JPH03501806A - 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体及びのう外摘出後の残遺水晶体上皮細胞の増殖抑制方法 - Google Patents

水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体及びのう外摘出後の残遺水晶体上皮細胞の増殖抑制方法

Info

Publication number
JPH03501806A
JPH03501806A JP1507336A JP50733689A JPH03501806A JP H03501806 A JPH03501806 A JP H03501806A JP 1507336 A JP1507336 A JP 1507336A JP 50733689 A JP50733689 A JP 50733689A JP H03501806 A JPH03501806 A JP H03501806A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
epithelial cells
cells
lens epithelial
cytotoxic
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP1507336A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2677438B2 (ja
Inventor
エメリー，ジャレッド　エム．
ラム，ドミニク　エム‐ケー
ケレハー，ピーター　ジェイ．
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baylor College of Medicine
Original Assignee
Baylor College of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/204,168 external-priority patent/US4871350A/en
Priority claimed from US07/206,610 external-priority patent/US5202252A/en
Application filed by Baylor College of Medicine filed Critical Baylor College of Medicine
Publication of JPH03501806A publication Critical patent/JPH03501806A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2677438B2 publication Critical patent/JP2677438B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体及びのう外摘出後の残遺レンズ上皮 細胞の増殖抑制方法導入 ■」 本分野は残遺レンズ上皮細胞の増殖を抑制するための方法及び組成物に関する。
青貝 のう外白内障摘出は白内障を除去するための好ましい方法である。この技法にお いて、胞状斑点水腫及び網膜剥離のごとき術後合併症が低頻度で存在する。水晶 体乳化のごとき改良されたのう外摘出技法の利用可能性及び広範囲の眼内水晶体 の移植のための無傷の後水晶体眼房の要求が、白内障の除去のためののう外白内 障摘出の使用をなを支持している。
限房内水晶体摘出にはかなりの頻度の後水晶体眼房の混濁が伴い、このことが良 好な視力を得るために後期のう法（ｐｏｓ−ｔｅｒｉｏｒ　ｃａｐｓｕｌｏｔｏ ｍｙ）又は後水晶体眼房の研磨のごとき追加の外科的方法を要求する。のう外白 内障摘出の後の後水晶体眼房混濁の病因は後水晶体眼房上の残遣水晶体上皮細胞 の増殖による頓挫性水晶体「ファイバー」及び「のうＪ　（ｂｌａｄｄｅｒ）細 胞【゛エルシュニッグ（Ｅｌｓｃｈｎｉｇ）のパール〕の形成に暴く。
二次白内障の形成を防止するため、種々の技法が使用される。Ｒｏｙら、Ｃｏｎ ｔａｃｔ　ａｎｄ　Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ　Ｌｅｎｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ（１９７９）　５　：　１７５−１７８は、水晶体細胞の増殖を抑制 する手段と゛してビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）及びビンブラスチ ン（ｖｉｎ−ｂｌａｓｔｉｎ）の使用を報告した。照射処理も試みられ、そして 有望であると報告されている。内の前室へのメト）・レキセード及びレチノン酸 の点眼も後水晶体眼房混濁の防止のために試みられている。しかしながら、これ らの処置法は特異性を欠き、これらは前室に存在する他の細胞タイプと水晶体上 皮細胞とを区別せず、そしてこれらの処置の結果として他の（好ましい）細胞が 損傷されることがある。従って、二次白内障の形成及び後水晶体眼房混濁の防止 の手段として残遣水晶体上皮細胞の選択的破壊をもたらす方法及び組成物に関心 が寄せられている。
■漣」ｊＬ（献 モノクローナル抗体の製造が記載されている。例えば、圃−ｎｏｃｌｏｎａｌ　 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｒｏｇｅｒ　）１．Ｋｅｎｎｅｔｔ、Ｔｈｏｍａｓ　 Ｊ、ＭｃＫｅａｒｎ。
Ｋａｔｈｌｅｅｎ　Ｂ、Ｂｅｅｈｔｏｌ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ＋ニューヨ ーク、１９８０　；　Ｎａ−ｈ匹（１９７５）％坦：　４９５−４９７　；米国 特許Ｎα４，２７１，１４５、Ｎα４，１９６，２６５、Ｎα４，１７２，１２ ４　、Ｎｏ、４．１９５，１２５　、Ｎα４，２６２，０９０、及び４，２９４ ，９２７を参照のこと。
主皿少互！ のう外白内障摘出後の後水晶体のう混濁を抑制するための方法及び組成物が提供 される。この方法は、上皮細胞に対して少な（とも実質的に特異的な細胞毒性剤 を使用し、そしてこれらを、のう外白内障摘出と同時に又はこれに続いて目の前 室に導入することを含む。細胞毒性剤の導入に先立って前室に非細胞毒性剤を導 入することが特に興味深く、この場合、非細胞毒性剤及び細胞毒性剤は上皮細胞 に対して同じ結合性を有する。
・なし　の晋 包外の抽出後に残遣水晶体上皮細胞の増殖を阻害するための方法及び組成物が提 供される。この方法は、原発性又は後発性の白内障を除去するときに、いずれか の残遣水晶体上皮細胞へ結合する水晶上皮細胞に特異的な細胞毒性剤を前眼房に 導入することを含んでなる。この細胞毒性剤は、水晶体上皮細胞に対して少なく とも実質的な特異性を示し、そして線維芽細胞、黒白血球、冠状内皮細胞など、 好ましくはまたもう一つの上皮細胞（例、冠状上皮細胞）のような前室に見い出 される他の細胞と低いかまたは全く交叉反応性を有しない。
好ましくは、細胞毒性剤の導入または包外白内障抽出前に、非細胞毒性剤を前眼 房に導入し、この前眼房で非細胞毒性剤は対応する抗原決定基または抗原部位を 有する前眼房と交叉反応するかまたはその眼房と接触する前眼房中のいずれかの 細胞と結合するように、実質的に細胞毒性剤と同様な特異的結合性を有する。
この細胞毒性剤は、少なくとも実質的に水晶体上皮細胞に対して特異的で補体を 固定可能なモノクローナル抗体および補体の組み合わせから成ることが可能であ る。使用際し、まず最初にその抗体が眼の前室に導入される。抗体がいずれかの 残遣水晶体上皮細胞に結合するのに十分な時間の経過後、補体がその前室に導入 され、水晶体上皮細胞の選択的な溶解を行う。モノクローナル抗体は単−ハイブ リドーマ細胞系から誘導されるか、または抗体類が水晶体上皮細胞上の各種抗原 成分と結合しろる各種ハイブリドーマ細胞系から誘導される２種以上のモノクロ ーナル抗体であることができる。補体と共に使用するには、モノクローナル抗体 がネズミ、ラビフトもしくはヒトなどを含む補乳類に存在し、例えば、ヒトＣＨ ２ドメインもしくは分子のＦｃ部とマウスまたは他の補乳類源の可変領域を有す るキメラ抗体またはそれらの組合せであることができる。抗体は補体を活性化し ろるいずれかのクラスまたはサブクラス、例えばＩｇＭ、　ＴｇＧ、　２ａ、　 ２ｂもしくは３またはそれらのヒトの等個物であることができる（補体結合性ク ラスについては、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒ１ｎｃｉ 　ｌｅｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ｇｏｄｉｎｇ、Ａｃａｄｅｎ＋ｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１４ページ、１９８６、参照のこと、 なのこの刊行物は引用により本明細書の内容となる）。
他方、細胞毒性剤は水晶体上皮細胞に実質的に特異的に結合可能なモノクローナ ル抗体と毒性剤の接合体であることができる。毒性剤は微生物または植物源から 誘導されうる。特に興味深いものは、天然由来のトキシン、例えばリシン、アブ リン、ジフテリアトキシンなどである。例えば、ＯｅｌｔｍａｒｒｎおよびＨｅ ａｔｈ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１９７９）２５４　：　１０２２〜１０ ２７；ＹｕｌｅおよびＮｅｖｉｌｌｅ　Ｊｒ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８０）７７　：　５４８３〜５４８６　；　Ｇ１１１ｉ １ａｎｄら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡＣ１９７Ｅり７５ ：５３１９〜５３２３　；米国特許第４，３７９．１４５号；英国特許第２０３ ４３２４号およびＭａｓｕｈｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、 ｃｏｍｕｎ、　（１９７９）９０　：　３２０〜３２６　；ならびにＢｌｙｔｈ ｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ（１９６１）２９０　：　１４５を参照のこと、そしてこ れらに公表された内容は引用により本明細書の内容となる。
トキシンＡ鎖または類似の有効な成分を例示すると、ジフテリアトキシンＡＩＪ ｉ、シュウトモナス・エルギノーザ（ハ匹−ｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ■匹且） エキソトキシンＡ由来の酵素活性タンパク分解断片、リシンのトキシンＡ鎖、ア ブリンＡ鎖、モデ・ンクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）　Ａ　８！ならびに、例えば ジェロニウム・ムルティフロルム（Ｇｅｌｏｎｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ ）、フィトラッカ・アメリカーナＣハ旦旦匹印ａ　ｍ　ｅ　ｒ　ｉ　ｃ　ａ　ｎ 　ａ　）、クロトン・チグリウム（Ｃｒｏｔｏｎ旦ｆ１肛）、ジャトローファ・ カーカス（赳江肚田Ｃｕｒｃａｓ）　、モモルディック・チャランテア（Ｍｏｍ ｏｒｄｉｃ　ｃｈａｒａ７１圏）および小麦胚などの植物体のような類似の活性 を有する多様な植物体に見られるタンパク質が挙げられる。就中、興味深いもの としては、サボナリア・オフィシナリス（箪−ｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌ ｉｓ）　（Ｔｈｏｒｐｅらｊ、Ｎａｔｌ、ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、（１９８５ ）７５：１５１）由来のサポリントキシンおよび植物トキシントリコサンチンな どが挙げられる。モノクローナル抗体は、完全な抗体分子またはモノクローナル 抗体断片、例えばＦａｂ　。
Ｆ（ａｂ’　）２　、　Ｆｖ、組み換え可変領域もしくはＴ細胞レセプターなど であることができる。モノクローナル抗体およびレセプターはネズミ、ラビット もしくはヒトなどのいずれかの咄乳類種であるか、またはそれらの組み合わせ、 例えばヒトの定゛常部領域およびマウスもしくは他の哺乳類の可変領域のキメラ 抗体であることができる。これらの抗体はＩｇＡ、　ＩｇＤ、　ＩｇＧ。
Ｉｇ？Ｉのような、そしてＩｇＧ１．２ａ　、　２ｂもしくは３またはそれらの ヒトの等個物であることができる。
モノクローナル抗体の調製方法は、十分に確立されている。
それらは当業者に既知のいずれかの方法で調製されうる。各種レンズ上皮細胞が 免疫源として使用でき、たとえ他の種（例、霊長類）の使用が発見されていると しても特にヒトのレンズ上皮細胞が使用できる。細胞源には、組織培養の増殖細 胞または白内障手術中に採取された組織が含まれる。従って、手術中に採取され た組織に由来するヒトレンズ上皮細胞または死後短時間内の、好ましくは死後約 ３０分以内のヒトレンズ上皮細胞が直接使用するか、あるいはこれらの細胞を十 分に確立された技法を用いて手術験体を組織培養物中に保持することができる。
本発明に従えば、哺乳類、好ましくはマウスまたは他の小動物が免疫源により高 度免疫化される。免疫化方法は周知であり、文献中に広く記載されている。免疫 源物質の一般に約１０Ｓ〜約１０’細胞または細胞等個体がアジュバントと一緒 にもしくは単独で哺乳類に注入されるか、あるいは比較的短期間を通じて反復注 射ににより注入される。動物の高度免疫化を確実にするためには２〜６回連続の 補圧注入が行われる。
次に、一般に最後の注入後１〜５日以内にこれらの動物は殺される。肺臓が採取 され、次いでこの肺臓細胞は一般に適当なミエローマ細胞系との融合によって不 死化される。
細胞融合方法はこの発明の限定部でな（、各種の技法を使用することが可能であ る。一般に、非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が この融合剤として使用される。肺臓細胞とミエローマ細胞は約５分間、通常ＰＥ Ｇ１５４０の非イオン界面活性剤および他の添加剤、例えば血清除去ダルベコの 改変イーグル培地（ＳＦ−ＤＰＩＥＭ）の存在中で組み合わされる０次に、過剰 の非イオン界面活性剤は細胞を洗浄することにより素早く除去される。
これらの細胞は、比較的低濃度（約１×ｌＯＳ／ウエル〜約５Ｘ１０’／ウエル 範囲）でヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（）ＩＡＴ）培地を含 んでなる普通の選択培地を有する小さな培養ウェル中で連座に分散される。
十分な期間、−ｉに１〜２週間後、ハイブリッドコロニーが観察される。次に、 これらのコロニーはレンズ上皮細胞に対して特異的に結合する抗体についてスク リーニングされる。
補体結合抗体が必要な場合には、さらに、これらのコロニーは抗体が補体を結合 しろるかどうかを測定するためにスクリーニングされる。目的の抗体を産生ずる コロニーが単離されたなら、これらのコロニーは継続した目的の抗体源として提 供することを永続化する。
水晶体上皮細胞に関連する単一の抗原性決定基に同けられるモノクローナル抗体 を分泌するハイブリドーマ細胞系を得るだめには、ハイブリドーマ細胞を、たと えば限界希釈法を用いてクローン化することができる。細胞がクローン化され得 る段階は、本発明にＨ”ｍ界ではなく、そしてたぶんその段階・は、対象の抗体 を分泌するコロニーの同定の前又は後である。
しかしながら、非抗体産生細胞と共に抗体産生細胞の過剰増殖を避けるために、 コロニーは、好ましくは、融合の後、できるだけ早くクローン化される。
抗体の大規模産生のためには、ハイプリドーマが、哺乳類の腹腔内に導入され、 そして腹水腫瘍として増殖せしめられる。次に、抗体がその腹水から単離される 。モノクローナル抗体の大規模産生のための変法は、上記方法を用いて上皮腫瘍 の誘発及び動物からの血液を集めることを包含する。ハイブリドーマ細胞はまた 、組織培養において大規模に増殖され得る。細胞が増殖培地中に抗体を分泌する 場合、抗体を含むならし増殖培地が、抗体単離のために集められる。ハイブリド ーマ細胞が抗体を分泌しない場合、細胞は集められ、従来の手段を用いて溶解さ れ、そして抗体がその細胞溶解物から精製される。モノクローナル抗体の精製方 法は、当業者に良く知られている。
補体は、標準の補体である。補体とは、細胞膜の損傷、たとえば溶解を引き起こ すために抗原−抗体複合体と反応する約９種の主要タンパク質を含むヒト又は他 のを椎動物の正常な血清を意図する。補体は通常、血清、たとえばウサギ血清と して供給される。本発明に有用な典型的な補体及びその調製法は、Ｍｏｎｏｃｌ ｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９８０）、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　 ＮｅｕＹｏｒｋ、εａｓ−Ｍｅｎｎｅｔｔｆｌｅ、、　３９１〜３９２ページ（ この出版物は、引用により本明細書に組込まれる）に記載される。他方、手術の 間、体液から十分な濃度で得られる患者の補体活性を使用することも可能である 。
毒性物質及び上皮細胞への結合を付与する成分の接合体を含んで成る細胞毒性物 質を調製するためには、その毒性物質及び抗体は、細胞質的に切断できる結合に より通常連結される。便利な結合は、特に毒性物質が内部硫黄を有する場合、ジ スルフィド、又は他の結合、たとえばペズチド結合、尿素結合、千オニーチル、 イミン、アミド、イミド、アミジン、等を包含する。使用できる官能基は、カル ボン酸基、アミノ基、イミン、アルデヒド、イソシアネート、メルカプタン、オ レフィン又は目標のものを包含する。さらに、基が、他の成分の内部基への便利 な結合を付与するために接合体における成分の１つに結合され得る場合、より複 膜な結合基が使用され得る。たとえば、ｍ−マレイミドイル安息香配のＮ−ヒド ロキルスクシンイミドエステルが、毒素中のアミドを調製するために使用され、 これは次に、チオエーテルを付与するために、モノクローナル抗体上の利用でき る硫黄原子を通して結合され得る。
典型的な細胞毒性物質は、次の弐： （ＡＳ、、）　−（Ｓ−Ｘ−Ｒ）、を有する。ここで、ＡＳ、、は、毒性物質の 一部として１又は複数の硫黄基を有する毒性物質を示し；ｎは１〜利用できるメ ルカプチド基として存在する、毒性物質に存在する硫黄基の数であり、一般的に は約４までであり；Ｒはモノクローナル抗体の受容体又はその誘導体であり；そ してｍは１〜ｎ、通常１〜２であり；そしてχは結合基であり、そして約１〜２ ０、通常１〜１２個の水素以外の原子（たと・えば、炭素、窒素、酸素及び硫黄 ）の結合又は基であり得る。
硫黄は通常、炭素原子、特に脂肪族飽和性炭素原子に結合されるであろう。Ｘは 脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式化合物又はそれらの組合せであり、−Ｍ的に はＯ〜６、より普通には約０〜４、好ましくは約１〜４個のへテロ原子を有し、 ここで酸素及び硫黄はオキソ又は非−オキソ−カルボニル又はそのチオ類似体、 又はエーテル（チオエーテルも含む）として存在し、そして窒素は、アミン又は アミドとして存在する。大部分、ヘテロ原子は、炭素に単独で結合されるであろ う。
ジスルフィドを結合する例示的な基は、アミノエチレン３−プロパニルメチレン カルボニル、α−スクシンイミジル、３−プロピレンチオカルボニルを包含する 。使用され得る基は、大部分、ジスルフィド結合を付与する従来の基である。
ジスルフィド化合物は、細胞特異的リガンドと反応することができる化合物であ り、それによって、メルカプチド基が、ジスルフィドから置換され、毒性物質と リガンドとの間に新規のジスルフィド結合をもたらすことができる。
大部分、結合は、受容体にアミド結合を付与する、約１〜６個の炭素原子の脂肪 族炭化水素であろう。但し、これは本来、便利なことではあるが、本発明の組成 物の実施可能性のためには必要でない。
他の毒性物質、たとえばＷａｌｄｍａｎ、　Ｊ、Ａ＋ｎｅｒ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏ ｃ、により記載されるようなモノクローナル抗体又は受容体に非拡散的に結合さ れるビスマウス（ｂｉｓｍｕｔｈ）　もまた使用され得る。
他方、リポソームは、モノクローナル抗体又は受容体に結合され得、ここでその リポソームは、種々の細胞毒性物質、たとえばメトトレキセート、５−フルオロ ウラシル、上記毒素のいづれか又は同様のものを含む。リポソームの調製のため にはたとえば、５ｚｏｋａ　ａｎｄ　Ｐａｐａｈａｃ！ｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ。
に組込まれている）を参照のこと。リポソームへの抗体の結合は、十分に文献に 記載されている。たとえばｌｅａ　ｔｈ　ｆａ−支、＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８３）８０　：　１３７７〜１３８１及びＬｅｓ ｅｒｍａｎ、２　ｅ　、、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９３　：　２２６〜２２ ８（これらは、引用により本明細書に組込まれている）を参照のこと。
結合成分に接合される他の細胞毒性物質もまた、本発明の方法に使用され得る。
その接合体は、補助剤の添加なしに、細胞毒性効果を十分に付与するであろう。
本発明を使用する場合、細胞毒性物質は、レンズの除去の後、眼の前眼房中に導 入されるであろう。それは、好ましくは、細胞毒性物質と交差反応する部位に特 異的に結合することができる非細胞毒性物質の導入に続いて、導入される。本発 明を実施するための好ましい方法は、次の通りである。１０〜２０ｐ！中１０〜 １００ｇの非細胞毒性物質が、角膜縁を通して眼房中に注入される。大部分、こ の物質は、モノクローナル抗体又はその特異的結合フラグメントであろう。一般 的に、溶液は、生理学的に許容できる溶液、たとえば生理的食塩水、リン酸緩衝 溶液又は同様のものであろう。導入する他の方法は、たとえば角膜の切開に続く 非細胞毒性物質の点眼及び細胞毒性物質と交差反応する部位に特異的に結合する ことができる。非細胞毒性物質約２５〜２００、好ましくは約５０〜１５０、よ り好ましくは約１００μの点眼を包含することができる。抗体又はそのフラグメ ントは、細胞毒性物質と交差反応することができるすべての部位に結合し、そし てまた、眼の前限房内に存在する“ホットスポット”に非特異的に結合するであ ろう。この場合、細胞が、細胞毒性物質から保護されるであろう。
交差反応性結合剤の使用は、細胞毒性物質が、水晶体の上皮細胞以外の細胞との 特異的又は非特異的な交差反応性を有する場合、特に重要なものであろう。交差 反応性非細胞毒性結合成分の先の点眼の使用により、細胞、特に水晶体の上皮細 胞以外の上皮細胞と種々の程度に交差反応する細胞毒性物質が調製される。
抗体結合を可能にしだ後（１０〜１５分）、角膜の切開が行なわれ（たとえばＥ ｘｔｒａｃａ　５ｕｌａｒ　Ｃａｔａｒａｃｔ　Ｓｕｒ　ｅｒ　＋Ｅｍｅｒｙ　 ＆ＭｃＩｎｔｙｒｅ、Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ＋１９８ ３を参照のこと）、そして前眼房が、生理学的に許容できる溶液、たとえば平衡 塩類溶液によりフラッ込され、未結合性非細胞毒性物質が除かれる。関節包外手 術及び水晶体の除去は、標準方法（Ｅｍｅｒｙ　＆ＭｃＩｎｔｙｒｅ、　Ｍ）に 従って行なわれる。角膜切開が閉じられた後、少なくとも２回目の切開が、細胞 毒性組成物を水晶体カプセル領域中に導入するために行なわれる。
２回目の注入のための物質が、毒性成分及びモノクローナル抗体を含んで成る接 合体を含む場合、一般的に注入は、水晶体の上皮細胞のすべてを実質的に完全に 又は完全に殺害するのに十分な細胞毒性組成物１０〜２０！Ｊｌ、通常約１〜１ ０ｇを含むであろう。
−ｉ的に、細胞毒性効果は、細胞毒性物質の点眼の後、比較的短い時間内で、通 常約０．５時間で実現し、又はその後すぐに、タンパク質合成の圀害が細胞毒性 効果の開始を評価するために使用され得る。しかしながら、生存率がいくつかの 他の機構、たとえば生体染色、等により評価される場合、それは、細胞毒性効果 （たとえば細胞の死）が示されるまで、数時間〜数日を要する。
細胞毒性組成物が補体−固定モノクローナル抗体及び補体を含む本発明を実施す るための好ましい方法は、水晶体の上皮細胞に特異的に結合することができるモ ノクローナル抗体約２５〜２００、好ましくは約５０〜１５０、より好ましくは 約１００４の点眼を包含する。一般的に、モノクローナル抗体は、生理学的に許 容できる溶液、たとえば生理的食塩水、リン酸緩衝溶液又は同様のものの中に導 入され、そして約１０８〜１０Ｉｆｆ、より普通には約１０９〜１０１２個の抗 体／ｄの濃度を有するであろう。他方、初期白内障の手術以外の時に行なわれる 場合、モノクローナル抗体の点眼のために角膜のまわりの切開を行ない、又は前 眼房中に抗体を注入する必要があろう。
モノクローナル抗体の導入及びいづれか残る水晶体の上皮細胞に前記抗体が結合 する十分な時間、通常約３０分間のインキュベーションの後、前眼房はフラッシ ュされ、すべての末。
結合抗体を除かれる。次に、補体（たとえば、Ｍｇ２−及びＣａ”を含む生理学 的に許容できる培地によるウサギ血清の適切な希釈溶液として）が、約２５〜２ ００、より普通には約５０〜１５０Ｉの量で前眼房中に導入され、ここで本発明 の物質は、水晶体の上皮細胞のすべてを実質的に完全に又は完全に殺害するため に十分な量で存在するであろう。一般的に、細胞毒性効果は、補体の導入の後、 比較的短時間内で、通常、約０．５時間で実現され、又はその後すぐに、標的細 胞の溶解が細胞毒性の開始を評価するために使用され得る。
本発明の組成物は、１又は複数の操作に使用するためにキットとして供給され得 る。そのキットは通常、使用の前、さらに希釈され得る濃縮物として存在する細 胞毒性組成物を含み、又はそれらは、バイアルが１又は複数回の投与量を含む場 合、使用する濃度で供給され得る。便利には、１回の投与量が注射器に供給され 、すなわち殺菌された容器に含まれ、その結果、医師は、注射器が所望する量及 び所望する濃度の薬剤を有する場合、その注射器を直接使用することができる。
抗体及び補体の組合せのためには、キットは、通切な割合の量でモノクローナル 抗体及び補体を含む多数の注射器を有することができる。注射器が直接使用のた めの製剤を含む場合、通常、本発明の方法による使用のためには他の試薬を必要 としないであろう。
次の例は、例示的であって限定するものではない。
１簾 水晶体上皮細胞に対して実質的に特異的なＩｇ？！抗体を分泌するネズミハイブ リドーマ細胞系ＨＢＩ−０９３０２を、１９８７年３月５日、Ａｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃａ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０ ８５２　、Ｕ、Ｓ、Ａ、に寄託し、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９３４３を得た 。水晶体上皮細胞に対して実質的に特異的なＩｇＧ３抗体を分泌するネズミハイ ブリドーマ細胞系）ＩＢＩ−４１９７−Ｘを、１９８８年６月１４日、ＡＴＣＣ に寄託し、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９７４７を得た。
実施旦よ 孟ス／ｚｏ−七コー眉１９４堅 Ａ、免疫化 白内障手術の間、前眼房の小さな切片としてヒト水晶体上皮細胞を得た。それら は無菌状態で集められ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰ？ＩＩ　１６ ４０に入れられた。生存可能な細胞は少なくとも２週間保たれた。ヒト水晶体上 皮細胞はフロイントの完全アジュバント中に乳化された。水晶体上皮細胞により マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）を免疫し、最初の投与では動物あたり５×１ＯＳ細胞／ ２００　Ｊを与えた。フロイントの不完全アジュバント中に乳化した同じ細胞か らなる追加免疫を３週間離して筋肉内に行った。これらのマウスは融合用の肺臓 を取り出す前に１１８０細胞又はヒト羊膜細胞（ＷＩＳＨ）のいずれかの投与を さらに２回受けた。
Ｂ、肚 最後の投与から３〜５日後免疫した動物より肺臓を取り出し、１つの細胞懸濁液 として調製した。次いで従来の条件デでリンパ球をＰ３−Ｘ−６３／Ａｇ８．６ ５３マウスミエローマ細胞と融合させる。融合後、ヒボキサンチン、アミノプテ リン、及びチミジンを含むイスコブ培養液（ｌ（ＡＴ培地）に再懸濁し、約１０ ４細胞／ウエルの密度を与えるようミエローマ細胞の数に従いウェル内に入れた 。培養液の半分を取りかえることにより細胞を５．１２．及び１５日間培養した 。スクリーニングアッセイにより抗体分泌に対しポジティブであると同定された 培養液をヒボキサンチン及びチミジン（ＨＴ）を含むイスコブ培養液（ＩＭＤＭ ）を１社含む２４ウエルプレートに移し、限界希釈により３回クローン化した。
ハイブリドーマ上清をウサギ水晶体上皮細胞を用いて結合について最初にテスト した。簡単には、ウサギ水晶体上皮細胞（ＲＬＥ細胞）を９６−ウェル皿で増殖 させ、０．０２５％グルタルアルデヒドで固定した。培養上清を加え、３７°Ｃ で１時間インキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ を用いて、結合した抗体を検出した。８００以上のハイブリドーマを分析した。
１つのハイブリドーマ、０９３０２がこの研究において用いるため選ばれた。抗 体は新たに摘出した前する。対照的に、これはＥＬＩＳＡにより示されるように リンパ系細胞と結合しない（表１参照）。
表−上 ＢＬＩＳＡによる１ｌａｂ　０９３０２と　□立　−、、＝０　−１！細　胞　 系　反応性“ ウサギ水晶体上皮細胞　十＋＋ ヒトリンパ細胞（Ｄａｕｄｉ）　− 猪金立異立 脱核したヒトの目（Ｌｉｏｎｓアイバンク、ヒユーストン）を液体窒素内で凍結 し一７０°Ｃで保存した。必要な場合、クリオスタットにより凍結組織切片を調 製し、ガラススライド上にのせた。切片をモノクローナル抗体を含むハイブリド ーマ培養上清、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗マウス抗体 により染色し、結合したマウス免疫グロブリンを検出した。用いた基質は３−ア ミノ−９−エチルカルバゾールであった。この方法を用い、ハイブリドーマ９３ ０２及び４１９７−Ｘからの上清は水晶体上皮細胞に結合した。目の前部の他の 細胞構造、すなわち角膜内皮細胞、虹彩上皮細胞等は染色されなかった。染色の 強さに基づき、水晶体上皮細胞の相対強さは４＋であり、水晶体上皮細胞の１０ ０％が染色されたことを表わし；前眼房内の他の細胞の１０％未満が染色され、 抗体が水晶体上皮細胞に対し実質的に特異的であることを示している。
ｊノ３ワと二丈」ｆ口１悲えラノｍ恒 マウスハイブリドーマ抗体のクラス及びサブクラスをオク゛ターローニー分析（ ム亜虱匹虹」１測剋圏虹ヒ江■蛙並ユ岨Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　２版、Ｇｏｄｉｎ ｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１０５頁＼１９８ ６参照）を用いて決定した。この方法を用いてバイブリド−７０９３０２がｒｇ Ｆ′Ｉ抗体を生産し、バイブリド−７４１９７−ＸがＩｇＧ３抗体を生産するこ とがわかった。
■体塾金 ８０〜９０％の融合を達成するため十分な数の標的細胞（ウサギ水晶体上皮細胞 （ＲＬＥ）　）を９６ウエル培養プレートにのせた。
０９３０２培養上清又は対照培養液を種々の希釈でウェルに加え（１００Ｊ／ウ エル）、３７°Ｃで３０分間身ンキュペートした。ウサギ血清（Ａｃｃｕｒａｔ ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、Ｎ Ｙ）（５Ｉ／ウエル）を加え、１２時間インキュベートを続けた。
黄色染料３−　（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニ ルテトラゾリウムプロミド（１’１ＴＴ）を紫色の生成物に変えるその能力によ り生きている細胞を同定した。
細胞生存率は生存率に比例する色の発生の強さを基準として決定した。着色した 生成物の強さは５７０ｎｍの光学密度（０，０，）において分光光度計により測 定した（？ｌｏｓｍａｎｎ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。
（１９８３）　６５　：　５５）。
ｌニー亀 ＲＬＥ　に・　る０９０２　び　の六 培養上清の０９３０２抗体　５７０ｎａ＋での吸収値希　釈　補体含む　補体含 まず １　未希釈　０．０３　０．２４ ２　ｉｔ３＜ｏ、ｏｏ　Ｏ，３３ ３９＜０．００　０．３８ ４　２７　＜０．００　０．３８ ５　８１　０．０４　０．３９ ６　２４３　０．４６　０．４１ ７　０．４８　０．４１ 対照（抗体含まず）　０．４９　０．４８表２に示されているように、補体のみ の添加は細胞生存率に効果がなく、一方抗体＋補体の組み合せは細胞を破壊する 。
皿１束亘 ウサギ水晶体上皮細胞を無菌カバーガラス上にまいた。カバーガラスをハンクス 平衡塩溶液（）ＩＢＳＳ）で洗浄し、アッセイする前に２４時間ＨＢＳＳ中の３ ％バラホルムアルデヒドで固定した。カバーガラスを再び）ＩＢｓｓで洗浄し、 次いでハイブリドーマ上清で覆った。室温で１時間インキュベートした後、再び カバーガラスをＨＢＳＳで洗浄し、希釈したフルオレセインイソチオシアネート −ラベルヤギ抗マウス免疫グロブリンを塗った。カバーガラスを洗浄し、次いて 顕微鏡スライド上にのせた。Ｚｅｉｓｓ顕微鏡により蛍光検鏡を行った。コダッ クＴｒｉ−Ｘフィルムを用いて写真を取った。結果は９３０２がＲＬＥ細胞の表 面に結合していることを示している。
尖旌拠主 ハイブリドーマ４１９７−Ｘからの上清をＥＬＩＳＡにより正常及び腫瘍細胞へ の結合能についてテストした。９６−ウェルプレートで付着細胞系を増殖させ、 ０．０５％グルタルアルデヒドで１０分間固定した。懸濁培養液をポリＬ−リシ ンを塗布したプレートにつけ、上記のようにして固定した。培養液中のモノクロ ーナル抗体をウェルに加え３７°Ｃで１時間インキュベートした。プレートを３ 回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギ抗マウスＩｇＧにより検 出されるマウスＩｇＧを結合した。種々の細胞タイプへのモノクローナル抗体の 結合を表３に示す。抗体はウサギ水晶体上皮細胞、並びに種々の異なる組織由来 の上皮細胞系に結合できる。非上皮起源の細胞にはほとんど又は全く結合しない 。さらに、４１９７−χからの抗体は免疫細胞化学染色により調べたところヒト 水晶体上皮細胞に結合した。不適切な抗体はヒト水晶体上皮細胞を染色しない。
濠−一工 々の１　イブへの４１９７−×７９直合ＭＥＩＥＩＯヒト頚部　上皮　０．１７ ＷＩＳＨヒト羊膜　上皮　０．１６ ＣＯＬＯ３２０結腸　悪性腺腫　０．００ＭＲＣ５ヒト皮膚　繊維芽球　０．０ ６Ｄａｕｄｉ　バーキントリンパ系　リンパｌｉ　Ｏ，０７Ｙ７９　絽膜芽腫　 ０．０６ ＲＰＭＩ　７９３２　黒色腫　黒色腫　０．００実座斑土 享−Ｊ−ム１膝 Ａ、　−八ｒ″のｔ０制 （ｉ）ジフテリア毒素；記載されているようにして（Ｃｈｕｎｇ及びＣｏ１１ｉ ｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｔｒｓ、Ａｃｔａ（１９７７）、４８３　：　 ２４８〜２５７）ジフテリア毒素（Ｃｏｎｎａｕｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）よりフラグメントＡ（ＤＴＡ）を調製し、８０°Ｃに１０分間加熱し残留毒素 をすべて不活性化した。ＤＴＡに対する酵素活性を、基質として”　Ｃ−ＮＡＤ による小麦胚伸長因子２のＡＤＰ−リボシル化によりアッセイした。
（１１）リシンＡ毒素：アフィニティー及びイオン交換クロマトグラフ法の組み 合せによりＲ３ｃｉｎｕｓ　ｃｕ＋ｕ＋ｕｎｉｓ　ｖａｒ　Ｚａｎｚｒ−ｂａｒ ｉｅｎｓｉｓの種からりシンＡ鎖毒素を精製した。ＨＢＩば）ＩｕｍｍｅｒｔＳ ｅｅｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉより得た種子 である。種子を計量し、１．１．３−１リクロロフルオレタン（Ｆｒｅｏｎ）中 でホモジナイズする。脱脂した種子のケーキを真空濾過により集め酢酸ナトリウ ム緩衝液ｐｕｔｏで抽出する。粗抽出液を一連のフィルター（最小は１００　ｔ ｓ＋　）から真空濾過により集める。濾過した抽出液を抽出に用いたものと同し 緩衝液で平衡化したファストＳセファロース陽イオン交換カラム（ファルマシア ）上にのせる。すべての抽出液をのせ、溶出液がベースラインにもどるまでカラ ムを洗浄する。リジンは燐酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、　ｐＨ７，５）によ り溶出される。この条件下でアグルチニンはカラムに結合したままである。
リジン画分を酸処理したセファロース４Ｂカラム（ファルマシア）にのせ、溶出 液がベースラインにもどるまでカラムを洗浄した。５０ｍＭ　トリスｐ）１８． ２緩衝液への２−メルカプトエタノールの添加により調製される還元緩衝液をカ ラムに通す。
還元されたりシンＡ鎖を集める。混入しているリシンＢ鎖及び全体リシン分子を 除去するため、精製したＡ鎖を小さなカラムに通す。条件はリジンＡがカラムに 結合しないような条件である。
精製したりシンＡを５０ｍＭトリスｐＨ８，１Ｍ２−ＭＥ中４■／ｒｄに濃縮し グリセロールと混合して保存する。これは最後に４°Ｃで貯蔵するため無菌バイ アルに０．２２ミクロンフィルターを通しフィルター滅菌される。
Ｂ・上庶」≦二＝）伏体韮イＩＩ針附戊（ｉ）（ＤＴＡ）−３Ｓ″′　人　のム 　：抗体（７，０ｄ、２　ｍｇ　／　ｍｆ！　）をＤｕｌｂｅｃｃｏの燐酸塩緩 衝食塩水、ｐＨ７，４、抗生抗真菌性溶？〆を含有（Ｇｉｂｃｏ、５、Ｏｄ／Ａ 　）に対して透析した。無水エタノール中のＮ−スクシンイミジル−３−（２− ビリシリジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）　（０，１８６ｄ、１（ｂｎＭ） をはげしく撹拌しながら抗体に加えた。この混合物を室温で３０分間にわたって 反応させ、次いで上記と同一の緩衝液Ｉ　ＡＸ２に対して透析した。透析の後、 抗体調製物を５ｔｕｃｈｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ。
（１９７５）　１５１　：　４１７〜４３２に記載のようにして２−ピリジルジ スルフィド含有量について分析した。ＤＴＡ（３，０ｄＪ　２．５■／ｄ）を、 ０．３−の１．０Ｍジチオトレイトール、ｐＨ’７．０を室温で３０分間にわた って添加することによって還元し、そして上述の緩衝液に平衝なセファデツクス （Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（２，６Ｘ　１２ｃｍ０カラム）上で脱塩した。
二〇カラムからのピークフラクションを集め（１１，０雌、０．５３■／雌）、 そしてＦＤＰ−（抗体）抗体（７，０ｄ、２．１■／戚）と混合した。ＤＴＡ及 び抗体の最終濃度はそれぞれ１．５Ｘ１０づＭ及び５．５　Ｘｌ０−’Ｍであっ た。反応混合物中における抗体に対するＤＴＡの最終モル比は約３であった。粗 製の接合体調製物（１８，Ｍ）を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）Ｙｌ’１−１０膜 上で超遠心分離する′ことによって、最終容量０．９雁まで濃縮した。この粗製 の（ｐｒＡ）−ｓｓ−（抗体）（９，０ｄ）を、ＤＰＳＳ緩衝液に平衡なセファ クリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２０００カラム（２，６Ｘ　１０６ｃｍ、流 量２２．１ｄ／ｈ）上でクロマトグラフィーした。そて、及びナトリウムジドデ シルサルフェート／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ　Ｉ　ＰＡＧＥ） によって、分析した。フラクション３０〜４０を集め、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ ）ＹＭ　１０膜上で濃縮し、そしてフィルター滅菌の後に細胞毒定量法に使用し た。
（ｉｉ）藷紘り庄月屓打」」１鎗遵迎治爪：　（ＰＴＡ）−ＳＳ　（抗体）をＪ 、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１９８４）　１３３：１３７〜１４６に記載のよう にして合成した。簡単に説明すると、０．１　Ｍ重炭酸ナトリウム中の抗体（１ 〜２　ｍｇ／ｍ）　、０．５　Ｍ　Ｎａｃｆｆｉ、ｐＨ８，０、及び５〜１０倍 モル過剰のＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート （ＳＰＤＰ）をはげしく撹拌しながら抗体に添加した。室温で３０分間にわたっ てインキュベートした後、Ｇ−２５セフアデツクス上でゲル濾過することによっ て、ピリジルジチオプロピオネ−）　（ＦＤＰ）−変性抗体をＳｅ叶から分離し た。ＲＴＡを最初に、最終濃度５０ｍＭのジチオトレイトールを添加することに よって還元し、引き続いて室温で１時間にわたってインキュベートした。次いで 、ＰＴＡを、Ｃ；−２５セフ７デソクス上のゲル濾過によってＤＴＴから分離し た。次いで、ＰＴＡを最終濃度４■／ｄまで濃縮した。次いで、５倍又は１０倍 モル過剰のＰＴＡをＲＤＰ抗体溶液に添加し、そして４°Ｃで１６時間にわたっ てインキュベートした。ＰＴＡ−抗体接合体をセファクリルＳ−２００上のクロ マトグラフィーによって精製した。
Ｃ，サボリンーー　士人　の副側 （ｉ）並！］予ヴ１１鼠 サポリンを、サポナリアオフィシアリス（錘シμｉｒｉａ７．２、Ｂｍｆｌ／ｇ を使用、を使用して抽出し、その際、磨砕した種子を４°Ｃで一晩じゅうすすい だ。上澄みを取り除き、２８．０ＯＯＸ　ｇで３０分間遠心分離した。粗製の上 澄みを５ｍＭ　ＮａＰＯ３、ｐＨ６，０に対して透析し、次いでＣＭビイオン交 換カラム上通過させることによって精製し、その際、カラムからのサポリンを０ ．０〜０．３ＮａＣｉ！、グラジェント（線状）で溶離した。リボゾーム抑制活 性を有するフラクションを集め、そして５ｔｉｒｐｙｅｔ　ａ！、、Ｖｉｒｃｈ ｏｉｙａ　Ａｒｃｈ、　（１９８７）５３　：　２５９〜２７１の方法を使用し て燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対して透析した。
（ｉｉ　）　ｉｉ企 精製した抗体をＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ −）　（ＳＰＤＰ）で室温で３０分間にわたって処理し、次いでＰＢＳに対して 透析して未反応の５ＰＤＰグループを除去した。透析後、抗体調製物を前記実施 例２．Ｂに記載のようにして２−ピリジルジスルフィド含有量に関して分析した 。５ＰＤＰに対する抗体の比は、抗体に対する５ＰＤＰの１０〜１５倍過剰であ った。サボリンを、１０倍量過剰のＰＢＳ中の５ＰＤＰＳｐＨ７，Ｏｌで室温で ３０分間にわたって処理し、次いで前記実施例２．８に記載のようにセファデッ クスＧ−２５上で脱塩した。カラムからのピークフラクションを集め、そしてサ ポリン対抗体の５倍モル過剰の比でＰＤＰ−抗体と混合した。セファクリル−３ ００カラム上を通過させることによって接合体を精製した。約１６０〜２１０　 Ｋ　ＭＷの範囲の分子量を有するフラクシヨンを集め、そして免疫学的特異性及 び細胞毒性に関して試験した。
竺淋４うｄＬ支慶 単−のモノクローナル抗体の大量生産を、約１０７ハイブリツド細胞を適当なＨ −２適合性マウスに注射することによって達成した。腹水腫瘍を次の方法によっ て導いた。腫瘍の産生のため、マウスに０．５　ｄのプリスタン（２、６，１０ ，１４−テトラメチルペンタデカン、Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔内注射し、そして １〜２ケ月間にわたって安静にした。種間ハイプリシーマを移植する前の３〜４ 日間、それぞれのマウスに５０μの抗リンパ球血清を注射した。腫瘍移植の当日 、それぞれのマウスに対して全身照射を行い（６００〜８００ｒａｄ）　、６〜 ８時間遅れて同族の骨髄１０７細胞マウスを与えた。次いで、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｓ変性イーグル培地中のハイブリシーマ細胞（１０６〜１０７）を腹腔内注射し た。腫瘍が出来はじめた時（注射後１０〜３０日間）、マウスから採血を行い、 血清中における抗体の存在と濃度をたびたび試験した。適当な抗体を集め、精製 し、そして保存した。
提供者（ドナー）の眼球から得たヒト水晶体包を水晶体赤道に対して垂直な中心 軸にそって半分に切開し、そしてクイブエコラーゲンを塗布した１６ｍｍ組織培 養ウェルの底に直に載置した。次いで、１成の培地のみ（対照）、あるいは４１ ９７Ｘ冨むＡ鎖免疫接合体（４１９７Ｘ　−ＲＡ）を含有するものをウェルに加 えた（０日間）。サンプルの一部を、上記した免疫接合体の代りの全リシントキ シン（リシンＡＢ）　と−緒に０日間インキュベートした。ウェルを９５％空気 −５％ｃｏ２中で３７°Ｃでインキュベートし、対照ウェル中の水晶体体外移植 組織において融合性の細胞生長が確認されるまで（９〜１９日間）インキュベー ションを継続した。細胞が１４日回定至った時には再び培地を加え、但し、この 場合には０．５雌の培地であった。０．１ｉの新しい培地を入れたウェルに３Ｈ −ロイシン（５μＣｆ）を加えた。次いで、これらのサンプルを１８時間にわた ってインキュベートし、そして蛋白質中への３Ｈ−ロイシン混入の測定のため、 ガラス繊維フィルター上でのＴＣＡ沈殿及び収集を通じて収獲した。
サンプル　処　理　、語−ｔ：Ｉ４　爺７’を「８９−１２２０　対照　０．０ ５ｉ／ｍｆｆ１　１１．６　９９．８”ｄｐｍ・・・１８時間をかけて水晶体組 織中に混入されたＴＣＡ沈殿可能な放射能から、組織見本単独に対して３Ｈロイ シンが結合特に非細胞毒性結合成分を導入した後、本発明の細胞毒剤を導入する ことによって、残りの水晶体上皮細胞を増殖から予防することができ、したがっ て２次的な白内障を回避する゛ことができる。本発明の方法及び組成物によれば 、２次的な白内障を防止するとともに眼のなかのその他の組織に対する傷害を回 避する簡単な手法が与えられ、また、今まで用いられてきたにはきたが通常細胞 毒の作用があった種々の技法に代りうる安全な技法が与えられる。本発明の２段 階処理によって、比較的に非特異性の細胞毒剤（例えば、上皮細胞に対して特異 的な抗体）を特定の上皮細胞ポプレーション、水晶体上皮細胞に対して特異性と なすことができる。白内障の手術の間にいろいろなタイプの上皮細胞を新しく解 剖学的に配置するので、その治療方法を可能なものとすることができる。
本願明細書に記載する刊行物や特許出願はすべて、本発明が関与するところの技 術分野における当業者のレベルを示すものである。本願明細書では全部の刊行物 及び特許出願を参照目的で記載しているけれども、その記載の程度は、それぞれ の個々の刊行物又は特許出願を特に別個に参照目的で示した場合と同じくらいで ある。
以上、本発明を全体的に説明したけれども、当業者に明らかなように、請求の範 囲の精神又は範囲を逸脱することなく多くの変更及び改良を施すことができる。
手続補正書（方式） 平成３年ｚ月　８日

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. １．水晶体上皮細胞に対して実質的に特異的に結合する抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞培養物であって、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９３４３又はＨＢ９７４７のア クセス番号を有するものを含んで成る組成物。
  2. ２．水晶体上皮細胞の表面上の抗原決定基に結合するモノクローナル抗体であっ て、ＩｇＭ，ＩｇＧ，２ａ，２ｂ又は３として分類されそしてＡＴＣＣＮｏ．Ｈ Ｂ９３４３又はＨＢ９７４７のアクセス番号を有するハイプリドーマ細胞培養物 により生産されるもの、あるいはそのヒト対応物、を含んで成る組成物。
  3. ３．正常水晶体上皮細胞と実質的に特異的に結合するモノクローナル抗体であっ てＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９３４３又はＨＢ９７４７のアクセス番号を有するハイプ リドーマ細胞により生産されるもの、を含んでなる細胞毒性組成物。
  4. ４．前記モノクローナル抗体が補体活性化抗体である、請求項３に記載の細胞毒 性組成物。
  5. ５．前記モノクローナル抗体が毒性剤と結合している、請求項３に記載の細胞毒 性組成物。
  6. ６．前記細胞毒性剤がジフテリア毒素のＡ鎖、リシン、又はアブリンである、請 求項５に記載の細胞毒性組成物。
  7. ７．前記毒性剤がサポリンである、請求項５に記載の細胞毒性組成物。
  8. ８．水晶体上皮細胞に対して実質的に特異的な補体固定モノクローナル抗体であ ってＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９３４３又はＨＢ９７４７のアクセス番号を有するハイ プリドーマ細胞により生産されたものを含む第一容器、及び補体を含有する第二 容器、を含んで成るキット。
  9. ９．前記第一及び第二容器がシリンジから構成されている、請求項８に記載のキ ット。
  10. １０．水晶体上皮細胞に対して特異的な細胞毒性剤を含む第一容器及び該細胞毒 性剤と交叉反応する非毒性剤を含む第二容器を含んで成るキットであって、該細 胞毒性剤がＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９３４３又はＨＢ９７４７のアクセス番号を有す るハイプリドーマ細胞により生産されたモノクローナル抗体を含んで成るキット 。
JP1507336A 1988-06-08 1989-06-08 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体及びのう外摘出後の残遺水晶体上皮細胞の増殖抑制方法 Expired - Fee Related JP2677438B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/204,168 US4871350A (en) 1986-11-04 1988-06-08 Methods and compositions for preventing secondary cataracts
US204,168 1988-06-08
US206,610 1988-06-14
US07/206,610 US5202252A (en) 1982-03-05 1988-06-14 Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and methods for preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH03501806A true JPH03501806A (ja) 1991-04-25
JP2677438B2 JP2677438B2 (ja) 1997-11-17

Family

ID=26899251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1507336A Expired - Fee Related JP2677438B2 (ja) 1988-06-08 1989-06-08 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体及びのう外摘出後の残遺水晶体上皮細胞の増殖抑制方法

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0372071B1 (ja)
JP (1) JP2677438B2 (ja)
KR (1) KR960005732B1 (ja)
AT (1) ATE126530T1 (ja)
AU (1) AU623666B2 (ja)
DE (1) DE68923852T2 (ja)
DK (1) DK34190A (ja)
FI (1) FI94258C (ja)
WO (1) WO1989012093A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2823495A (en) * 1994-06-09 1996-01-04 Houston Biotechnology Incorporated Methods and compositions for modulation of wound healing
DE102004021754A1 (de) 2004-04-30 2005-11-24 Reinhardt Thyzel Vorrichtung zum Entfernen von Epithelzellen aus einem Linsenkapselsack eines menschlichen oder tierischen Auges
WO2005117987A1 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Glazier Alan N Antibody conjugates targeting to ocular proteins
US20050265937A1 (en) * 2004-06-01 2005-12-01 Alan Glazier Systems and methods for changing eye color appearance

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58192831A (ja) * 1982-03-05 1983-11-10 ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体およびその製造方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58192831A (ja) * 1982-03-05 1983-11-10 ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン 水晶体上皮細胞に対するモノクローナル抗体およびその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2677438B2 (ja) 1997-11-17
EP0372071B1 (en) 1995-08-16
ATE126530T1 (de) 1995-09-15
DK34190D0 (da) 1990-02-08
WO1989012093A1 (en) 1989-12-14
FI94258C (fi) 1995-08-10
EP0372071A4 (en) 1990-06-26
DE68923852D1 (de) 1995-09-21
FI94258B (fi) 1995-04-28
KR900702004A (ko) 1990-12-05
KR960005732B1 (ko) 1996-05-01
DK34190A (da) 1990-04-06
DE68923852T2 (de) 1995-12-21
EP0372071A1 (en) 1990-06-13
AU3850989A (en) 1990-01-05
AU623666B2 (en) 1992-05-21
FI900630A0 (fi) 1990-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5055291A (en) Compositions for preventing secondary cataracts
RU2130780C1 (ru) Композиция и способ обработки неопластической клетки
US4724213A (en) Murine hybridoma Lym-1 and diagnostic antibody produced thereby
WO1995003783A1 (en) Polymeric device for the delivery of immunotoxins for the prevention of secondary cataract
JPH05505823A (ja) 細胞成長抑制法およびそれに有用な組成物
US4724212A (en) Murine hybridoma Lym-2 and diagnostic antibody produced thereby
RU2127122C1 (ru) Композиция, обладающая цитотоксическим действием, способ обработки лейкозной клетки in vitro
US4871350A (en) Methods and compositions for preventing secondary cataracts
US5616122A (en) Methods and compositions for preventing secondary cataracts
CA1333048C (en) Monoclonal antibodies against lens epithelial cells and methods for preventing proliferation of remnant lens epithelial cells after extracapsular extraction
US5876438A (en) Polymeric device for the delivery of immunotoxins for the prevention of secondary cataract
KR960005732B1 (ko) 수정체 상피세포에 대한 단클론성항체 및 낭외추출후 잔류하는 수정체 상피세포의 증식을 방지하기 위한 방법
EP0267005B1 (en) Compositions for preventing secondary cataracts
WO1995033492A9 (en) Methods and compositions for modulation of wound healing
WO1995033492A1 (en) Methods and compositions for modulation of wound healing
Kaminski et al. Target Ricin by Coupling to an Anti-Eiacrophage Monoclonal Antibody
EP0316463A1 (en) Murine hybridoma lym-1 and diagnostic antibody produced thereby
CA1338818C (en) Immunotoxins
IL84465A (en) Murine hybridoma lym-2 and diagnostic antibody produced thereby
IE59771B1 (en) Murine hybridoma lym-2 and diagnostic antibody produced thereby
IL84466A (en) A hybrid mouse of the sea-1 and a diagnostic antibody produced thereby

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees