ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー」、１０１：２１３４−２１ ６６（１９８５）参照］。これらは、スルファチド、ガングリオシド［ロバーツ 等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ ンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー」、８２：１３０６−１３］０（１９８ ５）］または様々な蛋白質およびプロテオグリカンを含み得る。これらの細胞表 面分子は、ラミニンが細胞に対して行う様々な作用の伝達物質であり得る。ラミ ニンは、正常および悪性間充繊細胞、例えば線維芽細胞および内皮細胞から、様 々な上皮細胞まで様々な細胞タイプの細胞接着および細胞移動を直接促し得るこ とが知られている（ティンプルおよびシアデク、前出）。しかしながら、それら のプロセスに関与するラミニンの正確な領域はまだ充分には確立されていない。

例えば、ヘパリン結合部位は、ラミニンの長いアームの球状体におけるＡ鎖に存 在することが知られている（オツド等、［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バ イオケミストリー」、１２３：６３−７２（１９８２））。しかしながら、Ａ鎖 の正確なアミノ酸配列は知られていないため、関連オリゴペプチドもまだ確認さ れ得ない。

最近、タイプ■コラーゲンの結合領域をもたず、細胞レセプターの結合領域を有 するラミニン・フラグメントが記載された。リオツタ等によるアメリカ合衆国特 許第４５６５７８９号。このリオツタ特許は、ペプシンまたはカテプシンＧでラ ミニンを消化することにより得られるラミニン・フラグメントを開示している。

さらに具体的には、ペプシンまたはカテプシンＧによるラミニンの消化の結果、 分子の長いアームが除去され、また短いアームの球状末端領域が改変された、Ｐ Ｉ（Ｍｒ２８００００）およびＣＩ（Ｍｒ３５００００）フラグメントが生じる 。似た分子量および結合能力を有するＣ１およびＰＩフラグメントはまた、プラ スミンおよびキモトリプシンでラミニンを消化することにより生成され得る。ラ ミニンはまた、主にラミニンの長いアームの下部に割り当てられた機能として、 神経突起発芽後成育を刺激することが知られている（エドガー等、ｒＥＭＢ０ジ ヤーナル」、３：１４６３−１４６８（１９８６））。

ラミニンは、上記機能を有することから、多様で臨床的に重要なプロセス、例え ば細胞移動、傷の治癒、神経再生、血管壁を通した腫よう細胞転移［リオッタ、 「アメリカン・ジャーナル・オブ・パソロジー」、１１７：３３９−３４８（１ ９８４）、マツカーシー等、「キャンサー・メタスタシス・レビューズ」、４： １２５−１５２（１９８５）］、糖尿病性細小血管障害、および高血圧による血 管肥厚における重要な成分となっている。ラミニンはまた、人体で使用される様 々な装置および材料に使用され得る。分子レベルでこれらのプロセスの病態生理 をさらに明確に理解するためには、ラミニンが呈する生物活性の各々をラミニン の特定小領域またはオリゴペプチドに割り当てる試みが重要である。これが達成 され得ると、天然無傷分子の特定機能を生じる小ペプチドに基づいた潜在的重要 性をもつ医薬が合成され得る。これを行うため、３種のラミニン鎖の正確なアミ ノ酸配列を決定する必要がある。現在までにＢｌ鎖のみが発表された。佐々木、 「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ ーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー」、８４：９３５−９３９（１９８７）。

従って、ラミニンと関連した広範な生物活性に関与するＢ１鎖内のペプチドのサ ブセットの単離および特性検定を行う必要がある。

それらの低分子量オリゴペプチドは、ラミニン自体またはそのＢｌ鎖よりも容易 に入手可能で、狭いプロフィールの生物活性を呈し、治療または診断薬としての それらの潜在的有用性の増すことが予想この発明は、ラミニンのＢｌ鎖のフラグ メントを代表するポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、慣用的固相ペ プチド合成により製造され得る。２種の好ましいポリペプチドの式は、ａｒｇ　 −ｔｙｒ　−ｖａｌ　−ｖａｌ　−１ｅｕ　−ｐｒｏ　−ａｒｇ　−ｐｒｏ　− ｖａｌ　−ａｙｓ　−ｐｈｅ　−ｇｌｕ−Ｉｙｓ−ｇａｙ−ｍｅｔ−ａｓｎ−ｔ ｙｒ−ｔｈｒ−ｖａｌ−ａｒｇ　（Ｆ　９）および ｇｌｕ　−１ｅｕ　−ｔｈｒ　−ａｓｎ　−ａｒｚ　−ｔｈｒ　−ｈｉｓ　−Ｉ ｙｓ　−ｐｈｅ　−１ｅｕ　−ｇｌｕ　−１ｙｓ−ａｌａ　−１ｙｓ　−ａｌａ 　−ｌｅｕ　−Ｉｙｓ　−ｉｓｏ　（Ｆ　１３　）である。ポリペプチドＦ９は 形式的には単離されたラミニン残基６４１−６６０を示し、ポリペプチドＦ１３ は形式的には単離されたラミニン残基１１７１−１１８８を示す。これらのポリ ペプチドの一文字アミノ酸コードは、ＲＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶ ＲおよびＥＬＴＮＲＴＨＫＦＬＥＫＡＫＡＬＫＩである。

これらの合成ポリペプチドを生物活性について検定した結果、これらは、合成基 質へのヘパリンの結合並びに（ａ）内皮細胞、（ｂ）メラノーマ細胞および（ｃ ）線維肉腫細胞、（ｄ）神経こう腫細胞および（ｅ）褐色細胞腫細胞の接着を含 む細胞接着の強力なプロモーターであることが見出された。従って、これらのポ リペプチドは、（ａ）神経再生における補助、（ｂ）負傷治癒および移植受容の 促進、（ｃ）培養基質への細胞結合の促進および（ｄ）悪性細胞転移の阻止に有 用であり得るものと考えられる。ポリペプチドＦ９およびＰＩ３が呈する生物活 性の範囲が異なるため、これらのペプチドの混合物はこの発明の範囲内に含まれ る。

なお、さらにインビトロまたはインビボでポリペプチドＦ９およびＰＩ３の消化 ／加水分解を行うと、実質的に均等な生物活性を有するフラグメントが得られる と予想されるため、それらの低分子量ポリペプチドはこの発明の範囲内に含まれ ると考えられる。

図面の簡単な記載 第１図は、ラミニンの概略図であり、各鎖に位置する球状領域を含めたＡ、Ｂｌ およびＢ２鎖の相対位置を示す。

第２図は、ラミニンのＢｌ鎖の主なアミノ酸配列を示す。

第３図は、ラミニン残基鎖における領域の組織を示す。

第４図は、この発明のポリペプチド・フラグメントのヘパリン結合活性を示すグ ラフである。

第５図は、プラスチック・プレートにおけるこの発明のポリペプチド・フラグメ ントのヘパリン結合活性を示すグラフである。

第６図は、この発明のポリペプチド・フラグメントによる天然ラミニンへのヘパ リン結合の阻止を示すグラフである。

第７および８図は、各々この発明のポリペプチド９および１３によるヘパリンお よび他のゲルコサミノグリカン間のきっ抗相互作用を示すグラフである。

第９−１３図は、各々大動脈内皮細胞、Ｍ４メラノーマ、ＭＭ線維肉腫、および Ｃ６グリオーマ、およびＰＣＩ２褐色細胞腫セルラインに関するこの発明のポリ ペプチド・フラグメントへの細胞接着を示すグラフである。

第１図に注目すると、回転シャドーイング技術を利用して電子顕微鏡により検査 した場合、ラミニンの構造は非対称交差形として現れる。３本の短いアームは各 々２つの球状領域を有し、長さは３７ｎｍである。長いアームは１つの大きな末 端球状領域を呈し、長さは７７ｎｆｆｌである。エンゲル等、前出。第１図から 明らかな通り、３種の鎖は、ジスルフィド結合および他の結合により会合してい る。３種のポリペプチド鎖の中で、分子量２１５０００を有するＢｌ鎖のみが公 表されている。佐々木等、前出。Ｂ１鎖の完全な配列は第２図に示されている。

第３図では、佐々木等（前出）に従い、Ｂｌ鎖の領域構造が図示されている。

ヘパリン様巨大分子、例えばヘパリンスルフェート・プロテオグリカンは基底膜 および細胞表面に存在し、従ってラミニンとそれらの会合は基底膜構造および多 様な細胞機能に影響を与え得るため、ヘパリン結合部位は特に興味深い。既に示 しに通り、ヘパリン結合部位は、ラミニンの長いアームの球状体におけるＡ鎖に 存在することが知られている（オツド等、前出）。正確なアミノ酸配列は知られ ていないため、関連したオリゴペプチドは確認されていない。この発明に従い、 我々は、ラミニンのＢ１鎖の領域を研究し、細胞付着促進活性を有する若干のペ プチド・フラグメントを合成した。合成されたポリペプチドおよびそれらの特性 を各々第１表および第２表第１表 Ｆ　９　：　ＲＹＶＶＬＰＲＰＶＣＦＥＫＧＭＮＹＴＶＲ２０量体ａａ＃　６４ １−６６０Ｆ１０：％ＥＴＦＱＲＹＲＣＬＥＮＳＲＳＶＶＫ　１８量体ａａ；！ ：　７１０−７２７Ｆ　１１　：　ＮＩＤＴＴＤＰＥＡＣＤＫＤＴＧＲＣＬＫ　 １９量体ａａ＃　９６０−９７８Ｆ　１２　：　ＶＥＧＶＥＧＰＲＣＤＫＣＴＲ ＧＹ　１６量体ａａ＃　１１３３−１１４８Ｆ　１３　：　ＥＬＴＮＲＴＨＫＦ ＬＥＫＡＫＡＬＫＩ　１８量体ａａ；＃　１１７１−１１８８Ｆ　１４　：　Ｖ ＤＳＶＥＫＫＶＮＥＩＫＤＩ　１４量体ａａ＃　１１９９−１２１２Ｆ　１５　 ：　ＬＥＲＥＳＰＦＫＥＱＱＥＥＱＡＲＬ　Ｉ　７量体ａａ＃　１３４０−１３ ５８Ｆ　１６　：　ＡＱＫＴＥＥＳＡＤＡＲＲＫＡＥＬ　１６量体ａａ＃　１６ ８５−１７００Ｆ　１７　：　ＬＥＲＫＹＥＤＮＱＫＹＬＥＤＫＡ　１６量体ａ ａ＃　１７２２−１７３７Ｆ　１８　：　ＶＣＤＰＧＹＩＧＳＲ１０量体ａａ； ＃９２４　９３３■　イソロイシン、Ｖ　バリン、Ｌ　ロイシン、Ｆ　フェニル アラニン、Ｃシスティン、　Ｍ　メチオニン、Ａ　アラニン、Ｇ　グリシン、Ｔ 　トレオニン、１　トリプトファン、Ｓ　セリン、Ｙ　チロシン、Ｐ　プロリン 、Ｈヒスチジン、Ｑ　グルタミン、Ｎ　アスパラギン、Ｋ　リジン、Ｒアルギニ ン、Ｅ　グルタミン酸、Ｄ　アスパラギン酸。

第２表 ペプチド　開始領域　バイトロバシー　アルギニンおよび指数＊　リジンの＃ Ｆ９　１Ｖ　−３，９４ Ｆｌｌ　ＩＩＩ　−２０，７３ Ｆ１２　ＩＩＩ　−１４，８３ Ｆ１３　ＩＩ　−１２，９５ Ｆ１４　Ｉｔ　−８，４３ Ｆ１５　ＩＩ　−３１，１３ Ｆ１６　１　−２４．８　４ Ｆ１７　１　−３３．９　４ ＦＩ８　ＩＩ［−１，３１ ＊Ｊ、カイトおよびＲ，Ｆ、トウーリトル、「ジャーナル・オブ・モレキュラー ・バイオロジー」、１５７：１０５−１３２（１９８２）の方法論に従い測定さ れたバイトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）指数値。

ポリペプチドの合成　この発明のポリペプチドは、メリフィールド固相方法を用 いて合成された。これは最も常用されているペプチド合成方法であり、Ｊ、Ｍ、 スチュワードおよびＪ、Ｄ、ヤングによる、「ソリッド・フェーズ・ペブタイド ・シンセシス」、ピアス・ケミカル・カンパニー出版、ロックフォード、イリノ イ（第２版、１９８４年）に詳しく記載されている（この開示内容を引用して説 明の一部とする）。

ペプチド合成のメリフィールド・システムは、ベンジルクロリド基により官能基 化された１％架橋ポリスチレン樹脂を使用する。ハロゲンは、保護アミノ酸の塩 と反応すると、エステルを形成し、それを樹脂と共有結合させる。ベンジルオキ シ−カルボニル（ＢＯｃ）基を用いてアミノ酸の遊離アミノ基を保護する。この 保護基を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中２５％トリフルオロ酢酸（Ｔ１’Ａ）に より除去する。新たに露出したアミノ基を、ＤＣＭ中１０％トリエチルアミン（ ＴＥＡ）により遊離塩基１こ変換する。次にジシクロへキシルカルボジイミド（ ＤＣＣ）の使用により、次のＢＯＣ保護アミノ酸を先のアミノ酸の遊離アミノ基 に結合させる。ＴＦＡ安定性ベンジル誘導体により合成中アミノ酸の側鎖官能基 を保護する。これらの反復反応は全てオートメーション化され得、この発明のペ プチドは、ベックマン・システム９９０ペプチド合成装置の使用によりユニバー ジティー・オブ・ミネソタ・マイクロケミカル・ファシリティ−において合成さ れた。

樹脂においてブロックされたポリペプチドの合成後、ポリペプチド樹脂を無水フ ッ化水素酸（ＨＦ）で処理することにより、樹脂へのベンジルエステル結合を開 裂させて遊離ポリペプチドを放出させる。

またベンジル誘導側鎖保護基をＨＦ処理により除去する。次いで、１０モル酢酸 を用いて、ポリペプチドを樹脂から抽出し、抽出物を凍結乾燥する。Ｃ−１８カ ラムにおける逆相技術による調製用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に より、凍結乾燥粗ポリペプチドを精製する。一般的な溶離勾配は、Ｈ１ｏ中０． １％ＴＦＡを用いた０％〜６０％アセトニトリルである。溶離剤の吸光度を２２ ０ｎｍでモニターし、フラクションを集め、凍結乾燥する。

精製ポリペプチドの特性検定をアミノ酸分析により行う。システィンまたはトリ プトファンが存在する場合、まずポリペプチドを２４時間１１０℃で６モルＨＣ ｌ２（一定煮沸）または４Ｎメタンスルホン酸中で嫌気的に加水分解する。加水 分解されたアミノ酸を、ベックマンにより供給されたくえん酸緩衝液を用い、ベ ックマン・システム６３００アミノ酸分析器を用いたイオン交換クロマトグラフ ィーにより分離する。定量は４４０および５７０ｒ＋ｍでの吸光度により行なわ れ、標準曲線と比較する。さらに、これらのポリペプチドは、配列決定により特 性検定され得る。この方法は、アミノ酸組成データが本質的にあまり情報を与え るものではない長いポリペプチドに対して特に有用である。配列決定は、Ｒ，Ｍ 、ヒュウィック等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリーＪ、２ ５６．７９９０（１９８１）の方法論による、モデル４７０Ａガス相シーケネー タ−（アプライド・バイオシステムズ、インコーホレイテッド）においてオート メーション化された、アミノ末端からの逐次エドマン分解法により行なわれる。

以下、実施例によりこの発明をさらに説明する。実施例では、第１表および第２ 表において参照し易く示した各ポリペプチドの前の接頭辞ｒＦＪは省かれている 。

実施例１ ペパリン結合検定。

ヘパリン結合検定では、ヘパリン結合活性について試験すべきペプチドまたは蛋 白質と結合する基質としてニトロセルロース・シートを利用する。ペプチド９お よび＋１−１８を５０ミリモルＮ　Ｈ５ＨＣＯ，に可溶化することにより、１　 ｕ／ｌｒＱの溶液を形成させる。

各溶液を同緩衝液中でｌ：１に系列希釈して１ｘ９／ｚＱ−１μ９７ＩＲＱの濃 度とした。５０ミリモルＮＨ，ＨＣＯ，に予め浸漬しておいたニトロセルロース ・シートを、９６ウエルのドツト・プロット装置（ベゼスダ・リサーチ・ラボラ トリーズ、ベゼスダ、メリーランド）中に置き、ウェルを通して様々な濃度の各 ペプチド１００μＱを吸引した。次いで、各ウェルを結合緩衝液（１０ミリモル のトリス−ＨｃＱ、ｐＨｓ、ｏ、０．１５モルＮ　ａ　ｃ　Ｑ）で３回洗浄し、 フィルターを除去し、−夜風乾させた。次いで、フィルターを、ｌＯミリモルＣ ａＣ１，含有結合緩衝液中室温で５分間平衡状態にした。次に、ｍＨ−ヘパリン を結合緩衝液（Ｃａ　含有）中５００００　ｃｐｒａ／ｘＱの濃度に希釈し、ニ トロセルロース・シートをこの混合物の存在下で２時間インキュベーションした 。次いで、フィルターを結合緩衝液で４回洗浄し、風乾した。試料の個々のスポ ットをニトロセルロースから切り取り、シンチレーション流体に浸し、結合した ヘパリンをベックマンＬＳ−３８０１液体シンチレーション計数管で定量した。

結果は、ペプチド９および１３が３Ｈ−ヘパリンと強く結合したことを示す（第 ４図）。幾つかの他のペプチドも３Ｈ−ヘパリンに結合したが、接着強度は、ペ プチド・フラグメント９および１３の場合に観察された強度より劣っていた。

実施例２ プラスチック・プレートへのペプチド結合。

９６−ウェル・プラスチック・プレート（培養セルラインによる実験が行なわれ 得る）への合成ペプチド（９および１ｌ−１８）の結合能力を試験するために、 上記実施例１の場合と類似した実験を行った。１！＋９／Ｉ（２の最大濃度でペ プチド９および１１−１８、ラミニンおよびＢＳＡの貯蔵溶液を調製し、ＰＢＳ ＋ＮａＮ５中で系列希釈し、ＩＨ／ｘ（１−１μ９／ｘ（ｌの最終濃度とした。

各濃度の溶液５０μＱを９６−ウェル・プレート上で被覆し、２８℃で一夜乾燥 させた。次いで、ウェルを６ミリモルのホスフェート、１００ミリモルＮａＣρ 、６８マイクロモルＣａＣｌ、、ｐＨ６，８（洗浄緩衝液）中２ｘｔｉ／ｍＱの Ｂ５Ａ２００ｘ（ｊで２時間処理することにより、非特異的結合を最少限にした 。次に、５０　μ（１（Ｄ３Ｈ−ヘハ’）　ン（１０ｔｔ９／ｘＩ２）を３７℃ で２時間加えた（５００００ｃｐｍ／ウェル）。次いで、ウェルを０．０５％ト リトンＸ−１００含有洗浄緩衝液で３回洗浄し、最後にそれらを３０分間６０℃ で２００μｇの０．５ＮのＮａＯＨおよび１％ＳＤＳとインキュベーションした 。各ペプチド濃度で結合した３Ｈ−ヘパリンの量を上記実施例１と同様に定量し た。第５図に示された結果は、ペプチド９およびラミニンがヘパリンと非常に強 く結合すること、およびペプチド１３もまたヘパリンと結合するが、強さは劣る ことを示している。

実施例３ ペプチド・フラグメントによるラミニンへのヘパリン結合の阻害。

ペプチド９．１１−１４および１６を含む溶液（プラスチックに吸収されていな い）を、プラスチック上で被覆された無傷の天然ラミニンへのヘパリンの結合阻 害能についてスクリーニングした。この実験方法により、ヘパリン結合検定にお けるペプチドの被覆差異による問題は回避される。ＰＢＳ中６０μ９／ｊ１１２ のラミニンを、ｌウェル当たり５０μｇを用いて９６−ウェル・プレート上で被 覆し、２８℃で一夜乾燥した。次いで、ウェルを洗浄緩衝液中２１９７Ｈ（ｌＦ ３ＳＡで２時間処理した（上記実施例２と同様）。ＰＢＳ中１巧／畦〜ｌμ＋？ ／１＋１２の範囲における様々な希釈率のペプチドおよびＣＨＡＰＳ（コラミド −プロピル−ジメチル−アンモニオ−プロパン−スルホネート）（非特異的付着 の回避に使用されるデタージエント）を、共に標準量の３Ｈ−ヘパリン（２５０ ００ｃｐｍ／ウェル、５ｔｔ９／ｘＱの最終濃度）と２時間３７℃でインキュベ ーションし、次に混合物をラミニン被覆プレート（５０μｍ２）に移し、さらに ２時間３７°Ｃでインキュベーションした。次いで、ウェルを洗浄し、前記と同 様に放射能を計数した。第６図に示された結果は、ペプチド９および１３がこの 検定によるヘパリンと最も強く相互作用することを示している。

実施例４ ヘパリン／ペプチド相互作用特異性。

荷電がヘパリンおよびペプチド９および１３間の相互作用における主要因子であ るか否か、またはヘパリン構造がまたこの相互作用にとって重大であるか否かを 調べるために、２種の他の硫酸化ゲルコサミノグリカン類、デキストランスルフ ェートおよびコンドロイチンスルフェートと一緒にヘパリンをきっ抗実験で使用 した。標準量として１ウエル当たり３．１μりのペプチド９およびｌウェル当た り１２．５μ９のペプチド１３により、上記と同様に９６−ウェル・プレートを 被覆した。各ペプチドについて異なる濃度を用いることにより、実施例２の結果 が示す通り、良好なレベルの感度でヘパリンとの相互作用をモニターした。ウェ ルを洗浄緩衝液中２ｘｇ／ｚ（ｌのＢＳＡで２時間処理した。次いで、標準量の ３Ｈ−ヘパリン（ｌウェル当たり５００００ｃｐｍ）並びに様々な量の非放射性 ヘパリン、デキストランスルフェートおよびデルマタンスルフエートを含む、５ ０μρの最終容量を各ウェルに加えた。３７℃で２時間インキュベーション後、 ウェルを洗浄し、放射能を実施例１の記載と同様に計数した。第７図（ペプチド ９の場合）および第８図（ペプチド１３の場合）で示された通り、３Ｈ−ヘパリ ンの結合の５０％阻害は、３Ｘ１０−１１モルのヘパリンにより達成され得る。

同じ効果を生じさせるタメには、１０〜１００倍高いモル濃度のデキストランス ルフェートおよびデルマタンスルフェートが必要とされる。従って、ヘパリンの 構造は、この相互作用における重大因子である。

実施例１−４は、ペプチド９および１３が、ヘパリン様分子と特異結合し得るラ ミニンのＢｌｌ上上領域であることを示した。

実施例５ 内皮細胞の接着。

Ａ、ウシ大動脈内皮細胞の単離。

次のプロトコルに従い、ウシ大動脈内皮細胞を単離した。近くの屠殺場から大動 脈を得、冷燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳＸｌ　３６　ミリモルＮａＣｌ、２．６ミリ モルＫＣＩ、１５．２ミリモルＮ　ａ　ｔ　ＨＰ　Ｏ４、ＰＨ７，２）中で洗浄 し、２時間以内に処理した。粗コラゲナーゼ（ＣＬＳｎＴ、乾燥型ｆｉｌ巧当た り＋２５−１４５単位、クーパー・バイオメディカル）を、ダルベツコ修飾イー グル培地（ＤＭＥＭＸギブコ）中２ｘ９／ｘＩ２の割合で使用した。管の遠位末 端を締め付１す、コラゲナーゼ−ＰＢＳ溶液で満たし、１０分間消化を行った。

管腔内容物を採取後、さらに２回、１０分間かけて２回新鮮なコラゲナーゼを加 えた。酵素−細胞懸濁液を等容量のｌＯ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含［ＤＭＥＭ に加えて酵素を阻害し、１０分間４００Ｘｇの遠心分離にかけた。生成した細胞 沈澱物を、ＩＯ％ＦＢＳ、１００単位／峠のペニシリンＧ、１００μ９／Ｉｘ（ ｌのストレプトマイシンおよび１００μ９／ＩＩ（ｌの粗線維芽細胞成長因子を 含むＤＭＥＭに再懸濁した。

３７℃で加湿した５％ＣＯ９雰囲気中７５ｃがフラスコにおいて細胞を培養した 。培養に同培地を週２回供給し、約７５％全面生長時点で細胞を検定で使用し１ こ。特徴的な丸石形態、全面生長到達後の生長の接触阻害、および第■因子：Ｒ Ａｇに関する陽性免疫蛍光染色（マイルズ・ラボラトリーズ）により、細胞は事 実上内皮細胞として同定された［Ｓ、シュバルッ、「インビトロ」、Ｌ上、９６ ６（１９７８）］。内皮細胞、血小板生成細胞および血小板のみ、第■因子：Ｒ Ａｇを含むことが知られている。この方法は、位相差顕微鏡および免疫染色から 判断すると、常用の手順で平滑筋細胞、周囲細胞または線維芽細胞による汚染を 殆ど伴わずに（５％未満）内皮細胞を高収率で与える。

Ｂ、大動脈内皮細胞接着検定。

３種の異なる量（０，１，１，０および１０．０μ９／ウエル）のペプチド９． １１−１８、ＢＳＡおよびラミニンを吸着させた９６ウエルのマイクロタイター ・プレートを用いて接着性を測定した。６゜−８０％全面生長した細胞培養を、 ３ｍＣ１／ｘ（ｌの３Ｈ−アミノ酸混合物を加えることにより２４時間代謝標識 した。検定の日に、細胞をトリプシン処理により採取し、血清を加えることによ りトリプシンを阻害し、細胞を洗浄してこの混合物を除き、ＨＥＰＥＳで緩衝さ せたＰＨ７，２のＤＭＥＭに再懸濁した。接着培地はまた２　Ｈ／　ｚＱのＢＳ Ａを含んだ。細胞を３−４Ｘ１０’／Ｉｌ＋１２の濃度に調節し、この細胞懸濁 液１００μａをウェルに加えた。次いで、検定混合物を３７℃で１２０分間イン キュベーションし１こ。インキュベーションの最後に、ウェルを、ｌＯミリモル Ｃａ　を含む温ＰＢＳで洗浄し、接着性集団を、１％ドデシル硫酸ナトリウムを 含む０．５ＮのＮａＯＨにより可溶化した。次いで、液体シンチレーション計数 管を用いて可溶化細胞を定量した。各測定を３回反復して行った。この試験の結 果を後の第９図に要約する。

これらの結果は、ペプチド９および１３および１２および１８が内皮細胞接着の 強力なプロモーターであることを示す。すなわち、これらのペプチドは、内皮細 胞接着を促進するための合成基質として有用であり得る。

実施例６ 癌細胞の接着。

Ａ、Ｍ４セルラインの単離および細胞接着性。

高転移性ネズミ・メラノーマ細胞に−１７３５−Ｍ４は、最初ユニバージティー ・オブ・テキサス・ヘルス・サイエンシーズ・センター、アンダーソン・ホスピ タル（ヒユーストン、テキサス）のＩ。

Ｊ、フィドラー博士により提供された。細胞を受け取ったとき、多数の初期継代 細胞は伸長し、液体窒素中で冷凍されていた。腫よう細胞は、通常６週間以下の 期間インビトロ培養される。この期間の後、細胞を捨て、別のインビトロまたは インビボ実験で使用するために新しい細胞を貯蔵庫から引き出す。この予防措置 を行うことにより、連続インビトロ継代の結果として生じ得る表現型浮動を最少 限に抑える。５％加熱不活化胎児ウシ血清を含むダルベツコ修飾イーグル培地で 細胞を培養する。５％Ｃｏｔ含有加湿雰囲気により培養物を３７℃インキュベー ター中で生長させた。０．０５％トリプシンおよび１ミリモルＥＤＴＡを用いて 、フラスコから細胞を静かに放出させることにより、細胞を週２回継代培養した 。

アミノ酸の代わりに３　ｍＣｉ／ｘ（１３ＨＴｄ（トリチウム化チミジン）を各 培養に加えること以外は、上記内皮細胞の場合と同じ方法でメラノーマ細胞を適 用した。内皮細胞の場合と同様に標識細胞を採取した。この細胞接着検定は、上 記ウシ大動脈内皮細胞検定の場合と同じであった。この検定の結果を後の第１０ 図に要約する。

Ｂ、ＭＭ線維肉腫セルラインの単離および細胞接着検定。

ネズミ線維肉腫細胞（ｕｖ　−２２３７−ＭＭ）は、最初ユニバージティー・オ ブ・テキサス・ヘルス・サイエンシーズ・センター、アンダーソン・ホスピタル （ヒユーストン、テキサス）の１．Ｊ、フィドラー博士により提供された。培養 、標識および採取技術はＡ項の記載と同じであった。実施例５の記載と同様に細 胞接着検定を行った。

この検定の結果を後の第１１図に要約する。

Ｃ，Ｃ６セルラインの単離および細胞接着検定。

ラットＣ６グリオーマ・セルラインをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ションから購入した（確認番号ＣＣＬ　１０７）。培養技術はＡ項の記載と同じ であった。標識および採取技術は実施例５の記載と同じであった。実施例５の記 載と同様に細胞接着検定を行った。この検定の結果を後の第１２図に要約する。

Ｄ、ＰＣ１２クロム親和性細胞腫セルラインの単離および細胞接着検定。

ＰＣＩ２ラット・クロム親和性細胞腫細胞は、ユニバージティー・オブ・ミネソ タ（ミネアポリス、ミネソタ）、デパートメント・オブ・アナトミー（解剖学科 ）のＰ、ルツノー博士により提供された。

培養技術はＡ項の記載と同様であった。標識および採取技術は実施例５の記載と 同様であっ１こ。実施例５の記載に従い細胞接着検定を行った。この検定の結果 を後の第１３図に要約する。

実施例５および６Ａ−Ｄは、ペプチド９および１３が、広範なセルラインにおけ る細胞接着の強力なプロモーターであることを示している。

この発明のポリペプチドの幾つかの実践的適用について構想をたてることができ る。それらの適用には、体内に合成基質を埋め込むことにより生じる傷の治癒促 進が含まれる。それらの合成基質には、細胞接着が正常宿主組織による合成移植 体の受け入れにおける重要因子である、人工血管、眼内コンタクトレンズ、股関 節部置換移植体などが含まれ得る。

アメリカ合衆国特許第４５７８０７９号に記載されている通り、これらのポリペ プチドを利用して、細胞をインビボ表面に誘引するか、ま几は移植前に特定表面 における所望の細胞タイプの生長を促進させる医療装置を設計することができる 。その方法の一例は、補綴装置、例えば血管、心臓バルブまたは脈管移植におけ る内皮細胞生長の誘導であり、これは一般にニトロセルロースまたはポリエステ ル繊維、特にダクロン（Ｄ　ａｃｒｏｎ、商標）（ポリエチレンテレフタレート ）繊維から織られるか編まれる。殆どのタイプの細胞は、ラミニンおよびこのポ リペプチドに誘引される。内皮細胞および線維芽細胞は、このポリペプチドに特 に誘引される。後者の点は、事故または手術後の傷口の閉鎖および治癒を助ける ためのパッチ移植などのコーティングにおける前記ポリペプチドの潜在的有用性 を示している。合成ポリマーのコーティングおよび移植はまた、粉砕性外傷、例 えばを髄損傷後の神経再生を助は得る。

それらの場合、ペプチドを生物分子、例えばコラーゲン、グリコサミノグリカン またはプロテオグリカンに結合させることは有利であり得る。それはまた、体内 、例えば血管または腹腔中への一時的まには半永久的内植体（経皮的装置と称す る場合もある）として用いることを意図した補綴装置のコーティング表面におけ るそれらの価値の指標である。それらの装置には、薬剤デリバリ−貯蔵器または 注入ポンプがある。

また、この発明のポリペプチドを用いて、インビトロでの使用を意図した天然ま たは人工基質への様々な細胞タイプの細胞接着を促進させることができる。例え ば、培養基質、例えばマイクロタイター・プレートのウェルまたは微多孔質繊維 もしくはビーズの培地接触表面は、細胞付着ポリペプチドにより被覆され得る。

これは培地におけるラミニンの使用をうまく回避し得るため、培養に関してより 充分に定義された条件およびより良好な再生性を提供し得る。

細胞付着表面の商業用途の一例として、ファルマシアにより製造されたサイトデ ックス粒子をゼラチンで被覆することにより、皿の場合よりもかなり小さい容量 の培地において同数の接着細胞を生長させることが可能となる。これらのビーズ の活性は、一般に生長培地におけるコーティング蛋白質の使用により異なり、こ れらのポリペプチドは、それらの目的に対して改善され、化学的に特定されたコ ーティングを提供するものと予想される。他の表面または材料、例えばガラス、 アガロース、合成樹脂または長鎖多糖類を被覆することにより、付着性を高める ことができる。

過去において、選択されたラミニン領域が、侵入性セルラインの転移能力を減少 させる能力について研究されている（マツカーシー等、前出）。この作用には、 ラミニンに関する細胞表面レセプターの飽和、従って中和が介在している。この 発明によると、この明細書に示されたデータは、ポリペプチド９および１３のレ セプターが悪性細胞の細胞表面に存在することを示唆している。従って、これら のポリペプチドを用いて、転移細胞のラミニン・レセプターをブロックすること により、それらの転移能力を低下させることができる。

様々な具体的で好ましい実施態様および技術を述べながらこの発明の説明を行っ た。しかしながら、この発明の精神および範囲から逸脱せずに、多くの変形およ び修飾が為され得るものと理解すべきである。

ラミニン　Ｂ１−４負　ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、　２　（続Ｑ） ■＝−−−−−−− φ（や＋令←※φ÷ 中＋やφ＋→φφ→＊仝 ■＝だロ！！２二セ田 −ａ　％　鉢　瓢　輪　−社　夕　８ 圏ロロロロ凶ロロロコ図 脇因ロロロだ口口ロコロ ■＝　ｒ２：ｌ：　！２巴セ二 社　＃　上部　ＩＩＬ署費　ζ Ｍ３囚口四２コロコロ ■＝芒！２：ｆ）ｔｏ仁巴 ロ図ロ＆−区口口ロコロ 囲ロ囮囚ロ区圀ロロロロ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年２月１６日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）本質的に、式 【配列があります】または 【配列があります】 で示されるポリペプチドまたはそれらの混合物により構成される組成物。
2. （２）本質的に、式 【配列があります】または 【配列があります】 で示されるポリペプチドまたはそれらの混合物により構成される組成物により被 覆された表面を含む、インビボ設置を意図した補綴装置。
3. （３）表面が脈管移植片の一部を構成する請求項２記載の補綴装置。
4. （４）表面が合成樹脂繊維でできている請求項２記載の補綴装置。
5. （５）表面が眼内コンタクトレンズの一部を構成する、請求項２記載の補綴装置 。
6. （６）表面が股関節部置換移植体の一部を構成する、請求項２記載の補綴装置。
7. （７）表面が経皮的装置の一部を構成する、請求項２記載の補綴装置。
8. （８）合成樹脂繊維が、ニトロセルロースまたはポリエステルから成る群から選 ばれる、請求項４記載の補綴装置。
9. （９）合成樹脂繊維がポリエチレンテレフタレートである、請求項４記載の補綴 装置。
10. （１０）本質的に、式 【配列があります】または 【配列があります】で示されるポリペプチドまたはそれらの混合物により構成さ れる組成物により被覆された表面を有する細胞培養基質。
11. （１１）表面が合成樹脂でできている請求項１０記載の細胞培養基質。
12. （１２）表面がビーズの一部を構成する、請求項１０記載の細胞培養基質。
13. （１３）表面が徴多孔質繊維の一部を構成する、請求項１０記載の細胞培養培地 。
14. （１４）表面がマイクロタイター・プレートのウェルを構成する、請求項１０記 載の細胞培養培地。
15. （１５）ヘパリンに対する特異的結合能力を有するラミニンのＢＩ鎖フラグメン トに対応するポリペプチド。
16. （１６）ポリペプチド・フラグメントが、【配列があります】 である、請求項１５記載のポリペプチド・フラグメント。
17. （１７）ポリペプチド・フラグメントが、【配列があります】 である、請求項１５記載のポリペプチド・フラグメント。
18. （１８）フラグメントが直接細胞接着を促進する、請求項１５記載のポリペプチ ド・フラグメント。