JPH03501850A - 本態性高血圧症に関連する因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本態性高血圧症に関連する因子 発明の分野 本発明は本態性高血圧症に関連する新しい因子及びこのような因子の類似因子の 発見に係わる。具体的には、本発明は患者サンプルの高血圧症因子（ｈｙｐ！ｒ ｊｅｎｊｉｏｎ＋ａｅｔｏｒ″ＨＦ”）を検出する定性的及び定量的生化学分析 方法に係わる。本発明はまた、このような高血圧症因子及び類似因子を応用した 治療方法、例えば、高血圧、血管収縮及びナトリウム排泄増加の調整などに係わ る。

さらにまた、本発明は新しい因子に対するしゃ新剤を利用した治療方法にも係わ る。

発明の背景 本態性高血圧症は米国における罹患率及び死亡率の第１の原因であり、６．ＮＯ 万人がその影響下にあるにも拘らず、その病因は未だに解明されていない。数年 前にＢｌａｕｓｔ！ｉｎは仮説上のナトリウム排泄増加ホルモンまたは因子を本 態性高血圧症の病因と結びつける理論体系を提案した（Ｂｌｍｕｓｊｅｉｎ等の Ａｎｎｕａｌｓ　ｏｆ　ｌｎｊ！ｒｎａ！　Ｍ！ｄｉｃｉｎｅ、　９８：　（第 ２部’）　７８５−７９２　（Ｉｎ２）　）。第１に、本態性高血圧症患者の大 部分は腎ナトリウム輸送系に遺伝的欠陥を有し、正常血圧の人よりもナトリウム 排泄が少ない。その結果、高血圧症患者は体内の水分保持量が健常者よりも多く なり易い。ナトリウム蓄積が増大すると細胞外液容積（ＥＣＶ）が次第に膨張す るはずであるが、細胞外液容積が膨張すると循環因子が作用してナトリウム貯留 を制限し、ナトリウム排泄を増加させる（尿と共にナトリウムを排泄させる）。

仮定因子は腎尿細管が尿からナトリウムを再吸収する作用に関与する酵素Ｎａ。

Ｋ−ＡＴＰａｓｅを抑制することによってこの機能を果す。

腎臓からのナトリウム損失（ナトリウム排泄増加）及び水分損失（利尿）の原因 になるとの主張に基づいて、この因子はナトリウム排泄増加ホルモンと呼ばれて いる。

実際には、ナトリウム分及び水分が見かけ上“正常”となるように新しく平衡状 態を確立しても、抑制因子が高い濃度で血液中を循環する。残念ながらＮａ、　 Ｋ　−ＡＴＰ　ａｓｓの作用は腎細胞に限定されず、平滑筋、例えば、血管壁、 心臓、神経組織などにも広く分布する。従って、この循環因子はこれらの組織に おける血管収縮の原因ともなり、高血圧を発生させる結果となる。

容積膨張及び／または高血圧に伴なって発生する循環Ｎａ、に−ＡＴＰｇｓｅ抑 制因子に関して多くのリポートが発表されている。試験管内における精製酵素に よる基質消費の減少または完全細胞内への変質８６Ｒｂ輸送（Ｋ゛置換分）に基 づく酵素抑制分析を利用して、多くの研究者が高血圧症患者の血漿と健常者の血 漿の著しい相違を指摘している。漿液中の１０個の抑制分画を分離するのに血漿 電気泳動が利用された。循環抑制因子の増加は赤血球中の細胞内ナトリウム及び 血小板中の細胞内カルシウムの増加とも関連づけられた。初めての試みではない が、Ｃ１ｏｉ１等はヒトの尿及び血漿から耐熱性、低分子量、陰イオン性のＮａ 、に−ＡＴＰａｓｅ抑制作用を有する物質を分離し、これを大脳室に注射すると 血圧が上昇した（Ｊ、　Ｆ、Ｃ１ｏｉｘ等のＡｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｎｅｐｈ ｒｏｌｏｇｙ、１４　：　１６１−１７１　（１９８５）　’）　、ウアバイン によるＮａ、に−ＡＴＰａｓｅの抑制はホルモンのような濃度で起こるから、内 因性の強心性配糖体のような物質をめた研究者もあった。

例えば、ジゴキシン・ラジオイムノアッセイに際して起こる未解明のモーが数多 く報告されている。新生児、腎疾患や子痴前症患者の血漿からジゴキシン様免疫 反応物質（“ＤＬＩＳ″）が発見されている。これらの報告のいくつかは非補償 マ、トリックス効果、薬剤及び抗体交差反応で裏づけることができる。ＤＬＩＳ （ｓ）は血漿、尿、脳、肝臓及び副腎組織から抽出された。酸、塩基、熱及び溶 媒抽出によってＤＬＩＳ（ｓ）の性質を解明しようという試みがなされ、その結 果、抗ジゴキシン抗体と交差反応し、かつＮａ、に−ＡＴＰａｔｃ抑制作用を有 する１乃至５種の低分子量（２００乃至７００　ドルトン）の有極性が顕著な物 質が得られた。しかし、その物理的特性については殆ど解明されておらず、分離 のプロトコルは極めて多様である。このような仮説上のナトリウム排泄増加ホル モンによる酵素抑制または酵素結合の全貌に関する出版物は皆無であり、研究は 始まったばかりである（Ｈａｔ＋ｐ！ｒｔ等のＡｍ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、 　、　２４７１６　：　Ｆ９１９−Ｆ９２４（１９８４）　）。

透析患者の血漿中のＤＬＩＳテストにおいて偽陽性反応が現われることが報告さ れている（Ｇｒａｕｃ等のＡｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、Ｍｅｄ、９９　：　６０４ −６０８　（１９８３）　）　。これらの患者から得られた血漿のジゴキシン免 疫測定に対するＤＬＩＳの干渉作用に鑑み、当時この所見は重要視された。しか し、肥満犬において血漿中のＤＬＩＳレベルが高いことも指摘されている（Ｇｒ ｕｂｅ＋等のＮａ＋ｕｒｃ　３０５　：　６６４６　（１９８Ｂ）　）。

いわゆるナトリウム排泄増加ホルモンまたは因子を測定するための種々の生化学 的測定法が提案されている。

Ｈａｍ１７ｎ等の米国特許第４．６６５．０１９号は高血圧症に関連するＮａ、 に−ＡＴＰｇｓｅの抑制物質の血漿レベル測定方法を示している。Ｈａｍｌｙｎ の方法は蛋白質を除去された血漿によるＮａ、Ｋ”ＡＴＰｇｓｅの抑制に基づく ものであり、特定のナトリウム排泄増加因子を特定するものではない。Ｎａｒｄ ｉ等は高血圧症と関連のある、分子量１０，０００乃至１７．０００ドルトンの 少なくとも１種類の蛋白質を検出することにより哺乳動物における高血圧症また は高血圧症素質の存在を診断する方法を開発したと主張している（Ｎｕｄｉ等の 米国特許第４．３２１．１２０号）。さらに新しくは、抗ジゴキシン抗体を利用 して尿中のナトリウム排泄増加因子の存在を検出するラジオイムノアッセイ（Ｒ ＩＡ）方法が報告されたが、因子を特定するものではない（Ｍｏｒｉｓｅ等のＥ ｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　３２　（３）　：　４０５−１１　（１９８５）　）。

最近、Ｋｕｓｋｅ等はナトリウム排泄増加因子の性質に関して“コンフリクト状 態（ｃｏｎｆｌｉｃｔｉｎｇ　５ＮｕＮｉｏｎ　）″を解明しようと試みた（Ｋ ｌｉｎ　Ｌ＋ｅｈｅｎｔｉｈｅ＋、　６５　：　５５３−５９（１９？）　’） 。“コンフリクト状態”についてＫｕｓｋｅ等は漿液、尿、及び組織抽出物中の （Ｎａ＝　＋Ｋ”　）−ＡＴＰａｇｅ抑制因子がかなり多様であると報告してい る（Ｄｅｌａｒｄｃｎｅｒ等のＰｈｙａｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　６５　：　６５８ −７５９　（１９８５）　）。

異なる採取源から得られたこれらの因子がジゴキシン抗体及び漿液中の（Ｃｒａ ｂｏｓ等のＦＥ　ＢＳ　Ｌｅｄ、１７５　：　２２３−２２８　（発行年不明） 、及びＫｅｌｌｙ等の］、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０　：１１３９６−１１４ ０５　（１９８５）　’）　、及び漿液、尿の部分精製分画及び組織分画中の（ Ｅｕｃｋａｌｅｖ等のＡｎｎ、Ｒｅｖ、ＰｈｙＳｉｏｌ、４６　：３４３−３５ ８　（１９８４）　；　Ｃｒａｂｏｓ等の上記文献；　Ｄｅ　Ｗａｒｄｃｎｅｒ のＰｈｙｓｉｏｌ、Ｐｐｖ、、６５：　６５８−７５４　（１９８５）　、及び Ｋｅｌｌｙ等の上記文献）（Ｎａ−＋Ｋ”　）−ＡＴＰａｇｅに対して示す免疫 反応性に関してコンフリクトする結果が観察された。低分子量物質が著しく有極 性であり（Ｄｅ　ＷａｒｄｅｎｅｒのＡｎｎ、Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １９　：　１３７−１４０　（１９８２）　）　、ペプチド性であるか（Ｂｕｃ ｋａｌｅｗの上記文献；　Ｇｒｕｂａｒ等のＰｒｏｅ、ＳＯＣ，Ｅ＋ｋｅｒ　Ｂ ｉｏｌ、Ｍｅｄ、、１５９：４３６−４６７　（１９７Ｂ）　；Ｋｌｉｎｇｍｕ 　ｌ　ｌ　ｅ　ｒ等のＫ１１ｎ　Ｗｏｃｈｅｎｓｉｈｅｒ、６０　：　１２４９ −１２５３　（１９８２）；　Ｋｒａｍｅ＋等のＲｅｎｇｌ　Ｐｈｙａｉｏｌ、 、８：８０−８９　（１９８３）　；Ｍｏｒｇａｎ等のＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　、　２６０　：　１３５９５−１３６００　（１９８５）　）　、また はステロイド性である（Ｃ１ｏｉｘ等のＢｉｏｃｈｃ＋ｎ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、１３１　：　１２３４−１２４０　（１９８５）　） 　コとが示唆された。さらにまた、不飽和脂肪酸（Ｂｉｄｕｄ等のＢｉｏｃｈｃ ｍ。

Ｂｉｏｐｈ７ｓ、　Ａｃｔ、　７６９　：　２４５−２５２　（１９８４）　； 　Ｔａｍｕｒ２等の］、Ｂｉｏｆ、Ｃｈｅｗ、、　２６０　：　９６７２−９６ ７７　（１９８５）　）及びデヒドロニ特表千３−５０１８５０　（４） ピアンドロステロン・サルフェート（Ｖｘｓｄｅｖ等のＲｃｓ、Ｃ。

ｍｍｕｎ、Ｃｈｅｍ、Ｐｇｊｈｏｌ、Ｐｈａ＋ｍａｃｏ１．、４９：３８フー３ ９９　（１９８５）　）にジキタリス様の性質が認められた。コンフリクト状態 を解明しようとしたＫｕｓｋｅの努力にも拘らず、想定されるナトリウム排泄増 加ホルモンの精製及び特定は不可能であった。

このように仮説上のナトリウム排泄増加ホルモンまたは因子の性質に関して多く の学説があるが、本発明以前に、広義の高血圧症と密接に関連する因子の分離、 精製及び特定に成功した理論は皆無である。また、本発明者らは生来の高血圧症 因子の誘導体または類似物質の化学的合成を可能にする一群の高血圧症因子の一 般的な化学構造を解明した。このような高血圧症因子及びその誘導体の特定、分 離及び合成は種々の治療上及び診断上の応用範囲の開発を可能にするものである 。

発明の要約 本発明は動物の組織または体液中の特定因子が本態性高血圧症と関連するとの発 見に基づくものである。このような内因性の高血圧症因子（本明細書では“ＨＦ ”と略記する）を分離し、精製し、その化学構造を解明した。

従って、その物理的、生物学的性質、及び内因性ＨＦ及びその合成類似化合物の 一般的化学構造によってＨＦを特徴づけることができる。ＨＦは有極性脂質、例 えば、分子量が約５２１〜５４１、紫外スペクトルが約１８６ｎｍにおいて最大 の不飽和ホスホリピドまたはスルホリピドのような極性脂質として物理的に特徴 づけられる。生物学的には、ＨＦはＮａ、に−ＡＴＰａａｅ、Ｃａ、Ｍｇ−ＡＴ Ｐ　ａｇｅ及びカルモジュリン活性化Ｃａ−ＡＴＰｘｓｅの少なくとも１つを抑 制し、抗ジゴキシン抗体と錯体を形成することができる。

化合的構造からも明らかなように、ＨＦ及びその類似物質は下記式で表わされる 化合物を含む：ＣＨ，−０−ＲＩ ＣＨ−Ｒ２ Ｒ１は少なくとも３つの二重結合を有するＣ１０乃至Ｃ２６不飽和アルキルまた はアシル、 Ｒ２は−ＯＨ，−Ｈ，−ＣＨ，またはＣＩＯ乃至Ｃ２６不飽和アルキルエステル 、 Ｒ３はＳまたはＰｌ Ｒ４はＣ１乃至Ｃ６飽和アルキル、及びＲ５はＮＨ，またはアルキルアミンを示 す。

さらにまた、本発明者らはそれぞれが本態性高血圧症と関連する同じ分子量の２ つの化合物ＨＦ−１及びＨＦ−２の混合物の形でＨＦが存在することを発見した 。意外なことに、本発明者らはＨＦ−１及びＨＦ−２が本態性高血圧症と関連す る互いに異なる主要生理効果を有することをも発見した。分離し、精製した形で ＨＦ−１を投与すると主としてナトリウム排泄増加を惹起し、ＨＦ−２を投与す ると主として血管収縮を惹起する。従って、以下の説明においてＨＦという語は ＨＦ−１及びＨＦ−２の天然混合物または分離ＨＦ−１及び分離ＨＦ−２の所定 混合物を意味するものとする。

本発明はＨＦ、ＨＦ−１，ＨＦ−２またはこれらの類似物質を動物に投与するこ とにより高血圧、ナトリウム排泄増加及び血管収縮を調整する方法をも提供する 。本発明はまた、ＨＦ、ＨＦ−１またはＨＦ−２に特定のモノクローン及びポリ クローン抗体、及び融合細胞系、即ち、モノクローン抗体を生成するハイブリド ーマの製法をも提供する。

本発明はまた、患者サンプル中のＨＦ、ＨＦ−１またはＨＦ−２の存在を検８す るかまたはその量を測定するためのインビトロ（試験管内）生化学分析方法及び その装置をも提供する。

図面の簡単な説明 第１図（ａ）、（ｂ）は陽子付加分子イオン・ピークが５３２に現われるＨＦの 質量スペクトル、第２図は最大ピークが約１８６に、第２ピークが約２２３に現 われるＨＦの紫外スペクトル、第３図はＨＦの極性脂質の性質を示す７２．　８ ５．　９９．１０５，２７３，２９１及び３４６にピークが現われる質量スペク トル、 第４図はＨＦ−１及びＨＦ−２の存在を示すＨＰＬＣグラフ、 第５Ａ図及び第５Ｂ図は羊にＨＦを注射した後の全身の血管抵抗（ＳＶＲ）に現 われる影響を示すため、平均ＳＶＲ値を実験時間にわたって経時的に画き、注射 後５分以内にＳＶＲが増大することを示すグラフ、第６Ａ図及び第６Ｂ図は羊に ＨＦを注射した後のナトリウム分別排泄（以下、ＦＥ　Ｎａ　（！ｒａｃｊｉｏ ｎａｌ　ｕｃｒｅｔｉｏｎｏｆ　Ｎａ）ともいう）の増大、即ち、ナトリウム排 泄増加を示し、ＦＥ　Ｎ！応答がＳＶＲ応答よりも緩慢であることを示唆するグ ラフ、 第７図はＨＦを含有する限外濾液で処理した細動脈における血管収縮効果をＨＦ 以外の対照物質を含有する限外濾液で処理した細動脈における血管収縮効果を比 較し・４種類の物質のうち、ＨＦ試薬がヒトの胎盤前線動脈の最大収縮を惹起し たことを示すグラフ、第８図は８頭の犬の一方の腎臓にＨＦを含有する限外濾液 を、他方の腎臓に対照物質を投与した結実現われるナトリウム分別排泄（ＦＥ　 Ｎａ　）を比較し、ＦＥ　Ｎａ値を試薬投与腎臓（空白棒）及び対照物質投与腎 臓（陰影付き棒）について別々に示し、腎注入前の期間をベースライン期間とし 、注入中及び注入後の期間を実験期間とした棒グラフ、 第９図は８頭の犬における投与ＨＦの濃度と、ＦＥ　Ｎａ　。

即ち、ナトリウム排泄増加の増大との関係を示し、試薬含有限外濾液と対照物質 含有限外濾液中のＨＦレベル差との関係で試薬投与腎臓と対照物質投与腎臓との 最大ＦＥＮａ増大差を画いたグラフ、 第１０図はイヌ腎臓細胞における４ＳＣａ２−蓄積の動態に対するＨＦの影響を 示すグラフ、 第１１図はサル平滑筋細胞における４５Ｃａ２−蓄積の動態に対するＨＦの影響 を示すグラフ、 第１２図はサル平滑筋細胞における２２Ｎａ−及び４５Ｃａ２ｍ輸送の動態に対 するＨＦ−１の影響を示すグラフ、第１３図はサル平滑筋細胞における２２Ｎａ ＋及び４ｓＣａ２゛輸送に対するＨＦ−２の影響を示すグラフ、第１４図はヒト 赤血球の試験管内実験におけるＮａ。

Ｋ−ＡＴＰａｓｅ及びＣａ、Ｍｇ−ＡＴＰＢｓｅ抑制作用を画き、ＨＦ−１及び ＨＦ−２が投与量にほぼ比例して双方の酸素に対して顕著な抑制効果を生むこと を示すグラフ、 第１５図はＨＦ−２の高速原子衝撃質量スペクトル（ＦＡＢ　ＭＳ）、 第１６図はＨＦ−２の衝突活性化連合質量スペクトル（ＣＡＤ　ＭＳ）、 第１７図Ａ−Ｇは第１５図及び第１６図の質量スペクトルにおいて観察される質 量が１００よりも大きいすべてのフラグメントの構造、 第１８図は分離されたヒトＲＢＣ膜におけるＨＦ（半精製）のＮａ、にポンプＡ 　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ抑制を投与量との関係で、ＩＨ％活性＝７．５ｎｍｏｌ　Ｐｉ ／ｍｉｎ　７ｍｇ蛋白質として示すグラフ、 第１９図は分離されたヒトＲＢＣ膜におけるＨＦ（精製混合物）のＣａポンプＡ 　Ｔ　Ｐ　ａｓｃ及びカルモジュリン活性化ＣａポンプＡ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ抑制 を投与量との関係で、カルモジュリン活性化Ａ　Ｔ　Ｐ　ａｇｅの１００％活性 ＝６６．７ｎｍｏｌ　Ｐｉ／ｍｉｎ　７ｍｇ蛋白質として示すグラフ、第２０図 は高血圧症患者の血漿から得られるＨＦの分離プロトコルである。

好ましい実施例の詳細な説明 ナトリウム排泄増加因子またはホルモンが本態性高血圧症の原因に含まれるとの 仮説が立てられてから久しい。

広義において、本発明はジゴキシン様免疫反応物質（ＤＬ　Ｉ　Ｓ）とも呼ばれ るこのような因子を分離し、精製し、構造的に特定した。この因子の特性が１つ だけ強調されるのを避けるため、本願明細書中ではこの因子を高血圧症因子また は“ＨＦ″と呼ぶことにする。

動物の組織または体液から分離され、精製されたＨＦは先ず第１に分子量が５２ １乃至５４１の有極性脂質として特徴づけられる。ＨＦの紫外スペクトルでは約 １８６ｎｍに最大ピーク、約２２３ｎｍに第２ピーク、約２０３ｎｍに最小値が ある。

ＨＦは種々の動物の組織または体液から分離することができ、例えば、本態性高 血圧症の透析患者から得られる濾過血液から抽８することができる。ＨＦの分離 及び精製の方法は多様であり、そのいくつかの例を例１〜３として後述し、第２ ０図にフローチャートで示す。一般に、患者から得た体液または組織サンプルか らのＨＦ分離はサンプルをアンモニウムイオンの存在においてアルカリ溶液で抽 出し、次いでエーテル／アセトン溶媒で抽出するというステップを含む方法によ って達成される。

ＨＦを分離し、精製したら、その物理化学的性質によってこれを特徴づけ、これ までに報告された他のナトリウム排泄増加因子から区別することができる。第１ 図に示すように、ＨＦの高速原子衝撃（Ｆ　Ａ　Ｂ）質量スペクトル分析の結果 、分子量が約５２１乃至５４１、もっと具体的には陽子を奪われた形で約５３１ の単一優勢成分が得られた。比較的小さいピークが約３６３及び約３４５にも認 められる。ＨＦの紫外スペクトルでは約１８６ｎｍに最大値、約２２３ｎｍにこ れよりも小さいピーク、２０３ｎｍに最大値が認められる。

他の分析ではＨＦが多（は不飽和ホスホリピドまたはスルホリピドの形を取る有 極性脂質化合物であることが示唆される。第３図に示すように、ＨＦを脂質とし て特徴づけたのは有極性脂質分子の７２．　８５．　９９．　１０５．２７３． ２９１及び３４６におけるピーク特性を示す質量スペクトル・データに基づく分 析の結果であった。

脂質特性が判明した後、既知の骨格構造の分子量から逆算すると、ＨＦが不飽和 ホスホリピドまたはスルホリピドであることが判明する。

ＨＦはその生物学的または生化学的性質によっても特徴づけることができる。本 態性高血圧症の病源論通り、ＨＦはＮａ、に−ＡＴＰａｓｅ作用を抑制すること ができる。Ｈａｍｌｙｎ等のＮａ＋ｕｒｃ、　３００　：　６５０−６５２　（ １９８２）に記載されているＮａ、に−ＡＴＰａｇｅ抑制分析方法に変更を加え た方法によって確認された。本発明者らはまた、患者の血漿から分離されたＨＦ がＣａ、　Ｍｇ　−ＡＴ　Ｐａ５ｅ及びカルモジニリン活性化Ｃａ−ＡＴＰａｓ ｃを抑制することができ、従って、細胞膜を通したカルシウム輸送に変化を与え て細胞内カルシウム濃度を高め、これによって細胞を反応過敏にすることを発見 した。本発明者らは赤血球（ＲＢ　Ｃ）膜におけるＮａ／に−ＡＴＰａｓｅ　、 Ｃａ。

Ｍｇ−ＡＴＰａｓｅ及びカルモジュリン（Ｃａｍ）活性化Ｃａ”ＡＴＰｘｓｅの 作用に対するＨＦの影響を調べた。濃度の異なる精製（ＨＰ　Ｌ　Ｃ後）ＨＦを 使用して、本発明者らはこれらの膜結合酵素に対するＨＦのＩＣ６゜を測定する ことができた。第１８図及び第１９図に示す測定結果から明らかなように、ＨＦ のＩＣ６゜はＮａ、に−ＡＴＰ　ａｓｅに対しては１０ｎｇＳＣａｍ活性化Ｃａ −ＡＴＰｘｓｅに対しては１５ｎｇｓ非活性化Ｃａ、ｍｇ−ＡＴＰａｓ！に対し てはＩＯＢであった。Ｃａｍ活性化Ｃａ−ＴＰｘｓ！に対するよりもＣａ、　Ｍ ｇ　−ＡＴＰａｓ！に対するＩＣ５ｏが高いのはＨＦとＣａｍとの相互作用また はポンプ（カルモジュリンの結合部分）との相互作用に起因すると考えられる。

ＨＦはまた、抗ジゴキシン抗体と錯体を形成することができる。この錯体形成は Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから購入した試薬（Ｒａｉｎｅｎ　Ｄ ｉｇｏｒｉｎユ２Ｊ　ＫＮ、　Ｎｃｖ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ、　ｖサ チューセッッ州（１１８６２，ノース　ビレリカ）をメーカーの指示書に従って 使用することにより２例または３例ずつ実施した。ただし、緩衝液には１４０ｍ ｍｏｌ　／Ｌ　ＮａＣｇに２（１０ｇ／Ｌのウシγ−グロブリンを溶かした溶液 １０μＬを補足した。未知物質の抗原抗体結合を漿液中のジゴキシン標準と比較 した。

ＨＦは培養サル大動脈（平滑）筋細胞及び培養イヌ腎細胞におけるナトリウム及 びカルシウム吸収量を増大させることでも特徴づけることができる。この実験は 例７に述べる手順で進めたが、ＨＦのＮａ、に−ＡＴＰａｓｅ及びＣａ、Ｍｇ− ＡＴＰａｓｅ抑制機能を裏付ける結果となった。ＨＦの作用で個々の血小板中に 起こる細胞内カルシウム増加に呼応して血小板凝集を活性化させることができる のもＨＦの特徴である。

本態性高血圧症患者の血漿から分離されたＨＦの構造分析の結果、ＨＦ−２がα 炭素に１９：４（１９炭素：４二重結合）脂肪酸側鎖を有し、分子式Ｃ２５Ｈ４ ２０９ＮＰで表わされる新規のホスファチジルセリン誘導体であることが判明し た。体内生成ＨＦ−２分離体の化学構造は、１； ＣＨ２０ＣＣｌ８Ｈ２９ Ｈ−ＯＨ 例１０−１２において後述するように上記化合物の類似化合物を合成したところ 、患者から分離された体内生成ＨＦと同様の生物学的作用を示した。従って、本 発明は下記一般式を有する化合物にも係わる。

ＣＨ２０Ｒ３０Ｒ４ＣＨ Ｒｌは少なくとも３つの二重結合を有するＣＩＯ乃至Ｃ２６不飽和アルキルまた はアシル、 Ｒ２は−ＯＨ，−Ｈ，−ＣＨ３またはＣＩＯ乃至０２６不飽和アルキルエステル 、 Ｒ３はＳまたはＰｌ Ｒ４はＣ１乃至Ｃ６飽和アルキル、及びＲ５はＮＨ，またはアルキルアミンを示 す。

いかなる理論にも拘束されたくないが、ＨＦ分子の生物学的活性部分はグリセロ ール骨格のα炭素における不飽和脂肪酸側鎖であると考えられる。従って、α炭 素におけるＲ１部分はＣＩＯ乃至Ｃ２６、好ましくはＣ１４乃至Ｃ２２の不飽和 アルキルまたはアシルとして特徴づ符表千３−５０１８５０　（７） けられる。最も好ましい実施例では、Ｒ１がＣ１８乃至Ｃ２０の不飽和アルキル またはアシルである。また、生物学的活性は少なくとも３つの二重結合の脂肪酸 不飽和を必要とするように思われる。二重結合を共役することが好ましい。従っ て、Ｃ２６側鎖の共役二重結合上限は１３となる。

他の部分、即ち、Ｒ２乃至Ｒ５については、選択を制限する条件は脂肪酸側鎖の 生物学的作用を妨げる立体障害を起こさないという条件だけである。患者から分 離されたＨＦのβ炭素におけるＲ２部分は多くの場合−ＯＨであるが、本発明の 範囲内の誘導体としては、−Ｈまたは−ＣＨ３部分を有する化合物も含まれる。

Ｒ２はＣ１０乃至Ｃ２６不飽和アルキルエステルでもよい。Ｒ３部分については 、本発明はイオウ及びリンを想定する。Ｒ４リンケージ基はＣ１乃至Ｃ６、好ま しくはＣ１またはＣ２飽和アルキル、Ｒ５部分はアミンまたはアルキルアミン基 でもよい。

本発明の範囲内の化合物の代表例としては、リソホスファチジルセリン（１４： 　３）　、（ｌｉｔ：　４）　、（１９：　４）　。

（２０：　４）、（２２：　４）及び（２，６：４）（カッコ内は炭素数：二重 結合数）のエーテル及びエステル類似化合物、及びリソスルホレシチン（１９： ３）のニーチル及びエステル類似化合物が挙げられる。

ＨＦの分離及び精製の過程で、ＨＦが分子量が同じで物理的性質も互いに似てい るが生理的または生物学的作用の異なる化合物ＨＦ−１及びＨＦ−２の混合物と して存在することが発見された。即ち、ＨＦ−１はナトリウム排泄増加を誘発す ることができるのに対し、ＨＦ−２は血管収縮を誘発することができる。クロロ ホルム：メタノール：Ｒ２０（容積比６５：３５：５）を溶媒とする薄層クロマ トグラフィー（ＴＬＣ）の結果に照らしてもＨＦ−１とＨＦ−２が区別され、Ｒ ｆ値はそれぞれ０．９０及び０．８５であった。生理学的作用が異なるだけでな く、ＨＦ−１とＨＦ−２はそれぞれの相対的Ｎａ、に−ＡＴＰ■ｅ抑制能力につ いても区別することができる。両者の相対的ＡＴＰａｓｅ抑制比は約１　：２０ 　（ＨＦ−１：ＨＦ−２）であった。例６では高圧液体クロマトグラフィー（Ｈ Ｐ　Ｌ　Ｃ）を利用してＨＦ−１及びＨＦ−２の混合物を分離する方法を説明す る。ＨＰＬＣによるＨＦ−１及びＨＦ−２混合物を分離する本発明の方法は患者 サンプルからの抽出物でカラムをプレコンディショニングするステップ（例えば 、サンプル抽出物から貯留脂質を調製するステップ）と、混合比が約１５〜２０ 　＋　１５〜２５　：　５５〜７５のメタノール：アセトニトリル：水溶媒でこ の一対の化合物を分離するステップを含む。

ＨＦ及び分離対ＨＦ−１及びＨＦ−２が分離され、精製されれば、これを種々の 治療及び診断目的に応用できることは当業者が容易に予想できるところである。

また、上述したように、ＨＦの誘導体または類似化合物はＨＦの生物学的作用を 維持できるように化学的に合成すればよい。説明を簡単にするため、以下の説明 において“ＨＦ”、　“ＨＦ−１″及び′″ＨＦ−２″という表現にはこれらの 合成された誘導体または類似化合物も含まれるものとする。

本態性高血圧症の病因におけるＨＦの役割が明らかになれば、薬学的有効量のＨ Ｆ、ＨＦ−１またはＨＦ　−，２を動物に投与することによってその高血圧を調 整することができる。具体的には、ＨＦ−１を投与することにより血管収縮とは 独立にナトリウム排泄増加及び利尿を調整することができる。ＨＦ−１の投与は 利尿剤として作用し、しかも尿中のナトリウム及び水の排泄だけを増加させ、カ リウム排泄は増加させないという有意義な作用をも有する。従来の利尿剤を服用 する患者にとってカリラム損失は重大な問題である。

血管収縮及びこれによる高血圧はネガティブな生理状態と見られがちであるが、 血管収縮と比較的高い血圧が望ましい場合がある。例えば、ショック状態に陥り 、これに伴なって低血圧状態となった患者にＨＦ−２を投与することによって血 管を収縮させ、血圧を上昇させることができる。危険なまでに低い血圧は応急処 置室、集中治療室及び心臓病治療室においてしばしば見られる状態である。従っ て、ＨＦ−２を即時投与することにより患者の血圧をより正常な範囲に戻すこと ができる。

本発明の因子は潜在的に貴重な薬学的性質を有する。

別々にまたは種々の組合わせでＨＦ−１及びＨＦ−２を投与すれば、動物におけ る高血圧、ナトリウム排泄増加及び血管収縮を調整することができる。従って、 ＨＦ。

ＨＦ−１またはＨＦ−２を組合わせて成る薬剤を調合し、特定因子を哺乳動物に 投与するように指示すればよい。

カリウム損失を伴なうことなくナトリウム排泄を促進するというＨＦ−１の顕著 な能力に鑑み、このＨＦ−１は特に有望な利尿剤である。在来タイプの利尿剤を 投与した結果として生ずるカリウム損失は深刻な問題であり、ＨＦ−１に固有の 薬学的作用によって克服できる。ナトリウム排泄増加と血管収縮の双方を惹起し たい場合、分離前のＨＦ混合物または分離ＨＦ−１と分離ＨＦ−２の所定混合物 を投与すればよいことは当業者にとって明白であろう。

ほかにＨＦを適正量投与することによって血小板形成を誘発したり、血小板をＨ Ｆで試験管内処理してから再び患者に注入するという形でもＨＦを治療に応用す ることができる。

本発明の化合物は例えば哺乳動物、鳥類、魚類、特にヒト、家畜及びペットなど のような動物に広く投与できる。

ヒトその他の動物に投与するための薬剤を製造するには従来の製薬方法に従って ＨＦを処理すればよい。ＨＦは活性化合物と有害な反応をしない経口、非経口ま たは局所投与に適した公知の賦形剤、即ち、薬剤学的に許容し得る有機または無 機担体物質と混合して使用することができる。薬剤学的に許容される適当な担体 としては、例えば、水、食塩水、アルコール、植物油、ベンゼンアルコール、ポ リエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロース またはデンプン）、マグネシウム、ステアリン酸塩、タルク、ケイ酸、粘性パラ フィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリスリトール 、脂肪酸エステル、ヒドロキシルメチルセルロース、ピロリドンなどが挙げられ る。

薬剤を殺菌し、必要に応じて補助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤 、乳化剤、浸透圧を制御するための食塩、緩衝剤、着色剤、調味及び／または芳 香物質など、活性化合物と有害な反応をしない物質と混合することができる。ま た、必要な場合にはその他の治療剤、例えば、ビタミンと組合わせることができ る。

内服用としては、錠剤、糖衣錠、水薬、ドロップ、廃剤、カプセルが特に好適で あり、甘味料を使用できる場合にはシロップ、エリキシルなどの形式でもよい。

非経口投薬の場合には注射可能な滅菌溶液（好ましくは油性または水性溶液）、 懸濁液、エマルジョン、あるいは廃剤を含む移植片の形式が特に好適である。定 量投与にはアンプルが便利である。また、リポソーム、経皮貼剤、あるいは活性 化合物がグレードの異なるコーティングで、例えば、マイクロカプセル充填、多 重コーティングなどの方式で保護されている組成物のような持続放出または直接 放出組成物の形で製剤することもできる。ＨＦ化合物を凍結乾燥し、これを例え ば注射薬調製に使用することも可能である。

局所投薬には局所投薬に適した、好ましくは移動速度が水よりも大きいキャリア を含む非スプレー配合組成物、粘着性乃至半固形または固形組成物として使用す る。適当な配合物としては、例えば溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟 膏、パウダー、塗布剤、二一口ゾルな−どがあり、必要に応じて殺菌したり、例 えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝剤または浸透圧制御のための食塩などと混 合する。局所投薬としてスプレー可能なエーロゾルも好適であり、この場合には 好ましくは固形または液状の不活性キャリア材と組合わせた活性成分を与圧され た揮発性の推進剤、例えばフロンと混合して絞り出し容器に充填する。

投与量は使用する特定の化合物、組成、投与方式、治療すべき特定の器官に応じ て異なる。所与の患者に対する投与量は公知の方法で、例えば、既知薬剤の主要 な成分化合物の個々の作用を、例えば、公知の薬理学的プロトコルによって比較 することで決定することができる。

本発明は診断及び治療に利用できるＨＦ、ＨＦ−１及びＨＦ−２に固有の抗体を 開発することを目的とする。

ポリクローン抗体は公知の技術を利用して、例えばヤギまたはラビットのような 免疫処置を施された哺乳動物の漿液から分離することができる。Ｎ出ｒｅ、　２ ５６　：　４９５−９７　（１９７５）でＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｆｅｉｎが 報告している基本的な方法を利用することにより、当業者はＨＦ、ＨＦ−１また はＨＦ−２に固有のモノクローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を開発す ることができるであろう。このようなモノクローン抗体の製法はマウスまたはそ の他の適当な哺乳動物をＨＦ、ＨＦ−１またはＨＦ−２で免疫処理し、抗体を生 産する器官、例えば膵臓を前記動物から摘出し、摘ａした器官から細胞ホモジネ ートを作成し、この細胞ホモジネートを培養ガン細胞、例えば骨髄腫細胞と融合 させ、ＨＦ免疫原に固有のモノクローン抗体を生産するハイブリッド細胞を選択 またはスクリーニングし、持続的に生産するようにハイブリッド細胞、即ち、ハ イブリドーマをクローン化し、ハイブリドーマによって生産されるＨＦ免疫原に 固有のモノクローン抗体を採取するステップを含む。

生産される抗体の種類はＩｇＭまたはＩｇＧ抗体であればよい。ＨＦ、ＨＦ−１ またはＨＦ−２が免疫処置された動物において充分に免疫原性でない場合、これ をハプテンとして特徴づけることができ、ハプテン分子が担体分子と１ルクする ことによって免疫原反応が起こる。

１　ハプテンを担体とリンクさせる方法は公知であり、ＨＦと結合させることの できる担体分子はオバルブミン、サイグロブリンなど多様である。モノクローン 抗ＨＦ抗体はＲａｎｃｈ等がＥｖｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍ ｕ＋ｏｌｏｇｙ、　１４　：　５２９−５３４　（Ｉｎ２）に発表し、Ｔ、ｋｏ ｉｋ！等がＣ１１ｎｉｃａｌ　Ｅｘｐｅ＋ｉｍｃｎｔｓ　ｂＨｒ、　Ｉｍｍｕｎ 、　、　５７　：　３４５−３５０　（１９８４）において、また、Ｅ、Ｈａｒ 山等がＣｌ１ｎ、　Ｌａｂ、Ｉｍｍｕｎ、　、　１６　：　１−６　（１９８５ ）においてそれぞれ交差反応性を検討した方法に従って培養することができる。

該当の抗体を得るため連続細胞系、即ち、ハイブリドーマをスクリーニングした ら、患者サンプルにおけるＨＦ因子の存在または量を検出するインビトロ検出方 法にモノクローン抗体を利用すればよい。ＨＦを検出するインビトロ検出方法と しては、患者がら得たサンプルをＨＦ、ＨＦ−１またはＨＦ−２との間に特定の 反応性を有する少なくとも１種類の抗体と接触させ、免疫測定により抗体とＨＦ の結合を測定する。あるいは、サンプルをＨＦ、ＨＦ−１またはＨＦ−２との間 に特定の反応性を有する少なくとも１種類の抗体と接触させ、因子と関連のある 抗体の量を測定し、この量をサンプル中に存在する因子の量と相関させることに よってサンプル中のＨＦ量を定量測定することができる。これらの測定にはモノ クローン抗体もポリクローン抗体も利用できる。また、抗体フラグメント及び抗 体の種々の領域に対応する遺伝子操作蛋白も利用できる。例えば、Ｌｏｉｕｕ等 がＣｌ１ｎ、　Ｅｘｐｅｒ、Ｉｍ＋ｍｃｎ、、　６７　：　７３８−７４５　（ １９８５）に発表したＥＬ　Ｉ　ＳＡ法に関してＰ、Ｃｏ５ｔｅｌｌｏ及びＦ、 Ｇ＋ａｅｎがＩｎｔ！ｃｔ、ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ、。

５６　：　１７３ｇ−１７４２（１９Ｈ）に報告したニトロセルロース結合法に 従って本発明の因子に関する免疫測定を行うことができる。さらにまた、抗ジゴ キシン抗体に対するＨＦの交差反応性に鑑み、免疫測定に際して抗ジゴキシン抗 体を抗体として利用することができる。

因子と関連する抗体の存在または量は抗体を検出マーカーで標識処理することに よって検出することができる。

本発明に使用される標識抗体には公知の免疫測定に使用されるのと同じ標識を付 ければよい。公知の標識としては、米国特許第３．９４０．４７５号に開示され ているような蛍光分析による検８に使用される蛍光標識や、米国特許第３、６４ ５．０９０号に開示されているような酵素マーカーなどがある。また、例えばＢ ｕｎｊｅｒ及びＧ＋！ｅｎｖｏｏｄがＮａｔｕｒｅ、　１４４　：　９４５　（ １９６２）に発表した方法やｐｘｖｉｄ等がＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔＢ、１３　： 　１０１４−１０２１　（１９７４）に発表した方法にしたがい、ｊ　１２５の ようなラジオアイソトープを標識として利用してもよい。

本発明は患者から得られた体液または組織中の内部生成ＨＦの存在または量を検 出するレセプター分析方法にも係わる。レセプター分析は基本的には患者サンプ ル及び既知量の合成ＨＦ類似化合物を、ＨＦ、ＨＦ−１またはＨＦ−２ともＨＦ 類似化合物とも複合可能な酵素と接触させるステップを含む競合分析方法である 。前記酵素の例としてＮａ、に−ＡＴＰａｓｅ　、Ｃａ、Ｍｇ−ＡＴＰａｇｅま たはカルモジュリン活性化Ｃａ−ＡＴＰａｇｅが挙げられる。サンプル中の高血 圧因子とＨＦ類似化合物は酵素側の限られた数の結合部位をめぐって競合し、各 酵素は結合部位を１ケ所しか持っていない。酵素の結合部位をめぐる競合を所定 時間後に停止させ、ＨＦ、ＨＦ−１またはＨＦ−２がサンプル中に存在して酵素 と結合しているかどうかを判定する。これは定性分析またはイエス／ノー分析で ある。定量分析の場合には、酵素と結合しているＨＦ類似化合物の量を測定し、 これを患者サンプル中に存在する高血圧因子の量と比例的に相関させる。

この相関はＨＦ類似化合物を検出可能なマーカーで標識処理し、遊離または結合 ＨＦ類似化合物の量を測定することによって行うのが普通である。酵素をサンプ ル及びＨＦ類似化合物と同時に反応させず、サンプルまたはＨＦ類似化合物を酵 素と共にあらかじめ培養する方が好ましい。

既に述べたように、ＨＦはＣａ、Ｍｇ−ＡＴＰＡＮ及びカルモジュリン活性化Ｃ ａ−ＡＴＰａｓ！を抑制する能力をも有し、細胞膜を通るカルシウム輸送を調整 することもできる。従って、ＨＦとＣａ−ＡＴＰａ＋ｅタイプ酵素基質の競合に 基づいてレセプター分析を開発することができる。Ｎａ、に−ＡＴＰａｓ！に基 づく分析に比較してこのＣａ−ＡＴＰｘｓｃに基づく分析には独自の利点がある 。即ち、Ｎａ、に−ＡＴＰａｓｅを抑制する物質は沢山あるが、Ｃａ、　Ｍｇ　 −ＡＴＰａｇｅまたはカモシュリン活性化Ｃａ−ＡＴＰａｓａを特定的に抑制す る体内生成物質を本発明者らは知らない。従って、Ｃａ−ＡＴＰａｓ！抑制に基 づく分析はサンプル中のＨＦのより正確な定量分析を可能にする。当業者なら容 易に理解できるように、本発明の分析方法は定性的でもあり得るが定量的でもあ り得るから、分離または分解されているＨＦ、ＨＦ−１またはＨＦ−２を含有す る未処理患者サンプルまたはその抽出物の分析に利用できる。

、ＨＦ、ＨＦ−１及びＨＦ−２は液状サンプル中で検出するのが好ましいが、組 織サンプル中で検出することもできる。本発明に従って利用される液状サンプル は全血、漿液、血漿、尿、汗、涙、唾液などである。問題のＨＦに特定の少なく とも１種類の抗体または酵素を含むＨＦ。

ＨＦ−１またはＨＦ−２の存在または量を検出する診断装置を組立てることがで きる。

本発明の因子の治療を目的とする用途としては、ほかに、因子のホルモン作用を 遮断するため、この因子に固有のモノクローン抗体を投与することによるＨＦ濃 度が高過ぎる患者の治療がある。患者に特定のモノクローン抗体を投与すること でＨＦ、ＨＦ−１またはＨＦ−２を遮断できる能力を利用すれば高血圧、ナトリ ウム排泄増加及び血管収縮を調整することができる。

また、本発明の高血圧症因子に対するモノクローン抗体を分離してしまえば、Ｈ Ｆ、ＨＦ−１また・はＨＦ−２のレセプター部位を検出してこれを遮断する公知 の技術を利用することによって抗イデイオタイプ抗体を開発することができる。

抗体だけでなく、ＨＦ、ＨＦ−１及びＨＦ−２に対するレセプター部位を遮断で きる他の物質、例えばジブキシンやウアバインも利用できる。即ち、因子に対す るレセプター部位を遮断することによって体内生成因子の薬理的影響を調整する ことができる。例えば、妊娠毒血症患者に血管収縮因子として公知の高レベルの ＤＬＩＳ及びＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　ｎが観察され、その病原に関係があると されている（Ｇｏｒｅｊｅｂｅｎｅｒ等のＡｍ、　Ｌ　０ｂｓＬ　Ｇｙｎ、　、 　１０１　：３９７−４００　（１９６８）及びＧｕｄｓｏｎ等のＡｍ、　］、 　０ｂｓＬ　Ｇｙｎ、　、　１５０：８３−８５　（１９８４）　）。従って、 ＨＦと結合してこれを不活性化することができるモノクローン抗体、抗体フラグ メントまたは抗体誘導体、またはＨＦレセプター部位を遮断できる抗イデイオタ イプ抗体は妊娠毒血症の治療に有望である。

例Ｉ　ＨＦの分離及び精製 組織からの分離精製 外科手術または死体解剖において切除された腎臓などのような新鮮な組織、また は培養組織は即時処理する力λ、または−７０℃で貯蔵すればよい。組織を解凍 し、細め１く刻み、回転切削刃を短時間作動させて低温のまま均質化した。遠心 分離によって沈殿物を除去し、後述するように上澄みを濾過し、ベンゼンなどで 抽出する。組織培地も血漿サンプルと同様に処理する。

血液または尿からの分離精製 新鮮な全血または尿を限外フィルターで濾過することにより低分子量化合物を分 離する。限外濾過の前に血漿または漿液を血液から分離してもよい。スクリーニ ング臨床検査のサンプルでは限外濾過ステップを省くことができる。カットオフ が５０．０００乃至２．０００ドルトンの限外フィルター、例えばＹＭ−２シア フロ膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、）を使用することができ、腎患者透析用Ｇｉ ｂｃｏフィルター（キニプロファン）も好適である。

量産の場合には血液の限外濾液または尿にウレアーゼを添加して尿素を分解する 。酵素の作用及び濾液中の尿素含有分を考慮して、約２５℃で行われるこのステ ップは短時間のステップとする。このステップは省略してもよいが、その場合、 分離の後作性は低下する。ＮＨ，の生成に伴なってｐＨが上昇したら、ＩＭＨＩ を添加することによりｐ、Ｈ７，ｏに滴定する。尿素含有量が１５ｍｇ／ｄＬ以 上の場合、このステップが望ましい。臨床漿液スクリーニング検査ではウレアー ゼ処理を省いてもよい。

ＨＦ含有量の低い液状マトリックスを使用する量産では、サンプル、例えば、血 液の限外濾液を凍結乾燥することによって容積を縮小させる。次いでこの乾燥し た残留物を、最終容積（ｍＬ）がｐＨ８，７に滴定するのに使用される５０％Ｎ Ｈ４ＯＨの容積を含めて残留物（ｇ）の３倍となるように水に溶かして再び液状 にする。乾燥ＮａｃＱを添加して溶液を飽和状態にする。

尿または漿液の臨床検査では１．０乃至３Ｍ酢酸アンモ。

ニウムでｐＨを８．６に調整する。トリスまたはその他の緩衝剤を使用するなら 、アンモニウム塩または水酸化アンモニウムを添加しなければならない。最適の 回収を達成するには希釈が３倍を超えてはならない。最大抽出を実現するにはア ンモニウムイオンが必要である。ｐＨは７．２から９．２までの間に設定すれば よいが、回収が最大となるのは８．６から８．８までの間である。

溶媒抽出は２段階で行われる。第１のステップでは、サンプルと等容積のベンゼ ンで非極性脂質を除去する。

有機層を捨てる。第２のステップでＨＦを分離する。精製にはサンプルと等容積 のエーテル：アセトン（１：　１）を使用する。これは時間の長さに左右される ステップであり、溶媒露出時間が長いほど回収量が増大する。分離前に１乃至２ ０時間混合すればよく、臨床スクリーニング漿液試験の抽出には１時間で充分で ある。大量のサンプルを扱うにはエーテル：アセトン（５：　７）を使用すれば よい。同様の極性及び溶解能力を有する他の溶媒系ならばＨＦと共に溶媒の種類 に応じた割合の汚染物質を抽出する。抽出を２〜３回繰返し、有機層を貯留する 。層の分離には遠心分離が必要である。酸化防止剤を使用しない場合には、でき るだけ迅速にＮ２雰囲気下で溶媒を蒸発させねばならない。サンプルの乾燥には 凍結乾燥が必要である。このステップ以後、露光は制限される。

臨床スクリーニング分析に際しては、有機残留物を生理的食塩水またはＮ２０に 溶解させて元のサンプル容積に、または、利用する免疫検定またはレセプター検 定の感度上の限界から必要なら元のサンプル容積以下の容積にする。再溶解には 少なくとも３０分間及び、充分な撹拌を必要とする。臨床的な漿液または尿の定 量的因子分析では、有機残留物をＨＰＬＣ溶媒、例えば、メタノール：アセトニ トリル：水（１５：　１５　：　７０）に溶解させる。半定量的分離では、残留 物をクロロホルム：メタノール：水（Ｈ：　３５　：　５）またはメタノール： イソプロピルアルコール：水（１５：１５ニア０）　、ＴＬＣ溶媒に溶解させる 。

量産の場合には、さらに別の抽出ステップが加わる。

残留物を少量のクロ°ロホルム：メタノール：Ｈ２０（６０：３５：５）に溶解 させる。不溶残留物を遠心分離によって分離し、洗浄後廃棄する。溶媒をＮ２雰 囲気下で除去し、必要に応じて凍結乾燥する。次いで残留物をＨＰＬＣ溶媒に溶 解させる。

９種類以上の汚染物質を含む多量のサンプルを扱う場合には、（例えば、Ｂ１０ −Ｒｉｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　の１００〜２００メツシユＢ ｉｏ＋ｉｌ　Ａを装備する）ケイ酸カラム・クロマトグラフィーを利用すればよ い。カラム（２Ｘ　２７ｃｍ）は約２５℃においてクロロホルム：メタノール： Ｎ２０（６０：　３５　：　５’）を溶媒として形成する。この溶媒にサンプル を加え、６０：３５：２のクロロホルム：メタノール：Ｎ２０混 溶離させる。２つの因子は汚染脂質の大部分よりも先に溶離される。酵素抑制ま たは免疫検定よりも、後述するような薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によっ て成分をモニターする方が便利である。すべての抽出ステップにおいて例外なく 行われることであるが、この溶媒をＮ２及び／または真空雰囲気下で、暗中で、 かつ５０℃以下の温度で除去する。油っぽい外観を呈することのある残留物を凍 結乾燥器において過度に乾燥させてはならない。

免疫検定と併用するのに好ましい分離方法は次の通りである。室温において各試 験管（スクリューキャップの付いたポリプロピレン円錐形遠心分離機）に０．３ ｍＬの漿液を注入する。各試験管に０．３　ｍＬ　１．ＯＭ，ｐＨ８．６の酢酸 アンモニウム緩衝液を注入する。各試験管に０．３ｍＬのベンゼンを注入し、３ ０秒間撹拌する。次いで、室温で１０分間、約１５００ｇの力で試験管を遠心分 離処理する。

ピペットでベンゼンを取８し、廃棄し、４４℃水浴中でＮ２流を使用して残留す る有機層及び約５０％の水性層をブローオフする。試験管に６，ＯｍＬのエーテ ル：アセトンを注入し、静かに撹拌する。試験管をロッカーに置き、暗中で１． ５時間放置する。各試験管を０．５ｍＬのエーテル：アセトン混合物で洗浄し、 撹拌し、ピペットで取出し、これを暗中に保管されている溶媒に添加する。４４ ℃においてＮ２で蒸発乾燥させる。再び０．３ｍＬの生理的食塩水またはＮ２０ に溶解させる。充分に撹拌し、溶媒和時間として少なくとも３０分間、好ましく は１２０分間放置する。

高血圧因子の薄層クロマトグラフィー（“ＴＬＣ”）上記のような精製ステップ の進行をモニターするため、ま、たは血液、尿または組織培地の抽出物に応用で きる高速半定量分離システムとしてＴＬＣを利用することができる。

吸着媒としては、シリカゲルを含浸させたグラスファイバーシート（ＩＴＬＣ− ＳＧ、Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、ｌｎｃ　）またはＬＨＰ−ＫＤ高性能 ２００マイクロ厚ガラス補強プレート（Ｗｘｔｍａｎｎ　）などを使用すること ができる。溶媒・系はクロロホルム：メタノール：Ｈ２０混合物（６０：　３５ 　：５）である。同様の極性を有する溶媒系、例えば、酢酸エチル、アセトンま たはアセトニトリルでも満足すべき分離が得られる。２５℃において（例えば２ ０分間にわたって）分離した後、プレート５０％Ｈ）　Ｐ　Ｏ４または２５％Ｔ ＣＡで顕色させ、１００℃に加熱する。ジゴキシン標準０．７７のプレート上で 因子は典型的なＲｆ値０．８及び０．７６を示した。ＨＦ−１及びＨＦ−２はそ れぞれのＲｆ値０．９０及び０．８５に基づいて弁別できる。

例２　８Ｆの分離及び精製 中空ファイバー人工腎ｊｉ（例えば、八ｍ１ｃｏｎ、　Ｆ＋ｅｃｉｎｉｕａ　、 　Ｇａｍｂｒｏ、及びＴｒａｒｅｎｏｌ製）を使用する正常血圧及び高血圧透析 患者の血液を限外濾過することによって血液濾液を調整した。濾液は初期段階で ０．１８〜０．７８μｇ／Ｌのジゴキシン等価物を含有し、乾燥後は固形で平均 １３ｇ／Ｌを含有した。濾液をウレアーゼで処理することにより尿素を除去し、 中和し、凍結乾燥した。得られた粉末を再び水に溶解させてその重量の４倍の容 積とし、次いで８ＭＮＨ４ＯＨでｐＨ８，８にアルカリ化した。１時間後、スラ リーをベンゼンで抽出し、有機層を廃棄した。

次いで水性層を等容積のエーテル：アセトン（５：　７）で抽出した。有機層を 貯留した後、乾燥Ｎａ（ｌを添加して飽和させ、抽出を繰返した。有機層を貯留 し、蒸発乾燥させた。

抽ａ残留物を再びアセトニトリル：メタノール：水（２５：　２０　：　５５） の第１ＨＰＬＣ可動相に溶解させた。これを（２２３ｎｍにセットされた）可変 波長検比器を装備したＨＰＬＣ装置と接続するＣ１８逆相カラム（２５ｃｍｘ　 ５ｃｍ、　Ｗａｎｒｓ、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　ＭＡ　）に加えることにより脱塩 し、部分精製した。等条件下に分離した２つのＨＦ含有分画（保持時間はそれぞ れ２．４及び２．７ｍ１ｎ）を貯留し、蒸発乾燥させ、再び第２可動相（アセト ニトリル：メタノール：　水＝１５　：　１５　：　７０）に溶解させた。次い で溶液をＨＰＬＣ処理し、特性を分析するためＨＦ−１及びＨＦ−２（保持時間 はそれぞれ１４．４及び１５．７ｍ１ｎ　）を別々に回収した。両クロマトグラ フィー分離のための流量は１．０ｍＬ／ｍｉｎであった。

このプロトコルでは終始ＨＰＬＣグレードの溶媒を使用した。水は脱イオン処理 した。ＨＰＬＣ工程の１つではアセトニトリルの代りにイソプロピルアルコール を使用できる。ＨＰＬＣ精製後に溶媒を減容する際には、この段階で４０％乃至 ６０％の損失が起こり得るから、サンプルの凍結乾燥を避けねばならない。凍結 乾燥に代わる方法として、窒素雰囲気下に（例えば、塩、アルコール、アセトニ トリルのような）溶媒を除去した後、抗ジゴキシン抗体またはＮａ、に−ＡＴＰ ａｓｅを使用するアフィニティー・クロマトグラフィーを利用してＨＦを回収す ることもできる。

例３　ＨＦの分離及び精製 ｐＨを８．６に調整してからベンゼンで抽出することにより、免疫検定用として 透析患者からの血液またはその限外濾液（０，３ｍＬ）を処理した。次いで水性 相をエーテル：アセトン（１：　１）で２回にわたって抽出した。

貯留有機層を蒸発させた後、残留物を再び０．３ｍＬの１４０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎ ａＣ！！に溶解させた。これのダニプリケート１００μＬ分取をメーカーの指示 に従い工１２５ジゴキシン・ラジオイムノアッセイ（Ｒｉ！ｎ！ｎジゴキシン・ キット、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ＋ｌ　Ｎｕｃｌｅａ＋　、ＮｏＮｈ　Ｂ１１１ｅ ｒｉｅａ　、ＭＡ０１８６２　）で測定した。ただし、緩衝剤には１４０　ｍｍ ｏｌ／　ＬＮａＣｌに２００ｇ／Ｌのウシγ−グロブリンを溶かした溶液１０μ Ｌを添加した。未知成分の抗原・抗体結合を漿液中のジゴキシン標準と比較し、 その結果を＋ＢＤＥ／ｍＬとしてめた。この方法の感度は０．０８〜４ｎｇ　Ｄ Ｅ　／　ｍ　Ｌであった。２０日間にわたって単一プールの分析でめた繰返し精 度は０．２８±０．０４Ｄ　Ｅ／ｍ　Ｌ　（ｘ　＋　Ｓ　Ｄ）であった。

部分精製ＨＦ剤は既にベンゼン及びエーテル／アセトンで抽出したから、上述の 抽出ステップは採用せず、窒素流の作用下に貯留クロマトグラフィー溶離物から ５μＬ及び２５μＬ分取の溶媒を除去し、免疫検定のため再び１４０ｍｍｏｌ／ Ｌ　ＮａＣ１に溶解させた。

透析患者からの限外濾液を、尿素が無くなるまでウレアーゼで処理し、次いで、 凍結乾燥した。乾燥した粉末を１５〜４１ｇずつ再び水に溶解させ、ｐ　Ｈ８， ６に調整し、上述のように溶媒を抽出した。エーテル：アセトン抽出の残留物を 乾燥させた後、再びクロロホルム：メタノール：水（容積比６０：３５：１）に 溶解させ、１．５Ｘ３２Ｃ！Ｏケイ酸クロマトグラフイーカラムに加えた。１ｍ Ｌ分画を溶出させるのにクロロホルム：メタノール：水Ｃ６０：３５：５）を使 用した。同じ溶媒でケイ酸薄層クロマトグラフィープレート上に溶出物の１０ｕ Ｌ分取を分別することによって溶出プロフィルを追跡した。ＴＬＣによる主要成 分が＞０．６９０力ラム分画を貯留した。溶媒除去後、残留物を、４頭の羊によ る実験の第１実験には注射用として５ｍＬの１４０　ｍｍｏｌ／　Ｌ　Ｎ　ａ　 Ｃ１：　Ｌタノール混合物（２：　１）に、他の実験には注射用として３ｍＬの １４０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｎ：ａＣｌ　ニジメチルスルホキシド（１：　２）にそれ ぞれ溶解させた。前者は濁った、または油っぽい溶液であり、後者は透明な溶液 であった。

ケイ酸カラム・クロマトグラフィーからの溶出物プールはジゴキシン抗体と交差 反応する２つの物質を含有していた。いずれも公称で１，０００分子量を排除限 界とするＡｍ１ｃｏｎ　Ｙ　Ａ　−２フイルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｄａｒｖｅ＋ ｓ、　ＭＡ）を通過する。Ｎａ、に−ＡＴＰａ＋ｅ抑制機能もジゴキシンに似た 免疫反応性も持たない１〜６種類の汚染物質も存在した。６種類のＨＦ剤のうち ２種類では薄層クロマトグラフィーに成分は３つだけあり、その２つはＨＦであ った。このことは残り４種類のＨＦ剤中の他の汚染物質がＨＦに帰せられる生物 学的反応に無縁であったことを暗示するものである。

例４　８Ｆの特性分析−物理的性質 血液または限外濾液から得られたＨＦの免疫反応性を溶媒抽出後に測定した。ま た、先のプロトコルからのＨＰＬＣ分画の限外濾液抽出物を、溶媒を蒸発させ、 再び０．８ＮａＣＡに溶解させてから測定した。いずれの場合にも、沈澱を容易 にするため１０μＬ０２００ｍｇ／ｍＬウシγ−グロブリン・フラクション■を 添加した以外は変更を加えることな（１２５Ｉジゴキシン・ラジオイムノアッセ イ・キット（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａ＋　）を使用した。分析結 果は０．１ｎｇ／ｍＬから８ｎｇ／ｍＬジゴキシン当量まで線形であり、誤差の 程度は０．２８±０．０４部ｇジゴキシン当量／ｍＬ　（Ｘ＋ＳＤ、ｎ＝２０） であった。従って、抗ジゴキシン抗体とのＨＦ交差反応性が確認された。

Ｂａｍ１ｙｎ等がＦｅｄ、　Ｐ＋ｏｃ、　、　４４　：　２７８２−８　（１９ ８５）に記載している共役酵素系を使用し、ただし、トリス（２−アミノ−２（ ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）の代りにＨＥＰＥＳ　（Ｎ− ２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタン−スルホン酸）で緩衝液を 調製してイヌＮａ、に−ＡＴＰａｓｅの抑制を３４０ｎｍで分光測定した。注入 の日に濃縮ＨＦ剤の５μＬ分取をサンプリングし、直ちに分析するかまたは一２ ０℃で７２時間貯蔵しＨＰＬＣ溶媒に溶かした精製ＨＦ剤の吸収スペクトルを、 可変波長記録分光計によって２５℃で測定した。第２図に示すように、約１８６ ｎｍにＵＶスペクトル最大値が認められた。

Ｋｒａ！ｏｓ　Ｍ　ｓ　−５０トリプル・アナライザーを使用し、８Ｋｖ加速電 圧において高速原子衝撃（Ｆ　Ａ　Ｂ）質量分析スペクトルを得た。ＦＡＢのた めの衝撃ガスとしてアルゴンを使用し、ヘリウムを２５℃で崩壊させた。第１図 に示すように、５３２に最大のピークが、３４５及び３６３に比較的小さいピー クが認められた。

高圧液体クロマトグラフィーを利用して因子を分離及び／または量定した。２２ ３ｎｍにセットされた分光検出器と接続してＣ１８逆相カラム（２５ｃｍＸ　５ ＋ｎｍ、　Ｗａｊｅｒ５　Ｍｉｌｆｏｔｄ　、　ＭＡ）を使用した。カラムをメ タノールで充分洗浄してから、このクロマトグラフィー条件下でバルク抽出物か ら保持時間〉１６分間で溶出した貯留脂質から得た調合物でプレコンディショニ ングした。カラムをこのようにコンディショニングしなければ、ベースライン法 に基づく２ビークではなく単一ピークとして２つの因子が分離する。第４図はＨ Ｆ−１及びＨＦ−２と関連する２つのピークを示す。このカラムでは１５　：　 １５　：　７０溶媒中においてそれぞれ１４．４及び１５．７分間の保持時間で 因子を平等な条件下に分離することができる。必要とする純度及び初発材料が２ つのＨＰＬＣステップの方が好都合であることを示唆するなら、メタノール：ア セトニトリル：Ｈ２Ｏの２０　：　２５　：　５５部合物でもっと迅速に分離す ることができる（因子ＨＦ−１及びＨＦ−２の保持時間はそれぞれ２．４及び２ ．７分間）。２つのＨＰＬＣステップを採用する場合には、先ず水分の少ない溶 媒を使用し、活性分画を回収し、それぞれの溶媒を除去し、次いでＨ２Ｏが７０ 部の溶媒中で因子を再びクロマトグラフィー分析する。

漿液または尿の臨床スクリーニング及びＴＬＣ分別に代わる半定量システムの場 合を除いて、因子測定にはＨＰＬＣを利用する。分離後に活性分画を窒素流及び 凍結乾燥する。

例６　血管収縮性及びナトリウム排泄促進性体重５０ｋｇの壮年で実験した。頚 動脈及び頚静脈にカテーテルを挿入することにより、外部に露出させて動静脈カ ニユーレを移植し、移植から少なくとも１週間後に実験をおこなった。

いずれの実験に際しても動物を立位のままケージ内で頚部をゆるやかに拘束した 。動静脈カニユーレはその中央部で着脱した。静脈カニユーレを介して肺動脈に 心臓内カテーテルを挿通した。正しい位置ぎめを確認した後、。

熱希釈法により心拍出量（ＣＯ）を測定するためカテーテルをこの部位に残した 。頚動脈カニユーレを介して平均動脈圧（ＭＡＰ）を測定した。静脈カニユーレ に注入管を接続し、注入ポンプで７２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｊ！を一定速度 で補給することにより正常損失を補った。膀胱に留置カテーテルを挿入した。膀 胱を完全に空にしてからベースライン・データ採集を開始した。

１時間にわたり１５分毎に尿、血液及び血行力学的データ（心拍出量及び平均動 脈圧）を採集することにより制御条件を確立した。１時間にわたるベースライン ・データ調査の後、頚動脈に３〜５ｍＬのＨＦを注射した。５分後に、さらに２ 時間にわたり１５分ごとに尿、血液及び血行力学データを採集した。

心拍出量及び平均動脈圧値から全身的な血管抵抗を計算した。クレアチニン・ク リアランス（ＣＩ　Ｃｒ）として糸球体濾過率（Ｇ　Ｅ　Ｒ）を計算し、パラア ミノ馬尿酸塩（ＰＡＨ）浄化値に基づいて有効腎血漿流量を計算した。実験間隔 を少なくとも１週間とした。合計６件の実験を２頭の羊で実施した。

尿及び血液化学 血漿及び原電解質、尿素窒素、クレアチニン及びグルコースをＡ　ｓｔｒｇ自動 臨床分析装置（Ｂａｃｋｍ２ｎ　１ｎｓｔ＋ｕｍｃｎｌｓ　、　Ｆｕｌｌｃｒｔ ｏｎ　、　ＣＡ）による公知の電気化学的及び分光測定的方法で分析した。測定 値は１％以内の精度を示し、サンプルの生理的較差にまたがる分散率はく２．５ ％であった口Ｒｉｃｈｔ！＋ｉｃｈのＣｌ１ｎｉｃａｌ　ＣｂｅｍｉｓＨｙ　： 　Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄＰｒｎｅｊｉｃｅ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　：　Ｓ、　 Ｋａｒｇｃｒ、　Ｉｎｃ、、　ＰＰ、　４７９−８１　（１９６９）に記載され ている分光測定によるＢｒａｊｊｏｎ−Ｍａｒｓｈａｌｌ法でＰＡＨを測定した 。

血行力学的効果 注射されたＨＦは６件すべての実験において血行力学的反応を誘起した。表ＩＡ 及び表ＩＢはベースライン・データ採集段階に得られた平均的な血行力学的測定 値を濃縮ＨＦ注射後のすべての測定値の平均と比較したものである。ｔ−テスト 及び分散（ｐ　＜　０．　Ｈｌ）分析の結果、ＳＶＨの増加が極めモ著しかった 。他の著しい変化は心拍出量の減少と平均動脈圧の上昇であった。

表ＩＡ ベースライン段階及びＨＦ注射後の 血行力学データ。値は平均上（ＳＥＭ）実験の状態　平均動脈圧　心拍出量　全 身血管抵抗ｍｍＨｇ　Ｉ　／ｍｉｎ ベースライン　７４．９（１，９）　８．２（０，２３）　７４９（５，９）Ｈ Ｆ注射後　７８．３（１，５）　６．９（０，１２）　９２１　（１３）１）　 ＜　０．０２　０．０００１　０．　ＯＨＩベースライン段階及びＨＦ注射後の 血行力学データ。値は平均（ＳＥＭ） 実験の状態　平均動脈圧　心拍８量　全身血管抵抗ｍｍＨｇ　ｊ！　／ｍｉｎ ベースライン　７６．６（１，５）　７．６（０，２３）　８３６（３７）ＨＦ 注射後　８０．６　（１，１）　６゜６（０，１３）　１０１１（３２）第５図 は実験期間にわたる平均ＳＶＲ値を経時的に示す。ＨＦ注射の５分後にＳＶＲの 増加が認められた。２時間の実験期間を通してＳＶＲは常にベースライン値以上 であった。分散（１）＜０．Ｈ２）を分析した結果、極めて著しい全身血管抵抗 増加が認められた。

ＨＦを注射してもクレアチニン・クリアランスから計算されるような糸球体濾過 率に対する影響はなかった。

同様に、有効腎血漿流量（ＰＡＨクリアランス）がＨＦによって著しく変化する ことはなかった。

第６図にはすべての実験に関して制御及び検査の時間の経過に伴なうＦＥ　Ｎａ の平均を示した。図示のように、ＦＥ　Ｎａの増加は全身血管抵抗応答よりも遅 かった。ただし、全身血管抵抗と同様に、注射後の２時間を通してＦＥＮａ増加 が持続した。ＨＦ注射後のこの増加は顕著であった（ｐ＜０．０１．分散の分析 ）。

腎に対する影響 表２はＨＦ注射前の１時間にわたるベースライン・データ収集段階と注射後の２ 時間にわたる段階における腎データを８件の実験に基づいて示す。表２に示すよ うに、ベースライン値の４倍に相当するＦＥ　Ｎａ増加がＨＦ注射後に現われた 。ＦＥ　Ｎａの増加に伴なって尿流量が５０％以上増加した。水クリアランス循 環は腎細管による水の吸収が著しく減少することを明らかにした。換言すると、 ＨＦ注射後、水クリアランスがベースラインから増加した。水及びナトリウムの クリアランスとは異なり、カリウムの分別排泄はＨＦ注射後減少した。

尿流量及びナトリウム排泄の増加に伴なうカリウム分別排泄の減少はこれまでナ トリウム排泄増加因子に関する研究で報告されたことはなく、意外な所見である 。通常なら、尿流量の増加に伴なってカリウムの分別排泄も増加する。ところが 、末端ネフロンにおけるＮａ、に−ＡＴＰａｓｅの抑制がカリウム排泄を減少さ せると考えられる。最近の研究は本態性高血圧症におけるカリウムの重要性を強 調しており、体内のカリウムは心臓グリコシドの能力を変化させることが知られ ている。ＨＦが腎によるカリウムの処理を変化させるのは興味深い。

例７　サル平滑筋及びイヌ腎細胞に対するＨＦ効果材料”ＣａＣｌ２　（１ｍＣ ｉ／ｍＬ）及び”Ｎ　ａ　Ｃ１（１００ｕＣｉ／ｍＬ）はＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｃ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。

ウアバインはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（ＳＬＬｏｕｉ ｓ、　ＭＯ）から購入し、最小必須培地、デニルベッコ変性イーグル培地、ウシ 胎児漿液及びハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）はＧｉｂｃｏ　（Ｌｏｎｇ　ｌ５ ｌａｎｄ　、　ＮＹ）から購入した。

細胞培養 ３５ｍｍ組織培養皿を使用し、５％ウシ胎児漿液を補足したデュルベッコ変性イ ーグル培地でサル大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）を平板培養した。５％ウシ胎児漿 液を補足した最小必須培地でイヌ腎細胞（ＣＫＣ）を培養した。

５％ＣＯ２及び９５％空気の湿気を含んだ雰囲気下で３７℃恒温器中で細胞を保 温し、融合段階付近で使用した。

経時的観察 はぼ融合状態のＳＭＣ及びＣＫＣ細胞を詳しくは後述するように洗浄し、定量の ＨＦを添加し、細胞を３７℃で３０分間保温した。それぞれの皿に１０μＣｉ／ ｍＬの４５０ａｃ１２を添加し、種々の規定時間にわたって反応を進行させた。

各規定時間が終ると同時に反応を停止させ、後述のように細胞に関連の放射能を 測定した。

２２Ｎ　ａ　”及びＪ５Ｃａ２４の定常標識融合状態に近いＳＭＣ細胞を３ｍＬ のＨＢＳＳで３回洗浄した。種々の濃度の精製ＨＦ−１またはＨＦ−２を細胞（ デュプリケート）に添加し、各培養皿に１ｍＬ４５Ｃａ”　（１０μＣｉ　／ｍ Ｌ）を添加し、細胞放射能を測定するまで２時間保温した。２時間が経過したと ころで溶液を吸引し、直ちに細胞を氷上に移し、速やかに３ｍＬの低温ＨＢＳＳ で５回洗浄した。最終吸引の後、各プレートに２ｍＬの０．５％ＳＤＣを添加し て細胞層を溶かし、シンチレーションびんに移した。次いでそれぞれのびんに１ ５ｍＬのシンチレーション・カクテル（Ｄｉｍｉ　ｆｕｍｅ）を添加し、内容物 を激しく撹拌してから細胞放射能を測定するため液体シンチレーション・カウン ターに移した。

平行実験において、全く同じＳＭＣ細胞を２．５μＣｉ／ｍＬ”Ｎａ＝で標識し てＮａ分に対するＨＦの影響を測６０ｍｍ組織培養皿を使用し、５％ウシ胎児漿 液を補足した最小必須培地でＣＫＣ細胞を融合状態に近くなるまで平板培養した 。温いＨＢＳＳで洗浄した後、それぞれの皿に２ｍＬのＭＥＭを添加した。２０ μＬの精製ＨＦまたは２０μＬのＥＴＯＨで細胞を３７℃で３０分間予備処理し 、次いでＨｔ、ｔ　Ｌの４５Ｃａ　Ｃ１２を添加し、１．５乃至１０分間にわた って反応を進行させた。それぞれの時点において、すばやく培地を取り除き、細 胞を５Ｘ３ｍＬの低温ＭＥＭで洗浄することによって反応を停止させた。次いで ２ｍＬの０．５％ＳＤＳを添加することによって細胞層を抽出し、１５ｍＬのシ ンチレーション・カクテルを添加し、液体シンチレーション・カウンターで細胞 放射能を測定した。それぞれの皿の最終ＨＦ濃度は２．５　ｎｇ／ｍ　Ｌ、総放 射能／皿は６．２１Ｘ　１１０６ｃｐであった。

第１０図に示すように２ｎｇ／ｍＬのＨＦで処理したＣＫＣ細胞の初期正味４５ Ｃａ２−蓄積率は同じであったが、細胞と連携する４５（：、　ａ２’の量は未 処理細胞の１．５〜２倍であった。

ＳＭＣ細胞における４５Ｃａ２゛蓄積動向に対するＨＦの影響 ３５ｍｍ組織培養皿を使用し、５％ウシ胎児漿液を補足したデュルベッコ変性イ ーグル培地でＳＭＣ細胞を平板培養した。融合状態に近い細胞を１．０５ｎｇ／ ｍＬ精製ＨＦまたは等量の０．９％ＮａＣｊ’で３０分間３７℃で予備処理した 。

１０μＬの”Ｃａ　Ｃ１２を添加し、５〜３０分間にわたって反応をモニターし た。放射能測定のため上述のように細胞を処理した。皿ごとの反応性を加算した 総反応性は３゜４５Ｘ１０６ｃｐｍであった。

第１１図に示すように、ＳＭＣ細胞を使用した実験では初期Ｃａ蓄積率にやや差 がある。これらの実験から明らかなように、ＨＦの効果としてＳＭＣおよびＣＫ Ｃ細胞の双方に４５Ｃａ２“の蓄積が可能である。

はぼ融合状態のＳＭＣ細胞をＨＢＳＳで洗浄し、種々の濃度（１４０〜７９０　 ｐｇ／ｍＬ）のＨＦ−１を添加し、１時間保温した。ａ５ＣａＣ１２または２２ Ｎ　ａ　Ｃ１を添加し、上述したように定常細胞放射能を測定した。

第１２図に示すように、ＨＦ−１はその投与量の増加に応じてＣａ及びＮａを比 例的に増加させたが、高濃度ＨＦ−１の場合には４５Ｃａ２−の増え方は軽微で あった。

第１２図に示した実験とは並行の実験であるが、ここでは３９０ｐｇ／ｍＬのＨ Ｆ−２を使用した。ＳＭＣ細胞は上記の場合と同様に培養した。第１３図及び第 １４図から明らかなように、Ｎａ及びＣａ蓄積に関してはＨＦ−２でも同様のパ ターンが観察されたが、ＨＦ−２の場合、蓄積は１１００ｐ／ｍＬ後に高原状態 となった。ＨＦ−１でもＨＦ−２でも投与量に対する応答はＣａの方がＮａより も敏感であった。

例８　患者サンプルのＨＦ検出のためのレセプター分析１００μＬのＨＦ抽出物 （例えば、総ＨＦスクリーニングの場合ならエーテル：アセトン（１：　１）溶 媒、ＨＦ−１またはＨＦ−２定量の場合なら分離ＨＰＬＣ分画）を蒸発乾燥させ 、再びＨ２Ｏに溶解させた。この溶液を１［１０μＬのイヌ腎臓Ｎａ、に−ＡＴ Ｐｇｓ！　（シグマ０．６ｍｇ／　ｍ　Ｌ　）　、及び０．２５ｍＭのＮａ２Ｅ ＤＴＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２及びＩＨｍＭ（ＤＮａＣｌを含有する７００μＬの ０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　−Ｃ１（ｐＨ７，２）と共に３７℃で１００分間保温し た。１００μＬ中の１ｍＭウアバインで対照を、１００μＬの水だけで被験物質 としてブランクをそれぞれ用意し、同じ緩衝剤／酵素混合物中で同時に保温した 。

１００μＬ中０．４ｕＣｉの３Ｈ−ウアバインを混合物に添加し、３０分間保温 した。水冷却緩衝剤で反応を停止させ、濾過または遠心分離によって直ちに抑制 物質／酵素複合体をグラスファイバー・フィルター上に回収した。水冷緩衝剤で 保持された放射能を液体シンチレーション・カウンターでカウントした。ウアバ インと比較することによって定量した。定量単位は０〜１００％結合で表わした 。

例９　ＨＦ−２の構造分析 上述のアルカリ溶媒抽出及び逆相Ｃｌ８ＨＰＬＣにより腎臓透析患者の血液濾液 からＨＦを分離した。Ａ、ＤａＢｕｐｔａ等のＣｌ１ｎ、　Ｃｈｃｍ、　、　３ ３　：　８９０　（１９８７）に記載されている方法を利用したジゴキシン・ラ ジオイムノアッセイで精製物質のＮａ、に−ＡＴＰａｓｅ抑制及び免疫反応性を 分析した。

患者によってその血液濾液中のＨＦ−１：ＨＦ−２（ＤＬ　Ｉ　Ｓ−１：　ＤＬ 　Ｉ　５−２）比に差があった。免疫及び抑制能力を保持しなからＨＦを多量に 分析することは困難であった。この事実は分子構造が元来不安定であるか、また は変質し易いことを示唆した。そこでＨＦ−２だけを広範囲にわたって分析した 。ここに述べる物質はイヌＮａ　−Ｋ　−ＡＴＰａｓｅ　／ｎｇジゴキシン等価 免疫反応性物質を２０％抑制した。

ジチオトレアトル／ジチオエリトレトル・マトリックスを使用し、質量スペクト ル・トリプル分析器（Ｋｒａ＋ｕＭＳ−５０）から高速原子衝撃質量スペクトル （ＦＡＢ　ＭＳ）を得た。サンプルを２５℃で導入し、加速電圧８ｋｖを使用し 、高速原子供給源としてアルゴンガスを使用した。質量分光器は陽イオン検出モ ードで操作した。

同じ装置を使用し、衝突ガスとしてヘリウムを使用して陽イオンの衝突活性化解 離質量スペクトル分析／質量スペクトル分析（ＣＡＤ　ＭＳ／ＭＳ）を実施した 。

ＨＦ−２のＦＡＢ　ＭＳスペクトル（第１５図）ではｍ／　ｚ　３６３．３４５ ．３２９．２２１．１９５．１７９．１６１及び１１９に娘フラグメントが現わ れる。

化合物をＣＡＤ　ＭＳ／ＭＳによって検討した結果、第１６図に示すフラグメン テーション・パターンが得られた。ｍ／ｚ３４６に現われた高いピークはホスホ セリンの先頭基及び陽子損失後も変化しない分子に起因すると解釈される（第１ ７Ａ、Ｂ図）。分子中のホスホセリン基の存在ｉ；！ＨＣＯＨ２ＣＨ（ＮＨ３− ）（ＣＯＯ−）＋：帰せられるｍ／ｚ１０５における大きいピークによって裏づ けられた（第１７Ｃ図）。第１７Ａ−Ｇ図は２つの質量スペクトルで観察される 質量が１００よりも大きいすべてのフラグメントの構造的解釈を示す。

第１６図に示す２つのフラグメントは親化合物中に新規成分が存在するという考 えと符合する。先ず、ｍ／ｚ２９１のピークは脂肪アシル・フラグメントの陽子 付加に起因すると考えられる（第１７Ｄ図）。もしそうならｍ／ｚ２７３におけ る大きいピークは同じ脂肪酸フラグメントからのＨ２０損失によって形成される ことになる（第１７Ｅ図）。この因子の構造の分子量と一致する脂肪酸が人体内 に形成されることは知られていない。

この脂肪酸の分子構造は以下に述べるような質量スペクトルデータから得られた 。ｍ／ｚ１２３のピークはＣ１０及びＣ１１間における仮説上の脂肪酸のアリル 分裂に起因すると考えられる（第１７Ｆ図）。ｍ／ｚ１７０における比較的小さ いピークはフラグメントがグリセロール骨格と、ホスホセリン先頭基ではなく位 置２のヒドロキシ基を保持しながら同じ脂肪アシル鎖のＣ６及びＣ７間にアリル 分裂が起こることによると考えられる（第１７Ｇ図）。ｍ／ｚ１７０における比 較的小さいピークは二重アリル分裂よりもむしろ単一のアリル分裂を示唆してお り、従って、Δ４，７構成であるよりもΔ５，８構成である可能性が高いことを 暗示している（Δは二重結合の炭素位置を示す）。脂肪アシル鎖の２つの異なる 部分から生ずる２つのアリル分裂が存在するということは脂肪アシル鎖中に１つ の二重結合及び２つの三重結合が存在するのではなく４つの二重結合が存在する ことを示唆する。Δ５．Δ８及びΔ１１に二重結合が存在するのはＣ６及び０７ 間及びＣＩＯ及びＣ１１間における分裂によってフラグメントが形成されたこと に原因があると考えられる。

なお、実験による質量スペクトル分析データとは符合するものの、あくまでも仮 説として第１７図に再構成して示したＨＦ−２に対応する化合物は人体生理学に とって新規であることに注目すべきである。

合成の手順は１，３−ベンジリデングリセロールで始まり、これは）１．　Ｐ、 Ｋｅｒｔｓｃｈｅ＋のＰｈｕｍａｘｉｅ、　３８　：　４２１−４２２（１９８ ３）に記載されているアプローチの変形である。塩化ベンゾイル、水酸化カリウ ムを添加し、最後にＨ，ＳＯ４で酸性化することによって１．３−ベンジリデン グリセロールを２−ベンゾイル１，３−グリセロール（こ−れを化合物Ａという ）に変換した。

Ｎ−ブロモスクシンイミド及びトリフェニルホスフィンを使用して市販のアラキ ドン酸から臭化アラキトニルを調製した。次いで臭化アラキトニル及びナトリウ ムを使用して化合物Ａをアラキトニルエーテル誘導体に転換した。Ｈ，Ｅｉｂｌ のＣｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、２６　：　４０５−４２９　（１９ ８０）に記載されているアプローチを利用してグリセロール骨格の位置３の遊離 ヒドロキシル基をホスホセリン先頭基に変換した。

例１１　リゾホスファチジルセリン（２０：４）の合成りｊｅｎｓ＋ｉ等がＣｈ ｅｗ、　Ｐｂｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、ＩＴ　：　２５７−２７０　（１９８５） に発表したようにホスホリパーゼＤ及びＬ−セリンを使用して市販のホスファチ ジルコリン（２０：　４．２（１：　４）をホスファチジルセリン（２０：　４ ．２０：　４）に変換した。

共役因子としてのＣａ”の存在においてエーテルを溶媒としてホスホリパーゼＡ ２を使用すれば、ホスファチジルセリン（２０：　４．Ｈ：　４）は容易にリゾ ホスファチジルセリン（２０：４）に変換される。

標準的なウィツテイヒ反応を利用してペンタナール及び３−ブロモプロパン酸か らΔ５・７・１０・”−１９：４脂肪酸（５，７，１０，１４の位置に二重結合 があり、炭素数１９、二重結合数４の脂肪酸）を合成した。ベンゼンを溶媒とし て使用し、２−ブロモプロパン酸及びトリフェニルホスフィンからウィツテイヒ 塩を形成した。乾燥ウィツテイヒ塩にアルデヒドを添加した後、テトラヒドロフ ラン・ジメチルスルホキシド媒質中でｎ−ブチルリチウムを使用してウィツテイ ヒ塩から陽子を除去した。

次いで最終生成物としての酸を塩基抽出によって精製した。

水素化リチウム・アルミニウム還元に続くピリジニウム・クロロクロメート酸化 によって生成物Δ３−カプリル酸を対応のアルデヒドに変換した。次いで再び３ −ブロモプロパン酸のトリフニこルホスホブロマイドを使用するウィツテイヒ反 応によって最終生成物Δ３−オクタナールをΔ３６−ウンデセンカルボン酸に変 換した。

上述したのと同じ順序のステップ、例えば、還元、酸化及びウィツテイヒ反応を 繰り返し、同じウィツテイヒ塩から得た最終生成からΔ３・６・’−１４：３酸 を生成し、この酸を還元し、次いで上記方法で酸化してΔ３・６・９−１４：３ アルデヒドを得た。このアルデヒドを５−ブロモ吉草酸のトリフェニルホスホニ ウム・ブロマイド塩と反応させて所期のΔ５・８・１】・）４−ＩＱ、４脂肪酸 を得た。

Ｄｊｅｒａ＋＋ｉ等がＣｈｅｍ、　Ｐｈｙ（Ｌｉｐｉｄ＋、３７　：　２５７− ２７０　（１９８５）に発表したアプローチを利用して、脂肪酸を、側鎖として 前記脂肪酸を含有するホスファチジルコリン化合物に変換した。初発材料として 、ジシクロへキシルカルボジイミド及び４−　（ジメチルアミノ）ピリジンの存 在において１，２−グリセロ５ｎ−３ホスホコリンのカドミウム塩及び１９：４ 脂肪酸を使用した。得られたホスホコリン分子を、ホスホリパーゼＤ及びＬ−セ リンを使用してホスホセリン分子に変換した。Ｃａ”の存在においてホスホセリ ンをホスホリパーゼＡ２と共に保温して、位置２．４グリセロール骨格において 脂肪酸を分裂させることにより最終生成物を得た。

それぞれの分析に使用されるＨＦの量を極力少なくすると共に、分析に要する時 間を短縮するため、Ｔｈｏｍｚ＋　Ｈｉｎｄｓ及びＨｏ５ｓｅｉｎ　５ａｄｒｘ ａｄｅｈは通常の分析に使用されるＨＦ（または試薬）量の１１５を使用してＡ 　Ｔ　Ｐ　ｘｓｅを測定するマイクロプレート・アッセイを開発した。この分析 に使用される総容積はＩＨｍＬである。９６個のウェル（凹部）を有する組織培 養プレートを使用し、プレートに先ずＨＦを添加し、Ｎ２下で溶媒を蒸発させる 。

すべてのウェルにＮａ、に、Ｍｇ及び（−Ｃａ及びＣａｍ分析用の）Ｃａをそれ ぞれ含む試薬を添加し、Ｎａ、　Ｋ−ＡＴＰａｓｅのウェルを除くすべてのウェ ルにウアバイン（０，０１ｍＭ）を添加する。次いで膜サンプルを添加しく絶対 蛋白濃度０．００４５ｍｇ）　、プレートを３７℃で１５分間保温する。次にす べてのプレートにＡＴＰ　（３ｍＭ）を添加し、プレートを３７℃で１時間保温 する。２０μｌの５％ＳＤＳを添加することによって反応を停止させる。アルコ ルベート、酸性モリブデート及びＳＤＳの混合物（１３０ｍＬ）をプレートに添 加し、プレート・リーダーの８１Ｏｎｍにおいて顕色した青色を測定する。

ブランク＝ＡＴＰ、膜及びウアバインを収容するウェル Ｍｇ”＝ＡＴＰ、膜及びウアバインを収容するウェルＮａ、／に＝ＡＴＰ及び膜 を収容し、ウアバインを含まないウェル Ｃａ＝ＡＴＰ、膜及びウアバインを収容するウェルＣａｍ＝ＡＴＰ、膜及びカル モジュリンを収容するウェル 比活性： Ｍｇ　ＡＴＰａａｅ　＝Ｍｇ　−ＡＴＰ　（ブランク）／６０ｍｎ／ｍｇ Ｎａ／Ｋ　ＡＴＰａｓａ　＝Ｎａ、に−ＭｇＣａ　ＡＴＰａｓｅ　＝Ｃａ−Ｍｇ Ｃａｍ　ＡＴＰａｓｅ　＝Ｃａｍ−Ｍｇ本発明では精製過程においてマイクロＡ 　Ｔ　Ｐ　ａｓｃ分析を利用してＨＦＯ比活性（生物学的活性）をチェックし、 これをジゴキシン抗体分析（ＲＩ　Ａ）と比較した。これにより精製過程を通し てＨＦの活性をモニターし、ＨＦを不活性化するステップがないかどうかを検討 することができた。さらに、ＡＴＰａｓ！分析の結果をジゴキシン抗体分析と比 較することにより、前記結果が生物学的に活性のＨＦと関連することから、ＨＦ 測定のためのこの分析の精度を確認することができた。

以上に本発明を好ましい実施例に関連して説明したが、当業者ならば以上の説明 に基づいて上記方法及び組成物に種々の変更を加えることができるであろう。従 って、本発明に対して与えられる特許の範囲は請求の範囲及びその等価記載事項 によってのみ制限されるものである。

非力類２ 剣【ダトスペ７ト１し ｍシヒ七ｔｃｐ、２Ｆ・ ６η７り θ檜７・庭・ ６宅りＩｌ・ −３０−０／７７／；１７　ｙ−２４ｍｔ’ｎ　２６−４θ／７７／／７　４タ 一フ２ｍ１ｔｙベースライン具Ａｍ　Ｅ　ノーヒ　スハ　へ＾４ル七２θ・ ／’ＩＤｃＫ＋￥１ｉ１１１１とイブ＊Ｉ６　’Ｃｏ、”　５ｉａｈＦＵ　１ｂ ＨＦｔ）ｈ　！ｉ’θη坏〃・ ５ｔｑｃｔａｙｙｒ７ｈ　”ｃａ’　１＃１．９Ｊｒｆｔｈｔ＝ｎｌりＨＦり影 １♂ｆＦ：卯簡爬シＱデ〜、１．．凭−２“輸１７θ灼可うＨＦ−１９動盲３？ 膚肖相り乙（つ３σる２シ免−び−α２゛韓ｉＡｔ≦ねりＦＩＦ−２９累１〕 ６７釈３４７６ １］ θり杉敬ｊ７Ｆ。

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Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｒ１が少なくとも３つの二重結合を有するＣ１０乃至Ｃ２６不飽和アルキル またはアシルであり、Ｒ２が−ＯＨ、−Ｈ、−ＣＨ３またはＣ１０乃至Ｃ２６不 飽和アルキルエステルであり、 Ｒ３がＳまたはＰであり、 Ｒ４がＣ１乃至Ｃ６飽和アルキルであり、Ｒ５がＮＨ３またはアルキルアミンで あるとして、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる化合物。
2. ２．Ｒ１が、Ｃ１９（二重結合数４）アシル、Ｃ２０（二重結合数４）アルキル 、またはＣ２０（二重結合数４）アシルであり、Ｒ２が−ＯＨであり、Ｒ３がＰ であり、Ｒ４がＣＨ２またはＣＨ２ＣＨ２であり、Ｒ５がＮＨ３であることを特 徴とする請求項第１項に記載の化合物。
3. ３．動物の組織または体液から分離され、本態性高血圧症と関連性を有し、分子 量が約５２１乃至５４１の範囲にあり、紫外スペクトルにおいて約１８６ｎｍに 最大ピークを示す内部生成因子の生物学的活性を有する化合物。
4. ４．前記化合物が抗ジゴキシン抗体と錯体を形成できるか、または酵素Ｎａ，Ｋ −ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ，Ｍｇ−ＡＴＰａｓｅ、及びカルモジュリン活性化Ｃａ− ＡＴＰａｓｅの少なくとも１つを抑制できることをも特徴とする請求項第１項ま たは第３項に記載の化合物。
5. ５．前記化合物が血管収縮を惹起できることをも特徴とする請求項第１項または 第３項に記載の化合物。
6. ６．前記化合物がナトリウム排泄増加を惹起できることをも特徴とする請求項第 １項または第３項に記載の化合物。
7. ７．薬剤として有効な量の請求項第１項または第３項の化合物を投与することを 特徴とする動物における高血圧調整方法。
8. ８．請求項第１項、第３項、第５項または第６項の化合物と特異的に結合できる ことを特徴とする抗体。
9. ９．前記抗体がポリクローン抗体であることを特徴とする請求項第８項に記載の 抗体。
10. １０．前記抗体がモノクローン抗体であることを特徴とする請求項第８項に記載 の抗体。
11. １１．患者サンプルを請求項第１項または第３項の化合物と錯体を形成できる少 なくとも１つの抗体と接触させ、免疫分析により前記抗体の錯体形成を判定する ことを特徴とする患者サンプルにおける本態性高血圧症関連因子のインビトロ検 出方法。
12. １２．患者サンプルを請求項第１項または第３項に記載の化合物と錯体を形成で きる少なくとも１つの抗体と接触させ、本態性高血圧症関連因子と錯体を形成す る前記抗体の量を測定し、前記量を前記サンプル中に存在する前記因子の量と相 関させることを特徴とする本態性高血圧症関連因子量のインビトロ測定方法。
13. １３．患者サンプル及び請求項第１項または第３項に記載の化合物を、本態性高 血圧症関連因子及び前記化合物と錯体を形成できる酵素と接触させ、レセプター 分析により前記酵素の錯体形成を判定することを特徴とする本態性高血圧症関連 因子のインビトロ検出方法。
14. １４．患者サンプル及び請求項第１項または第３項に記載の化合物を、前記因子 及び前記化合物と錯体を形成できる酵素と接触させ、前記酵素と錯体を形成した 前記化合物の量を測定し、錯体を形成した前記化合物の量を前記サンプル中の前 記因子の量と相関させることを特徴とする本態性高血圧症関連因子量のインビト ロ測定方法。
15. １５．前記酵素をＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ，Ｍｇ−ＡＴＰａｓｅ及びカル モジュリン活性化Ｃａ−ＡＴＰａｓｅから選択することを特徴とする請求項第１ ３項または第１４項に記載の方法。
16. １６．前記化合物を検出可能なマーカーで標識することを特徴とする請求項第１ ３項または第１４項に記載の方法。
17. １７．請求項第１項または第３項に記載の化合物との間に特異的な反応性を有す るモノクローン抗体を薬剤として有効な量だけ投与することを特徴とする動物に おける高血圧調整方法。
18. １８．請求項第１項または第３項に記載の化合物と特異的に結合できる抗体を生 成させるハイブリドーマ細胞系。
19. １９．（ａ）アンモニウムイオンの存在においてアルカリ溶液でサンプルを抽出 し、 （ｂ）エーテル及びアセトン溶媒で抽出することを特徴とする患者の体液または 組織サンプルから高血圧症因子を分離する方法。
20. ２０．（ａ）患者サンプルからの抽出物であらかじめカラムをコンディショニン グし、 （ｂ）約１５〜２０：１５〜２５：５５〜７５混合比のメタノール：アセトニト リル：水溶媒系で高血圧症因子混合物を分離する ことを特徴とする高圧液体クロマトグラフィー利用の高血圧症因子分離方法。