JPH03501252A - 血管を冷凍保存する装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血管を冷凍保存する装置及び方法 本発明は血管を安定化させる装置に係わシ、特に、長期間にわたって血管を保存 できるような極低温に迄血管を冷凍する際に使用する保存手順に関する。又、血 管を冷凍及び解凍するための装置を使用する方法が開示される。冷凍保存された 血管は、自身の血管を移植することのできない患者に移植したシ、新鮮な血管を 利用できない場合に患者に移植するうえで有用である。

発明の背景 １冷凍保存”は、細胞や、静脈並びに動脈を含む血管のような組織物質を極低温 にて冷凍し、その組織の生育性及び機能を保存した状態で保管する技術である。

毎年、米国だけでも５６０，０００例もの小血管による冠動脈バイパスの”ジャ ンプ”手術が実施されている。

その他に１００，０００例もの贋より下方に於ける末梢血管の手術が実施されて いる。小さな血管手術の中の１５％は、既に以前に手術を受けたために利用可能 な適当な組織がない患者や、糖尿病を患っていたり組織が不適当となってしまう 病気を患っている患者に対して施術されている。臨床的には、唯一の代替方法は 最適とはいえない組織を使用するか、或いは閉塞を生じ易い人工血管を使用する ことであシ、従って理想的とはいえない。心臓弁組織の冷凍保存（１９８７年１ 月２日付出願の関連する米国特許願第０００，０９５号を参照されたい。この特 許願は参照することでその全てをここに組み入れられる）の成功によって、又、 これ迄に３，０００例を超える弁の冷凍保存並びに約２，２００例を超える移植 の成功によって、この技術を同様に静脈及び動脈の組織に対して拡張させること が意図されている。このようにして、臨床的な設定に於いて冷凍保存された組織 が上述した特許に関しての必要性を満し、又、患者に対する傷の形成を少なくし て外科手術の時間及び費用を低減するのである。

同種移植血管を使用するこれ迄の試みには多くの問題点があった。その方法に於 ける主なる懸念は、使用される迄組織を冷凍し保管することができないことのた めに、組織を手に入れる時点が一致しないということであった。更に、これ迄の 研究ではこの分野の技術レベルを利用して冷凍処理することに失敗してきておシ 、この結果として組織の生育力は低く不定となシ、開花（ｐａｔｅｎＣ７）が早 期に失われる結果を生じていた。

静脈及び動脈に於ける冷凍学的な保存に関して発表された数例の報告書はあるが 、その保存手順に伴う冷凍生物学的な変化に関してのシステム的な試験結果は発 表されていない。殆ど全ての研究者は血管にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） を簡単に浸み込ませて、その組織を液体窒素の中で急速冷凍していた。何人かの その他の研究者は制御不能且つ測定不能な冷凍速度を使用していた。人体から切 り離されると、血管組織は収縮する自然の傾向を見せる。これ迄の研究によれば 、そのような状態に於いて血管の内皮層は剥がれてしまい、それ故にこのような 血管が組織移植されたならば血栓症を生じ易くなるということが示されている。

このような血管の内皮層を保存することは特に重要となる。何故ならば、血管内 部のこの内皮層は積極的に血栓の発生を防止するからである。伏在静脈の冷凍保 存に関するこれ迄の研究によれば、冷凍並びに解凍された組織に於ける主なる異 常はこの組織層の破壊並びに損失である。この組織の冷凍保存に関する第１の目 標は、氷結晶の形成を防止することである。この氷結晶は細胞構造を破壊し失わ せる。別の冷凍方法が特定の組織に応用できる。全ての組織は冷凍保存並びに解 凍に耐える能力に於いて同じではなく、有効な生育力を維持する能力に於いても 同じではないのである。

この技術を乳房内勤脈やその他の動脈の組織に対して成功裏に応用できることを 知る研究者はいなかった。

発明の概要 本発明の装置は、血管を支持し且つ膨張させ、冷凍保存を容易となすための液体 を血管に浸み込ませることができる構造とされている。特に、血管を冷凍保存す るのに使用される血管支持台（５ｔｅｎｔ　）が開示される。この血管支持台は 、ドナーから取った血管の一部に挿入できる端部をそれぞれ有している第１及び 第２の細長い探り針シ即ちスタイレットと、スタイレットに取付けられて血管内 部に係合し、スタイレットの上での血管れ液密結紮を容易となす手段と、選択的 に調整可能な互いに直面する関係状態でスタイレットを受け止め、血管をスタイ レットの間で膨張させて血管が収縮するのを防止する支持手段とを含んで構成さ れている。このようにしてこの血管支持台は、血管の調達並びに冷凍保存の両段 階を通じて血管を支持するのである。この装置を使用した本発明の方法は、血管 の支持、取シ外し、処理研究所への発送、処理（冷凍処理を含む）解凍及び希釈 に先行して行われる血管の準備に関する技術を伴う。特に強調されることは、血 管壁が無傷で元の一体状態に維持されることに加えて、血管内皮（内面層）が保 存されることである。これは、血管拡張に係わる１非接触”外科技術、血管支持 台の使用、並びに、氷結晶の形成や浸透衝撃による組織の損傷を最少限に抑えて 液体窒素のほぼ一１９６℃の温度に迄静脈や動脈を冷凍させる独特の冷凍過程の 使用、を伴うのである。本発明はまた、冷凍された組織がその損傷を最少限に抑 えて急速解凍されることのできる解凍手順をも含んでいる。本発明によって冷凍 保存された血管は、解凍されると蘇生し、何等かの理由によって心臓血管或いは 末梢血管を再形成するための適当な血管を持たない患者に於ける病気に侵された 血管や損傷された血管と交換するのに理想的に適当とされるのである。

従って本発明の目的は、人間或いは動物の静脈及び静脈の組織を修復したシ取り 扱うための装置及び方法を提供することである。

本発明の他の目的は、生きている血管を長期間にわたって保存するための装置及 び方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、冷凍処理の前に行う化学処理の独特な成分セットを提 供することである。

本発明の更に他の目的は、切シ取られた血管を支持し膨張させる装置を提供する ことである。

本発明の更に他の目的は、解凍された後も内皮を含めて血管細胞が高い生育力を 維持できるように血管を冷凍する独特の冷凍手順を提供することである。

本発明の更に他の目的は、細胞の育成力を最大限に維持できる血管の急速解凍を 可能にする人間の血管の冷凍保存方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、極低温にて長期間にわたって保管された後で移植に適 当な生きた血管を提供することである。

本発明の更に他の目的は、解凍するだめの特別且つ独特な方法によって生きた血 管を提供することである。

本発明のこれらの及びその他の目的、特徴及び利点は、開示した以下の実施例の 詳細説明及び添付の請求の範囲の記載を参照すれば、明白となろう。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の好ましい実施例による支持台装置の概略斜視図。

第２図は、本発明の好ましい実施例による支持台装置の分解斜視図。

第３図は、静脈を冷凍する冷凍過程を示す概略図。

第４図は、本発明の好ましい実施例によって約８０〜９Ｑｒｎｔの溶液内に支持 された静脈を解凍する解凍曲線を示すグラフ。

好ましい実施例の詳細な説明 さて更に詳しく図面を参照すれば、これらの図面に於いて同じ符号は全図を通じ て同じ部分を示している。

第１図は血管支持台１０を示しておシ、この血管支持台は６つの主要部分、即ち 支持トラック１４、スライドする基部止め枠組立体１８及び固定された先端止め 枠組立体２２、で構成されている。これらの６つの部分の全ては、（ａ）都合の 悪い変形や亀裂を発生することなく極低温に迄冷凍することができる、（ｂ）極 低温にて柔軟性を有している、（Ｃ）化学的に不活性であシ、可塑剤のような化 学成分を血管内部に浸出させて血管を汚すようなことのない、そして、（（１） 冷凍保存の手順に於いて使用されるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレ ン又はプロピレングリコール、グリセロール或いはその他の化学成分もしくは溶 液に耐えることができ且つ反応しない、ような何れかの適当な材料によって製造 することができる。トラック１４は実質的に真っ直ぐで細長い部材であり、止め 枠組立体１８及び２２を取付けるのに使用される。このトラックは何れかの好ま しい形状とされることができるが、平行管とされ、このトラック１４に止め枠組 立体１８及び２２が取付けられたときにそれらの止め枠組立体を安定させる目的 で、片側に（・了その長手部分の少なくとも一部に溢って走る溝２６が備えられ ているのが好ましい。トラック１４の基端側の面には、傾斜部３０が位置決めさ れておシ、この傾斜部は大部分が先端に向けられている７ランゾを有している。

この傾斜部３０は、取付は部がトラック１４に溢ってスライドされたときにその トランクの端部から取付は部が滑シ落ちないようにしているのである。

基端側のスライド可能な取付は部３４は円筒形部材とされ、一端に陥凹部とされ た円筒形の軸線方向開口を有しておシ、その陥凹部は取付けぎンを組部材として 受け入れることができるようになっている。取付は部３４の他端には前記円筒形 に対して直角な開口が形成されておシ、この開口がトラック１４を作動的に受け 入れることができるようになっている。取付は部３４はトラック１４に泊ってス ライドできるようになつておシ、血管部材の与えられた長さに調整することがで きるようになっている。

基端側の止め枠組立体１８は円筒形の取付はビン３８を含む。この取付はピン３ ８は基端側の取付は部３４の軸線方向の穴の中に同軸的に着脱自在に組み付けら れ、又、円筒形軸線の回シに回転できることが好ましい。基端側の取付は部のビ ン３８は本体４２と直角に一体形成されている。本体は中空円筒形とされ、穴４ ６を有していて、この穴４６は円筒形の両側を通して延在され、ビンに対して直 角方向に配向されている。本体４２の一端に沿って、一対の突起５０が半径方向 に互いに対置されて配置されておシ、これらの突起は止め部として作用する。止 め栓バレル５４が本体４２の円筒形の内部に嵌合されており、この止め栓バレル は円筒形で、本体４２の内部で内方に配向されて回転可能に配置されている。バ レル穴５８がバレル５４を通してその軸線に直角に配置されておシ、本体４２の 穴４６と選択的に整合されて止め栓を通る流れを可能にすることができるように なっている。レバー６２は実質的に矩形の部材であって、一端にて止め栓バレル ５４に直角に一体構成されている。レバーがトラック１４と平行になるように回 転されると、バレル穴５８及び本体の穴４６は整合されて止め栓を通る通路を形 成するが、トラック５４と直角な位置となる迄バレル５４が時計方向に回転され ると、穴の整合が外れて止め栓を通る流体もしくは空気の流れを遮断するように なす。

探シ張り即ちスタイレット６６は中空で実質的に真っ直ぐな細長いチューブとさ れ、トラック１４と平行に整列されている。スタイレットの自由端には孔７０が 形成され、又、スタイレットの他端は本体４２に突当てられている。スタイレッ ト６６は本体４２と一体構成され、ピン３８に対しては直角に配向されている。

スタイレット６６は穴４６と整合され対置されている。

スタイレット６６の中空内部は止め栓本体４２の片側にて穴４６と通じている。

スタイレット６６０表面には少なくとも１つ、好ましくは２つもしくはそれ以上 の前方へ向けてテーパーを付された傾斜面７０がスタイレット６６と一体的に形 成されている。スタイレット６６は血管と連結できるように設計されており、血 管はスタイレットの上に嵌め付けられ、本体４２に当て付けることができるよう になされる。スタイレットの孔６８は血管が連結されたときにその内部に流体や 空気を流し込むことができるようになっている。スタイレット管はその内部の中 空穴と基本的に平行であるように寸法形成されている。傾斜面７０は肩部７４に て終端しておシ、この肩部は以下に更に詳しく説明するように圧密結紮できるよ うにしているのである。

固定された先端側の止め枠組立体２２は基本的には基端側のスライドする止め枠 組立体１８と同じであるが、次の注目すべき変更点が相違している。軸線方向の 取付は部の穴が基端側の取付は部の穴と異なシ、従って取付けｔ７７８の直径は 取付はピン３８の直径と異なっていて、これらの２つの止め枠組立体を相互に交 換出来ないようになされている。このことは止め枠組立体が先端側の組立体か基 端側の組立体かと混乱するのを回避している。先端側の取付は部８２はトラック １４の先端に永久固定されているのが好ましい。

先端側の本体８６もまたその表面に穴（４６と同様の穴）と整合させてルアーフ ィッティング（商品名）を一体に備えておシ、注射器を着脱自在に受け止めるこ とができるようになされている。この代わシに、注射器のような流体供給装置を 着脱自在に受け止めるだめのルアーフィッティングのない状態でボス９０が使用 できる。標準的なルアーフィンティングは当業者には一般に知られている。代替 例に於いては、ボス９０は同様に基端側の止め枠組立体１８と一体の構造とされ 、トラック１４の上に取付けられる前又は後で血管の逆フラッシュ洗浄を行なえ るようになっている。

先端側のレバー９４は基端側のレバー６２と同様ではあるが逆方向に回転する。

即ち、トランク１４と平行な状態に於いて先端側レバー９４は開”位置となシ、 トラックに対して直角となるように回転された状態で”閉”位置となる。この止 め栓の両レバーは、両者がトラック１４に平行とされているときに互いに向かつ て方向法めされ、閉じ動作に際して血管を引っ張ることがないようになっている 。このうにして、これらのレバーはその構造部の全長を長くすることはなく、先 端側レバー９４が先端側のボス９０もしくはルアーフィッティング８６と干渉す ることもない。

この支持台は切シ取られた血管を支持し膨張させる。

この切取り手順は以下に説明する例で詳細に説明する。

血管を滑らかにする適当な筋肉弛緩剤を含有する特別に調合された潅流溶液が血 管の長さ部分に沿って付与される。成る時間、通常は約１０分〜１５分経過した 後、血管が注意深く切シ離される。これには、一般に”非接触”と称される技術 が使用される。これによシ、血管の先端側と基端側との端部での切開が行われる 。

ドナーの心臓が拍動しているならば、横断切断された血管のその部分は結紮糸に よって結紮される。支持台装置１０の取シ外し可能な止め枠組立体１８及び２２ がその血管の各端に位置決めされ、その血管を通して成る量の洗浄／膨張溶液が 潅流される。しかる後に切シ離しは完了する。この潅流媒体は何れかの適当な媒 体とされることができ、デルベコス　ミニマル　エセンシャル　メディア（ｙｙ 　）とされるのが好ましい。

その他の媒体には、それに限定することを意図するのでなくて、メディアム１９ ９、イーグル　メディア、ハンクス　メディア、デルベコス　モディファイドイ ーグル　メディア、イスコプス　モデイファイドデルベコス　メディア、デファ インド　メディアＡ２、ＣＭＲＬ　−ｉ　Ｑ　６６、ＲＰＭＩ　−１６４０（同 様に１６０６．１６６０又は１６３４）、Ｆｌｏ、Ｆ１２、アルファメディア、 等がある。これらの媒体に対して、限定するわけではないが人間の血清、胎児の 腓から得た血清（Ｆｅ２）、血清基質等のような血清、及び限定するわけではな いがニトロプルシド、ダントロレーン、ニフェジピン、ベラパミル、フエントラ ミン、トラゾリン、プロカルブイア等の血清拡張剤が添加される。約１×１ＱＥ −４〜約３０Ｘ１０に一４モル、好ましくは約３Ｘ１０１．４モル、の濃度のパ パベリンを使用するのが好ましい。この媒体溶液はまた成る種の添加剤、即ち、 パイカーボネー）、ＨＥＰＥＳ或いは同様なバッファー、グルタミン、Ｄ−グル コース及びナトリウムピルベート、を有している。

血管が完全に取シ外される前に、止め栓の端部が支持台装置１０の支持トラック １４に取付けられ、血管に収縮する機会を与えないようになす。血管の内面の内 皮層に有害となるのが血管のこの自然収縮であり、このためにこの支持台はこれ を保護するように設計されているのである。血管の残る部分が切シ離されると、 血管が取得けられた支持台１０は外部容器に入れて搬送する準備が整うのである 。

支持台１０は、この冷凍保存方法に於ける他の段階を通じて血管を支持し保護し 続ける。このように支持された血管が冷凍保存の場に到着すると、この支持台は 付帯的な血管結紮を行うための一連の洗浄並びに検査を行うための支持を行うの である。冷凍処理が行われる間この支持台は、血管側壁が折れ曲がるのを防止す るのに必要な支持を行う。又、解凍に際しての最終段階及び希釈に於いて、この 支持台は血管が折れ曲がらないように再び保持し、冷凍剤の添加及び除去を容易 となす。

本発明は、静脈や動脈のような内皮層を有する組織を冷凍し、保管し、そして解 凍する方法を提供する。

本発明によって冷凍されるこの組織は、細胞の生育力の低下を最少限に抑えて極 低ｉで長期間にわたって保管することができるのである。本発明は、氷結晶の形 成に起因する組織の損傷並びにゆつくシした冷却に起因する溶液作用を最少限に 抑えて、静脈や動脈のような組織を約−１９６°Ｃの液体窒素の温度に迄冷凍で きるようになす独特の冷凍過程を含むのである。本発明はまた、解凍スケジュー ルをも含んでいる。これによれば、冷凍された組織は、組織の損傷を最少限に抑 えて急速に解凍されることができる。本発明によって冷凍保存された静脈及び動 脈は解凍されたときに生物学的に生育力を有し、又、病気にかかった或いは機械 的に損傷された血管と交換するのに理想的に適しているのである。

保存すべき組織は研究所に受理された組織と全く同様である。考慮すべきことは ドナーの年令、健康及び血管の病歴である。その他の重要な考慮は、血管の入手 迄の死後の時間（温間虚血）及び血管の入手から研究所での処理迄の時間（冷間 虚血）である。調達の間の組織の取シ扱い並びに組織の発送に使用される媒体の 取り扱い方法には注意を払う必要がある。

本発明によって冷凍される人間の血管の提供源となることができるドナーは年令 で約５５７迄とされ、又、重症のアテローム性動脈硬化症、糖尿病、循環器疾患 、重症の高血圧症、静脈瘤性の静脈、伝染病を患っていてはならない。

調達の全ては無菌状態の下で行われる。入手迄の死後の経過時間は内皮層の細胞 に重大な影響を及ぼす。

それ故に、調達はドナーからの死後直ぐに実施されるべきであるが、何れにして も死後約１０分を超えてはならない。例えば、冠動脈バイパス手術のためには理 想的な長さは約１７ｃｍで少なくとも４１１１１１径の血管を得なければならな い。これ以外の直径及び長さのものも使用でき、本発明の範囲に含まれるという ことは理解されねばならない。

殺菌処理 多くの抗生物質は血管の内皮層に対して極端に有害であることが発見された。こ の有害性は、時間、温度、作動態様を含めて多くの要因の結果として生じる。抗 生物質に加えて、抗真菌性薬物（抗真菌性）の薬剤が組織の内皮に対して有害と なるのである。細胞の生育力を向上させ且つこれ迄の薬剤に抗する微生物を殺す ためには、細胞の有害性並びに無菌化効力に関して新しい抗生物質及び殺菌剤の テストを続けることが必要である。

抗生物質及び抗真菌性薬物の混合物は適当な殺菌効果のあることが見出された。

イミペネム（Ｉｍｉｐｅｎｅｍ）及びアンコバン（Ａｎｃｏｂａｎ　）の混合物 はとくに適当であることが見出された。第１表は試験管の中で内皮の生育力に及 ぼす抗生物質培養効果を示している。

第　Ｉ　表 ＡＰＣＶＬ　４時間　Ｎ５ ＡＰＣＶＬ　１２時間　Ｐ＜、０５ ＰＳＡ　１２時間　Ｎ５ ＡＰＣＶＬ　＝アム７オテリシンＢ、２５μｇ／ｍｊポリミキシンＢ硫酸塩、１ ００μｇ　／　ｒｎ！セフオキシチン、２４０μｇ　／　ｍｔヴアンコミシン、 ５０μｇ　／　ｍ！ リンコミシン、１２０μｇ／ゴ ＰＳＡ　＝ペニシリン（５０ＩＵ　／　ｍｌ　）ストレプトマイシン（５０ｍ９ ／ｍ７）アムフオテリシンＢ　（Ｉ　Ｑｒｎ９７ｍｔ　）冷凍媒体 組織をその中で冷凍させる媒体は釣合いのとれた細胞の環境条件を維持する上で 非常に重要である。時間及び温度もまた特定の媒体が成功するか否かに関与して いる。一般に、血液結晶や人工結晶のようなプロティン懸濁液が細胞の最大限の 生育力を維持する上で与えられねばならない。

多くの冷凍媒体が本発明の実施に於いて成功裏に使用できる。バランスのとれた 組織培養媒体即ち単純な燐酸緩衝食塩水のような媒体が殆どの種類の組織に対し て使用できる。この特定の種類の組織に対しては、先に説明した添加剤と組み合 わせたＤＭＥＭが好ましい媒体とされる。

冷凍媒体は、濃厚なりＭｙに対して約１チ〜６０チ、好ましくは１０％、のＦＣ Ｍ、即ち胎児腓血清を加え、上述した範囲の、好ましくは約０．０１２％、のパ パベリンを加え、そして約１チ〜１０％、好ましくは２．５％〜５チ、更に好ま しくは２．５％、の濃度のコンドロイチン硫酸を加えて、構成される。

ジメチルスルホキ７ド（ＤＭＳＯ）もまた少なくとも１つの段階にて１モルを、 或いは好ましくは６段階にて０，２５モル、０．５モル及び１モルを、４℃にて 滴定によって添加される。ＤＭＳＯの濃度は約０．５〜６モル濃度迄の範囲で変 化できる。ＤＭＳＯのモル濃度の増加は血管に外傷を与えないように徐々になさ れるのが好ましい。ＤＭＳＯは高い温度にて添加することができるが、そのタイ ミングは非常に重大であシ、成る種の組織には有毒となる場合がある。

内皮の保護に於いてこれを更に洗練し且つ組織の一体性を保存するのに使用され る重要な技術革新は、コンドロイチン硫酸を使用する点である。このグリコスア ミノグリカン（ＧＡＧＳ　）は細胞外床の主成分である。

コンドロイチン硫酸のモル重量は５，００　Ｄ〜５０，０００迄変化でき、又、 これはＤ−グルクロニック酸及びＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトスアミンのリピー トユニットで構成された硫酸塩ディスサツカリド（ｓｕｌｐｈａ　ｔｅａａｉｓ ｓａｃｈａτ１ｄｅ）である。一般に、この物質はにゾルの添加剤であシ、この 溶液は角膜の短期保存（４°Ｃ）に使用される。

その他の適当なグリコスアミノグリカンの例としては、限定するわけではないが ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、等が含まれる。他の 冷凍保護剤には、限定するわけではないがグリセロール、ホリビニルぎロリドン 、ハイドロキシチルスターチ、及び、ポリエチレングリコール、ジメチルホルム アミド、エチルグリコール、等が含まれる。

第■表は冷凍溶液にこの添加剤を添加した一連の実験を示している。グループ１ 〜６はグループ７及び８とは異なるプロトコル即ち条件が使用され、グループ７ 及び８では２時間の保温が行われた。この結果、冷凍混合物にコンドロイチン硫 酸を添加すると内皮の生育力を著しく改善することが示された。

これらの物質は支持台１０の使用もしくは不使用に関係なく冷凍保存の処理に使 用することができる。冷凍保護剤としてコンドロイチン硫酸又はその代替剤（Ｇ Ａ（）Ｓ　）が血管に加えて細胞、組織、そして器官の冷凍保護のだめの処理に 使用できるのである。

第　■　表 内皮細胞の生育力に及ぼすコンドロイチン硫酸の影響力１０２チのコンドロイチ ン　４　２．４１５　＊　（１１８）１７２　（３１９）３５４　２．７０価酸 （ＣＳ）の無し対有り ８）１１の０７ドロイチン硫　４　１．７０４　ｎｓ　（２０７）１５１　（６ ９）　８２　５５酸り無し対　有り ＋　ｎＳ＝有効ではない（Ｐ＞０−０５）：＊≦ｐ、Ｏｓ：＊本≦Ｐ、０１てい る。

冷凍過程 冷凍過程は組織の冷凍保存に成功する上で非常に重大である。組織の生育力を最 大限にするために数多くの変数が存在する。例えば、流体の体積、組織の寸法、 パンケージの幾何学的形状、並びに、冷凍保護剤、組織及び冷凍媒体に関する特 性の組み合わせ、の全てが最適な冷凍過程に作用するのである。細胞懸濁液に関 して利用できる従来技術の冷凍過程は血管の冷凍に適していないこと、及び、心 臓弁組織に関する従来技術の冷凍過程も適当でないこと、が理解されねばならな い。それぞれの組織はそれぞれに独特で最適な冷凍過程のあることが断定された 。成る組織の冷凍保存に成功するのに必要な冷凍過程は他の組織の冷凍保存に成 功するのに必要な冷凍過程とは異なるのである。

組織の冷凍には多数の要素を考慮することが必要である。これらの要素の中には 、平衡点付近の温度（通常は凝固点の温度に対して＋４°Ｃ）、凝固点に於いて 発する発熱の解放及び制御、水に対する細胞膜の浸透性で決定されるような最適 冷凍速度、細胞の表面一体積比、媒体中の冷凍保護剤の種類及び濃度、これらの 冷凍保護剤に曝す温度及び時間、冷凍速度を制御される冷凍機から冷凍保存され た組織を取り出してそれを液体窒素の冷凍装置に浸漬する冷却速度、並びに温め る速度、及び組織の厚さ、がある。

このように、ドナーから静脈を調達即ち切シ取シ、その血管を移送のために適当 な組織保存特性を有する媒体中に置き、そして冷凍スケジュールに従って血管を 冷凍する前に適当な冷凍保存剤を使用するというこの方法が、適当な冷凍保存を 行う上で望まれるのである。これを達成するために、室温並びに冷却速度はサン プルに対して所望の効果を生じるように制御されるのである。血管組織は僅かに 異なる速度で冷却されるので、又、特定の温度で相変化が生じるので、冷凍速度 の注意深い制御が続けられねばならない。

冷凍速度の範囲は血管を収容するパッケージ内の流体の体積並びにそのパッケー ジの幾何学的形状の関数でもある。ここに説明する冷凍過程はパッケージの体積 及び幾何学的形状に関係するが、本発明は体積及び幾何学的形状に変化をきたす 、従って冷凍速度に変化をきたすパッケージ設計の変更を包含するものと理解さ れるべきである。冷凍速度は与えられた温度にて成る程度変化できる。適当な範 囲は約０．０１−１００°Ｃ／分、約０．１−３０°Ｃ／分、好ましくは約０． ３−１°Ｃ／分、更に好ましくは約０．５−１°Ｃ／分である。本発明の好まし い実施例に於いては、血管の全体的な冷凍速度は約０．５°Ｃ／分に維持される 。本発明に於いて静脈及び動脈を冷凍保存するのに使用される好ましい冷凍スケ ジュールは、約２．５ｃＩｒＬ×２５ｃｒＩＬの全体積を有するパッケージ化し た組織を冷凍装置の中に配置する段階を含んでいる。７５〜８５縦の特定の流体 体積に関する典型的な冷凍過程は、室の初期温度が一１０℃に設定されている。

この室は、サンプル（単数又は複数）が＋４°Ｃに到達する迄は０．０１°Ｃ／ 分の冷却速度に設定される。この時点で、組織は０．５±０．２°Ｃ／分の速度 で冷却されるようになされ、サンプルが一２±０．５となる迄継続される。−２ ±０．５°Ｃに達した時点で、相変化が始まる。この時点で、融解熱の発生に備 えて、冷却速度は室が一７０°ＯＫ達する迄−６０℃に高められる。室が一７０ °Ｃに到達した直後に、この室は一６０°Ｃになる迄２０°Ｃ／分の速度で温め られ、−６０℃になるとその温度が１７分間にわたって保持される。

この間、血管の実際の冷却速度は、約−０，５±０．２°Ｃ／分である。この１ ７分が経過した時点で、呈は再び一６０℃のレベルに達する迄１０°Ｃ／分の速 度で温められる。この−５０°Ｃのレベルが１分間持続され、しかる後にサンプ ルが一２０℃に達する迄室は０．０１°Ｃ／分の冷却速度で冷却を開始される。

この間、サンプルの実際の冷却速度は約０．５±０．２°Ｃ／分である。最終的 な冷却速度の調整段階はサンプルが一６５℃又はそれ以下の温度に達する迄０． ５±０．２℃／分での冷却を持続させる。この冷却過程の結果、その最初から最 後迄の冷却速度は約０．５±０．２°Ｃ／分となる。この冷却速度が静脈組織に とって最適であった。静脈を収容したパッケージが室から取シ出され、−１９６ °Ｃの保移用の液体窒素の冷凍装置の中に置かれる。第６図は本発明の典型的な 冷却過程を示している。

血管が移植の施設から要請されたような場合には、その組織は液体窒素の冷凍装 置の中に収容されている移植を行う病院からの要請を受けると、組織は米国特許 明細書簡４，５９７．２６６号に開示された容器のような適当に断熱された発送 用容器の中に戻される。この特許は参照することでその全部がここに組み入れら れる。この特許のものはボール紙製の容器であって、厚さ１０．１６ｃ！ＩＬ（ ４ｉｎ　）の発泡物質を備えている。

好ましい実施例は液体窒素の中に保存されていたドライアイスを使用するのであ シ、液体窒素の浸み込んだドライアイスが血管を収容したパッケージの回りに置 かれるのである。このパッケージはしかる後に箱に詰められる。移植片の臨床上 の書類作シに必要な適当なプロトコル及びその他の文書は発素体に含まれる。

病院に到着したならば、血管及びそれに係わるパッケージが液体窒素の冷凍装置 の中に置かれる。この組織は１３０℃より高い温度での保存されるのを許すこと はできない。何故ならば、温度サイクルの繰返しは細胞の生育力を失わせる傾向 を示すからである。ドライアイスと等しい温度（−７８，６°Ｃ）での保存は組 織内の醪素モル濃度の低下を防止するほど十分に低温であるとは見られず、従っ て保存期間が大幅に短縮され同種移植片での解凍及び希釈は明確に定義される。

何故ならば、氷結晶の成長及び浸透衝撃が組織を傷つけてしまうからである。静 脈は温水浴の中に置くことで解凍されるべきである。サンプルの体積に応じて、 １℃〜１０００°Ｃ／分の解凍速度、好ましくは１０°Ｃ〜５Ｄ’Ｃ／分の解凍 速度がこれらの血管の解凍に適当である。一度解凍されたならば、選択された冷 凍保護剤を通常は段階的な方法で除去して、細胞に対する浸透衝撃の影響を少な くし、これによシ周囲媒体との細胞の整然とした平衡が得られるようにすること が必要である。時間及び温度が主要な考慮要素である。

血管が使用されるべき時の直前に、血管が解凍されるべきであシ、又、段階的な 希釈方法を使用して冷凍保存添加剤が除去され、これにより浸透性の損傷を最少 限に抑えればならない。この解凍並びに希釈手順は実際の冷凍手順と同様に重要 であると見做される。何故ならば、氷結晶の形成はこの手順の相間にも生じ得る からである。更に、適当な温度並びにタイミングに関しての注意を払わないと、 冷凍保護剤の成分の有害性によって生育可能な細胞の数が低減してしまい、又、 血管に亀裂を生じて実際的に使用不能な部片にしてしまうことになる。

以下の特定の例は、本発明の方法を血管に関する調達、極低温とする迄の冷凍、 及び解凍に応用した場合として示している。この例は当業者には自明であり、本 発明がここに示した特定の例に限定されるものではないことが認識されよう。

切開は無菌状態の「非七触」技術を採用して行われた。血管及び外膜は、手順の 進行を通じて、潅流媒体（ＤＭＥＭ、Ｉ　Ｃ１％の胎児腓結晶及びパパペリン０ ．１２■／コ）に液浴される。この媒体はまた、２５ミリモルのヘペス緩衝剤、 グルタミン、１０００ｍ９のＤグルコース／　Ｌ　％及びｐ）１７．３±０．５ のピルビン酸塩ナトリウ（ＧＩＢＣＯＬａｂ、Ｃａｔ、　＃　３８０−２３２０ 　）の添加剤を有している。外膜の切除に続いて、後側の静脈切開が行われ、止 め枠組立体が挿入されて所定位置に結紮される。この血管は潅流媒体によって静 かに潅流処理された。その二枚的血管が確認され、主力る血管から約１〜２　ｍ ｍにて結紮される。

血管が完全に切シ取られる前に、支持台装置１０の手術トラック１４が先端側の 止め枠組立体２２及び基端側の止め枠組立体１８に取付けられる。切取シが完了 されると、基端側の止め栓は閉じられ、血管は約１００＋ｕＨｇとなる迄潅流媒 体によって潅流処理される。この後、先端側の止め栓が閉じられて血管を膨張状 態に保持するようになす。潅流溶液が残っている血管がプラスチック筒及び２重 の殺菌包装のなされたような発送容器の中に置かれる。この移送用箱は通常はス チロフオームで作られておシ、血管を収容する筒は約４°Ｃの氷水の中に置かれ る。しかる後、施設へ速く配送するために一般に特急便サービスが利用される。

何故ならば、活かしておくためには血管はドナーの心臓脈動停止から約２４時間 以内に到着しなければならないからである。

手術を行う施設に到着したならば、血管は氷が今も存在していることを確認する ために適当なパッケージ包装がなされていたかを検査される。清浄室内に滅菌場 が形成されて血管を検査され、処理段階が完了される。この処理段階での最初は 、検査をして無関係な組織を除去することである。二次的な支脈の全ての検査が 行われ、漏れがなかったならば、支持台に手術されたこの血管は抗生物質による 殺菌の準備が行われる。

殺菌 血管を予防的に殺菌するために、以下の重要な手順が参照されるべきである。

１、　イミペネム（１２μｇ／ｍｌ）がＤＭＥＭの溶液中に与えられる。これは 組織培養媒体である。

２、アンコパン（抗真菌性薬物）（５０μｇ　／　ｍ！　）もその溶液に添加さ れる。

３、血管はその溶液中で潅流され且つ液浴され、４時間にわたって６７℃の保温 器の中に置かれる。

冷凍保護剤の滴定に引き続いて、血管は極低温の冷凍保存に於−ける酷寒に耐え ることのできる袋内に包装される。通常は、幾つかの連続した層による包装が使 用され、血管を収容した内側パッケージの滅菌保存を行うようになされる。最終 的に、血管は冷凍保存の準備が達成されるのである。

冷凍媒体は、濃いＤＭＥＭ　＋　１０　％の胎児腓血清＋ＣＪ−１２Ｃ９７ａｔ のパパベリン＋２，５％のコンドロイチン硫酸＋１モルのＤＭＳＯ或いはその他 の適当な保護剤によって構成されている。

冷凍過程の詳細 本発明に於いて静脈及び動脈の冷凍保存に使用される冷凍スケジュールは、７５ 〜８５ｒｎｌの流体体積とともに２．５ｃＩＩＬ×２５ｃＩｒＬの円筒形の形状 に包装した組織を適当な冷凍装置（クリオメツド　モデル＃Ｉ　Ｃ１１０（９９ ０Ｃ）のような装置）の中に配置することを含んでいる。ここに与えられた温度 は大体の値であり、成る程度の自由度が機械や機器の相違を考慮して与えられる べきである。室の初期温度は１０℃に設定される。この室は、サンプルが＋４° Ｃに到達する迄は０．０１°Ｃ／分の冷却速度で冷却されるように設定される。

この時点で、組織は０．３±０．２°Ｃ／分の速度で冷却されるようになれ、サ ンプルが一２°Ｃとなる迄継続される。−２℃に達した時点で、相変化が始まる 。この時点で、融解熱の発生に備えて、室が一７０℃に達する迄冷却速度は一５ ０℃に高められる。室が一７０℃に到達した直後に、この室は一６０°Ｃになる 迄２０’Ｃ／分の速度で温められ、−６０°Ｃになるとその温度が１７分間にわ たって保持される。この間、血管の実際の冷却速度は約０．５±０．２°Ｃ／分 である。この１７分が経過した時点で、室は再び一３０℃のレベルに達する迄１ ０８Ｃ／分の速度で温められる。この−６０°Ｃのレベルが１分間持続され、し かる後にこの室はサンプルが一２０℃に達する迄０．０１°Ｃ／分の冷却速度は 約０．５±０．２°Ｃ／分である。最終的な冷却速度の調整段階はサンプルが一 ６５℃又はそれ以下の温度に達する迄０．５±０．２°Ｃ／分での冷却を持続さ せる。この冷却過程の結果、その最初から最後迄の冷却速度は約０．５±０．２ °Ｃ／分である。この冷却速度が静脈組織にとって最適であった。静脈を収容し たパッケージが室から取り出され、−１９６°Ｃの保存用の液体窒素の冷凍装置 の中に置かれる。

血管が移植の施設から要請される迄は、その組織は液体窒素の冷凍装置の中に収 容されているのである。

発　送 冷凍された血管は上述したような方法で適当な容器に入れて発送される。

解　凍 解凍並びに希釈の手順は以下のようにして実施される。即ち、 １、　滅菌場の中で且つ全て殺菌された部材を使用して、６７°Ｃ〜４２°Ｃに 温められた少なくとも２ｔの滅菌水をトレー器材或いはその他の容器に溜めて、 支持されている組織の全長部分を受け入れるようにする。

２、包装された血管を保護用の厚紙製の箱から取シ出し、その水浴槽の中に置く 。この包装体は、約８分間にわたって手で或いは自動的に攪拌されるか、或いは 包装体を軽く触診してもはや氷結晶が存在しないような状態になる迄、その浴槽 内に置いたままにすべきである。

３、氷結晶が存在しないと一度判定されたならば、この包装体を浴槽から取シ出 し、２つのノツチの間の面積部分に於いて外側の箔包装を注意深く拭いて乾燥状 態となし、挾みを使用してそれらのノツチの間で箔包装を切断する。箔の袋から 内側の清潔な袋を取シ出すには殺菌した鉗子が使用される。又、殺菌した挾みを 使用して内側の袋を切断する手順を繰シ返す。

４、支持されている血管を注意深く取シ出して清潔な殺菌されているトレー器材 或いはその他の適当な容器の中に置き、そこでもって希釈段階の最初の段階が行 われる。注射器を使用して５０　ｃｃの溶液（壜Ａ）が血管に与えられた。

この溶液は、 ０．５モルのマンニトール、 １０％の胎児腓結晶、及び ＤＭＥＭ　。

を含有している。血管はこの溶液によって優しく潅流処理され、洗い落とされた 物質はトレー内に残され、これによシ血管が５分間にわたって浸漬される。マン ニトールの代わシに、何れかの非浸透性の生体融和性の糖、例えば限定するわけ ではないが蔗糖、ソルビトール、トレハロース、グルコース等の糖で代用するこ とができる。ＤＭＳ○濃度の希釈は段階的に行われ、先行する段階でのモル濃度 の半分以下の段階的減少としなければならない。従って、最初のＤＭＳＯ濃度が １モルであるとするならば、最初の希釈段階ば１／２モル濃度の糖、次は１／２ モル濃度の糖、最終的にＤモル濃度の糖となされるのである。

５、段階４．が完了した時点で、トレー内の溶液は他の適当な容器内にあけられ 、トレーの中に次の薬剤が添加されて混合される。即ち、 段階４．で使用した壜Ａに残っている溶液５０ｃｃに、５Ｑｃｃの溶液（壜Ｂ） を加えた溶液が添加されて混合される。壜Ｂの溶液は、 １０％の胎児腓結晶、及び ＤＭＥＭ　。

を含有している。この混合液はこの時点でマンニトールが０．２５モル濃度とな る。注射器を使用してこの混合液で血管を優しく潅流し、約５分間にわたってそ の溶液中で血管を液浴する。

６、　段階５．０完了した時点で、トレー内の溶液が再び廃棄され、壜Ｂ内に残 っている溶液をトレーにあける。血管を優しく潅流し、約５分間にわたってその 溶液中で揺すられ（−０ Ｚ　このようにして血管は移植の容易がなされた。

しかし意図して使用される迄は、支持台から取シ外してはならない。

プルに基づいた典型的な解凍曲線を示しておシ、これは静脈の２０ｃｍ部片を４ ２°Ｃの５ｔの水の中に配置しそ収容しておシ、パッケージはその血管が解凍す る迄−１分間につき２回程各１５秒間だけ攪拌された。この水浴槽は解凍手順の 進行にともなって冷却されるがままにしだ。解凍速度は約２５°Ｃ／分であった 。典型的な解凍時間は約８分であった。

組織移項 ここに説明した方法で保存された血管は冠動脈又は末梢血管再構成のための動脈 の代わりとして使用することが意図された。従って、移植用組織は抗原性の組織 であるので、幾つかの注意事項及び推奨事項が示唆される。即ち、 １、　ドナー／移植骨は入れ人の血液群は相客性がなければならない。

２、　抗血小板療法の手術後の治療は限定するわけではないがディビリダモール 又はアスピリンを含むことができる。

３、　限定するわけではないがシクロスポリン、プレドニソロン及びアヂチオプ リンを含む小用量で短期有効な免疫抑制剤が移植部片に対する拒否反応を最少限 に抑えるのに使用される。

上述した技術を利用することによって、血小板の沈着が抑制され、これによシ血 程発生の可能性が少なくなシ、結局のところ開花状態が少なくされるのである。

免疫抑制剤の保温のような免疫学的な作用を少なくするためにその他の方式の血 管の下準備を行うことも考内皮細胞層は牛の分岐糸内皮（ＢＦＡ−ＩＣ）とされ た。これらの細胞は塑性組織の培養基質に取シ付いた状態で本来の状態で冷凍保 存された。生育力はアクリジンオレンジ及びプロピジウム沃化物、染料封入／排 除の効力検定の組み合わせを使用して判定された。ジメチルスルホキシドがその 他のテストされた冷凍保護剤よシも優れた効力を有することが見出された。これ らのテストされた冷凍保護剤には、グリセロール、ヒドロキシエチルスターチ及 びポリビニルゾロリドンが含まれる。ゆるやかな冷却速度と組み合わせて使用さ れる場合には、１−［ニル濃度のＤＭＳＯが最適であると判定された。第■表を 参照されたい。

第■表 静脈に関する冷凍過程の研究 （内皮細胞に関する制限された希釈の効力検定を使用）１珠冷凍　対　０．５℃ ／分　６　６．６９６＃（２５８）３３８（１５３）ｉ３８　．５９、　６段階 でＤＭＳＯ添加 ２）未冷凍　対　６℃／分　３　３．５５４　＊　（２４８）　２２８　（９６ ）　努　、６９６段階でＤＭＳＯ添加 ３）０．５℃　対　３°Ｃ／分　３　１．６７？ｎｓ　（１１９）　９５　（９ ６）　５６　−Ｆ３１６段階でＤＭＳ　Ｏ添加 ４）ＤＭ　ＳＯ無し対　有り　３　４．５１２　＊　（２０）　１８　（１０？ ）　８４　５．４５０．５°Ｃ／分（３段階） １ｎｓ　＝有効ではない、Ｐ＞０．０５＊＝Ｐ≦、０５ ＊＊＝Ｐ≦、０１ ０．５８Ｃ／分に於いては、内皮細胞の７０％以上が生き残る。これを１０°Ｃ ／分もしくはそれ以上の冷却速度の場合と比較すると、２０％以下の細胞しか生 き残らないのである。第■表を参照されたい。

第■表 牛の内皮細胞層の冷却速度０Ｃ／分に於ける生き残υ量に作用する冷却速度の影 響 光の実験は、実際の伏在静脈を使用するとともに、既に説明したＤＭＳＯの準備 並びに滴定に関するプロトコルに沿って、繰り返して行われた。本質的には、Ｄ ＭｓＯはそれぞれ４℃にて１０分間の６回の段階で添加され、濃度が１／４モル 濃度、１／２モル濃度そして１モル濃度となるようになされた。このＤＭＳＯは 、２５ミリモルのＨＥＰＥＳ緩衝剤と１０％の胎児腓血清とを含有するＤＭＥＭ と混合された。冷凍速度は０．５８Ｃ／分又は′５°Ｃ／分から変化された。こ の実験では０．５°Ｃ／分の冷却速度の方が、それより速い３°Ｃ／分の冷却速 度の場合よシも内皮の一体性の比率が高くなる結果を示している。第Ｖ表を参照 されたい。

第　Ｖ　表 ０．５°Ｃ／分又は６°Ｃ／分による 冷凍保存後の内皮の一体性 内皮の一体性（チ） 速度　サンプル＃　静脈＃　平均値　対照対照　１１４　３８　８６±１　−ｍ −３１０４６２±７　７２．１ ０．５　２０　７　７０±５　８１．４補正書の翻訳文提出書　（曲ｍｌｌ！１ ８４条の８銅秦）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血管を冷凍保存するのに使用される血管支持台であつて、 ドナーから切り取られた血管部分に挿入できる端部をそれぞれ有している第１及 び第２の細長いスタイレツトと、 前記スタイレツトに取付けられ、血管の内部と係合して、スタイレツト上に取付 けられた血管の液密な結紮を容易となすように作用する手段と、互いに対しで調 整可能に向かい合う状態で選択的にスタイレツトを受け止める支持手段であつで 、血管が収縮するのを防止されるようにスタイレツトの間で膨張させ、これによ り血管の入手並びに冷凍保存の段階を通じで該支持台が血管を支持するようにな すための前記支持手段と、 を含んで構成されたことを特徴とする血管支持台。 ２．請求項１に記載された装置であつて、前記支持手段が細長い支持部材、及び 、該細長い支持部材と係合される一対の支持部材と、前記各支持部材が前記スタ イレツトの対応する１つを受け止め、少なくとも１つの支持部材は細長い支持部 材に対して選択的に移動できるようになつていて、これにより支持部材の間並び にそれに受け止められているスタイレツトの間の向かい合う間隔距離を調整でき るようになつていることと、 を含んで構成され、 これによりスタイレツトは支持部材から取り外された状態で血管に取付けられる ことができるとともに、しかる後にスタイレツトの間に血管が張り渡された状態 で支持部材に対しで取付けることができるようになさ九でいる、 ことを特徴とする血管支持台。 ３．請求項１に記載された装置であつて、スタイレツトがそれに嵌着された血管 の内部と選択的に連通される流体通路を有しており、これによりスタイレツトの 間に張り度された血管を通して流体を灌流できるようになつている、 ことを特徴とする血管支持台。 ４．請求項３に記載された装置であつて、血管の中に流体を選択的に流入させる ことができるようにするために少なくとも１つの流体通路に組み付けられている 弁手段、 を更に含んで構成されたことを特徴とする血管支持台。 ５．請求項１に記載された装置であつて、前記支持手段が、 細長いトラックと、 前記トラック上に配置された第１及び第２のスタイレツト支持部材と、 少なくとも１つスタイレツト支持部材がトラックに移動可能に取付けられており 、スタイレツト支持部材の間隔距離が該一方のスタイレツト支持部材を前記トラ ックに対して移動させることによつて調整できるようになつていることと、 対応するスタイレツト支持部材にスタイレツトを着脱自在に受け止める手段と、 前記スタイレットがその上に嵌着された血管の内部に通じることのできる流体通 路を有していることと、前記スタイレツトに組み付けられ、前記流体通路を選択 的に遮断して支持台に配置された血管の内部に対しての連通を制御する弁と、 を含んで構成されたことを特徴とする血管支持台。 ６．請求項５に記載された装置であつて、前記弁が内部室及び該室に通じた孔を 有する弁本体を含んでおり、 スタイレツトは、前記内部室に通じる孔に対して自身に備えられている通路を連 通させて前記本体に連結されており、 弁は、前記内部室に作動的に組み付けられ、支持台に配置された血管の内部に流 体を選択的に流れ込ませることができるようになしている、 ことを特徴とする血管支持台。 ７．請求項６に記載された装置であつて、前記着脱自在に受け止める手段が、弁 本体及びスタイレツト支持手段の何れか一方にブラグ部材と、弁本体及びスタイ レット支持手段の他方に配置されたブラグと組み合う受け入れ部材とを含んでお り、弁本体及び連結されたスタイレツトが、血管にスタイレットを連結させた状 態のまま支持台の残りの部分から取り外され、しかる後にスタイレット間に血管 を張り渡した状態でスタイレット支持手段に対して取付けられることができるよ うになつている、ことを特徴とする血管支持台。 ８．血管を冷凍保存するのに使用される血管支持台であつて、 （ａ）実質的に真つ直ぐな支持トラック手段と、（ｂ）血管を支持して膨張させ るための一対の取付け手段と、 を含んで構成されたことを特徴とする血管支持台。 ９．血管を冷凍保存するのに使用される血管支持台であつて、 （ａ）細長い実質的に真つ直ぐな支持トラック手段と、 （ｂ）支持トラック手段に着脱自在に取付けられたスライド可能な止め栓組立体 であつて、（ｉ）止め栓本体、 （ｉｉ）止め栓本体と連通された中空スタイレツト、及び （ｉｉｉ）支持トラック手段に止め栓本体を着脱自在に取付けるための取付け手 段、 を含んでなる前記スライド可能な止め栓組立体と、（ｃ）支持トラック手段に取 付けられた固定の止め栓組立体であつて、 （ｉ）止め栓本体、 （ｉｉ）止め栓本体と連通された中空スタイレツト、及び （ｉｉｉ）容器からスタイレツトへ流体を流すのを容易とするために止め栓本体 に連通されたボス手段、を含んでなる前記固定の止め栓組立体と、を含んで構成 されたことを特徴とする血管支持台。 １０．血管を冷凍保存するのに使用される血管支持台であつて、 （ａ）細長い実質的に真つ直ぐな支持トラック手段と、 （ｂ）支持トラック手段に調整可能に取付けられたスライド可能な止め栓組立体 であつて、（ｉ）止め栓をトラックに連結する細長い円筒形の取付け部であつて 、該取付け部を通しで半径方向に延びた穴の形成された中空空間、及び取付けピ ンを受け止めることができる取付け部の部分を通して軸線方向に延びた穴の形成 された第２の空間を有しでいる前記取付け部、 （ｉｉ）丸められた開口端部を有し、血管部分に挿入できる直径の細長い中空ス タイレツト、及び、該スタイレツトの外面に沿つて配置された少なくとも１つの 隆起した環状フランジで、該フランジは後方へ向かつてテーパーを付された傾斜 部を有していて、該フランジ及びスタイレツトを血管内部に容易に挿入できるよ うに表しており、該フランジはフランジ肩部にて終端しでいて、これにより血管 の内面と係合して血管の液密な結紮を容易にできるようになす前記フランジ、（ ｉｉｉ）内部に円筒形の止め栓が同軸的且つ作動的に配置された中空の円筒形本 体、及び、半径方向の孔を有し、該孔が本体内部の穴と整合されて、血管内に取 り外し可能に受け入れられる寸法とされたスタイレツトの中に流入する物質の流 れを選択的に可能にし又は遮断することができるレバー、 （ｉｖ）前記本体及び止め栓穴と整合されるように本体から半径方向外方へ延び た中空の筒状のスタイレツト、 （ｖ）前記本体から外方へ且つスタイレツトと直角に延び、止め栓取付け部の内 方空間の中に同軸的に配向されて作動的に位置決めされることができる円筒形の 取付けピン、 を有してなる前記スライド可能な止め栓組立体と、（ｃ）（ｂ）に記載したよう な固定の止め栓組立体であつて、円筒形のボスを更に含み、該ボスは実質的に平 たい面で終端しているとともに前記本体から軸線方向に延びてスタイレツトと一 直線になり、これによりボスを通しで本体及びスタイレツトヘ、更に血管へと通 じる開かれた通路を形成するようになつており、この固定の止め栓は、スライド 止め栓スタイレツトの孔と固定止め栓スタイレツトの孔とが互いに向き合うよう に支持トラック手段と一体構成された固定取付け部によつて、支持トラックに対 しで直角に且つスライド止め栓と平行に支持トラックの一端で回転可能に取付け られている前記固定の止め栓組立体と、を含んで構成されたことを特徴とする血 管支持台。 １１．血管を冷凍保存する方法であつて、（ａ）患者から血管を切り取り、 （ｂ）切り取つた血管を少なくとも１つの有効量の抗生物質を含んだ適当な媒体 中に置き、（ｃ）切り取つた血管を少なくとも１つの有効量の冷凍保存剤に接触 させ、 （ｄ）細胞の生育力を許容レベルに維持できる冷凍スケジュールに従つて血管を 冷凍し、 （ｅ）血管を一１００℃より低い温度で保管する、諸段階を含むことを特徴とす る血管の冷凍保存方法。 １２．請求項１１に記載された方法であつて、抗生物質が有効量のイメペネム及 びアンコバソ混合物であることを特徴とする血管の冷凍保存方法。 １３．請求項１２に記載された方法であつて、血管が冷凍保存剤及びジメチルス ルホキシドの添加剤で滴定されることを特徴とする血管の冷凍保存方法。 １４．請求項１１に記載された方法であつて、冷凍保存剤を含有する溶液が、媒 体、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、グルタミン、Ｄ−グルコース及びピルビン酸ナトリウム 、胎児腓血清、パパベリン、コンドロイチン硫酸、及びＤＭＳＯの有効量である ことを特徴とする血管の冷凍保存方法。 １５．請求項１４に記載された方法であつて、前記媒体がメジウム１９９、イー グルメデイア、ハンクスメディア、デルベコスモデイフアイドイーグルメデイア 、イスヒブスモデイフアイドデルベコスメデイア、デフアインドメディアＡ２、 ＣＭＲＬ−１０６６、ＲＰＭＩ−１６４０（同様に１６０３、１６３０、又は１ ６３４）、Ｆ１０、Ｆ１２、アルフアメデイア、等を含むグルーブから選択され ることを特徴とする血管の冷凍保存方法。 １６．請求項１５に記載された方法であつて、媒体がデルベコスミニマルエセン シヤルメデイアである血管の冷凍保存方法。 １７．請求項１６に記載された方法であつて、冷凍保存剤が、 デルべコスミニマルエセンシヤルメデイア、２５ミリモルのへペス緩衝剤、 グルタミン、 １０００ｍｇＤ−グルコース／ｌ ｐＨ７．３のピルビン酸ナトリウム １０％胎児腓血清、 ０．０１２％パパベリン、 ２．５％コンドロイチン硫酸、 １モル濃度のＤＭＳＯ を含む混合物の有効量である血管の冷凍保存方法。 １８．請求項１６に記載された方法であつて、血管が、デルベコスミニマルエセ ンシヤルメデイア、２５ミリモルのへペス緩衝剤、 グルタミン、 １０００ｍｇＤ−グルコース／ｌ ｐＨ７．３のピルビン酸ナトリウム １０％胎児腓血清、 ０．０１２％パパベリン、 ２．５％コンドロイチン硫酸、 １モル濃度のＤＭＳＯ を含む混合物の有効量で幾度も滴定され、連続的に１／４モル、１／２モル及び １モルのジメチルスルホキシドを添加されることを特徴とする血管の冷凍保存方 法。 １９．請求項１８に記載された方法であつて、冷凍スケジュールが、 （ａ）血管を冷凍室の中に置き、 （ｂ）サンブルが約−２℃に達する迄適当な速度でサンブルを冷却し、 （ｃ）相変化が実質的に完了した後に適当な速度でサンブルを冷却し、 （ｄ）室から血管を取り出し、 （ｅ）血管を約−１９６℃の温度の液体窒素の冷凍装置の中に置く、 諸段階を含むことを特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２０．請求項１８に記載された方法であつて、冷却速度が約０．１℃／分、１０ ０℃／分の範囲にあることを特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２１．請求項２０に記載された方法であつて、冷却外が約０．１℃／分〜３０℃ ／分の範囲にあることを特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２２．請求項２１に記載された方法であつて、冷却速度が約０．３℃／分〜１℃ ／分の範囲にあることを特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２３．請求項２２に記載された方法であつて、冷却作動が約０．５℃／分〜１℃ ／分の範囲にあることを特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２４．請求項２３に記載された方法であつて、冷却作動が約０．５℃／分からの 範囲にあることを特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２５．請求項１９に記載された方法であつて、冷凍スケジュールが、 （ａ）血管を冷凍室の中に置き、 （ｂ）サンブルが約−１０℃の初期温度から約＋４℃に達する迄約０．０１℃／ 分の速度でサンブルを冷却し、 （ｃ）サンブルが約−２℃に達する迄約０．３℃／分の速度で室を冷却し、 （ｄ）室が約−７０℃の温度に達下る迄約３０℃／分の速度で室を冷却し、しか る後に （ｅ）室が約−６０℃の温度に達する迄約２０℃／分の速度で室を温め、 （ｆ）約−６０℃の温度に１７分間にわたっで室を維持し、 （ｇ）室が約−３０℃の温度に達する迄約１０℃／分の速度で室を温め、 （ｈ）約−３０℃の温度に１分間にわたつて室を維持し、そしで （ｉ）サンブルが約−２０℃の温度に達する迄約０．０１℃／分の速度で室を冷 却し、次に（ｊ）サンブルが約−６５℃の温度に達する迄約０．５℃／分の速度 で室を冷却し、しかる後（ｋ）血管を室から取り出し、そして （ｌ）約−１９６℃の温度の液体窒素の冷凍装置の中に血管を置く、 諸段階を含むことを特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２６．請求項１１に記載された方法であつて、更に、（ｅ）冷凍した血管を解凍 する、 段階を含むことを特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２７．請求項１８に記載された方法であつて、解凍段階が、 （ａ）軽い触診又は目視検査によつてもはや氷結晶が存在しないことが示される とき迄、３７℃に温められた無菌水の中に血管を置き、 （ｂ）無菌水から冷凍保存された血管を取り出し、（ｃ）（ｉ）０．５モルのマ ンニトール、（ｉｉ）１０％胎児腓血清、及び （ｉｉｉ）デルベコスミニマルエセンシヤルメデイア（ＤＭＥＭ）＋２５ミリモ ルのへペス緩衝剤、グルタミン、１０００ｍｇＤ−グルコース／ｌ及びピルビン 酸ナトリウム、 を含有する溶液の５０ｃｃで血管を灌流し、（ｄ）上記（ｃ）の段階で崩壊した 物質の中で５分間にわたつて血管を洗浄するようになし、 （ｅ）（ｉ）０．２５モルのマンニトール、（ｉｉ）１０％胎児腓血清、及び （ｉｉｉ）ＤＭＥＭ＋２５ミリモルのへペス緩衝剤、グルタミン、１０００ｍｇ Ｄ−グルコース／ｌ及びピルビン酸ナトリウム、 の有効量を含有する溶液を添加し、 （ｆ）（ｉ）０．２５モルのマンニトール、（ｉｉ）１０％胎児腓血清、及び （ｉｉｉ）ＤＭＥＭ＋２５ミリモルのへペス緩衝剤の混合物で５分間にわたつて 血管を灌流し、そして（ｇ）１０％胎児腓血清、 （ｉｉ）ＤＭＥＭ＋２５ミリモルのへペス緩衝剤、グルタミン、１０００ｍｇＤ −グルコース／ｌ及びピルビン酸ナトリウム、 の有効量を含有する溶液の有効量の中で５分間にわたつて血管を灌流し且つ液浴 する、 諸段階を含むことを特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２８．請求項１１に記載された方法であつて、基端側スタイレツトを血管の基端 側開口内に挿入し、且つ、先端側スタイレツトを血管の先端側聞口内に挿入し、 血管の両端をそれそれのスタイレットに対して結紮し、しかる後に支持トラック に対するそれぞれの取付け部に各止め栓組立体を取付けることによつて、切り取 られた血管が請求項１に記載された装置の上に支持され膨張されるされることを 特徴とする血管の冷凍保存方法。 ２９．デルベコスミニマルエセンシヤルメデイア、 ２５ミリモルのへペス緩衝剤、 グルタミン、 １０００ｍｇ％Ｄ−グルコース／ｌ ｐＨ７．３のピルビン酸ナトリウム １０％勇胎児腓血清、 ０．０１２％パパベリン、 ２．５％コンドロイチン硫酸、 １モル濃度のＤＭＳＯ の混合物の有効量で構成されたことを特徴とする冷凍保存剤。 ３０．冷凍保存された血管を解凍するためのキットであつて、 （ａ）（ｉ）マンニトール、 （ｉｉ）胎児腓血清、 （ｉｉｉ）ＤＭＥＭ＋へペス緩衝剤、グルタミン、Ｄ−グルコース及びピルビン 酸ナトリウム、を含有する溶液Ａ、 （ｂ）（ｉ）胎児腓血清、 （ｉｉ）ＤＭＥＭ＋へペス緩衝剤、グルタミン、Ｄ−グルコース及びピルビン酸 ナトリウム、を含有する溶液Ｂ、 を含んでなることを特徴とする解凍キツト。 ３１．血管を冷凍保存するためのキットであつて、（ａ）請求項１に記載された ような血管支持台と、（ｂ）デルベコスミニマルエセンシャルメデイア、 ２５ミリモルのへペス緩衝剤、 グルタミン、 １０００ｍｇＤ−グルコース／ｌ ｐＨ７．３のピルビン酸ナトリウム １０％胎児腓血清、 ０．０１２％ババベリン、 ２．５％コンドロイチン硫酸、 １モル濃度のＤＭＳＯ の混合物で構成された有効量の冷凍保存溶液と、（ｃ）血管の無菌状態及び一体 性を保持するためのパーキング手段と、 を含んで構成ことを特徴とする冷凍キット。 ３２．グリコスアミノグリカンの有効量を含有することを特徴とする冷凍保存剤 成分。 ３３．請求項２７に記載された冷凍保存剤成分であつて、グリコスアミノグリカ ンがヒアルロン酸、デルマタン硫酸、へパリン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン 硫酸から選択されたことを特徴とする冷凍保存剤成分。 ３４．グリセロール、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルスターチ、及び 、ポリエチレングリコール、ジメチルホルムアミド、エチルグリコールから選択 された有効量の物質を含有したことを特徴とする冷凍保存剤成分。