JPH03501732A

JPH03501732A - 多重ラメラリポソームの自発的小胞化方法

Info

Publication number: JPH03501732A
Application number: JP89501609A
Authority: JP
Inventors: マッデン，トーマス，ディー
Original assignee: ザ　リポソーム　カンパニー，インコーポレイテッド
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1988-12-22
Publication date: 1991-04-18
Also published as: CA1330199C; WO1989005636A1; EP0393145A1; EP0393145A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】多重ラメラリポソームの自発的小胞化方法ｉ１灸１１本発明はホモジナイズ化、ろ過、超音波処理、もしくは押出し技術、あるいはその系へのエネルギーの導入を必要とするような他の技術、あるいは脂質を過酷な環境に曝すことなく、単層小胞体（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を形成する方法に関する。このような環境としては例えば洗浄剤もしくは極端なｐＨ環境が挙げられる。

リポソームは取り込まれた（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）水性容量（ａｑｕｅｏｕｓｖｏｌｕｍｅ）を含む完全に閉鎖された脂質二分子膜（ｂｉｌａｙｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）である、リポソームは、基ラメラ小胞体（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）　（単一の二分子膜を有する）または多重ラメラ小胞体（ＭＬＶ：ＩＩｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌａｓ）　（水性１によって、隣のものと仕切られている多くの二分子膜を持つタマネギ様構造）であり得る。

この二分子膜は疎水性の（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）尾部部位と親水性の（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）の頭部部位を持つ二つの脂質の単層より成っている。

この二分子膜の構造は、脂質単分子膜の疎水性の（無極性）尾部は二分子膜の中心に配向し、一方親水性の（極性）の頭部は水性相（ａｑｕｅｏｕｓ　ｐｈａｓｅ）に配向しているというようなものである。

パンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）等［ジャーナル・サブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１９６５．１２：２３８−２５２）コの初期のリポソームの調製は、燐脂質を有機溶媒中に懸濁し、蒸発乾燥させて反応容器上に燐脂質膜を残留させることにある１次に水性溶液の適当量を加え、混合物を膨潤し、得られた多重ラメラ小胞体（にＬＶｓ）からなるリポソームは機械的手段で分散させる。このようにして形成されたＭ　Ｌ　Ｖ　ｓは本発明の実施に当って用いることができる。

本発明の出発リポソームとして用いることができる他の種類のリポソームも実質的に同じ層溶質分布（１ａ＋ｍｅｌｌａｒ　５ｏｌｕｔｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）をもつリポソーム類である。この種類のリポソームはレンダ（Ｌａｎｋ）等の米国特許４，５２２，８０３中で安定な多層小胞体（ＳＰＬＶ：　５ｔａｂｌｅ　Ｐｌｕｒｉｌａｍｅｌｌａｒ　Ｖｅｓｉｃｌｅｓ）と呼ばれており、ファウンティン（Ｆｏｕｎｔａｉｎ）等の米国特許４，５５８，５７９中では単相（ｍｏｎｏｐｈａｓｉｃ）小胞体と呼ばれている。小胞体が存在する凍結・融解された多層小胞体（ＦＡＴＭＬＶ：　Ｆｒｏｚｅｎ　Ａｎｄ　Ｔｈｏｖｅｄ　Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ　Ｖｅｓｉａｌｅｓ）は少なくとも１回の凍結と融解の繰り返しを受ける。この工程はバリイ　（Ｂａｌｌｙ）等の１９８７年１月１５日公開ＰＣＴ出［８７１０００４３、発明の名称「改良された取り込み効率を有する多層リポソームＪ中に記載されており、いずれも本書中に引用されている。

リポソームは、脂質から成る。ここで用いられる脂質という用語は、脂質物質の疎水性部分が二分子膜の内側に向かって配向し、一方、親水性部分は水性相に向かって配向しているような二分子膜となる、任意の適当な物質を意味するものとする１本発明のリポソーム製剤に用いることのできる脂質は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、更に詳しくは、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びシミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）のようなリン脂質である。リポソームは、ＤＭＰＧ、あるいはＤＭＰＧとＤＭＰＣとを例えば３ニアのモル比で混合したものをそれぞれ使用して、形成及び小胞化することができる。

リポソーム製造中に、脂質を懸濁させるために、有機溶媒を用いてもよい、適当な溶媒は、中程度の極性と誘電特性を有し、脂質を可溶化するものであり、ベンゼン、クロロホルム、塩化メチレンのようなハロゲン化、脂肪族、脂環族又は芳香−脂肪族の炭化水素類、メタノール、エタノールのようなアルコール類、及びベンゼン：メタノール（７０：　３０）のような混合溶媒が挙げられるが、これらに限定されるものではない、その結果、脂質含有溶液（脂質及び他の成分が全体にわたって均一に分配されている混合物）が形成される。溶媒は、一般に生物適合性、低毒性及び可溶化能に基づいて選択される。

本発明の多重ラメラリ°ポソーム原料及び多重ラメラリポソーム製品は、脂質可溶性生物活性剤を含有してもよい、このような生物活性剤は、リポソームの脂質二分子膜と典型的に結合する０本発明で用いられる場合、生物活性剤という用語は、生物活性を有する任意の化合物を含むものである０例えば、イブプロフェン。

インドメタシン、サリンダック、ピロキシカム、ナプロキセンのような非ステロイド系抗炎症薬；ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート等のような抗腫瘍薬及びジブカインのような麻酔薬、ピロカルピンのようなコリン作動薬、ベネドリルのような抗ヒスタミン薬、コディンのような鎮痛薬、アトロビンのような抗コリン作動薬、イミブラミンのような抗うつ薬、プロプラノールのような抗不整脈薬の如き他の治療薬のような脂質可溶性薬剤、並びに染料；免疫調節剤、造影剤、蛍光剤のような治療蛋白質及びペプチドの如き他の脂質親和性剤が挙げられる。更に１本発明の方法によって作られた小胞は、二分子膜結合マーカー又は蛋白質、ペプチドのような分子を含んでもよい。

本発明のリポソームは、リポソーム−薬剤搬送系で用いられる。

リポソーム−薬剤搬送系においては、薬剤のような生物活性剤をリポソームと結合させ、次いで治療すべき患者に投与する０例えばＲａｈｍａｎ等、米国特許第３，９９３，７５４号；　５ｅａｒｓ、米国特許第４，１４５゜４１０号；　Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等、米国特許第４，２３５，８７１号；　５ｃｈｎｓｉｄｅｒ、米国特許勇４，２２４，１７９号；　Ｌａｎｋ等、米国特許第４，５２２，８０３号；及びＦｏｕｎｔａｉｎ等、米国特許第４，５８８，５７８号参照。

疾患の治療に有用な多くの薬剤では、患者に毒性が認められる。

かかる毒性としては、抗腫瘍薬ドキソルビシンの場合の心臓毒性や、アミノグリコシド又はアンホテリシンＢのようなポリエン抗生物質の場合の腎毒性がある。

アンホテリシンＢは、生命をおびやかす真菌性感染症の治療に唯一の物も高い信頼性を有する。極めて毒性の高い抗真菌性ポリエン抗生物質である（　丁ａｙｌｏｒ等。

アメリカン　レビューレスビレ−ジョンディスクロージャー（Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、　１２５．６１０−６１１　（１９８２））、アンホテリシンＢは疎水性薬剤であるため、水溶液には不溶性であり、デスオキシコレートへのコロイド状分散体として市販されているが、この分散に用いる分散剤が、そ九自体、毒性を有している。アンホテリシンＢメチルエステル及びアンホテリシンＢは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因に示されており、脂質被覆レトロウィルスであるＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶウィルスに対しても活性であることが知られている（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ等、バイオケミカルファーマコロジ− （Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｎａｃｏｌ、）　３５．４１１０−４１１３（１９８６））、この研究性）とアンホテリシンＢとを添加して、ＨＴＬＶ−ｍ／ＬＡＶ感染細胞の培養液を分離し、ウィルスの複製に関して、その細胞の測定を行った。その結果、アンホテリシンＢメチルエステル及びアンホテリシンＢは、ヘルペスウィルスについて示されたのと同様に、標的細胞をウィルスの細胞変性効果から守ることが分った（Ｓｔｅａｖｅｎｓ等、アーキテクチュアルヴイロロジー（Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、）、旦、３９１（２９７５））。

リポソームでカプセル化したアンホテリシンＢを使用することの報告が文献に見られるｎ　Ｊｕｌｉａｎｏ等〔アンナールスニューヨーク　アカデミーサブサイエンス（Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）４４６、３９０− ４０２（１９８５））は全身的な真菌性感染症をリポソームアンホテリシンＢで治療することを検討している。このようなリポソームとしては、例えばモル比で７：３のシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）とシミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、及びコレステロールのようなリン脂質が挙げられる。遊離及びリポソームに取り込まれたアンホテリシンＢを比較した急性毒性の研究（ＬＤ、。）及び生体外測定から、リポソーム製剤の使用により抗真菌性効力は実質的に変らず、毒性は低下することが分った＊　Ｌｏｐｅｚ− Ｂｅｒｅｓｔａｉｎ等〔ジャーナルサブインフェクシャスディジーズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、）　１５１．７０４−７１０（１９８６））は、リポソームでカプセル化したアンホテリシンＢを全身真菌性感染症患者に投与した。リポソームは、ＤＭＰＣとＤＭＰＧとを７：３のモル比で含有し、薬剤を９０％以上の効率でカプセル化した。５モル％のアンホテリシンＢでのリポソーム薬剤治療の結果、治療を受けた患者の６６％に薬効があり、真菌性感染の一部もしくは全体に緩解が認められた。Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｓｓｔｅｉｎ等〔ジャーナルサブインフェクシャスディジーズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

りｉｓ、）　！４７．９３９−９４５（１９８３））、Ａｈｒｅｎｓ等〔エスジャーナルサブメディカルヴア１１マイコロジー（Ｓ、　Ｊｏｕｒ、　Ｍｅｄ、　Ｖａｔ、　Ｍｙｃｏｌ。

２２、１６１−１６６（１９８４））、Ｐａｎｏｓｉａｎ等［アンチマイクロバイアルエージェンツケモテラビ−（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏ、）　２５．６５５−６５６（１９８４））及びＴｒａｍｂｌａｙ等〔アンチマイクロバイアルエージェンツケモテラビ−（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ。Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏ、）　２６．１７０−１７３（１９８４））も、マウスの全身カンジダ症及びリーシュマニア症（Ｐａｎｏｓｉａｎ等、前出）の治療及び予防におけるリポソームアンホテリシンＢに対する遊離アンホテリシンＢの比較効力をテストした。

カンジダ症の治療において、リポソームでカプセル化したアンホテリシンＢを用いると、治療指数が高くなることが見出された。

すべての場合、この薬剤をリポソームでカプセル化すると、より多量のアンホテリシンＢ投与を認容できることが見出された。アンホテリシンＢ−リポソーム製剤は、リーシュマニア症の治療にはほとんど、あるいは全く効果がなかった。

はとんどあるいは全く効力低下なしに、取り込まれた薬剤の毒性を緩和するリポソームの能力は、ますますよく確認されるようになってきている。従って、これらの品質を持った全ての種類のリポソームを作り得ることに対する要求が増大している。単ラメラ小胞は、膜介在法の研究の場合と共に、ある種の生体内薬剤搬送については、明らかに多重ラメラ小胞体よりも好ましい。

生体内搬送小瓶として使用した場合、例えば、基ラメラ小胞体は、ＭＬＶよりもゆっくりと血液から取り除かれ、肺及び多分骨髄への分配が促進される９本発明の時点までは、これらの種類の小胞を製造する公知の方法は、フィルターからの押出し、あるいは超音波処理、均質化、磨砕などのエネルギー人力を必要とする他の物理的破損方法のような、多重ラメラ小胞体の過酷な処理に依存していた。

低ｐＨ又は高Ｐ　Ｒにおいて、洗浄剤又は溶液を使用して基ラメラ小胞体を形成する過酷な化学的処理手法も用いられている９本発明は、従来、必要とされた過酷な処理を行わず、低イオン強度の培地で、所定温度にてリポソームを培養することにより、多重ラメラ小胞体から単うメラホ胞体を形成させる技術を提供するものである。

更に、これらの系の製造は思いがけなく簡単であることに加えて、極めて限定された条件下で形成される。これらの脂質の小胞体化が、脂質の相転移温度（Ｔｃ）近辺及び低イオン強度培養下でのみ起こるという事実によって、小胞体形成が高度に制御される。更に、これらの系に特有の二分子膜の不安定性は、二分子膜と薬剤のような疎水性化合物との相互作用に好都合であり、あるいは膜蛋白質又はペプチドの挿入を促進するものと期待されよう。

ｉ豆Δ！１本発明は、多重ラメラ小胞体（ＭＬＶ）から基ラメラ小胞体を自発的に形成する方法を開示する。かかるＭＬＶは脂質からなり、基ラメラ小胞体は、多重ラメラ小胞体を中性ＰＨのイオン強度媒体にて、脂質の転移温度近辺でインキュベートすることにより形成される。好ましくは、脂質はリン脂質からなり、特にホスファチジルグリセロール単独又はホスファチジルコリンとの組み合わせからなり、更に好ましくは、モル比で７：３のシミリストイルホスファチジルコリンとシミリストイルホスファチジルグリセロールとからなる。

本発明の基ラメラ小胞体を形成するには、リポソームを約ＯｍＭから約２５ｍＭ１：での塩の媒体（培地）にて、約２２〜２６℃、好ましくは約２４℃でインキュベート（培養）する、更に好ましくは、媒体がｐＨ約７．０〜８．０、好マシくはｐＨ７，６で、約０〜１０ｍＭの塩からなり、インキュベーション時間は約１５分から約２４時間である。

１１立貫見髪■豆第１図は、ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ　（７：　３）のＭＬＶの小胞化をインキュベーション媒体のイオン強度の関数として示す。ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ　（１０ｍＭ）を下記培地にて、４℃で水和し、２４℃で培養した（実施例１及び２参照）。サンプル媒体は、Ｈ，０（白丸）；２ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（黒四角）；１０ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍ　Ｍ　ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　、　ｐ　Ｈ７、６（白三角）；又は２５ｍＭＮａＣ１，２ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，６（黒三角）であった。

第２図は、ＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧの３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。脂質（１０ｍＭ）をＨ、Ｏにて４℃で水和し、そのスペクトルを３０℃で記録した（Ａ）、同じ脂質混合物を２４℃で１時間（Ｂ）及び１２時間（Ｃ）インキュベ−１〜した。１５０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，６にて水和し、２４℃で１２時間インキュベートしたＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ　（モル比７：３）をＣＤ）に示す。

第３図は、ホスファチジルコリンとホスファチジルグリセロールの混合物の”Ｐ −ＮＭＲスペクトルである。脂質（１０ｍＭ）を１５０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，６（Ａ。

Ｂ、Ｃ）又は２ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，６（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ。

Ｈ）４：テ水和し、２４℃（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｇ、Ｈ，Ｊ）　又は１０’Ｃ（Ｄ、Ｅ、Ｆ）で１６時間インキュベートした。

丑ｊＢ列詳１口と１朋一本発明の基ラメラリポソームは、中性ｐＨの低イオン強度媒体、及びゲルから液体への結晶転移温度（Ｔｃ）近辺のインキュベージョン温度の条件に、多重ラメラリポソームを置くことによって形成される。このようなインキュベーション条件下で、ＭＬＶは小胞化して基ラメラ小胞体を形成する。中性Ｐ）（付近の狭い範囲で小胞化が起こるので、本方法では、酸性及びアルカリ性ｐＨへの変更を必要とする従来技術は不要である。

本発明のリポソームは、好ましくはリン脂質からなり、特にシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はシミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）との組み合せからなる。リポソームの小胞化には、ＤＭＰＣとＤＭＰＧとを種々のモル比とするのが適当であるが、小胞化速度は、ＤＭＰＧ濃度の低下と共に低下する。

水和に際し、最も自然に存在するリン脂質は、一般に、二分子膜構造か、又は六角形ＨＩ［相のいずれかをとる（Ｃｕｌｌｉｓ及びｄｅＫｒｕｉｊｆｆ、パイオヒミカ　ウントバイオフィジカエト　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、　５５９．３３９（１９７９）；　Ｃｕ１ｌｉｓ等、リン脂質及び細胞１１１！、　Ｊ、ＦＪｕｏ、　Ｅｄ、　ＣＲＣＰｒｅｓｓｔ　Ｂｏｃａ　Ｂａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ（１９８５））、両方の例において、形成された高分子構造は大きく（数ミクロン）、安定であり、これらの２つの多形相間の遷移によっても小さい小胞は生じない、一つの例外は、カルシウムの存在下で六角形ＨＩ［相をとるカルシオリビンの場合である。この混合物をＥＤＴＡに対して透析すると、小さい小胞が生じる（Ｖａｉｌ等、バイオヒミカ　ウントバイオフィジカエトアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、　５５１．７４（１９７９））　、　Ｌ、かし、これはおそらく、円筒状ＨＩＥ配列の外側において、カルシオリピンからカルシウムが除され、その結果、二分子膜小胞体が“発泡”することによるものであろう、大きい多重ラメラ小胞体は、脂質の構造及び運動特性を研究するのに有用な膜モデルであるが、膜研究及び薬剤搬送の多くの分野で、単ラメラ小胞体系の使用を必要とし、その使用が好都合である。基ラメラ小胞体は、２つのカテゴリーに定義することができる。それらは、直径が約５０ｎｍ未満の小さい基ラメラ小胞体（ＳＵＶ）と、通常、直径が５０ｎｍ〜１μｍの小胞体を含む大きい基ラメラ小胞体（ＬＵＶ）とである（　Ｈｏｐｅ等、ケミカルアンドフィジカルリポソーム（Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐ、）丘立、　８９（１９８６））、　ＬＵＶについては、多層内部水性区画がなく、比較的高い取り込み容積が得られるため、膜融合〔ウィルシャット（Ｖｉｌｓｃｈｕｔ）等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１９．６０１１（１９８０）　）及び生物活性化合物の生体内搬送［Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ等、ファーマコロジカルレビュー　（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｒｅｖ、）３６．２２７（１９８４））を含む各種研究分野において有用なものとなっている。乾燥脂質を単に水和しただけで形成されたＭＬＶは、非平衡溶質分配による浸透ストレス下にあるが（Ｇｒｕｎｅｒ等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２４．２８３３（１９８５））　、それにもかかわらず、安定な構造をしている。ＭＬＶからＬＵＶ又はＳＵＶを形成するには、上述のように１例えば超音波処理（）ｌｕａｎｇ、バイオケミストリー（Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　８　、３４４（１９６９））やポリカーボネートフィルターからの押し出しくＨｏｐｅ等、バイオヒミカ　ウントバイオフイジカエトアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、　８１２．５５（１９８５））による積極的な粉砕が通常必要である。

ホスファチジルコリンと帯電単一鎖洗浄剤（）ｌａｕｓｅｒ等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２５．２１２６（１９８６））又は短鎖リン脂質（Ｇａｂｒｉｅｌ等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２３．４０１１（１９８４））との混合物からＬＵＶを形成することが記載されているが、二分子膜形成性リン脂質のみからなるＭＬＶの自発的小胞化の唯一の報告例は、一時的にアルカリｐＨに置かれた。酸性リン脂質とホスファチジルコリンとの混合物に関するものである［）ｌａｕｓｅｒ等、プロシージングスサブザナショナルアカデミーサブサイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　７９．１６８３（１９８２）　ＨＨａｕｓｅｒ等、米国特許第４，６１９，７９４号、１９８６年１０月２８日発行：Ｈａｕｓａｒ等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２５．２１２６（１９８６）；Ｇａ１ｎｓ等、バイオヒミカ　ウントバイオフイジカエトアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、　７３１．３１（１９８３）　：　Ｌｉ等、Ａイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２５．７４７７（１９８６））。

膜脂質をアルカリ性ｐＨに置くと、脂質及び／又は存在する生物活性剤が分解し、小胞内容物が洩出するため、この技術は、リポソームを使用いる薬剤搬送の分野の欠点を補うのに役立っている。我々は、驚くべきことに、飽和ホスファチジルグリセロール及び飽和ホスファチジルコリンとホスファチジルグリセロールとの混合物において、中性ＰＨ付近で基ラメラ小胞体を形成することができることをここに開示する。思わぬことに、脂質の小胞化は、ゲルから液体への結晶相転移点（転移温度、Ｔｃ、約２２〜２６℃、最も好ましくは約２４℃）近辺の温度でのみ起こり、水和又は低イオン強度のインキュベーション媒体を用いた場合に起こる。高イオン強度のインキュベーション媒体（約５０ｍＭよりも高い塩）を用いると、小胞化速度が低下するか、あるいは小胞化が全く起こらない、小胞化は、インキュベーション媒体の高イオン強度が低下するにつれて、起こるようになる。ＭＬＶは、低イオン強度のインキュベーション媒体（約１０ｍＭ以下のイオン強度）に置かれ、脂質のＴｃ近辺でインキュベーションされた時。

自発的に小胞化する。インキュベーション媒体としては、任意のイオン種類の溶液、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムその他の塩類が用いられる。従って、インキュベーション媒体に約○〜２５ｍＭの範囲の塩が存在すれば、小胞化を促進するであろうが、最適条件は約Ｏ〜１０ｍＭの塩である。

ＭＬＶの小胞化は、低イオン強度培地で１５分〜数時間、使用する脂質のゲルから液体への結晶転移温度近辺でリポソームをインキュベートするように条件づけることができる。小胞化が起こったかどうかは、準弾性光散乱を用いて得られたリポソームの大きさの測定（単うメラ対多重ラメラ）、凍結−破砕電子顕微鏡を用いる得られた小胞体の影像化、及びライン形状、スペクトル幅が狭く、信号が等方性である場合は、単ラメラ小胞体構造を示し。

一方、フィールドショルダーが低く、フィールドピークが高い場合は、小胞体が大きいことを示す。

例えば、アンホテリシンＢのような薬剤の如き生物活性剤を導入するリポソームは、次のような本発明方法により形成することができる。アンホテリシンＢを超音波処理により、水溶液、例えば蒸留水、に分散させる０次いで５分散薬剤を水溶液中、例えば蒸留水又は食塩水中、で脂質分散体と混合する。混合物を使用脂質の転移温度あるいはそれよりも高い温度でインキュベートし、小胞体を形成する。

シミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭ　Ｐ　Ｇ）を単独又は組み合せて使用し、リポソームを形成した場合、及び脂質を、約Ｏ〜約２５ｍＭ塩のイオン強度を有する水溶液と混合し、その脂質の転移温度近辺（即ち約２２〜２４ ℃）でインキュベートした場合、リポソームは自発的に小胞化し、大きい単ラメラ小胞体（ＬＵＶ）を形成する。このＬＵＶ形成方法は、化学薬品、洗浄剤と接触させたり、極端なｐＨにしたりするような、小胞体の過酷な処理を用いるものではなく、対応米特許出願番号第１３６゜２６７号、　１９８７年１２月２２日出願、に開示されており、この関連部分はここでも引用されている。

例えば、ＤＭＰＧは単独でも使用できるし、例えばＤＭＰＣのような他の脂質と、例えばＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧが３ニアのモル比となるように組み合せて用いることもできる。これらの脂質は、ベンゼン：メタノ−“ルは７０　：　３０　（Ｖ／Ｖ）溶液から共凍結乾燥することができ、使用時まで−２０”Ｃで貯蔵される。ＭＬＶは、脂質（例えば脂質合計１３　、５　ｕ　ｍｏｌｅ／　ｍｌ）を蒸留水、緩衝液などの水溶液中で４℃で水和することにより調製される。アンホテリシンＢを含有するＬＵＶを形成したい場合は、イオン強度が約０〜約２５ｍＭ塩の水溶液中で脂質を水和し、約２３℃で培養する０次いで、約０　、９８　ｕ　ｍｏｌｅ／ｍｌの濃度で、浴超音波処理により蒸留水中に分散させたアンホテリシンＢを、水利脂質に添加し、約２３℃で約１時間インキュベートして、アンホテリシンＢ含有ＬＴＪＶとする。脂質とアンホテリシンＢとの割合は、アンホテリシンＢが約７モル％の割合となる。

本発明の脂質は１例えば蒸留水、食塩水、緩衝水溶液などの任意の入手可能な水溶液を用いて水和し、リポソームを形成することができる。このような緩衝液としては、リン酸緩衝塩溶液（“ＰＢＳ″）、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸（“トリス″）緩衝液及び好ましくはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジシーＮ−２−エタンスルホン酸（”ＨＥＰＥＳ”）緩衝液のような緩衝塩溶液が挙げられるが、これらの限定されるものではない、このような緩衝液は、約７．０〜約８．０のＰ　Ｈで用いるのが好ましく、特に約７．６のＰＨが好ましい、必要であれば、培地のイオン強度を小胞化過程に応じた生理的数値に調整してもよい。

本発明のリポソームは、小胞化前又は後に脱水してもよく、それによって使用時までの貯蔵期間を延長することができる。リポソームの凍結乾燥には、標準凍結乾燥装置又はそれ同等の装置を使用すればよい。

リポソームは、単に減圧下に置いて、懸濁液を蒸発させることにより脱水してもよい。また、脱水前に、リポソームとその周囲の媒体とを凍結させることもできる。このような脱水は、一つ又はそれ以上の保護剤（例えば保護糖）の存在下で、Ｊａｎｏｆｆ等の方法（Ｐ　ＣＴ　８６１０１１０３．１９８６年２月２７日発行、ここでも引用されている）により行うことができる。

本発明の方法で得られるリポソームは、ヒトを含む哺乳動物において、感染症又はリポソームの使用によって、例えば徐放性、低毒性及び薬剤をその生物活性形態で導出する他の特性が有利に得られる状態の治療に用いることができる。

製剤の投与方式によって、化合物が導出される生体内の部位及び細胞が決まってくる０本発明のリポソームは、単独で投与できるが、一般に、目的とする投与経路及び標準的な製薬上の慣例に応じて選ばれた製薬担体と混合して投与されるであろう、製剤は、例えば、動脈内又は静脈内に非経口注射することができる。ｊｌ剤は、経口、皮下、又は筋肉内経路で投与してもよい。非経口投与については、例えば、溶液を等張にするだけの塩又はグルコースのような他の溶質を含んでもよい殺菌水溶液の形で用いることができる。製剤の特定の性質に応じて、その他の用途は、当業者が想到できるであろう。

局所投与方式については、本発明のリポソームをゲル、オイル、エマルジョン等の投与形態に混合することができる。このような製剤は、クリーム、ペースト、軟膏、ゲル、ローション等として、直接塗布により投与される。

経口投与方式については、生物活性剤をカプセル化している本発明のリポソームを錠剤、カプセル剤、１ｏｓｅｎｇｅｓ＋　トローチ剤、散剤、シロップ剤、チンキ剤、水溶液、分散液等の形で使用することができる０錠剤の場合、使用できる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム及びリン酸塩が挙げられる。

でんぷんなどの各種崩壊剤及びステアリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルクなどの滑沢剤が通常、錠剤に用いられる。カプセル剤形の経口投与については、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールが希釈剤として有用である。経口用に水性分散液が必要な場合は、活性成分を乳化剤及び分散剤と組み合わせる。

必要であれば、ある種の甘味剤及び／又は香味剤を加えることができる。

次の実施例は、本発明の説明のために示すだけのもので、発明の範囲を限定するものではない。

１庭銖よりＭＰＣＨＤＭＰＧ　（７：　３Ｍ比）をベンゼン：メタノール（７０：　３０Ｖ／Ｖ）から凍結乾燥した。この脂質を蒸留水、ｐＨ７，６，４℃で１０ｍＭに水和し、ＭＬＶｓを形成した１次いで、この懸濁物を２４℃で１５分間インキュベートした。ＱＥＬＳ研究は得られたリポソームがＬＵＶｓに相当する直径約２００ｎｍであることを示した。

上記の方法を水利溶液として２ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて続いて行なった。

ＱＥＬＳｍ定はＬＵＶｓであることを示した。

この実施例は、中性のｐＨにおいて、低イオン強度の媒体（蒸留水、０ｍＭ塩）中、７：３Ｍ比のＤＭＰＣＨＤＭＰＧのインキュベーションにより、基ラメラリポソーム類の形成を示すものである。基ラメラリポソーム類はその調製が２４℃ でインキュベートされた時、自発的に形成した。

夾庭史主水和溶液として１５０　ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃ１，２ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液を用い、実施例１の操作及び材料が使用された。ＱＥＬＳ測定はインキュベーション後、リポソームの大きさにおいて（小胞形成のない）変化のないことを示した。

第１図は、インキュベーション時間に対するＭＬＶ又はＬＬ、ｌＶの指示としてその小胞体直径（準弾性光散乱により得られた、ＱＥＬＳ）をプロン１−することにより小胞形成を証明しており、２４℃における小胞形成の割合が水和媒体のイオン化強度に直接関係していることを示している。第２図は該懸濁液の”Ｐ− ＮＭＲスペクトルにより、小胞形成を証明している；この小胞化された試料（ＢおよびＣ１低イオン化強度でのインキュベーション）は特徴的な狭いスペクトルおよび等方性の脂質移動のピークを示し、これは小胞体が４００ｎｍよりも小さいことを期待させるものである。第２図のＡおよびＤは低いフィールドショルダーと２つの高いフィールドビークを有する特徴的な二分子線形状（ｂｉｌａｙｅｒｌｉｎｅｓｈａｐｅ）を示している。ＡおよびＤのプロットは小胞形成が生じないＴｃより上の温度および高イオン化強度の水和媒体といった各々の条件下でインキュベートされた試料から記録された。多重ラメラもしくは単ラメラ小胞体を視覚化させることにより、凍結粉砕電子顕微鏡法で該ＱＥＬＳおよび”Ｐ−ＮＭＲのデータを確認した。

１１箆止ＤＭＰＧ　（ｌｏｍＭ）を１０ｍＭＮａＣ１，２ｍＭＨＥＰＥＳを用い、４℃、ｐＨ７，６で水和しＭ　Ｌ　Ｖ　ｓを形成した。これらＭ　Ｌ　Ｖ　ｓを２４℃ で１５分間インキュベートし、この試料をＱＥＬＳで分析した。°得られたリポソームは単ラメラ（ＬＵＶｓ）であった。

この実施例は実施例１３と比較することが出来、３ニアのモル比のＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧを１０ｍＭＮａＣ１中でインキュベートしてつくられるリポソーム（実施例１３）は、５時間のインキュベーションの後ようや〈実施例３の２００ｎｍ直径の小胞体に到達することができる。

１１檻生７：３のモル比のＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧを水蒸気飽和空気中３２℃で６０分間平衡化し、次いで、水利媒体として２ｍＭのＨＥＰＥＳを、３２℃のインキュベーション温度を用い、実施例１の手法および材料を用いてＭＬＶｓ（１０ｍＭ脂質）をつくった。６時間インキュベーション後、ＱＥＬＳｍ定法でこのリポソームが２ミクロンより大きな平均直径を有することを示していて、小胞形成は起きていなかった。

上記製剤を、続いて２４℃でインキュベートしたところ、このリポソームが小胞体化され、単ラメラ小胞体になっていることがＱＥＬＳ測定により示された。

この実施例は脂質の約Ｔｃ辺りでのリポソーム系のインキュベーションの対照である；これは、このインキュベーションのパラメーターが本発明での重要な要件であることを示している。

叉１旌ｌ水和媒体として２ｍＭのＨＥＰＥＳを、および１５℃のインキュベーション温度を用い、実施例１の手法および材料を採用した。

６時間のインキュベーション後、ＱＥＬＳ測定ではこのリポソームが２ミクロンより大の平均直径を有していることが示され、小胞形成は生じていなかった。

この実施例は、Ｔｅが重要なインキュベーションのパラメーターであることの、更なる対照として使われている。このインキュベーション温度では小胞体形成は生じていなかった。しかしながら、この系が２４℃でインキュベートされたとき、このリポソームは素速く小胞化された。

叉立医旦７：３Ｍ比のＤＯＰＣ：　ＤＯＰＧを２ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝剤で水和し、２４ ℃で２４時間インキュベートした。試料を、二分子相脂質組織と相応したスペクトラムを持ったｓｌＰ−ＮＭＲ分光分析法を用いて分析したところ、この小胞体は約４００ｎｍより大きい直径を有していた。

１庭匠Ｉ７：３Ｍ比のＤＯＰＣ：　ＤＯＰＧを用い、実施例１の手法、材料を採用して、この脂質を２ｍＭ　ＨＥＰＥＳで水和し、２４℃、１６時間インキュベートした。

”Ｐ−ＮＭＲ分光分光分立り、小胞体形成はほとんど、あるいは全く生じていないことが分った。

１１且旦７：３Ｍ比のＤＯＰＣ：　ＤＯＰＧを用い、実施例７の手法、材料を採用して、この脂質を２ｍＭＨＥＰＥＳで水和し、２４℃、１６時間インキュベートした。

”Ｐ−ＮＭＲ分光分析は、小胞体形成はほとんど、あるいは全く生じていないことを示した。

夾１匠１７　：　７　：　３　：　３Ｍ比のＤＯＰＣ：　ＤＭＰＣ：　ＤＯＰＧ　：　ＤＭＰＧを用い、実施例７の手法、材料を採用して、この脂質を２ｍＭＨＥＰＥＳで水和し、２４℃で１６時間インキュベートした。

この実施例において、そのゲル及び脂質−結晶領域が開腹質類、例えばＤＭＰＣ：ＤＯＰＣ：ＤＭＰＧ：ＤＯＰＧ　（７：７：３：３）を含有する時、ＭＬＶ構造の非常に限定された崩壊しか現われない。これらの系において、ジオレイルリン脂質の存在はＭＬＶ構造を安定化する。この実施例はオレオイル−含有系の安定性を示す、ホスファチジルグリセロールが存在している時でさえ、低イオン強度の緩衝液中でのインキュベーションは小胞体形成を誘導しないため、そのジオレオイル類は７：３Ｍ比のＤＯＰＣ：ＤＯＰＧの混合物を安定化し、この系は多重ラメラを残留する。

更に、ジオレオイル類の安定化特性が実施例７〜１２で観察され、そこでは、ゲル相脂質（即ち、シミリストイル鎖）及び脂質結晶相脂質（即ち、ジオレオイル類）の開領域が存在するときでさえ、何らの小胞体形成は観察されない、第３図（Ａ−Ｊ）は１０℃又は２４℃のいずれかでインキュベートされた試料の３１ｐ −ＮＭＲスペクトルを示す、全スペクトルは二分子膜相（ＭＬＶＳ）における大きな小胞体の特徴を示し、これらの試料は小胞体化しなかった。

裏庭匠よ交７：３Ｍ比のＤＯＰＣ：　ＤＭＰＧを用い、実施例７の手法、材料を採用して、この脂質を１５０ｍＭＮａＣ１，２ｍＭＨＥＰＥＳで水和し、２４℃で１６時間インキュベートした。

１１且よよ７：３Ｍ比のＤＭＰＣ：　ＤＯＰＧを用い、実施例７の手法、材料を採用して、この脂質を１５０ｍＭＮａＣ１，２ｍＭＨＥＰＥＳで水和し、２４℃で１６時間インキュベートした。

大息例」−２− ７：７：３：３Ｍ比のＤＯＰＣ：　ＤＭＰＣ：　ＤＯＰＧ　：　ＤＭＰＧを用い、実施例７の手法、材料を採用して、この脂質を１５０ｍＭＮａｃ１．２ｍＭ　ＨＥＰＥＳで水和し、２４℃で１６時間インキュベートした。

１１丘よｌ３ニアＭ比のＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧを用い、実施例３の手法、材料を採用して、この脂質を１０ｍＭ　ＮａＣ１，２ｍＭ　ＨＥＰＥｓ、ＰＨ７，６，４℃で水和した０次いでその懸濁液を２４℃で１時間インキュベートした。ＱＥＬＳ測定は、ＭＬＶｓの小胞体化がＬＵＶｓを形成したことを示した。

１１五上主脂質（１４，８ｕｍｏｌｅ／ｍｌ、７：３モル比のＤＭＰＣ：　ＤＭＰＧ）を蒸留水中で水和し、４℃でインキュベートした。得られたＭＬＶｓを、２つを積み重ねたポリカーボネートフィルターを、ＬＵＶＥＴ操作を用いて１０回通して押し出した。

アンホテリシンＢを１０　、８　ｕ　ｍｏｌｅ／　ｍｌの濃度で、超音波浴を用いて蒸留水中に分散した。そのアンホテリシンＢ分散液をその脂質懸濁液に加え、最終脂質及びアンホテリシンＢの濃度がそれぞれ１’３　、５　ｕ＋ｍｏｌｅ／ｍｌ及び０　、９８　ｕ　ｍｏｌｅ／　ｍｌとなるようにした。

導入されなかったアンホテリシンＢを除去するために、その試料の２０１１をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　Ｌ　８−６０遠心分離器中で２２℃でＴｉ６０又は５Ｗ２７０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で３０分間１５．０００×ｇで遠心分離した。アンホテリシンＢのない上澄液をそのリポソームベレットを撹乱することなく除去した。得られたリポソームを準弾性光散乱により測定したところ、直径１．Ｏｕｍ以上大きさのものであった。

２３℃のインキュベーション条件を用いる上記の操作を１５０ｍＭ　ＮａＣ１＋　１０ｍＭ　Ｎａ、ＰＯ，、ｐＨ７，４を用いて繰り返し、その脂質を水和した。得られたリポソームを準弾性光散乱により測定したところ、直径１．Ｏｕｍ以上の大きさのものであった。リポソームに取り込まれたアンホテリシンＢの割合は、その媒体のイオン強度が低い（蒸留水対１５０ｍＭＮａＣ１）時、最高であった。

叉１丘よｌ実施例１４の操作及び材料が使用したが、蒸留水中に懸濁された脂質をアンホテリシンＢと共に２２℃でインキュベートした。

得られたリポソームは単ラメラであり、準弾性光散乱により平均直径約０．１〜０．２ｕｍと測定された。

第１図第　２　図国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．脂質のゲルから液体への結晶転移温度で、中性のｐＨにおいて、低イオン強度の媒体中で、多重ラメラ小胞体をインキュベートすることによる、ジミリストイルホスファチジルグリセロールを含有する多重ラメラ小胞体から単ラメラ小胞体を自発的に形成する方法。
２．多重ラメラ小胞体が付加的にジミリストイルホスファチジルコリンを含有する請求の範囲１記載の方法。
３．ジミリストイルホスファチジルコリン及びジミリストイルホスファチジルグリセロールが７：３のモル比である請求の範囲２記載の方法。
４．リポソームが約２４℃でインキュベートされる請求の範囲３記載の方法。
５．リポソームが約０ｍＭ及び２５ｍＭ塩の間の媒体中でインキュベートされる請求の範囲２記載の方法。
６．リポソームが約１０ｍＭ集の媒体中で約１５分間インキュベートされる請求の範囲５記載の方法。
７．リポソームが媒体中、ｐＨ約７．０から約８．０でインキュベートされる請求の範囲１記載の方法。
８．リポソームが媒体中、ｐＨ約７．６でインキュベートされる請求の範囲７記載の方法。
９．多量ラメラ小胞体を約１０ｍＭ塩の媒体中で、約２４℃、ｐＨ約７．６で約１５分間インキュベートすることによるジミリストイルホスファチジルグリセロールを含有する多重ラメラ小胞体から単ラメラ小胞体を自発的に形成する方法。
１０．リポソームが付加的にジミリストイルホスファチジルコリンを含有する請求の範囲９記載の方法。
１１．以下の工程を包含する、高薬剤モル比における薬剤及び脂質を含有するリポソームを含有する組成物の製造方法：（ａ）水性溶液中に薬剤を懸濁する工程、（ｂ）水性溶液中に脂質を懸濁する工程、（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）の生成物を混合する工程、及び（ｄ）その脂質の転移温度又はそれ以上で工程（ｃ）の生成物をインキュベートする工程。
１２．薬剤が超音波処理によって水性溶液中に懸濁される請求の範囲１１記載の方法。