JPH03501803A - 殺虫ネマトーダの液体培養での大量生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 殺　ネマトーダの′　立　での大　生 改亙立三 本発明は、特に農業、庭園、および家庭の昆虫のために生物薬剤を使用する昆虫 防除に関する。特に、本発明は、改良栄養培地および最適の培養条件を用いて昆 虫寄生ネマトーダの液体培養での大規模生産に関する。

１１旦１五 ネマトーダは、分節に分かれていない丸い嬬虫の群を表す。

解剖学的構造は簡単で、単純な腸を持ち、細長い紡錘形である。非常に多くの科 に分けられ、あるものは自由生活し、一方、他のものは植物あるいは動物に寄生 する。昆虫に寄生するものは、昆虫体寄生もしくは昆虫体病原性ネマトーダと呼 ばれる。

昆虫防除に対する最大の商業的関心のある目は、Ｒｈａｂｄｉｔｉｄａ目であり 、いくつかの科を包含し、多（の構成員は昆虫に寄生する。　Ｓｔｅｉｎｅｒｎ ｅｍａｔｉｄＳおよびＨｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｄｓが、前記の科の中では 顕著である。ネマトーダの分類の一般的な議論およびその中の昆虫体寄生性の科 は、Ｐｏ１ｎａｒ、　Ｇ、０．著二ニーシャーシー州Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌ １社刊「ネマトーダの博物学（ＴｈｅＮａｔｕｒａｌ　Ｈｉｓｔｏｒｙ　ｏｆ　 Ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）Ｊ　（１９Ｂ３）に見られる。

ネマトーダには、５段階を有する標準ライフサイクルがあり、その５段階は、新 しい表皮が形成され、古い表皮が落とされる脱皮段階によって描写される。簡単 に言えば、段階５の成虫が生み、その卵が段階１の幼虫を発生させ、適当な条件 下で、段階２へ移動する。普通は、段階２の幼虫は、単純に段階３の幼虫に成長 し、そこから段階４の幼虫に成長し、その後サイクルを完成させ、成虫段階にな る。しかしながら、昆虫防除用にネマトーダを使用することで興味深いのは、周 囲の状況が継続的成長および生殖のためには比較的都合が悪いとき、Ｓｔ、ｅｉ ｎｅｒｎｅｍａｔｉｄｓおよびＨｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｄｓネマトーダの 段階２の幼虫は、代わりに「段階３の感染性若虫（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ　ｊｕｖ ｅｎｉｌｅｓ）Ｊすなわち「ＩＪ」に成長することである。前記の状況下では、 第二段階の特性である表皮は保持され、鞘と呼ばれる。前記表皮は、完全にネマ トーダを囲う。ＩＪは、昆虫に感染しやすく、寄生を犠牲にして段階４と成虫を 通ってライフサイクルを完成させる。

ＳｔｅｉｎｅｒｎｅｍａｔｉｄｓおよびＨｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｄｓ　Ｉ Ｊネマトーダは、昆虫防除の効果的な手段である。前記ネマトーダは、形態的に 同一であり、通常土壌粒子の周りの表面水膜に住んでいる。

生存のためには酸素と湿気を必要とするが、物は食べず、エネルギー源として自 らの食料貯蔵物を利用する。鞘が取り除かれれば、感染力がある。

ＳｔｅｉｎｅｒｎｅｍａｔｉｄｓおよびＥｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔ　ｉｄｓネ マトーダ生態の別の面は、重要である。これらの科の中のネマトーダは、昆虫体 を発病させる特性の主な原因であるが、完全な原因ではないバクテリアの種と共 生する。ネマトーダの成長は、合間共生生物の存在に助けられている。おそらく 、共生生物が簡単に吸収される食料源として役に立つからであろう。

ベディングの三者培養法［（１９８４）幻」ユ知且Ｌ」免ｕ１出：１１７−１２ ０〕が、昆虫体寄生ネマトーダの大量生産用に提案されている。ベディング法は 、ネマトーダが増殖する、均質化された動物組織を含浸させたプラスチック発泡 体の固相マトリックスを使用する。この技術では、バクテリア共生生物とネマト ーダとの両方が増殖する、充分に空気を含んだ基質を提供する。ベディング法は 、−回分で１０９ネマトーダの生産に適用されている。しかし、将来的に市場は 、前記の量の１０，０００倍の生産能力を要求し得る。ベディング法の拡大版は 、高価な自動化された設備を要求し、無菌状態を維持するのが難しく、培地の調 製およびネマトーダの採取に困難を呈する。液体三者培養法は、これらの制限を 防止する。

昆虫体寄生ネマトーダの液体三者培養は、通常は昆虫血リンパの微量で増殖する 。無菌性の液体培養は報告されているが、効果は限定され、高価な養分添加物を 必要とする。例えば、養分研究の中で、１００ｍ１を下回る液体培地量が、５ｔ ｏｌｌ。

Ｎ、　＜１９６１）　Ｊ　Ｈｅ１ｍ！ｎｔｈｏｌ、　Ｌｉ５ｔｅｒ　５ｕｐｐｌ 、　ｐｐ、１６９−１７４；　Ｊａｃｋｓｏｎ、　Ｇ、Ｊ、　（１９７３）　Ｅ ｘ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　３４：　１１１−１１４；）Ｉａｎｓｅｎ、　Ｅ、。

ｅｔ　ａｌ　（１９６７）、　４２ｎｃｌ　Ａｎｎ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ａｍ　Ｓ ｏｃ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ；　ＬｏｖｅＦＷν”　、　＝ｔ　＝１　（１９７０ ）　Ｎｅｍａｔｃ山１」１６：　５６３−５６６：およびＢｅｕｃｈｅｒ、　Ｅ 、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ　（１９７０）　Ｎｅｍａｔｃ山冴ｎＩ６：　４０３−４０ ９に使用された。やはり、前記の報告は、ネマトーダの生物学的要求および、生 理学的要求は液体懸濁液中で満たされ得ることを示した。これらの培地の通気の ためのいくつかの手段が要求される。薄い液体層への拡散、攪拌、あるいは泡立 てのいずれかによって供給され得る。

液体三者培養を発展させる大きな困難のひとつは、不マトーダを過剰な剪断力に さらさずにバクテリアおよびネマトーダの両方に充分な通気を供給することであ る。液体三者培養での虹困至組坦、自由生活のネマトーダの増殖のためのひとつ の技術が報告されている。前記の技術では、バクテリアは養分のない塩溶液中に ネマトーダと懸濁される。前記の条件下では、バクテリアには、代謝のための遊 離している養分はほとんどな（、従って、酸素要求は低い。本発明を導（研究の 中で、ステロール添加物が提供される限り、同じ技術がＮ、　ｃ肚匹■匹且の培 養に使用し得ることが発見された。しかしながら、バクテリア要求が非常に高い ことが発見されたので、前記技術の商業用開発は、経済的に除外された。

１９８６年２月２７日に公布されたＰＣＴ出願第８６１０１０７４　（、”以下 、　「Ｐａｃｅら」と称す）は、通気要求に関連したいくつかの問題と取り組む ネマトーダの大規模培養の方法を開示した。この手順は、攪拌反応器中での成虫 ネマトーダが粉砕される攪拌速度を決定した。攪拌速度はその後、この決定され た攪拌速度より下のレベルに下げられ、培養期間中維持された。

ｐａｃｅらは、また、雄牛の腎臓ホモジエネートおよびイーストエキスとからな る従来の液体培地の使用を説明してｌ、する。

ネマトーダ培養の他の培地は、大豆ベブトンーイーストニキスーブドウ糖（Ｂｕ ｅｃｈｅｒら（１９７１）　Ｊ　Ｎｅｍａｔｏｌ　３二Ｌ９９−２００無菌ｉ夜 体培養用）、ペプトン−グルコースおよび、ｚ＋クチリア（Ｄｕｔｋｙ、　Ｓ。

Ｒ１ら（１９６７）　Ｊ　Ｎｅｒｎａｔｏｌ　１３：１４０寒天倍地での三者培 養用）、および養分肉汁−イーストエキス−大豆粉−コーン油（Ｗｏｕｔｓ、　 Ｗ、Ｍら（１９８１）　Ｊ　Ｎｅｒｎａｔｏｌ　１３：４６７−４６９二者固体 担体もしく（ま発泡体）を包含する。前記の培地のそれぞれ（よ、一種もしり（ マそれ以上の高価であるか調製の難い）材料を含有して％’ｌる。

Ｐａｃｅらの三者液体培養法は、最初の１０日間で２０の生殖ｉ１合（ミリリッ トル当り２．０００のネマトーダから４０，０００１こ増力口）を示し、２０日 後に液体培地中に感染性幼虫力５形成されたと報告された。無菌システムを使用 した他の研究者も同じ様な生殖割合を報告したが、著しい量の感染性幼虫の観察 １ま報告されなかった。

液体養分培地で三者ネマトーダ培養を支持するカタ酸素要求性に制御される重大 な構成要素は、卵黄の様な乳化剤力；必要であり、乳化剤は、添加された油もし くは脂肪の利用を容易にするのに役立つことが発見されて−する。現在までのと ころ、昆虫体寄生ネマトーダの液体培養のため１こなる乳イヒ剤を使用した報告 はない。しかしながら、卵黄は、補乳類の寄生虫の培養で動物の血清の代用とし て使用され、成功も失敗もしている。

Ａ、　Ｒｏｄｅｒ　［（１９８２）　Ｎａｔｕｒｖｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ 　６９：９２−９３］Ｉｔ、昆虫細胞の培養でウシ胎児血清の代わりに卵黄を使 用した。Ｍ。

Ｓ、　５ｅｈｎｉｅｒおよびＢ、　Ｆｒ１ｅｄ［（１９８１）　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐ ａｒａｓｉｔｏｌ　１０：３９１−３９５１は、Ａｂｌｏｓｏｍａ　ｓｕｗａｅ ｎｓｅ、寄生吸虫（吸虫間の蝋虫）の培養にＮＣＴＣ１３５中で卵黄を使用した 。更に、卵黄は、特に旦旺■１ｏｅｏ匹ｕｓヲ用いてバクテリアの細胞培養にし ばしば用いられているｏ　Ｐ、　Ｆ、　Ｂｕｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ　［（１９７３ ）　Ｊ　Ｐａｒａｓｉｔ＋江葺：３１９−３２２］は、卵黄は蝕ゴ士り巨（吸虫 ）の培養には利益を与えないことを発見し、Ｄ、Ｗ、Ｗ、　Ｋａｎｎａｎｇａｒ ａ［（１９７４）　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐａｒａｓ葺立■：６７Ｓ−６１は、卵黄はｈ 三壓工国■培養に利益を与えないことを発見した。前記の場合のどれも油成分を 乳化する卵黄の役割を包含してはいなかった。

従って、本発明の目的は、液体培養での昆虫体寄生ネマトーダの産生効率を改良 することである。

本発明の更なる目的は、三者ネマトーダ培養を支持するが、酸素要求性で制御さ れる改良液体培地を提供することである。

前記養分培地は、簡単に調製され、現在入手可能な培地に比べて比較的費用がか からない。

本発明の更なる目的は、各ネマトーダ成長段階に関連して酸素透過要求性によっ て攪拌速度を変化させる、バクテリアおよびネマトーダ成長を促進する方法を提 供することである。

λ豆旦に丞 本発明は、液体培養で昆虫体寄生ネマトーダを培養するための商業的に費用のか からない培地を提供する。ここで必須な養分は、卵黄のような乳化剤、イースト が提供するようなビタミンおよびミネラル源、油が提供するトリグリセリド、お よびタンパク源である。本発明の好ましい実施態様は、゛約１〜２％の卵黄、約 ０．１〜１％（乾燥重量）のイースト細胞、約２〜５％のコーン油、および約１ 〜３％の大豆粉を含有する。

本発明は、上記で説明された液体培地での昆虫体寄生ネマトーダの培養方法をも 提供する。ここで培地は、バクテリア共生生物であらかじめインキユベートされ 、昆虫体寄生ネマトーダの培養がその後、使用されて前記培地に接種され、ネマ トーダ生殖すイクル中接種された培地を攪拌する手段が提供される。本方法は、 より高い生殖率を維持し、１０日から１６日後に感染性ネマトーダを生じさせる 。

好ましくは、本発明の液体培地に関連して、発酵容器での高濃度の比較的純粋な 感染性段階のネマトーダを製造する、昆虫体寄生ネマトーダを培養する方法が、 提供される。この方法は、酸素透過要求性の変化により攪拌率を変化させること を包含し、ネマトーダ生殖および増殖に最適の条件を区別して提供する。

図面の簡単な説明 第１図は、昆虫体寄生ネマトーダの発酵サイクルの間の攪拌レベルとネマトーダ 生殖との関係を例示する図である。攪拌速度は、５０ｒｐｍ　（四角で図示され ている）、１２５ｒｐｍ　（Ｘで図示されている）、もしくは５００ｒｐｍ　（ 逆三角形で図示されている）のいずれかに保たれるか、あるいは６４＋ｎｍ　Ｈ ｇの酸素移動のレベルを維持するために稼動中に変化させたく：で図示されてい る）。

本発日を　施する　法 り足ゑ 「昆虫体寄生ネマトーダ」とは、昆虫の一種またはそれ以上の種に寄生する不マ トーダを指示する。昆虫体寄生不マトーダの最も重要な目は、Ｒｈａｂｄｉｔｉ ｄａであり、本発明は、主にこの群の２つのＲｈａｂｄｉｔｉｄの科、すなわち Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａｔｉｄａｅおよび）Ｉｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｄａ ｅの培養および／もしくは出荷に向けられている。しかしながら、他の昆虫体寄 生の科もまた、本発明の方法が適用され得る対象として適当であり、それには、 Ａｌｌａｎｔｏｎｅｍａｔｉｄａｅ％Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｉｄａｅ、　Ｅ ｎｔａｐｈｅｌｅｎｃｈｉｄａｅ。

Ｍｅｒｍｉｔｈｉｄａｅ、　Ｎｅｏｔｙｌｅｎｃｈｉｄａｅ、　５ｐｈａｅｒｕ ｌａｒｉｉｄａｅ、およびＴｅｔｒａｄｏｎｅｍａｔｉｄａｅを包含する非Ｒｈ ａｂｄｉ　ｔｉｄ科と共にＤｉｐｌｏｇａｓｔｅｒｉｄａｅＳＰａｎａｇｒｏｌ ａｉｍｆｄａｅＳＰｈａｂｄｉｔｉｄａｅおよびＳｙｒｏｐｈｏｎｅｍａｔｉｄ ａｅを包含する。

上記に述べられたように、Ｒｈａｂｄｉ　ｔｉｄａとして、商業用に最も重要な 科は、ＳｔｅｉｎｅｒｎｅｍａｔｉｄａｅおよびＨｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉ ｄａｅである。ｒ　ＮｅｏａｐｌａｃｔａｎａＪに対して文献を参照することは 、Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａｔｉｄａｅの特定の属を指示する。特定の種に対する 命名法としてのＮｅｏａｐｌａｃｔａｎａおよびＳｔｅｉｎｅｒｎｅｍａという 語−ｍ−例えば、Ｎ、　ｇｌａｓｅｒｉあるいはＳ、　ｇｌａｓｅｒｉ−−一は 、時として、おき換えて使用される。

ネマトーダの様々な群の分類が混乱させるようなものである一方、本発明が、昆 虫に感染性があり、ライフサイクルの中に段階として、上記の背景技術の項で説 明された特徴を持つ段階３の感染性若虫（ＩＪ）を持つ属に向けられていること は明標昆虫により、一種もしくはそれ以上の種が特に有効である。

「感染性若虫」あるいはｒｌＪＪは、昆虫宿主に侵入し、感染する能力のある非 成虫段階を指す。本発明の対象である科では、これらは段階３ＩＪである。

「攪拌」は、発酵容器の中に流動を導入するどの様な物理的手段をも指す。機械 的パドル攪拌および強制空気バブリングを包含するが、それに限定されるもので はない。

し二股五呈五里 手順の対象である感染性若虫は、木や果実に穴を開ける虫（ｂｏｒｅｒｓ）、ゾ ウムシ（ｒｏｏｔ　ｗｅｅｖｉｌｓ）、毛虫、地主（ｂｅｔｔｌｅ　ｇｒｕｂｓ ）、ハムシモドキの幼虫、マメコガネ、およびケラ（ｍｏｌｅｃｒｉｃｋｅｔｓ ）を包含する様々な害虫の防除に役立つ。この様な感染性の若虫によって標的と される主な農作物は、とうもろこし、イチゴ、アーモンド、温室穀物、マツシュ ルーム、さとうきび、およびじゃがいもを包含する。家禽飼育設備および他の動 物舎もハエがいないように保たれる。典型的な農業上の使用においては、感染性 若虫は多くの標的とされる環境に使用される。例えば、マツシュルームハウスで の５ｃｉａｒｉｄノ＼工の防除には、およそ５ＸｌＯ”個の虫が各々のハウスに 適用される。

本発明は、改良液体培地を使用して昆虫体病原性ネマトーダを大規模液体培養す る方法を包含する。培地は、乳化剤、ビタミンおよびミネラルのイースト源、ト リグリセリド源、タンパク源を有し、必要に応じて、塩、消泡剤、養分、および 緩衝液を含有する。トリグリセリドあるいは油成分は、卵黄のような乳化剤の存 在で、充分に乳化され、発酵の数日間充分な乳化状態を維持することが発見され ている。これは、油が分離して、発酵容器の表面に浮く卵黄なしの発酵と著しい 対称をなす。卵黄は、乳化剤として好ましく、現在までのところ、培地での乳化 濃度の上限は決定されていない。１〜２％体積／体積がかなり操作しやすいこと が知られている。卵黄が好ましい乳化剤である一方、レシチンは、卵黄成分の一 部を代用し得る。一般的に、０．１〜０．５％のレシチンが、卵黄と共に用いら れ得る。他の乳化剤は、グリセロールモノステアラードもしくはモノオレアート 、ポリオキシエチレンソルビタンおよび脂肪酸−炭水化物エステルを包含する。

培地には、イーストエキスおよびイースト細胞の様なビタミンおよびミネラル源 も含有されるべきである。ビタミンおよびミネラルの他の源は、肉のエキスおよ び植物のエキスを包含するが、イーストが、はるかに最も便利で経済的な源であ る。イースト細胞は、イーストエキスのより安価な代用品として好まれる。培地 に、約０．１〜１％（乾燥重量）あるいは同等の０．３〜３％（湿潤重量）のイ ーストを使用することが好まれる。

種々のトリグリセリド源が本発明で使用可能である。この様なトリグリセリド源 は、例えば、とうもろこし、紅花、太豆、ひまわり、菜種の様な植物油、魚油お よびラードの様な動物油を包含するが、それらに限定されることはない。少なく とも、トリグリセリド源のひとつは、培地の中に包含されるべきであるが、油と の混合物も使用することができ、本発明の範囲内である。好ましいトリグセリド 源は、２〜５％（Ｖ／Ｖ）の濃度の植物油、特にコーン油である。

タンハク源も種々の源から供給され得る。例えば、動物からもしくは植物から得 られた物質であるタンパクエキスは・媒地のよく知られた成分である。ＥｎＬｉ ｙＰｒｏおよび肉ペプトン、魚の粗びき粉、大豆ペプトンおよび大豆粉の様な乾 燥動物内臓エキスは、本発明の使用のために全て入手可能である。前記の源の内 、大豆粉が好まれる。大豆粉の濃度の上限は決定されていないが、約１〜３％重 量／体積を使用することが好ましい。

必須ではないが、付加添加成分も望むならば、培地に加え得る。例えば、塩、コ レステロール、滅菌水あるいは燐酸塩−緩衝液処理塩類が、本発明に使用され、 得られる感染性ネマトーダの収率を落とさない。

従って、昆虫体寄生性ネマトーダの大量生産のための好ましい液体培地は、約１ 〜２％の卵黄、０．１〜１％（乾燥重量）のイースト細胞、約２〜５％のコーン 油、および約１〜３％の大豆粉を含有する。前記の好ましい培地は、食料産業で 使用される加工されていない生の材料の成分から準備され、筒単に入手可能であ る。

培地は、最初に油成分および卵黄を混ぜ、その後前記油分のある材料を水と均一 化することからなる。次に、残りの材料が加えられ、培地はオートクレーブ処理 により滅菌される。

最初の混合工程作業は、必須ではないが、この様にして準備された培地は、より 安定した乳濁液を形成し、感染性不マトーダがより高い収率で得られる。

他の面においては、本発明は、感染性ネマトーダの高濃縮を作り出すために昆虫 体寄生性のネマトーダを大規模液体培用する方法を包含する。そのために、本発 明の培地は、ネマトーダの共生生物であるバクテリアであらかじめインキ二べ一 トされる。当該技術分野で認められるように、第一段階の型のバクテリアの集団 を使用することが好ましい。共生生物のバクテリアを加えることは製法の収率お よび昆虫に対するネマトーダの感染性を最大限にするために重要である。

培地ミリリットル当りおよそ１ｘ１ｏ７個のバクテリア細胞が、ネマトーダ培養 での接種前に２５−３０℃で約２４−４８時間育てられる。培地へのバクテリア の接種後、空気流量率はおよそ分当り１発酵槽体積で導入され、攪拌率は、５０ ％飽和のレベルで溶存酸素を調節するように調整される。しかしながら、培地へ 充分な酸素を供給する他の条件を用いることも可能である。

若虫ネマトーダは感染性不マトーダであるか、Ｊ３を好ましい型態とするＪｌか ら３４段階の若虫である。ネマトーダ接種濃度は、培地のミリリットル当り１０ ０から５．０００個のネマトーダの間で変化させ得る。ネマトーダ接種時には、 酸素有効性を増加させるために、望むならば、最大３バールまでの圧力を加え得 る。発酵がネマトーダの成虫段階に達するにつれて、バクテリアの酸素必要量は 下がり、従って、攪拌を低減することが可能となる。

接種後、ネマトーダの種類に応じて温度は２０−２８°Ｃに下げられ、培養の成 長中前記の温度は維持される。

エルレンマイヤー攪拌フラスコが使用される本方法の特定の実施態様では、フラ スコ体積で、１：４−１：８の割合で発酵培養物の量を維持することが好まれる 。培養は、１Ｏ−１６ＥＩ間の培養中回転する攪拌機でｌｓＯｒｐｍで攪拌され る。

攪拌タンク反応器は、この様な容器の中で作り出される高い剪断状態にもかかわ らず、好ましい発酵容器である。発酵中およそ分当り１発酵槽体積の空気流量率 が維持される場合、攪拌速度はかなり高いレベルに調整され、得られる感染性若 虫の収率に決定的な影響を及ぼすことなく、培養のどの特定の成長段階の酸素要 求量の変化に適応させる。下記に更に説明されるように、培養の剪断に対する感 度は、種々の成長段階および発酵培養に付随する酸素要求量で決定され、従って 、攪拌率の上限のパラメータがめられる。

第二世代若虫の濃度は、発酵期間の８日の始まりから１６日にに決定される。前 記培地は、他の培地より高いレベルの、世代当り２００倍の増加を超える、再生 を支持することが発見され、他の報告された方法よりより短い期間、例えば、１ ０−１６日以内で感染性若虫を提供する。この様に、本発明の培地および方法は 、安価な簡単に入手可能な材料を用いて、大規模な昆虫体寄生ネマトーダが簡単 に培養される工程を提供する。

−回分の製造過程が上記で説明される一方、本発明はまた、培地がＪ３およびＪ ４発達段階中に再補給される「フェッドバソチ」工程を提供する。前記方法は、 発酵培養の際、付加的な養分源を提供し、養分−限定成長条件を克服し得る。

本発明の更なる面は、混合容器中のバクテリアおよびネマトーダ成長を維持する 方法に関する。ここで、攪拌速度は、必要とされる酸素移送量の変化に従って変 化し、ネマトーダの再生および成長に最も適した条件を特異的に提供する。混合 容器で得られた状態は、予測は困難であるが、ネマトーダ生産を成功させるため には重要である。決定的なパラメータは、温度、溶存酸素テンションおよび剪断 力ならびに他の物理的な力によるものである。工程の温度は、小さな容器あるい は静止培養で藺単に最適化され得る。最適温度を大きな容器で維持するのが、困 難であることは証明されていない。

溶存酸素は、工程の大部分にわたっておよそ３２ｍｍ　Ｈｇを上回って維持され なければならないが、成虫が成長し産卵をする時には、４０ｍｍ　Ｈｇより高（ 、好ましくは８０ｍ＋ｎ　Ｈｇでなければならない。混合タンクの中でこれらの 状態を得る困難は、その工程の酸素要求量および酸素移送率に依存する。酸素移 送率は、空気流速、泡サイズ分配、および混合の程度から構成される。ここで説 明される工程中の最大酸素要求は、およそ２゜ｒｎｍｏｌ／ｈｒであるが、発酵 中の他の時には、５ｍｍｏｌ／ｈｒもしくはそれを下回り得る。最大酸素要求時 に、攪拌タンク反応器で、重要な酸素テンションを維持ためには、高速度の攪拌 が必要とされる。

激しい攪拌は、ネマトーダ生殖を抑制し得ることは長い間認識されてきた（Ｓｔ ｏｌｌ、　Ｎ、（１９５３）　Ｌ−工二ユ３９＋４２２−４４４）。

前述のＰａｃｅらは、成虫ネマトーダが粉砕される攪拌反応器中での攪拌率を決 定する手順を説明する。彼らは、粉砕が生じる反応器中で、成虫ネマトーダが粉 砕され得る攪拌器の最小先端速度で、「剪断力」を決定する。しかしながら、剪 断力は、剪断率（先端速度に比例する）および粘性率の積である（Ｂｒｏｗｎ、 　Ｒ，Ｌ、＜１９８６）　Ｃｈｅｍユ■止組旺■、　Ｊｕｎｅ　９．　ｐｐ、５ ５−６３）。

許容できる先端速度のＰａｃｅらによる測定は、ｌｃｐの粘性率で水中で行われ た。しかしながら、その工程での培地の粘性率は、決められてはいなかった。そ れ故に、説明された方法は、工程自体での圧力状態を予測するのは不可能であり 、粘性率は未知であり、おそら（変化し得る。多くの手段が、最大剪断力を計算 するために発表されたが、生物学的プロセスの規模拡大において、許容し得る剪 断状態を確実に決定するためには、これらの方法のどれも使用できないことは、 一般的に認識されている（Ｔｒｉｌｌｉ、　Ａ、（１９１１６）　Ｉｎｄｕｓｔ ｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ｐｐ 、２７７−３０７）。

しかしながら、酸素移送率と攪拌強度との間バランスを最適にするために有利に 使用され得る２つの方策がある。ひとつは、バブルコラムもしくはエアリフト反 応器の様な非攪拌容器を使用することであり、低い（しかし限定された）剪断力 しか伴わないことが知られている。特に、振動フラスコおよび攪拌タンク反応器 の様な発酵容器で有効である別の方策は、剪断力が制限される工程の間のみ攪拌 力を制限し、酸素移送が必要とされる場合にのみ、攪拌力を強めることである。

多くの発酵工程とは違い、ネマトーダ産生は、進行中の発達段階の分布の変化に よって特徴づけられる。例えば、成虫不マトーグは、ネマトーダ接種後２日から ５日の間で優勢であり、一方、若虫は６日以後優勢である。本発明の方法は、酸 素要求がバクテリアの初期の成長期に最大であり、成虫が発達する際に減少し、 若虫の数が増えるときに再び増加するという発見に基づく。更に、若虫は成虫に 比べて、かなり剪断力には影響されないことが発見されている。例えば、互いの 表面の間の間隙が２ｍｍである、回転おもりと中空シリンダとの間に不マトーダ を位置させることによって、剪断による効果が試験Ｊ２−Ｊ３　２８００ 成虫　１８００ 薄板剪断装置での別の実験では、成虫を６３０ダイン／ａｍ２で粉砕されなかっ た。

ひとつの容器で見られた剪断力と別の容器で見られた剪断力とを比較することは 困難であるが、成虫が若い形態よりも敏感であることは明らかである。上記の結 果からの粗い外挿の結果、２０１発酵槽の中では約５００ｒｐｍで、２５００１ 発酵槽の中では１１００ｒｐ未満で、粉砕が発生することが予測される。従って 、この知識によって、攪拌速度を変化させて発酵工程を制御し、培養の中のネマ トーダ成長の優勢な感染段階が最適な条件になるように特異的に提供することが できる。

発酵終了後、ネマトーダは発酵容器から直接に採取される。

採取は、培地からネマトーダを分離するどの様な従来の手法を用いてもよく、遠 心分離、沈澱および濃化が包含される。

本方法では、培地の粘性部分からネマトーダを分離するのに固体ボウル遠心機（ ｓｏｌｉｃｌ　ｂｏｗｌ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）が、使用された。

スラリーは、およそ２５００−３００Ｏｒｐｍで６Ｌ／分の最も効果的な流速で ボウル遠心機を貫流した。スラリーは、更に不純物を除去され、泥、油、および 非ＩＪ要素からネマトーダを分離した。

その後、スラリーは、２％（Ｖ／Ｖ）の濃度でＩｖｏｒｙ■石鹸の様な穏やかな 石鹸で希釈される。前記の点において、表面張力に目に見える変化が観察された 。生成物は、その後、粒子を分散させるために剪断ポンプを貫流する。得られる スラリーは、ＩＪの多数を保持するために最大の流量が得られるように、そして 、最小の回転速度で、再び遠心分離機にかけられる。

浄化工程は、ネマトーダ／分子分配の顕微鏡の観察によって充分な浄化が達成さ れたと決定されるまで繰り返される。

生成物回収に続いて、必要であれば濃縮工程が実施される。

本発明の広義の型に包含され得る他の型があるにもかかわらず、次の実施例は、 付加バクテリア共生生物を用いた別のネマトーダ種の成長を示す。実施例は特定 の選択された種族のみについて行われているが、本発明は全ての昆虫体寄生ネマ トーダに適用されることが留意されるべきである。

従って、本発明は次の実施例によって更に説明される。本発明の実施態様を示す ためのみに提供され、発明の範囲の限定として解釈されるべきではない。

実１上−」工 Ｏ，Ｓ％のＮａＣ１，０，２５％のＸＨ２ＰＯ４，０，５％の卵黄、３．０％（ 乾燥重量）のイースト細胞、１．０駕もしくは２．０％の大豆粉、０．５％のＥ ｎＬｉｖＰｒｏ、　５．０％のコーン油、および２０ｍｇ／ｌのコレステロール を含有し、ｐｈ８．　ｏの培地が１２５ｍ１フラスコで３０ｍ１オートクレーブ 処理された。

滅菌培地は、３Ｘ１０”個の狂胚旦１疫徂ユ堕坦ｙ上四■バクテリアが接種され 、回転振盪機（ｌｓＯｒｐｍ）で２８°Ｃで培養された。およそ２４時間後、Ｎ ｅｏａ　１ｅｃｔａｎａ　ｃａｒ　ｏｃａ　ｓａｅ　（全てＩＪ）が、２゜００ ０．１，０００．５００および２００／ｍｌの密度で加えられた。培養温度は、 ２５℃より低かった。

ネマトーダ接種後５日および８日後にサンプルが取られた。

次の表は、５日のネマトーダ総数および８日の感染性若虫の数を示す。

（以下余白） １１里　人ニーＪ　釘しユ１団　８Ｅ］ユＬ圧最高の生殖率は７０５であった。

培養か−ら採取されたネマトーダは、昆虫に対して病原性があった。

見立五−主 直径１ｃｍのくぼみを持つプラスチック皿が、Ｎ、ｃａｒ　ｏｃａ　ｓａｅの０ ．２５ｍ１培養液に用いられた。培地は、０．５％のＮａＣ１，０，２５％のＨ １２ＰＯ４，３，０％（乾燥型ｉｔ）のイースト細胞、２．０％の大豆粉、５％ のコーン油、０．６２５％のＥｎＬｉｖＰｒｏ、および下記に示される種々の卵 黄濃度を含有した。培地はＸ、　ｎｅｍａｔｏ　ｈｉｌｕｓ　（３１）を接種し 、Ｎ、ｃａｒ　ｏｃａ　ｓａｅ　（ｊｌ）は２５℃で培養された。７日後、数は 以下のようであった。

ニー且　肚■ｄ畦 １％　５６．５００ ０．２５χ　２７，０００ ０％　１３．０００ 大玉」Ｌ〜１ ２．０％の大豆粉、１．０％の卵黄、０．６２５％の乾燥動物タンパク質（Ｅｎ ＬｉｖＰｒｏ）、０．５％（乾燥重量）のイースト細胞、５％のコーン。

油、ｏ、ｓ％ノＮａＣ１，およびＫＨ２ＰＯ４を含有する、　ｐｈ８．０の培地 が４つの１２５ｍ１エルレンマイヤーフラスコで３０＋ｎｌオートクレーブ処理 された。

各フラスコの滅菌培地には、３ＸＩＯ”個のＸｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ　ｎｅｍｏ ｔ蛙出旦バクテリアが接種され、回転振盪機（１５０ｒｐｍ）で２８℃で培養さ れた。７２時間後、２つのフラスコは、独立して、Ｊｌ−Ｊ２Ｎ、ｃａｒ　ｏｃ ａ　ｓａｅ接種原もしくはＪ３−Ｊ４　Ｎ、ｃａｒ　ｏｃａ　ｓａｅ接種原のど ちらかの″″１，０００若虫／功１が接種された。ネマトーダの接種後、フラス コは、１５０ｒｐｍで振盪され、２５℃で培養された。

ネマトーダ密度は、ネマトーダ接種後およそ７０（１６８時間）の実験の終了時 に数えられた。（若虫の接種原の段階は、以下に示されている。） ごＩ　−ｒ　’）二ひ１１墨　Ｌ　二七優以【支６９時間　１−２　６８，５０ ０±６，５５７　ｎ　＝４／２６８．５時間　３−４　１０７．７７８±１０， ６１６　ｎ　＝　３７３”ｎ＝数／フラスコ当りの数 Ｊ３−Ｊ４から成る若虫の接種原の使用（本実験では主にＪ３からなる若虫を使 用した）は、Ｊｌ−Ｊ２からなる接種原の使用と比較して、５０％を上回る成功 である。

爽血立−土 直径１０ｃｍｘ高さ７５ｃｍのガラス発酵槽が、直径５ｃｍｘ高さ２０ｃｍの排 気管付エアリフト反応器として操作された。４０ミクロン孔焼結された金属多孔 分散管が、排気管の底に設置された。

体積が６リツトルであることを以外は、実施例３と同様にしてＮ、ｃａｒ　ｏｃ ａ　ｓａｅの培養が行われた。実験中６’）ｙトル／分の割合で空気が導入され た。７日に、９５．θ００／ｍｌのネマトーダ密度が得られた。

Ｋと！一旦 １６リツトルの培地を有する２０リツトルの攪拌タンク発酵槽（Ｂｉｏｅｎｇｉ ｎｅｅｒｉｎｇ）に、Ｘ、　ｎｅｍａｔｏ　ｈｉｌｕｓおよび４８時間後にと一 注２が接種された。発酵槽は、環状の多孔分散管を通１、て工６リットル／分の 空気流量で操作された。発酵槽は、溶存酸素（Ｄｏ）が６４ｍｍ　Ｈｇを下回る まで２５０ｒｐｕ＋で攪拌された。その時、ｒｐｍは３００ｒｐｍに促進され、 Ｄｏが６４ｎｏ＋＋　Ｈｇを下回った時はいつでも、５００ビ一クｒｐｍに達す るまで５０もしくは１１００ｒｐの単位で促進された。ＤＯが９６ｍｍ　Ｅｇを 上回った時、ｒｐｍは５０から１１００ｒｐ分下げられ、２５０ｒｐｍの最終速 度となった。

さて、添付図面の第１図を参照して、結果は種々の攪拌速度が培養ネマトーダの 生殖能力に与える効果を示す。攪拌速度は、５０ｒｐｍ　（四角で図示されてい る）、１２５ｒｐｍ　（Ｘで図示されている）、もしくは５００ｒｐｍ　’（逆 三角形で図示されている）のいずれかに保たれるか、あるいは６４ｍｍ　Ｈｇの 酸素テンションを維持するために稼動中に、変化している（＊で図示されている ）に設定された。

５０ｒｐｍおよび１．２５ｒｐｍで操作を行った場合、酸素テンションは、ネマ トーダ接種後、５Ｂから１２日の間の期間中Ｏｗｎ　Ｈｇに低下する。５００ｒ ｐｍおよび種々の制御作動を行った場合は、酸素テンションは６４ｍｍ　Ｈｇを 上回ってうまく維持された。

亙困 本発明の方法によって生産された昆虫体寄生不マトーダは、幅広い範囲の生物的 殺虫剤として使用され得る。

上記ネマトーダは、穀物に散布すること、木の幹に注入すること、土壌に散布す ること、および球粒の様な固形、希釈あるいは非希釈形で土壌に適用すること、 の様な公知の方法で使用され得る。

国際調査報告 １°ｌｅａｌ１ｗｎｌ　Ａ６１１に°ｂ６Ｐ　Ｎ°ＰＣＴ／ＵＳ８８１０４１２ ４

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．液体培養で昆虫体寄生ネマトーダを培養するための培地であって、乳化剤、 ビタミンおよびミネラル源、トリグリセリド源、およびタンパク源を有する。
2. ２．請求項１に記載の培地であって、前記乳化剤は、卵黄によって提供される。
3. ３．請求項１に記載の培地であって、前記ビタミンおよびミネラル源は、イース ト細胞もしくはイーストエキスによって提供される。
4. ４．請求項３に記載の培地であって、前記ビタミンおよびミネラル源は、イース ト細胞もしくはイーストエキスによって提供される。
5. ５．請求項１に記載の培地であって、前記トリグリセリド源は、植物油である。
6. ６．請求項５に記載の培地であって、前記植物油は、コーン油である。
7. ７．請求項１に記載の培地であって、前記タンパク源は、大豆粉である。
8. ８．請求項１に記載の培地であって、該培地は、約１〜２％の卵黄、約０．１〜 １％のイースト細胞、約２〜５％のコーン油、および約１〜３％の大豆粉を含有 する。
9. ９．液体培地で昆虫体寄生ネマトーダを培養する方法であって、該方法は、請求 項１に記載の培地をバクテリア共生生物であらかじめ接種すること、該培地を昆 虫体寄生ネマトーダの培養物で接種すること、ネマトーダ培養の生殖サイクル中 、該接種培地を撹拌および通気する手段を提供すること、および感染性若虫を回 収することを包含する。
10. １０．液体培地で昆虫体寄生ネマトーダを培養する方法であって、該方法は、請 求項８に記載の培地をバクテリア共生生物であらかじめ接種すること、該培地を 昆虫体寄生ネマトーダの培養物で接種すること、ネマトーダ培養の生殖サイクル 中、該接種培地を撹拌する手段を提供すること、および感染性若虫を回収するこ とを包含する。
11. １１．請求項９に記載の方法であって、Ｊ３およびＪ４段階の若虫がネマトーダ 接種において優位を占める。
12. １２．請求項９に記載の方法であって、前記ネマトーダはＮ．ｃａｒｐｏｃａｐ ｓａｅ、前記共生生物はＸ．ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓである。
13. １３．請求項９に記載の方法であって、第二世代感染性若虫は、若虫の開始集団 の接種後１０から１６曰以内に形成される。
14. １４．請求項１３に記載の方法であって、第二世代感染性若虫は、Ｊ３段階の若 虫の接種後１０日以内に形成される。
15. １５．請求項９に記載の方法であって、生殖率が世代当り２００を超える。
16. １６．請求項９に記載の方法であって、前記培地がＪ３およびＪ４成長段階中に 再補給される。
17. １７．液体培地を含有する発酵容器中で高濃度の比較的純粋な感染性段階のネマ トーダを製造するための昆虫体寄生ネマトーダを培養する方法であって、該方法 は、酸素透過要求性によって撹拌速度を変えることを包含し、ネマトーダの生殖 および増殖に最適の条件を区別して提供する。
18. １８．請求項１７に記載の方法であって、更に、一定の空気流速を維持すること を包含する。
19. １９．請求項１７に記載の方法であって、前記撹拌速度が成虫相で最小である。
20. ２０．請求項１７に記載の方法であって、新しく生まれた若虫集団の成長中に前 記撹拌速度を増加する。
21. ２１．請求項１７に記載の方法であって、前記発酵容器は、機械的内部撹拌機、 バブルカラム発酵器およびエアリフトループ反応機からなる群から選択される。
22. ２２．請求項１７に記載の方法であって、前記液体培地は、乳化剤、ビタミンお よびミネラル源、トリグリセリド源、およびタンパク源を含有する。
23. ２３．請求項２２に記載の方法であって、前記液体培地は、卵黄、イースト細胞 、コーン油、および大豆粉を含有する。
24. ２４．請求項２３に記載の方法であって、前記液体培地は、約１〜２％の卵黄、 約０．１〜１％のイースト細胞、約２〜５％のコーン油、および約１〜３％の大 豆粉を含有する。
25. ２５．請求項９に記載の方法に従って増殖する昆虫体寄生感染性若虫ネマトーダ 。
26. ２６．請求項１０に記載の方法に従って増殖する昆虫体寄生感染性若虫ネマトー ダ。
27. ２７．請求項１７に記載の方法に従って増殖する昆虫体寄生感染性若虫ネマトー ダ。