JPH03501861A - 細胞間粘着分子およびその結合性リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 細胞間粘着分子およびその結合性リガンド関連出願に関する記述 本出願は米国特許出願第０７１０４５．９６３号＜１９８７年５月４日出願）、 第０７／　１１５．７９８号（１９８７年１１月２日出願）、第０７／１５５． ９４３号（１９８８年２月１６日出願）、第０７／１８９．８１５号（１９８８ 年５月３日出願）、第０７／２５０．４４６号（１９８８年９月２８日出願）お よび第０７／３２４．４８１号（１９８９年３月１６日出１ｊ）の一部継続出願 である。本出願は米国政府の支持下に一部なされた。米国政府は本発明においで ある種の権利を有する。

産業上の利用分野 本発明はリンパ球の群が細胞基質を認識しそれに付着して炎症反応中に炎症部位 に浸透し細胞と反応する過程で含まれる。Ｉ　ＣＡＭ−１のような細胞間粘着分 子に関する。本発明はさらにそのような細胞間粘着分子に結合し得るリガンド分 子、これらリガンドのスクリーニングアッセイ、および該細胞間粘着分子、該リ ガンド分子および該スクリーニングアッセイの使用に関する。

従来技術 白血球はホストをバクテリアまたはウィルスのような外敵に対して適切に防御す るために細胞基質に付着し得なければならない。

防御システムの優れた見解はＥｉｓｅｎ、　Ｉｆ、　１１．により“Ｍｉｃｒｏ −ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、ペンシルバニア州フィラデルフィア、１ｌａｒｐｅ 　＆Ｒｏｗｓ社刊、＜１９８０）　、２９０−２９５および３８１−４１８’に おいて提示されている。白血球は内皮細胞に結合できて循環系から進行中の炎症 部位に浸透できなければならない。さらにまた、白血球は抗原提供細胞に付着し て正常な特異的免疫応答が起り得ねばならず、さらに、リンパ球は、適当なター ゲット細胞に付着してウィルス感染または腫瘍細胞の分解が起り得ねばならない 。

最近、そのような付着の仲介において含まれる白血球表面分子がハイブリドーマ 技術を用いて同定された。要するに、ヒ）Ｔ−細胞（Ｄａｖｉｇｎｏｎ、　Ｄ、 等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．八ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７８：４５３５− ４５３９　（１９８１））とマウスひ脳細胞［’Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、等、 Ｂｕｒ、Ｊ、Ｉｍｗｕｎｏｌ、９　：３０１−３０６　（１９７９）　）に対し て向けられた各モノクローナル抗体は白血球表面に結合し、上述の付着関連機能 を抑制しているものと同定された［Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、等、ｐｅｄ、Ｐｒ ｏｃ、４４：　２６６０−２６６３　（１９８５））、これらの抗体により同定 された分子はＭａｃ−１およびリンパ球機能会合抗原１　（ＬＦＡ−１）と称さ れる。Ｍａｃ−１はマクロファージ、顧る。ＬＦＡ−１は大部分のリンパ球に見 い出されるヘテロダイマーである［Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、　Ａｏ等、１ｍｍ ｕｎｏ＋、　Ｒｅｖ、　６８　：　１１１−１３５　（１９８２））。これらの ２つの分子、および第３分子ｐ１５０・、９５　（これらはＭａｃ−１と同様な 組織分布を有する）は上記の白血球分子は糖たん白質の関連群の１員であること を見白質群は１つのアルファー鎮と１つのベータ鎮を有するヘテロダイマーから なっている。抗原の各々のアルファー鎮は互いに異なるけれども、ベータ鎖は高 度に保護されていることが判明してい１８０３　（１９８３＞）。糖たん白質群 のベータ鎮（ある場合には“ＣＤ１８”と称す）は９５ＫＯの分子量を有するこ とが見い出され、一方アルファー鎖は１５０ＫＯ−１８０に口で変化することが 見い出された［Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、等、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、４４　：　２ ６６０−２６６３　＜１９８５）］。膜たん白質のアルファーサブユニットはベ ータサブユニットの有する広い相同性を有していないけれども、糖たん白質のア ルファーサブユニットの近似分析は両者の間に実質的な類似性があることを示し ている。ＬＦＡ−１関連糖たん白質のアルファーおよびベータサブユニット間の 類似性の検討はＳａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ、　Ｆ、等によりなされている。

［Ｊ、　ＩＥｘｐｅｒ。

Ｍｅｄ、１５８　：　５８６−６０２　（１９８３）　；Ｊ、　ｆＥｘｐｅｒ、 　Ｍｅｄ。

１８５　：１７８５−１８０３　（１９８３））。

白血球表面上に上記粘着たん白質群のいずれかの１員の正常量を発現することが できない１群の人々が同定されている（　１９８５　）　；　Ａｎｄｅｒｓｏｎ 、　Ｄ、Ｃ０等、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１５２　：６６８−６８９ 　（１９８５））。これらの患者のリンパ球は分子のＬＦＡ−１群が抗体により 中和されている健常者に類似するインビボ欠陥を示していた。さらにまた、上記 の患者等は、彼らの−２６７７（１９８５）　：Ａｎｄｅｒｓｏｎ、ロ、　Ｃ０ 等、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、。

１５２：６６８−６８９　（１９８５））。これらのデータはリンパ球がＬＦＡ −１群の機能的粘着分子の欠如により正常な形で粘着できない場合に免疫反応が 緩和されることを示している。

即ち、要約すれば、動物の健康および生命力を維持するリンパ球の能力はリンパ 球が他の細胞（内皮細胞のような）に粘着できことを必要とする。この粘着はリ ンパ球の細胞表面上に存在する特異的レセプター分子を含む細胞−細胞接触を必 要とすることが判明している。これらのレセプターはリンパ球が他のリンパ球ま たは内皮および他の非血管細胞に粘着することを可能とする。細胞表面レセプタ ー分子は相互に高度に関連することが判明している。リンパ球が上記の細胞表面 レセプター分子を欠損しているヒトは慢性で再発性の感染症、および欠陥抗体応 答を含む他の臨床的症状を示す。

リンパ球粘着は外来組織が認識され拒絶される過程で起るので、この過程の理解 が臓器移植、組織移植、アレルギーおよび腫瘍学の分野において著しく価値があ る。

発明の内容 本発明は細胞間粘着分子−１（ＩｃＡＭ−１）およびその官能性誘導体に関する 。本発明はさらにＩＣＡＭ−１の機能を抑制し得る抗体および抗体フラグメント 、およびＩＣＡＭ−１機能に対する他のインヒビター、並びにそのようなインヒ ビターを同定し得るアッセイに関する。本発明はさらに上記分子すべての診断お よび治療上の用途に関する。

さらに詳細には、本発明は実質的に天然不純物を含まない細胞間粘着分子ＩＣＡ Ｍ−１またはその官能性誘導体を包含する。本発明はさらにリンパ球表面に存在 する分子に結合し得るそのような分子に関する。

本発明はさらに検出可能に標識した細胞間粘着分子ＩＣＡＭ−１およびその誘導 体に関する。

本発明はさらにＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体を発現し得る組換えＤＮＡ 分子を包含する。

本発明はまた次の各工程を含む実質的に純粋な形でＩＣＡＭ−１を回収する方法 を包含する： （ａ）　ＩＣＡＭ−１を発現する細胞膜からＩＣＡＭ−１を可溶化して、可溶化 ＩＣＡＭ−１調製物を調製すること、（ｂ）　上記可溶化ＩＣ，ＡＭ−１調製物 をＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体を含有するアフィニテイマトリックスに導入す ること、（Ｃ）　ＩｃＡＭ−１を上記アフイニテイマトリックスの抗体に結合さ せること、 （ｄ）　上記マ）　ＩＪフックスら抗体に結合し得ないすべての化合物を除去す ること、および （ｅ）　ＩｃＡＭ−１を上記マトリックスから溶出させることによりＩＣＡＭ− １を実質的に純粋な形で回収すること。

本発明はさらにＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群から 選ばれた分子に結合し得る抗体を包含する。本発明はまたそのような抗体を産生 じ得るハイブリドーマ細胞を包含する。

本発明はさらにモノクローナル抗体Ｒ，−５−Ｄ、を産生じ得るハイブリドーマ 細胞を包含する。

本発明は、さらに、次の工程を含む、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体を産生ずる 所望のハイブリドーマ細胞の産生方法も包含する。

（ａ）　動物をＩＣＡＭ−１を発現する細胞で免疫すること、（ｂ）　上記動物 のひ脳細胞をミエローマ細胞系と融合させること、（Ｃ）　融合させたひ臓およ びミエローマ細胞から抗体分泌性／％イブリドーマ細胞を調製すること、および （ｄ）、ハイブリドーマ細胞を所望のＩＣＡＭ−１結合性抗体を産生じ得るハイ ブリドーマ細胞にスクリーニングすること。

本発明はまた上記方法で取得したハイブリドーマ細胞およびそのハイブリドーマ 細胞から産生させた抗体も包含する。

本発明はまた細胞間粘着の非免疫グロブリンアンタゴニストの同定方法にも関し 、その方法は次の工程よりなる：（ａ）　細胞間粘着のアンタゴニストであり得 る非免疫グロブリン剤を凝集可能な複数の細胞を含有するリンパ球調製物とイン キュベートすること；および （ｂ）　上記リンパ球調製物を検査して上記非免疫グロブリン剤の存在がリンパ 球調製物の細胞凝集を抑制するかどうかを測定すること；凝集抑制が上記非免疫 グロブリン剤を細胞間粘着のアンタゴニストとして同定すること。

本発明はまた哺乳動物の特異的防御システムの応答に由来する炎症を治療する方 法にも関し、その方法はそのような治療の必要な対象物に上記炎症を抑制するの に十分な量の抗炎症剤を与えることを含み、かつこの抗炎症剤はＩ　ＣＡＭ−１ に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体のフラグメント、ＩＣＡＭ− １、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体、およびＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアン タゴニストからなる群より選ばれる。

本発明はさらにＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストがＬＦＡ−１以 外のＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストである上述の炎症治療方法 を包含する。

本発明はまた浸透にＬＦＡ−１群の官能性−員を必要とする造血腫瘍細胞の転移 を抑制する方法にも関し、この方法はそのような治療を必要とする患者に上記の 転移を抑制するのに十分な量の抗炎症剤を与えることを含み、かつこの抗炎症剤 はＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体のフラグメ ント、ＩｃＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体、およびＩＣＡＭ−１の非免 疫グロブリンアンタゴニストからなる群より選ばれる。

本発明はさらにＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストがＬＦＡ−１以 外のＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストである上記の造血腫瘍細胞 の転移を抑制する方法も包含する。

本発明はまたＩ　ＣＡＭ−１発現腫瘍細胞の成長を抑制する方法も包含し、その 方法はそのような治療を必要とする患者に上記成長を抑制するのに十分な量の毒 素を与えることを含み、この毒素はＩＣＡＭ−１に結合し得る毒素由来抗体、Ｉ ＣＡＭ−１に結合し得る毒素由来抗体フラグメント、ＬＦＡ−１群分子の毒素由 来１員、およびＬＦＡ−１群分子の１員の毒素由来官能性誘導体からなる群から 選ばれる。

本発明はまたＬＦＡ−１発現性腫瘍細胞の成長を抑制する方法にも関し、その方 法はそのような治療を必要とする患者にかかる成長を抑制するのに十分な量の毒 素を与えることを含み、この毒素は毒素由来ＩＣＡＭ−１およびＩ　ＣＡＭ−１ の毒素由来官能性誘導体からなる群から選ばれる。

本発明はさらに炎症を有する懸念のある哺乳動物対象体の特異的防御系の応答に 由来する炎症の存在および位置を診断する方法に関し、その方法は、 （ａ）　上記の対象体にＩ　ＣＡＭ−１を発現する細胞を同定し得る検出可能に ８ｉ識した結合性リガンドを含有する組成物を投与すること、および （ｂ）　上記結合性リガンドを検出すること、を含む。

本発明はさらに炎症を有する懸念のある哺乳動物対象体の特異的防御系の応答に 由来する炎症の存在および位置を診断する方法に関し、その方法は、 （ａ）　上記対象体の組織のサンプルをＩ　ＣＡＭ−１を発現する細胞を同定し 得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組成物とインキュベートする こと、および（ｂ）　上記結合性リガンドを検出すること、を含む。

本発明はまたＩ　ＣＡＭ−１発現性腫瘍細胞を有する懸念のある哺乳動物対象体 のそのような細胞の存在および位置を診断する。方法にも関し、その方法は、 （ａ）　上記対象体にＩＣＡＭ−１に結合し得る検出可能に標識した結合性リガ ンドを含有する組成物を投与すること、このリガンは抗体およびＩ　ＣＡＭ−１ に結合し得る抗体フラグメントからなる群より選ばれること、右よび （ハ）上記結合性リガンドを検出すること、を含む。

本発明はまたＩＣＡＭ−１発現性腫瘍細胞を有する懸念のある補乳軌物対象体の そのような細胞の存在および位置を診断する方法にも関し、その方法は、 （ａ）　上記対象体の組織のサンプルをＩＣＡＭ−１に結合し得る検出可能に標 識した結合性リガンドを含有する組成物とインキュベートすること、このリガン ドが抗体およびＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体フラグメントからなる群より選ば れること、および、（ハ）上記結合性リガンドを検出すること、を含む。

本発明はまたＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫瘍細胞を有する懸念のある対 象体のそのような細胞の存在および位置を診断する方法にも関し、その方法は、 （ａ）　上記対象体に１．ＦＡ−１群分子の１員に結合し得る検出可能に標識し た結合性リガンドを含有する組成物を投与すること、このリガンドはＩＣＡＭ− １およびＩＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群より選ばれること、および（ｂ ）　上記結合性リガンドを検出すること、を含む。

本発明はまたＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫瘍細胞を有する懸念のある対 象体のそのような細胞の存在および位置を診断する方法にも関し、その方法は、 （ａ）　上記対象体の組織のサンプルを分子のＬＦＡ−１群のｌ員に結合し得る 検出可能に標識した結合性リガンドに存在下にインキュベートすること、このリ ガンドはＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群より選ばれ ること、および（ロ）上記組織サンプル中に存在する分子のＬＦＡ−１群の１員 に結合している上記結合性リガンドを検出すること、を含む。

本発明は、さらに、 （ａ）　ＩｃＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体のフラ グメント、Ｉ　ＣＡＭ−１、Ｉ　ＣＡＭ−１の官能性フラグメント、およびＩＣ ＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストからなる群より選ばれた抗炎症剤、 および（ｂ）　デクサメセゾン、アザチオビリンおよびシクロスポリン八から選 ばれた少なくとも１つの免疫抑制剤。

を含む製薬組成物も包含する。

図面の簡単な説明 第１図は正常細胞とＬＦＡ−１欠損細胞間の粘着を図式的に示す。

第２図は正常細胞／正常細胞粘着過程を図式的に示す。

第３図は５０％ｇ／ｄのＰＭＡの不存在（Ｘ）または存在（０）下の細胞凝集の 動力学を示す。

第４図はＬＦＡ−１−細胞とＬＦＡ−１’細胞間の凝集を示す。

図中に示すようにカルボキシフルオレスセインジアセテート標識ＥＢＶ−形質転 換細胞（１０’）を１ＯＳ未標識同元細胞（黒枠）またはＪＹ細胞（白枠）とＰ ＭＡの存在下に混合した。１．５時間後、凝集物中または遊離の標識細胞を実施 例２の定量アッセイを用いて計数した。凝集物中の標識細胞の％を示す。２つの 内の１つの代表的な試験を示している。

第５図はＪＹ細胞からのＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の免疫沈降を示す。ＪＹ細胞 のトリトンＸ−１００溶解物（レーン１および２）または対照溶解バッファー（ レーン３および４）をＩｃＡＭ−１に結合し得る抗体（レーン１および３）また はＬＦＡ−１に結合し得る抗体（レーン２および４）で免疫沈降させた。パネル Ａは還元条件下での結果を示し、パネルＢは非還元条件下で得られた結果を示す 。分子ｊｌＪＭ準物はシーンＳに示した。

第６図はヒト皮ふ繊維芽細胞上のＩＣＡＭ−１発現に対してのＩＬ−１とガンマ −インターフェロンの効果の動力学を示す。ヒト皮ふ繊維芽細胞は８Ｘ１０’細 胞１０．３２ｃｎｆウエルの密度に増殖させた。ＩＬ−１（１０μ／ａｔ’、黒 丸）または組換えガンマ一時間で、４℃に冷却し間接結合アッセイを実施した。

標準偏差は１０％を越えなかった。

第７図はＩ　ＣＡＭ−１へのＩＬ−１とガンマ−インターフェロン効果の濃度依 存性を示す。ヒト皮ふ繊維芽細胞は８Ｘ１０’細胞１０．３２ｃｊウエルの密度 に増殖させた。ＩＬ−２（白丸）、組換えヒ）ＬＬ−１＜白四角）、組換マウス ＩＬ−１＜黒画角）および組換えベータインターフェロン（白三角）を図中に示 した希釈率で４時間（ＩＬ−１）または１６時間（ベータおよびガンマ−インタ ーフェロン）インキュベートした。示した結果は４回測定の平均を示し、標準偏 差は１０％を越えなかった。

第８図はＩ　ＣＡＭ−１ｃＤＮＡのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。第 １ＡＴＧは位置５８にある。ＩＣＡＭ−１）ＩＪプシンペプチドに相当する翻訳 配列はアンダーラインを施しである。

疎水性推定シグナルペプチドおよびトランスメンプラン配列は肉太アンダーライ ンを施している。Ｎ−結合グリコシル化部位は囲っている。位Ｗ２９７６のボリ アデニリル化シグナルＡＡＴＡＡＡはオーバーラインを施している。図示した配 列はｌ−Ｉ　Ｌ　−Ｇ　ＯｃＤＮ八クワクローン用る。内皮細胞ｃＤＮＡはその 長さの大部分に亘ってシーケンシングし小さな差異のみを示した。

第９図はＩＣＡＭ−１相同ドメインおよび免疫グロブリン超遺伝子群への相関を 示す。（Ａ）５つの相同ドメインの配列（Ｉ］、Ｓ）：列んだ２以上の同じ残基 は囲っている。ＮＣＡＭドメインに２回以上含まれる残基、およびセットＣ３お よびＣ１のドメイン中に含まれる残基はＩＣＡＭ−１内部繰返しによって配列し ている。

Ｉ　ＣＡＭ−１のドメイン中の予想βストライドの位置は棒線および配列上の小 文字でマークしており、また免疫グロブリンＣドメイン中のβ−ストランドの公 知の位置は棒線および配列下の大文字でマークしている。Ｉ　ＣＡＭ−１ドメイ ン内の推定ジスルフィド架橋の位置はＳ−８によって記している。ＩＣＡＭ−１ に相同性のたん白質ドメインの（Ｂ−Ｄ）配列：各たん白質はＦＡＳＴＰプログ ラムを用いてＮＢＲＦデータベースを調査することによって先ず配列する。各た ん白質配列はＭＡＧ％ＮＣＡＮ、Ｔ細胞レセ−糖たん白質である。

第１０図はＩＣＡＭ−１とＭＡＧの二次構造の比較図である。

第１１図は平坦膜中でＩＣＡＭ−１に結合しているＬＦＡ−１陽性ＥＢＶ−形質 転倹Ｂ−リンパ芽球腫（Ｉｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞を示す。

第１２図はプラスチック結合ベシクル中のＩ　ＣＡＭ−１に結合しているＬＦＡ −１陽性Ｔ−ＩＪンバ芽球およびＴ−ＩＪンバ球を示す。

第１３図はプラスチック結合ベシクル中のＩ　ＣＡＭ−１に結合しているＪＹ　 Ｂ−リンパ芽球腫の細胞またはベシクルのモノクローナル抗体による前処理によ る結合抑ｉ１ｉ＋１を示す。

第１４図はプラスチック結合ベシクル中のＩＣＡＭ−１へのＴ−リンパ芽球の結 合に対しての温度の効果を示す。

第１５図はプラスチック結合ベシクル中のＩＣＡＭ−１へのＴ−リンパ芽球の結 合における二価のカチオンの必要性を示す。

第１６図は末梢血液単核細胞がＴ−細胞会合抗原０ＫＴ３の認識に応答して増殖 する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す。

“０ＫＴ３”は抗原の添加を示す。

第１７図は、末梢血液単核細胞が、非特異的Ｔ−細胞分裂促進物質である、コン カナバリンへの認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す 。“Ｃ０ＮＡ”はコンカナバリンへの添加を示す。

第１８図は、末梢血液単核細胞が、鍵穴カサガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ 　ｌｉａ＋ｐｅｔ　ｈｅａ＋ｏｃｙａｎｉｎ）抗原の認識に応答して増殖する能 力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す。“Ｋ　Ｌｌ−１”は、鍵穴カサガイヘモ シアニンの、細胞への添加を示している。

第１９図は末梢血液単核細胞が、破傷風菌トキソイド抗原の認識に応答して増殖 する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す。

”ＡＧＮ”は破傷風菌トキソイド抗原の、細胞への添加を示す。

第２０図はＩＣＡＭ−１欠落変異体へのモノクローナル抗体ＲＲ１／１、Ｒ６， ５、ＬＢ２、およびＣＬ２０３の結合を示す。

第２１図はＩＣＡＭ−１欠落変異体のＬＦＡ−１への結合を示す。

第２２図は抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲ１／１、Ｒ６，５、ＬＢ２ 、およびＣＬ２０３により認識したエピトープを示す。

第２３図はＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１ドメイン２変異体の結合能力を示す。

第２４図はＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１ドメイン３変異体の結合能力を示す。

第２５図はＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１ドメイン１変異体の結合能力を示す。

第２６図はＩＣＡＭアミノ末端ドメインの配列を示す。

好ましい実施態様 本発明の１つの局面はＬＦＡ−１に対しての天然結合性リガンドの発見に関する 。ＬＦＡ−１群分子のような分子は、細胞間粘着の過程に含まれており、“粘着 分子”と称されている。

本発明の天然結合性リガンドは“細胞間粘着分子−１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌ ａｒ　Ａｄｂｅｓｉｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ−１）″または“ＩＣＡＭ−１″と 表示される。ＩＣＡＭ−１は７６−９７ｋｄの糖たん白質である。

ＩＣＡＭ−１はヘテロダイマーではない。本発明はＩ　ＣＡＭ−１およびその“ 官能性誘導体”に関する。ＩｃＡＭ−１の１官能性誘導体”はＩ　ＣＡＭ−１の 生物学的活性に実質的に同様な生物学的活性（機能的または構造的に）を有する 化合物である。“官能性誘導体”なる用語は分子の“フラグメント、“変異体” 、゛同族体”または“化学誘導体”を包含するものとする。ＩＣＡＭ−１のよう な分子の“フラグメント′は分子の任意のポリペプチドサブセットを意味する。

ＩＣＡＭ−１活性を有しかつ可溶性（即ち、膜結合していない）であるｌ　ＣＡ Ｍ−１のフラグメントは特に好ましい。ＩＣＡＭ−１のような分子の“変異体” とは全分子またはそのフラグメントと構造上または機能上実質的に同様である分 子を称する。分子は他の分子と両分子が実質的に同様な構造を有するかあるいは 両分子が同様に生物学的活性を有する場合に“実質的に同様”と称される。即ち 、２つの分子が同様な活性を有する場合、これらの分子は変異体であるとみなさ れ、該用語は本明細書において分子の１つの構造が他の分子中に見い出されない 場合あるいはアミノ酸残基配列が同じでない場合でも使用される。ＩＣＡＭ−１ のような分子の“アナログ、つまり１同族体２とは分子全体またはそのフラグメ ントに対し機能上実質的に同様である分子を称する。本明細書で使用するとき、 分子が通常分子の１部でない追加の化学的成分を含む場合、その分子は他の分子 の“化学的誘導体”であると称する。そのような成分は分子の溶解性、吸収性、 生物学的半減期等を改善し得る。これらの成分はまた分子の毒性を低減させ、分 子の望ましくない副作用等を消去または減衰させる。そのような作用を緩和させ 得る成分は“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｏ＋ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ　（１９８０）″に記載されている。°毒素由来”分子は“化学誘 導体”の特別のクラスを構成している。°毒素由来”分子は毒素成分を有する分 子（Ｉ　ＣＡＭ−１または抗体のような）である。そのような分子の細胞への結 合は細胞の極く近くに毒素成分を運びそれによって細胞死を促進する。任意の適 当な毒素成分を使用できるが、例えば、リシン毒素、ジフテリア毒素、ラジオア イソトープ毒素、膜−チャンネル形成性毒素等の毒素を用いることが好ましい。

そのような成分全分子に結合させる方法は当該技術において周知である。

ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子のｌ員のような抗原性分子はリンパ球表面 に天然に発現している。即ち、そのような細胞の適当な動物への腹腔内注射等に よるような導入はＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子のｌ員に結合し得る抗体 の産生をもたらすであろう。場合によっては、そのような動物の血清を取り出し これら分子に結合し得るポリクローナル抗体の原料として使用することもできる 。しかしながら、好ましいのはそのような動物からひ臓球（ｓｐｌｅｎｏ　ｃｙ ｔｅｓ）を取り出し、かかるひ臓細胞をミエローマ細胞系と融合させ、得られた 融合細胞からＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得るモノクロ ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を確立することである。

上記の方法で得たハイブリドーマ細胞はＩ　ＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子 の一員のいずれかに結合し得る抗体を産生ずる所望のハイブリドーマ細胞を同定 する種々の方法によってスクリーニングできる。１つの好ましいスクリーニング アッセイにおいては、そのような分子はそのニブスティン−パールウィルス形質 転換細胞の凝集を抑制する能力によって同定される。そのような凝集を抑制し得 る抗体をさらにスクリーニングしてこれらの抗体がそのような凝集をｌｃＡＭ− ｘまたはＬＦＡ−１群分子の一員への結合によって抑制したかどうかを決定する 。ＩＣＡＭ−１をＬＦＡ−１群分子から区別できる任意の手段をそのようなスク リーニングに用いることができる。例えば、抗体と結合した抗原は免疫沈降およ びポリアクリルアミドゲル電気泳動によるようにして分析できる。結合抗原がＬ ＦＡ−１群の分子の一員である場合には、免疫沈降した抗原がダイマーとして見 い出されるであろうし、一方、結合抗原がＩ　ＣＡＭ−１である場合には、単− 分子量種が免疫沈降して来るであろう。また、ＬＦＡ−Ｉ！分子の１員に結合す る抗体はＩＣＡＭ−１に結合する抗体からＬＦＡ−１を発現するがＩ　ＣＡＭ− １は発現しない顆粒球のような細胞に結合する抗体の能力をスクリーニングする ことによっても区別できる。

顆粒球に結合する抗体（細胞凝集を抑制することが知られている）の能力はその 抗体がＬＦＡ−１に結合し得ることを示す。そのような結合のない場合はＩ　Ｃ ＡＭ−１をＭＥ　ａし得る抗体を示唆し得る。顆粒球のような細胞に結合する抗 体の能力は通常の熟練者に法にはイムノアッセイ、細胞凝集、フィルター結合試 験、抗体沈降等がある。

本発明の抗凝集抗体はまたそのＩ　ＣＡＭ−１を発現する細胞（活性化内皮細胞 のような）に特異的に結合する能力およびそのＩＣＡＭ−１を発現しない細胞に 結合し得ない能力を測定することによっても同定し得る。当業者によって容易に 理解されるように、上記の各アッセイは修正して即ち、異なる順序で行って種々 の可能性あるスクリーニングアッセイを擾供でき、これらアッセイの各々はＩ　 ＣＡＭ−１に結合し得る抗体とＬＦＡ−１群分子の１員との間で同定および区別 化を行い得るものである。

本発明の抗炎症剤は、天然方法（例えば、動物、植物、真菌、ドクテリア等をＩ 　ＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストを産生ずるよう誘導することに よっであるいは動物をＩＣＡＭ−１に結合し得るポリクローナル抗体を産生ずる よう誘導することによるような）により、合成方法〔例えば、ポリペプチド合成 用のメリフィールド法を用いてＩＣＡＭ−１、Ｉ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体ま たはＩ　ＣＡＭ−１のたん白質アンタゴニスト（免疫グロブリンまたは非免疫グ ロブリンのいずれか）を合成することによるような）により、ハイブリドーマ技 術（例えば、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を産生させるような ）により、また組換え技術（例えば、本発明の抗炎症剤を種々の宿主（例えば、 酵母、バクテリア、真菌、培養動物細胞等）中で、あるいは組換えベクターまた はウィルスベクターから産生させるような〕により得ることができる。用いる方 法の選択は便宜さ、所望の収率等のファクターによる。上記の方法、手法または 技術の１つのみを用いて特定の抗炎症剤を産生させる必要はなく、上記の方法、 手法および技術は組合せて特定の抗炎症剤を得てもよい。

Ａ、ＬＦＡ−，１結合性パートナー＜ＩＣＡＭ−１）の同定１、ＬＦＡ−１依存 凝集のアッセイ 多くのエプスタイン−バーウィルス形質転換細胞は凝集を示す。この凝集はホル ボールエステルの存在下で促進できる。そのような同型（ｈｏｍｏＬｙｐｉｃ） の凝集（即ち、１種のみの細胞種を含む凝集）は抗ＬＦＡ−１抗体によってブロ ックされることが見い出された〔“ＲｏＬｈｌｅｉｎ、　Ｒｏ等、Ｊ、　Ｅｘｐ ｅｒ、　Ｍｅｄ、　１６３　：１１３２−１１４９　（１９８６）″、該文献は 参考として本明細書に引用する〕。即ち、ＬＦＡ−１依存性結合の度合は自発性 またはホルボールエステル依存性凝集形成の度合を評価することによって決定で きる。

ＬＦＡ−１依存性凝集を干渉する試剤は該試剤がエプスタイン−パールウィルス 形質転換細胞の自発またはホルボールエステル依存のいずれの凝集を抑制するか どうかを測定し得るアッセイを用いることによって同定できる。殆んどのエプス タイン−パールウィルス形質転換細胞はこれら細胞がＬＦＡ−ルセブター分子を 発現し得る限りそのようなアッセイに用い得る。

ソノような細胞は”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、Ａ、等、Ｊ、ＥｘｐｅｒｏＭｅｄ 、１６０：１９０１−１９１８　（１９８４）”の方法によって調製できる。

該文献は参考として本明細書に引用する。任意のそのような細胞を本発明のＬＦ Ａ−１依存性績合アッセイにおいて使用できるけれども、好ましいのはＪＹ細胞 系の細胞を使用することである（Ｔｅｒｈｏｓｔ、　Ｃ，Ｔ、等、Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＩＩｓ＾、７３：９１０　（１，９７６）） 。これらの細胞は任意の適当な培養培地で培−できるが、最も好ましいのは１０ ％ウシウシ血清および５０μｇ／−のゲンタマイシン（ギブコラボ」トリーズ社 、ニコーヨーク）を加えたＲＭＰ１１６４０培地中で細胞を培養することである 。これらの細胞は動物細胞増殖に適する条件（即ち、一般に３７℃の温度で、５ ％ＣＯ３の雰囲気中で、９５％の相対湿度にてなど）、下で培養すべきである。

２、ＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１の結合リンパ球がＬＦＡ−ルセプター分子の群 を欠損するヒト個うな人は白血球粘着欠損症（ＬＡＤ）をこうむると云われてい る。そのような人のＥＢＶ形質転換細胞は上述の凝集アッセイにおいて自発また はホルボールエステル存在下のいずれにおいても凝集しない。そのような細胞を ＬＦＡ−１発現性細胞と混の存在下でインキュベートした場合には形成されなか ったことである。即ち、凝集はＬＦＡ−１を必要としたが、ＬＦＡ−１欠損細胞 のＬＦＡ−１含有細胞に、よる凝集形成能力はＬＦＡ−１結合ノゞ−トナーはＬ ＦＡ−１ではなくむしろ従来未発見の細胞間粘着分子であったことを示唆してい た。第１図は細胞間粘着のメカニズムを示す。

Ｂ、細胞間粘着分子−１（ｉｃＡＭ−１＞新規な細胞間粘着分子ＩＣＡＭ−１は “Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等の手順［Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１３７　：１２７ ０−１２７４　（１９８６）　、該文献は参考として本明細書に引用する〕によ って最初同定された部分的に特徴付された。Ｉ　ＣＡＭ−１分子を検出するため に、モノクローナル抗体をＬＦＡ−１発現が遺伝的に欠損しているヒトの細胞で 免疫したマウスのひ臓細胞から調製した。得られた抗体をそのＬＦＡ−１発現細 胞の凝集を抑制する能力についてスクリーニングしたく第２図）。詳細には、Ｉ ＣＡＭ−１分子マウスをＬＦＡ−１抗原を発現しないＬＡＤ患者からのＥＢＶ形 質転換Ｂ細胞で免疫した。これら動物からのひ臓細胞を取り出し、ミエローマ細 胞と融合させてモノクローナル抗体産生性ハイブリドーマ細胞になるようにした 。次に、ＬＦＡ−１を発現する正常人からのＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を上記ハイブ リドーマ細胞のモノクローナル抗体の存在下でインキュベートしてＥＢＶ形質転 換Ｂ細胞のホルボールエステル媒介、ＬＦＡ−１依存、自発性凝集を抑制し得る 任意のモノクローナル抗体を同定した。上記のハイブリドーマ細胞はＬＦＡ−１ 抗原を全く含まない細胞から誘導したので、ＬＦＡ−１に対するモノクローナル 抗体は産生されなかった。従って、凝集を抑制することが判った抗体はいずれも 、ＬＦＡ−１ではないけれどもＬＦＡ−１粘着過程にかかわっていた抗原に結合 し得るものでなければならない。そのようなモノクローナル抗体を取得する方法 は任意の方法を使用できるけれども、好ましいのはＢＡＬＢ／ＣマウスをＲｏｔ ｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等（Ｊ、　１ｍｍｕｎｏｌ、　１３７：１２７０−１２７４ 　（１９８６））により開示された経路およびスケジュールを用いてＬＦＡ−１ 欠損者からのエプスタイン−パールウィルス形質転換末梢血単核細胞でもって免 疫することによってＩＣＡＭ−１結合性モノクローナル抗体を得ることである。

そのような細胞はＳｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、＾０等により開示されている［Ｊ。

Ｅｘｐｅｒ、Ｍｅｄ、１６０：１９０１−１９１８　（１９８４）　〕。

Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体の産生および検出のための好まくはＩＣＡＭ− １を発現するがＬＦＡ−１を発現しないＴＮＦ活性化内皮細胞により免疫する。

抗ＩＣＡＭ−１抗体を産生するハイブリドーマ細胞を調製する最も好ましい方法 においては、Ｂａｊ７ｂ／ＣマウスをＪＹ細胞および特異化Ｕ９３７細胞（ＡＴ ＣＣＣＲＬ−１５９３）により順次免疫する。そのような動物からのひ臓細胞を 取り出しミニロール細胞と融合させ抗体を産生性ハイブリドーマ細胞に発展させ る。得られた抗体をそのＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の両方を発現するＪＹ細 胞のようなＥＢＶ形質転換細胞系のＬＦＡ−１依存、ホルボールエステル誘起凝 集を抑制する能力についてスクリーニングする。Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等（ Ｊ。

１ｍｍｕｎｏ１．１３７：　１２７０−１２７４　（１９８７））により開示さ れているように、そのような凝集を抑制し得る抗体をＳ　Ｋ　Ｗ　５（Ｄｕｓｔ ｉｎ、　１４．等、Ｊ、Ｅｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ、’　１６５　：　６７２−６９ ２　（１９８７）、そのホルボールエステルの存在下で自発的に凝集する能力は ＬＦＡ−１に結合し得る抗体によっては抑制されるが抗ＩＣＡＭ−１抗体によっ ては抑制されない〕のような細胞系のホルボールエステル誘起凝集を抑制する能 力について試験する。ＪＹ細胞のような細胞のホルボールエステル誘起凝集を抑 制し得るがＳＫＷ、のような細胞のホルボールエステル誘起凝集を抑制し得ない 抗体は恐らく抗ＩＣＡＭ−１抗体である。また、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体 は、ＬＦＡ発現性細胞（ＪＹ細胞のような）のＬＦＡ−１依存性凝集を抑制し得 るがＬＦＡ−１を発現するがＩＣＡＭ−１を殆んどまたは全く発現しない細胞（ 正常顆粒球のような）に結合し得ない抗体あるいはＩＣＡＭ−１を発現するがＬ ＦＡ−１を発現しない細胞（ＴＮＦ活性化内皮細胞のような）に結合し得る抗体 のスクリーニングによっても同定し得る。別の方法は、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ− ’１または両方を発現する細胞から、ＪＹ細胞のような細胞のＬＦＡ−１依存性 凝集を抑制する抗体を用いて免疫沈降させ、５ＤＳ−１”’ＡＧＥあるいは等価 の方法により抗体により沈降した分子のいくつかの分子特性を測定することであ る。その特性力月ＣＡＭ−１の特性と同じであるならば、その抗体は抗ＩＣＡＭ −１−抗体であるとみなし得る。

上述の方法で調製したモノクローナル抗体を用いて、ＩＣＡＭ−１細胞表面分子 を精製し特性付した。ＩＣＡＭ−１はヒト細胞または組織からモノクローナル抗 体アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。そのような方法におい ては、ＩＣＡＭ＝１と反応性のモノクローナル抗体を不活性カラムマトリックス に結合させる。そのような結合を行う任意の方法を使用できるが、好ましいのは ”０ｅｔｔｈｅｎ、　Ｉｆ、Ｃ，等、Ｊ、　［１ｉｏ１．　Ｃｈｅ＋＋＋、　２ ５９　：　１２０３４（１９８４）”の方法を用いることである。細胞溶解物を 上記マトリックスに通したとき、存在するＩ　ＣＡＭ−１分子はマトリックスに 吸着され保持される。カラムのｐｌ＋またはイオン濃度を変える。任意の適当な マトリックスを使用できるけれども、好ましいのはマトリックス材料としてセフ ァローズ（ファルマシア）を用いることである。カラムマトリックスの作製およ びそのたん白質精製での使用は当該技術において周知である。

当業者によって理解された方法において、上述のアッセイ法を用いて細胞粘着の 速度または程度を減衰しあるいは抑制り得る化合物を同定することができる。

ＩＣＡＭ−１は血管内皮細胞、胸腺上皮細胞、ある種の他の上皮細胞、および繊 維芽球のような非造血細胞上並びに組織マクロＢ細胞および樹枝状細胞、リンパ 節、およびバイエル板のような造血細胞上に発現した細胞表面糖たん白質である 。Ｉ　ＣＡＭ−１はリンパ節および反応性増殖を示すへん桃腺内のＴ細胞領域の 血管内皮細胞状に高度に発現される。ＩＣＡＭ−１は末梢血リンパ球上に少量発 現される。ある骨ずい単球細胞系のホルボールエステル刺激特異化はＩＣＡＭ− １発現を大きく増大させる。即ち、ＩＣＡＭ−１は炎症部位に優先的に発現され 静止状態の細胞には一般に発現されない。皮ふ繊維芽球上のＩ　ＣＡＭ−１発現 は１０μ／ｄのレベルのインターロイキン１またはガンマ−インターフェロンに よりそれぞれ４時間または１０時間以上で３倍〜５倍増大する。その誘発はたん 白質およびｍＲＮ八合へに依存し可逆的である。

ＩＣＡＭ−１は繊維芽球上での９７Ｋｄ、骨ずい単球細胞系上での１１４Ｋｄ、 およびＢ　ＩＪンバ芽球細胞ＪＹ上での９０にｄの分子量を有する異なる細胞腫 での分子量異種抗原性を示す。ＩＣＡＭ−１生合成は約７３Ｋｄの細胞間プレカ ーサーを含むことが判っている。ツニカマイシン処理（グリコジル化を抑制）か ら得られる非−Ｎ−グリコジル化形は分子量５５にｄを有する。

、　ホルボールエステル刺激Ｕ９３７細胞からあるいは繊維芽球細胞から単離し たＩ　ＣＡＭ−１は化学説グリコジル化後６０Ｋｄの分子量を有する同一の主要 生成物を与える。Ｉ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗体はフィトヘマグルチニン芽 球のＬＦＡ−１欠損細胞系への粘着を干渉する。繊維芽球（リンパ球でない）の Ｉ　ＣＡＭ−１に結合したモノクローナル抗体による前処理はリンパ球−繊維芽 球粘着を抑制する。リンパ球のＬＦＡ−１に対する抗体による前処理（繊維芽球 は行なわない）もリンパ球−繊維芽球粘着を抑制することが見い出されている。

従って、ＩＣＡＭ−１は白血球上のＣＤ１８複合体の結合性リガンドである。Ｉ 　ＣＡＭ−１はＩＬ−１、ガンマ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子のよう な炎症メゾイータ−によりインビトロで繊維芽球および内皮細胞上にインビボで の炎症領域中へのリンパ球の浸潤と時間枠的に一致して誘起可能である（Ｄｕｓ Ｌｉｎ。

Ｍ、Ｌ、等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７　：　２４５−２５４、＜１９８６） ：Ｐｒｏｂｅｒ、　Ｊ、　Ｓ、等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：１８９３−１ ８９６、（１９８６））。さらに、ＩＣＡＭ−１は血管内皮細胞、胸腺上皮細胞 、他の上皮細胞および繊維芽球のような非造血細胞上にまた組織マクロファージ 、マイトジェン刺ｆｆ１Ｔリンパ芽球、へん桃腺内の胚中心Ｂ細胞および樹枝状 細胞、リンパ節およびバイエル板のような造血細胞上にも発現される（ＤｕｓＬ ｉｎ、　Ｍ、　Ｌ、等、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７　：　２４５−２５４、（１９８６））。ＩＣＡＭ− １はアレルギー性湿疹、偏平苔節、発疹、じんま疹および水痘性疾患のような良 性炎症のケラナノサイト上にも発現される。アレルギー性である患者の皮ふへの ハブテンの適用により誘発させたアレルギー性成ふ反応もケラチノサイト」二に 多量のＩ　ＣＡＭ−１発現を生じた。これに対して、皮ふ上の有毒バッチはケラ ナノサイト上にＩＣＡＭ−１発現を生じなかった。ＩＣＡＭ−１は種々の皮ふ学 士の不整からの皮ふ傷害の生検からのケラナノサイト上に存在し、Ｉ　ＣＡＭ− １発現はアレルギーバッチ試験からの傷害において誘発されたが、毒性バッチ試 験傷害からのケラチノサイトはＩＣＡＭ−１を発現しなかった。

Ｉ　ＣＡＭ−１は、従って、リンパ球が付着できる細胞基質であり、その結果、 リンパ球は炎症部位に浸透し得および／またはこの炎症に貢献する各種のエフェ クター機能を伝達し得る。そのような機能には抗体の産生、ウィルス感染ターゲ ット細胞の溶解等がある。本明細書で使用する“炎症”なる用語は特異的または 非特異的防御系の反応を含むことを意味する。“特異的防御系”なる用語は特異 的抗原の存在と反応する免疫系の成分を称するものとする。炎症は、特異的防御 系の反応によって引き起され、媒介されあるいはそれに伴う場合には、特異的防 御系の応答に由来するものといわれている。特異的防御系の応答に由来する炎症 の例には風疹ウィルス、自己免疫疾患、Ｔ細胞によって仲介された遅延型過敏症 （例えば、ＭａｎＬａｕｘ試験で“陽性”となる患者におけるような）、乾節等 がある。

゛非特異的防御系反応”は免疫記憶のできない白血球により媒介される応答であ る。そのような細胞には顆粒球およびマクロファージがある。本明細書で使用す るとき、炎症は、その炎症が非特異的防御系の反応によって引き起され、仲介さ れあるいはその反応に伴う場合には、非特異的防御系の応答に由来するものとい われる。少なくとも１部が非特異的防御系に由来する炎症の例には、喘息、成人 呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または敗血症もしくは外傷の副次的な重複器官損症 群、心筋または他の組織の再潅流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）損傷、急性糸球体 腎炎、反応性関節炎、急性炎症成分による皮ふ炎、急性化膿性髄膜炎または他の 中枢神経系炎症疾患、熱傷、血液透析、ロイカフニレシス（Ｉｅｕｋａｐｌ＋ｅ ｒｅｓｉｓ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、壊死性全腸炎、顆粒球輸血関連症候 群、およびサイトカイン誘起毒性のような状態に伴う炎症がある。

本発明によれば、ＩＣＡＭ、１官能性誘導体、特に、ドメイン１．２および３を 有するＩＣＡＭ−１のフラグメントまたは突然変異体を含むような誘導体を上記 のような非特異的防御系反応の処置または治療において使用できる。そのような 処置または治療においてより好ましいのはＩＣＡＭ−１のドメイン２を含有する ＩＣＡＭ−１７ラグメントまたは突然変異体である。そのような処置または治療 において最も好ましいのはＩ　ＣＡＭ−１のドメイン１を含有するＩＣＡＭ−１ フラグメントまたは突然変異体である。さらに、本発明は喘息の治療におけるＩ 　ＣＡＭ−１およびその官能性誘導体の使用も意図する。

Ｃ，ＩＣＡＭ−１遺伝子のクローニング任意の多くの方法を用いてＩＣＡＭ−１ 遺伝子をクローニングできる。そのような方法の１つはＩ　ＣＡＭ−１遺伝子を 含有する挿入物の存在についてｃＤＮＡ挿入物のシャトルベクターライブラリー （ＩＣＡＭ発現性細胞由来の）を分析することである。そのような分析は細胞を 上記ベクターで移入し次いでＩ　ＣＡＭ−１発現についてアッセイすることによ って実施できる。この遺伝子をクローニングする好ましい方法はＩＣＡＭ−１分 子のアミノ酸配列を決定することが含まれる。これを行うには、Ｉ　ＣＡＭ−ま たん白質を精製して自動化シークエネーターにより分析できる。

また、分子は臭化シアンによりあるいはパパイン、キモトリプシンまたはトリプ シンのようなプロテアーゼによるようにして分解できる（Ｄｉｋｅ、　Ｙ、等、 Ｊ、１３ｉｏ１．　Ｃｈｅａｐ、　２５７　：　９７５１−９７５８（１９８２ ）　：　Ｌｉｕ、　Ｃ０等、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒ ｅｓ、　２１　：２０９−２１５　（１９８３））。ＩＣＡＭ−１の全アミノ酸 配列を決定できるけれども、好ましいのは分子のペプチドフラグメントの配列を 決定することである。ペプチドが１０ケのアミノ酸より長い場合、その配列情報 は一般にＩＣＡＭ−１の遺伝子のような遺伝子をクローニングするのに十分であ る。

ペプチド中のアミノ酸残基の配列は、普通用いられている３文字表示または１文 字表示を用いて本明細書においても表示する。

のような教科書において見い出される。そのような配列を縦に書くときには、ア ミノ末端基は列の頂部にあるようにし、カルボキシ末端基は列の底部にあるよう にする。同様に、横方向に書くときには、アミノ末端は左にあるようにし、カル ボキシ末端は右末端にあるようにする。ペプチド中のアミノ酸残基はハイホンに よって分離できる。そのようなハイホンは単に配列の存在を容易にすることを意 図しているだけである。単なる例示としては、−Ｇｌｌｙ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｐ ｈｅ　−と表示したアミノ酸配列はＡＡａ残基がｃ＋ｙのカルボキシ基に結合し ていることおよびＳｅｒ残基がＡ１ａ残基のカルボキシ基およびＰｈｅ残基のア ミノ基に結合していることを示している。この表示はさらにアミノ酸配列がテト ラペプチドＧ　１　ｙ　−Ａ　１　ａ　７Ｓｅｒ　−Ｐｈｅを含有していること も示している。この表示はミノ酸配列をこの１つのテトラペプチドに限定するも のではなく、（１）アミノまたはカルボキシに結合した１種以上のアミノ酸残基 を有するテトラペプチド、（２）アミノおよびカルボキシ末端の両方に結合した １種以上のアミノ酸残基を有するテトラペプチド、（３）追加のアミノ酸残基を 有していないテトラペプチドを包含するものとする。

１種以上の適当なペプチドフラグメントがシーケンシングされると、これらをコ ードし得るＤＮＡ配列を検査する。遺伝子コードは縮重するので、１種以上のコ ドンを用いて特定のアミノ酸をコードできる［１ｌｌａｔｓｏｎ、　Ｊ、　Ｄ、 、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ口ｉｏｌｏｇｙ　ｏｒ　ｔｂｅ　Ｇｅｎｅ。

第３版、Ｗ、Ａ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ社、カルホルニアメンローハーク、（１９７ ７）、ｐｐ３５６−３５７］。ペプチドフラグメントを分析して最低度の縮重性 を有するオリゴヌクレオチドによってコードされ得るアミノ酸配列を同定する。

これは好ましくは単一コドンのみによってコードされているアミノ酸を含有する 配列を同定することによって行う。場合によっては、そのようなアミノ酸配列は 単一オリゴヌクレオチドのみによってコードされ得るけれども、多くの場合、そ のアミノ酸配列は任意の１セツト（組）の同様なオリゴヌクレオチドによってコ ードされ得る。重要なのは、上記セットのすべてのメンバーがそのペプチドフラ グメントをコードし得るオリゴヌクレオチドを含有し、かくしてそのペプチドフ ラグメントをコードする遺伝子として同じヌクレオチド配列を潜在的に含むのに 対し、上記のセットの１メンバーのみはこの遺伝子のヌクレオチド配列と同一の ヌクレオチド配列を含むことである。このメンバーは上記のセット内に存在し、 上記セットの他のメンバーの存在においてさえもＤＮＡにハイブリッドし得るの で、単一オリゴヌクレオチドを用いて上記ペプチドをコードする遺伝子をクロー ニングするのと同じ方法で分解していないオリゴヌクレオチドセットを用いるこ とができる。

上述の方法と正確に同じ方法において、ペプチドフラグメントをコードし得るオ リゴヌクレオチド配列または配列セットに相補的であるヌクレオチド配列を有す るオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドのセット）を用い得る。

ＩＣＡＭ−１遺伝子のフラグメントをコードし得る適当なオリゴヌクレオチドま たはオリゴヌクレオチドのセット　（またはそのようなオリゴヌクレオチドまた はオリゴヌクレオチドに相補性であるもの）を同定しく上述の手順を用いて）、 ＤＮＡについて当該技術で周知の手段を用いて、好ましくはＩＣＡＭ−１遺伝子 配列を発現し得るヒト細胞由来のｃＤＮＡｆＡ製物により合成しハイブリッド化 する。核酸ハイブリッド化技術はＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、等、により”Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、 　ＣｏｌｄｓｐｒｉｎｇＨｌｌａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）″において、 またｌｌａｙｍｅｓ、　Ｂ、口１等により”Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｃｌ　ｌ１ ｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ、　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＩＲ ＬＰｒｅｓｓ社、ワシントンＤ、　Ｃ，（１９８５）２において開示されており 、これら文献は参考として本明細書に引用する。使用するＤＮＡまたはｃＤＮＡ 源は好ましくはＩＣＡＭ−１配列に富む。

そのような濃厚化はＩＣＡＭ−１合成を誘起する条件下で培養された細胞（ホル ボールエステルの存在下で増殖させたＵ９３７等のような）からＲＮＡを抽出す ることによって得たｃＤＮＡから最も容易になし得る。

上述した方法のようなあるいは同様な方法はヒト　アルデヒド−２５２４（１９ ８５））ヒト　エストロゲンレセブスー遺伝子（Ｗａｉｔｅｒ、　Ｐｏ等、ｒ’ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８２　：　７８８９−７ ８９３　（１９８５））、組織型プラスミノーゲン　アクチベーおよびヒト胎盤 アルカリ　ホスファターゼ相補ＤＮＡ［にａｍ、　Ｈ。

等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、１ｌｓＡ８２：８７１５−８７ １９＜１９８５）：Ｉのクローニングを成功裏に可能にしている。

Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子をクローニングする別の好ましい方法においては、発現ベ クターのライブラリーをＩＣＡＭ−１を発現ベクター中に発現できる細胞からＤ ＮＡまたは好ましくはｃＤＮＡをクローニングすることによって調製する。この ライブラリーを次いで抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体に結合しＩＣＡＭ−１またはＩＣＡ Ｍ−１７ラグメントと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得るヌ クレオチド配列を有するたん白質を発現し得るメンバーについてスクリーニング する。

上記方法により得られたクローニングＩ　ＣＡＭ−１遺伝子は操作によって発現 ベクターに結合させバクテリアまたは真核生物細胞に組み込んでｌＣＡＭ−また ん白質を産生させる。そのような操作技術はＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、等（前出 ）により開示さ、当該技術において周知である。

Ｄ、ＬＦＡ−１依存性凝集のアッセイの使用ＬＦΔ−１依存性凝集を測定し得る 前述のアッセイを用いてＬＦＡ−１依存性凝集の度合を抑制するアンタゴニスト として作用する試剤を同定できる。そのようなアンタゴニストは凝集に関係する ＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１の能力を付与することによって作用し得る。即ち 、そのような試剤はＬＦＡ−１またはＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体のような 免疫グロブリンを包含する。さらに、非免疫グロブリン（即ち、化学）剤も、上 記アッセイを用いてこれらがＬＦＡ−１凝集のアンタゴニストであるかどうかを 決定し得る。

Ｅ、ＩＣＡＭ−ルセプタ一たん白質に結合し得る抗体の使用１、抗炎症剤 ＣＤ、、２１３１合体の各１員に対するモノクローナル抗体は内皮への結合［１ １ａｓｋａｒｄ、　Ｄ、　管、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎａｌ、ｌ　３７　：　２９０１ −バ球の抗原およびマイトジアン誘起増殖（Ｄａｖ　ｉｇｏｎ、　Ｄｏ等、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、１ｌｓＡ７８　：　４　５３５−４　５３ ９（１９８１））　、抗体形成（Ｆｉｓｈｅｒ、　Ａ、等、Ｊ、ｌｒｎｍｕｎｏ Ｌｌ　３６　：　３１９８−３２０３　（１９８６））、および細胞毒性Ｔ細胞 （Ｋｒｅｎｓｋｙ、　Ａ。

組等、Ｊ、　Ｉｎｕｎｕｎｏｌ、１３２　：　２１８０−２１８２　（１９８４ ））、マクロファージ［Ｓｔｒａｓｓｍａｎ、　ｃ、等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １３６　：４３２８−４３３３　（１９８６））、および抗体依存性細胞毒反応 ｒ；４マレルずべての細胞〔にｏｈｉ、　Ｓ、等、Ｊ、　ｌｒｎｍｕｎｏｌ、　 １３３　：２９７２−２９７８　＜１９８４）：ｌの溶解活性のようなすべての 白血球のエフェクター機能を包含する白血球の多くの粘着依存性機能を抑制する 。これらの機能のすべてにおいて、上記抗体は白血球の適当な細胞基質への粘着 能力（この能力は最終結果を抑制する）を！１′ＩＩ制する。

前述したように、ＩＣＡＭ−１分子のＬＦＡ−１群分子の１員への結合は細胞粘 着において極めて重要である。粘着の過程において、リンパ球は外来抗原の存在 について動物を連続的にモニターし得るものである。これらの過程は通常は望ま しいものであるけれども、これらの過程はまた臓器移植拒絶、組織移植拒絶、お よび多くの自己免疫患者の原因でもある。従って、細胞粘着を減衰または抑制で きる何らかの手段が臓器移植、組織移植の受け入れ者または自己免疫患者に大い に望まれている。

Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体は哺乳動物の抗炎症剤として極 めて適している。明らかに、そのような薬剤（ま粘着を選択的に抑制でき通常の 薬剤で見い出し得るネフロ毒性のような他の副作用を示さない点で一般の抗炎症 剤と異なっている◎従って、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を用 いて哺乳動物においてそのような副作用の恐れなしに臓器または組織の拒絶反応 を防止しあるいは自己免疫応答を修正できる。

、重要なことは、Ｉ　ＣＡＭ−１を認識し得るモノクローナル抗体の使用はＨＩ Ａ不均衡を有する個々人においてさえも臓器移植を行うことができるということ である。

２、遅延型過敏反応のサプレッサー ＩＣＡＭ−１分子は殆んど遅延型過敏反応に含まれる部位のような炎症部位に発 現するので、ＩＣＡＭ−１分子に結合し得る抗体（特にモノクローナル抗体）は そのような反応の減衰または排除において治療的潜在力を有する。この潜在的治 療用途は２つの方法のいずれかで活用できる。第１は、ｌ　ＣＡＭ−１に対する モノクローナル抗体を含有する組成物を遅延型過敏反応に呈する患者に投与でき る。例えば、そのような組成物は毒キワダ、毒オーク等の抗原と接触した人に投 与できるであろう。

第２の態様においては、Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を抗原 と共に患者に投与してその後の炎症反応を防止する。即ち、抗原とＩＣＡＭ−１ 結合性モノクローナル抗体との共投与は上記抗原の投与後に人に一時的に許容し 得る。

３、慢性炎症疾患の治療 ＬＦＡ−１を欠損するＬＡＤ患者は炎症応答を示さないので、ＬＦＡ−１の天然 リガンド、Ｉ　ＣＡＭ−１の拮抗作用もまた炎症応答を抑ｉ１ｉ＋１するものと 信じている。Ｉ　ＣＡＭ−１に対する抗体の炎症を抑制する能力は円板状エリス マトーデス、自己免疫甲状腺炎、実験的アレルギー性脳をずい炎（ＥＡＥ）　、 多発性硬化症、糖尿病レイナート症候群のある態様、リウマチ様関節炎等の慢性 炎症および自己免疫疾患の治療における治療用途の基本を与える。一般に、ＩＣ ＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体はステロイド療法により現在治療可能 な疾患の治療に用い得る。

４、診断および判定的用途 ＩＣＡＭ−１は殆んど炎症部分に発現するので、Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るモ ノクローナル抗体は患者の感染および炎症部位を画像化または可視化する手段と して使用できる。そのような用途においては、モノクローナル抗体はラジオアイ ソトープ、アフィニティラベル（ビオチン、アビジン等のような）、蛍光ラベル 、常磁性原子等の使用により検出可能に標識化する。そのような標識化を行う手 順は当該技術において周知である。画像診断における抗体の臨床的応用は“Ｇｒ ｏｓｓｍａｎ、　Ｉｆ、　Ｂ、　、　１ｌｒｏｌ。

Ｃｌ１ｎ、Ｎｏｒｔｈ　八ｍｅｒ、　１３：４６５−４７４　＜１９８６）　” 　、ｔｌｎｇｅｒ、　Ｅ、　Ｃ０等、Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｒａｄｉｏｌ、２０　： 　６９３−７００（１９８５）″および”Ｋｈａｗ、　Ｂ、　Ａ、等、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２０９　：２９５−２９７　（１９８０）”により検討されている。

炎症の存在はまたＩＣＡＭ−１を発現する細胞のＩＣＡＭ−１遺伝子配列にまた はＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡ配列に結合するｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮへのよう な結合性リガンドの使用によっても検出できる。そのようなハイブリッド化アッ セイを行う技術はＭａｎｉａｔａｉｓ、　Ｔ、　（前出）によって開示されてい る。

そのような検出可能に標識した抗体の病巣の検出は炎症または腫瘍発現部位を示 し得る。１つの実施態様においては、この炎症検査は組織または血液のサンプル を取り出しそのようなサンプルを上記検出可能に標識した抗体の存在下にインキ ュベートすることによって行う。好ましい実施態様においては、この方法を磁性 画像診断、フルオログラフィ等を用いて非侵略的方法で行う。そのような診断試 験は臓器移植受は入れ者を潜在的な組織拒絶の早期発見のためにモニターするの に用い得る。そのようなアッセイはまたリウマチ様関節炎または他の慢性炎症疾 患に対する個々人の対応を決定するにも実施し得る。

５、治療または診断目的で投与する抗原物質の導入の補佐例えば、ウシインシュ リン、インターフェロン、組織型プラズミノーゲンアクチベーターまたはマウス モノクローナル抗体のような治療または診断剤への免疫応答はそのような薬剤の 治療または診断価値を実質的に減少させ、実際に、血清病のような疾患を生じ得 る。そのよつな事情は本発明の抗体を用いて改善できる。この実施態様において は、そのような抗体を治療剤または診断剤と組合せて投与する。抗体の添加は受 け入れ者を上記薬剤の認識から防止し、従って、受は入れ者が薬剤に対する免疫 応答を開始するのを防止する。そのような免疫応答がないことは患者の治療剤佳 たは診断剤の追加の投与を受け入れる能力をもたらす。

Ｆ、細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の使用ＩＣＡＭ−１はＬＦＡ−１の結 合パートナ−である。かくして、ＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体は疾患の 治療においてＬｌ’八−１に結合し得る抗体と相互変化的に使用できる。即ち、 可溶化形において、そのような分子は炎症、臓器拒絶、移植拒絶等を抑制するの に用い得る。ＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体は抗ＩＣＡＭ抗体と同じ方法 で用いて治療剤または診断剤の免疫原性を減少させ得る。

ＩＣＡＭ−１、その官能性誘導体、およびそのアンタゴニストを用いて表面上に ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１を発現する腫瘍細胞の転移または増殖をブロック し得る。種々の方法がそのような目的を達成するのに用い得る。例えば、造血細 胞の浸透はＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ−１結合を必要とする。従って、そのような結 合のアンタゴニストは上記の浸透を抑制し白血球由来の腫瘍細胞の転移をブロッ クする。また、ＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得る毒素由 来分子も゛患者に投与し得る。そのような毒素由来分子がＩＣＡＭ−１またはＬ ＦＡ−１群分子のｌ員と結合する場合、毒素の存在が腫瘍細胞を殺しそれによっ て腫瘍の増殖を抑制する。

ＩＣＡＭ−１依存性粘着はＩＣＡＭ−１またはＬ　Ｆ　Ａ−，１に結合し得る非 免疫グロブリンアンタゴニストにより抑制し得る。

ＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストの１つの例はＬＦＡ−１である 。ＬＦＡ−１に結合する非免疫グロブリンアンタゴニストの例はＩ　ＣＡＭ−１ である。前述のアッセイを使用することによって、追加の非免疫グロブリンアン タゴニストを同定し精製できる。ＩＣＡＭ−１依存粘着の非免疫グロブリンアン タゴニストはＬＦＡ−１に対する抗体またはＩＣＡＭ−１に対する抗体と同じ目 的で使用できる。

Ｈ９本発明の組成物の投与 ＩＣＡＭ−１の治療効果は患者に全ＩＣＡＭ−１７たはその任意の治療上活性な ペプチドフラグメントを投与することによって得られる。

ＩＣＡＭ−１およびその官能性誘導体は組換えＤＮＡを用いて合成的にあるいは たん白質分解により取得できる。ＩＣＡＭ−１の治療上の利点は追加のアミノ酸 残基を有してキャリヤーに対する結合性を改善しあるいはＩＣＡＭ−１の活性を 改善したＩＣＡＭさらにある種のアミノ酸残基を欠損しあるいは別のアミノ酸残 基を含むＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体もそのような誘導体が細胞粘着に作用す る能力を示す限り包含するものとする。

本発明の抗体およびＩＣＡＭ−１分子は、これらを含有する調製物がこれらの生 成物と共に通常天然に見出される物質を実質的に含まない場合、“天然不純物を 実質的に含まない”といえる。

本発明はＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体およびその生物学的活性を有するフラグ メント　（ポリクローナルまたはモノクローナル）にも及ぶ。そのような抗体は 動物、組織培養または組換えＤＮＡ手段により調製できる。

患者にＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体またはそのフラグメントを投与するには 、あるいは、ＩＣＡＭ−１（またはフラグメント、変異体または誘導体）を受け 入れ患者に投与するには、その投与量は患者の年令、体重、身長、性別、一般的 医療条件、病歴等のファクターによる。一般には、患者に約Ｉ　Ｐｇ／　ｋｇ〜 １０　ｍｇ／　ｋｇ（患者体重）の範囲の抗体投与量で投与すること、が望まし いが、それにより低量または高量の投与量も投与できる。ＩＣＡＭ−１分子また はその官能性誘導体を患者に投与するときは、同じく約ｌｒ’ｇ／ｋｇ〜１０■ ／ｋｇ（患者の体重基準）の範囲の投与量でそのような分子を投与することが好 ましいが、それより低量または高量の投与量も使用できる。後述するように、上 記の有効投与ｌはくすることができる。本発明においては、１つの化合物は第２ の化合物と、その２つの化合物の投与がこれら固化合物を患者血清中で同時に検 出できるような条件になる場合において患者に共投与できると云える。

ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体及びｌ　ＣＡＭ−１自体の両者は患者に静注、筋 注、皮下、腸内または非経口的に投与できる。抗体またはＩＣＡＭ−１を注射に より投与するときは、投与は連続注入によりあるいは１回または多数回ポーラス により行い得る。

本発明の抗炎症剤は炎症を抑制するのに十分な量で受け入れ対象体に投与するも のである。その量は、薬剤の投与量、投与経路等が炎症を減衰させあるいは防止 するに十分である場合において炎症を“抑制２するに十分であると云える。

本発明の抗炎症剤は炎症の発症前（予想される炎症を抑制するために）または炎 症発症後のいずれにおいても投与できる。

抗ＩＣＡＭ−１抗体またはそのフラグメントは単独または１種以上の追加の免疫 抑制剤と組合せて投与できる（特に、臓器または組織移植の受け入れ者に対して ）。そのような化合物の投与は“予防２または“治療”目的のいずれかであり得 る。予防的に投与する場合には、これらの免疫抑制剤は炎症応答または症候の前 に投与する（例えば、臓器または組織の移植前、移植中または移植直後の臓器拒 絶症候の前）。これらの化合物の予防的投与は後の何らかの炎症応答（例えば、 移植臓器または組織の拒絶等）を防止または低減するのに役立つ。治療的に投与 する場合には、これらの免疫抑制化合物は実際の炎症の症候（例えば、臓器また は組織拒絶のような）の発症時（またほそめ直後）に投与する。これら化合物の 治療的投与は何らかの実際の炎症（例えば、移植臓器または組織の拒絶のような ）を低減するのに役立つ。かくして、本発明の抗炎症剤は炎症の発症前（予想さ れる炎症を抑制するように）または炎症の開始後のいずれかで投与できる。

組成物はその投与が受け入れ患者に許容される場合に“薬学上受は入れ可能であ る”と云える。そのような薬剤はその投与量が生理学上有意である場合に、“治 療上有効な量”で投与されるき云える。薬剤はその存在が受け入れ患者の生理に 検知可能な変化をもたらす場合に経理掌上有意である。

本発明の抗体及びＩ　ＣＡＭ−１分子は薬学上有用な組成物’Ｇ！！！］製する 公知の方法によって処方でき、それによってこれらの物質またはその官能性誘導 体を薬学上許容できるキャリヤーベヒクルと混合物きして組合せ得る。適当なベ ヒクルおよびその調製物（例えば、他のヒトたん白質、例えば、ヒト血清アルブ ミンを含む）は、例えば”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（第１６版、Ｄｓｏｌ、　Ａ、編、マーク・イースト ン（Ｐ八）、（１９８０）”に記載されている。有効な投与に適する薬学上許容 し得る組成物を調製するためには、そのような組成物は適当量のキャリヤーベヒ クルと共に有効量の抗ＩＣＡＭ−１抗体またはＩＣＡＭ−１分子、またはその官 能性誘導体を含有する。

追加の薬学的方法を用いて活性の持続を制御するこきができる。

制御放出性製剤は抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体またはＩ　ＣＡＭ−１、またはこれらの 官能性誘導体を複合体化しあるいは吸収するポリマーを使用することによって得 ることができる。制御された伝達は適当なマクロ分子（例えば、ポリエステル、 ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロー ス、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミン硫酸塩）および該マクロ分 子の濃度並びに放出を制御するための混入方法を選択することによって達成でき る。制ｒＢ放出製剤により活性持続を制御するもう１つの可能性ある方法は抗Ｉ ＣＡＭ−１抗体またはＩ　ＣＡＭ−１分子、またはこれらの官能性誘導体をポリ エステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリラクトン酸またはエチレン−酢酸ビ ニルコポリマーのような高分子物質の粒子に混入させることである。

また、これら薬剤を高分子粒子に混入させる代りに、これらの薬剤を例えばコア セルベーション法によりあるいは界面重合法により調製したマクイロカプセル例 えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよび（メチ ルメタクリレート）マイクロカプセル中に、あるいはコロイド状薬物伝達系例え ばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノパー ティクル、ナノカプセルまたはマクロエマルジョン中に内包させることも可能で ある。そのような方法も“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（１９８０）　”中に記載されている。

実施例 これまで本発明を一般的に説明して来たが、以下の実施例は本発明をより容易に 理解できるであろう。これらの実施例は例示を目的とするものであり本発明を限 定するものではない。

実施例１ 動物細胞の培養 一般に、本発明のＥＢＶ形質転換およびハイプリドーマ各細胞は２（ｌａＭのし 一グルタミン、５０μｇ／ｒｎ１．のジェンタマイシン、および１０％のウシ胎 児血清を加えたＲＭｐＨ６４０培地中に保存した。細胞は３７℃で、５％ＣＯ□ 、９５％湿度雰囲気下で培養した。

エプスタイン−パールウィルス（ＥＢＶ）形質転換体を確立するために、２０％ ウシウシ血清（Ｆｅ２）および５０μｇ／ｒｄのジェンタマイシンを加えたＲＰ Ｍ１１６４０培地中の１０６個のＴ細胞放血末梢単核細胞／ｉを１６時ｌ８９５ −８細胞のＥＢＶ−トを１０マイクロタイターウエルに入れた。培地をＲＰＭ１ １６４０培地（２０％ウシウシ血清および５０μｍ／ｌジンタマイシンを加えた ）で細胞増殖が見られるまで置換えた。細胞は殆んどのウェルで増殖し同じ培地 中に拡った。フィトヘマグルチニ７　（ＰＨＡ）芽球を１＝８００希釈Ｐ　ＨＡ 　−Ｐ　（Ｄｉｒｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　ｉｅｓ社、デトロイト、Ｍ＋）を含有するＲＰＭＩ　１６ ４０培地（２０％ウシウシ血清加）中１０６細胞／ｄで確立した。

ＰＨＡ系はインターロイキン２　（ＩＬ−２）調整培地で拡がりＰＨＡにより弱 く脈動した［Ｃａｎｔｒｅｌｌ、　ＩＩ、Δ５等、Ｊ、　Ｅｘｐｅｒ。

、Ｍｅｄ、１５８：１８９５　（１９８３））。上記手順は”Ｓｐｒｉｎｇｅｒ 、Ｔ３等、Ｊ、、Ｅｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ、１６０　：　１９０１−１９１８　（ １９８４）”により開示されており、その記載は参考として本明細書に引用する 。上記手順で得た細胞を次いで抗ＬＦＡ−１抗体でスクリーニングしてこれらが ＬＦＡ−１抗原を発現するかどうかを決定した。

そのような抗体は”５ａｎｃｈｅｙ　Ｍａｄｒｉｄ、　Ｆ、等、Ｊ、Ｅｘｐｅｒ 、　Ｍｅｄ、１５８：１７８５　（１９８３）”に開示されている。

実施例２ 細胞凝集および粘着のアッセイ 細胞粘着の度合を評価するために、凝集アッセイを用いた。かかるアッセイに用 いた細胞系は５ｍＭの１ｌｅｐｅｓバツフアー（ＳｉｇｍａＣｈｅ＋５ｉｃａ１ 社、セントルイス）を含有するＲＰＭ］１６４０培地で２回洗浄し２Ｘ１０’細 胞／！ｌｔ１！の濃度に再懸濁させた。平底９６ウエルマイクロタイタープレー ト（漸３５９６　；　Ｃｏａｓｔａｒ社、ケンブリッジ、ＭＡ）に５０μｌの適 当なモノクローナル抗体上清、５０μｌの精製モノクローナル抗体を含むまたは 含まない完全培地、５０μｌの２００％ｇ／ｍｆホルボールエステルホルボール ミリステートアセテート（ＰＭＡ）含有完全培地および１００μｌの完全培地中 ２Ｘ１０’細胞／ｍｌ濃度の細胞を加えた。これは５０％ｇ／＋ｊ’ＰＭＡと２ Ｘ１０’細胞／ウエルの最終濃度を与えた。細胞を自然に沈降させ、凝集度を各 時点で計数した。度数は０〜５１の範囲にあった。ここで０は密集中に本質的に 細胞がないことを示し；１９は１０％以下の細胞が凝集物中にあり；２４は５０ ％以下の細胞が凝集していることを示し＝３３は１００％までの細胞が小さいゆ るやかな密集中にあったことを示し；４４は１００％までの細胞が大密集中に凝 集したことを示し；５４は１００％の細胞が大きい極めて密な凝集物中にあった ことを示す。細胞粘着のより定量的な評価を得るために、試剤および細胞を上記 と同じ順序で５ｄポリスチレンチユーブに加えた。チューブを３７℃でグリシト リ−シェーカー上の台中に置いた。約２０　Ｏｒｐｍで１時間後に、１０μｌの 細胞懸濁液をヘモサイトメーター中に入れ遊離細胞の数を定量した。％凝集を次 の等式によって決定した。

上記等式中の入れた細胞の数はインキュベートしていない細胞と完全培地のみを 含有するコントロールチューブ中の−当りの細胞数である。上記等式中の遊離細 胞の数は試験チューブからの−当りの非凝集細胞の数に等しい。上記の手順は” Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等、Ｊ、Ｅｘｐｅｒ、Ｍｅｄ、１６３：　１１３２− １１４９　（１９８６）”によって開示されている。

実施例３ ＬＦＡ−１依存性細胞凝集 実施例２で記載した定量的凝集アッセイをエプスタイン−バールウィルス形質転 換細胞系ＪＹを用いて行った。マイクロタイタープレート中の培地にＰＭＡを加 えて、細胞凝集を観察した０時間経過ビデオ記録計はマイクロクイターウェル底 部のＪＹ細胞が動いており活性な膜波動および仮定運動を示していた。隣接細胞 の仮定間の接触はしばしば細胞−細胞粘着をもたらした。粘着が持続した場合、 細胞接触領域は尾１ｊ　（ｕｒｏｐｏｄ）に移動した。接触は激しい細胞運動お よび反対方向への細胞の引っ張り合いにも依らず維持できた。ＰＭＡ処理および 未処理細胞間の主な違いは１度形成された上記接触の安定性において現われてい た。ＰＭＡにおいては、細胞密集が出現し、その周りに粘着した追加の細胞とし て粒度の成長があった。

粘着を測定する第２の手段としては、実施例２で記載した定量的アッセイを用い た。細胞懸濁液を２時間、２００ｒρ−で振り、ヘモサイトメーターに移し、凝 集物中に含まれない細胞を計数した。ＰＭＡの不存在では、４２％（ＳＤ−２０ ％、Ｎ−６）のＪＹ細胞が２時間後、凝集物中にあったが、５０μｇ／−のＰＨ Ａと共に同じ条件下でインキュベートしたＪＹ細胞は凝集物中に８７％（ＳＤ− ８％、Ｎ−６）の細胞を有していた。凝集の動力学的検討はＰＭＡがすべての試 験時間で凝集速度および強度を促進していることを示した（第３図）。

実施例４ 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体を用いての細胞の凝集抑制ＰＭＡ誘起細胞凝集 への抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体の効果を試験するために、そのような抗体 を実施例２の定量凝集アッセイに従ってインキュベートした細胞を加えた。この モノクローナル抗体はＰＭＡの存在または不存在下のいずれにおいても細胞凝集 の形成を抑制していることが判った。ＬＦＡ−１のアルファーｔＸに対するモノ クローナル抗体のＦ（ａｂ’）ｚおよびＦａｂ　’フラグメントは双方とも細胞 凝集を抑制できた。一方、本質的に１００％の細胞が抗ＬＦＡ−１抗体の不存在 下では凝集を形成し、抗体を加えたときは２０％以下の細胞が凝集物中に見い出 された。この実験の結果はＲｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等により開示された（ム」 ■旺−ハム上工３：１１３２−１１４９　（，１９８６））。

実施例５ 細胞凝集はＬＦＡ−ルセブターを必要とする：ＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞を 実施例１で記載した方法により患者から調製した。この細胞をＬＦＡ−１を認識 し得るモノクローナル抗体に対してスクリーニングし、細胞がＬＦＡ−１欠損で あることを見い出した。

実施例２で記載した定量凝集アッセイを上記ＬＦＡ−１欠損細胞を用いて行った 。この細胞はＰＭＡの存在においても自発的に凝集しなかった。

実施例６ Ｉ　ＣＡＭ−１の発見 実施例５のＬＦＡ−１欠損細胞をカルボキシフルオレスセインジアセテートで標 識した（Ｐａｔａｒｒｏｙｏ、　Ｍ、等、Ｃｅｌ！　Ｉｍ＋＊ｕｎｏｌエエ：２ ３７−２４８　（１９８１））、標識細胞を同原またはＪＹ細胞と１：１０の比 で混合し凝集物中のフルオレスセイン標識細胞の割合を”Ｒｏｔｈｌｅｉｎｔ　 Ｒ，等　Ｊ、　Ｅｘ　ｅｒ、　Ｍｅｄ、６３　：　１１３２−１１４９　（１９ ８６）”の方法に従って測定した。ＬＦＡ−１欠損細胞はしＦ　Ａ　−１発現性 細胞と共凝集し得ることを見い出した（第４図）。

ＬＦＡ−１が凝集形成またはその維持にのみに重要であるかどうかを決定するた めに、ＬＦＡ−１に結合し得る抗体を上記の前取って形成させた凝集に加えた。

抗体の添加は上記の前取って形成させた凝集を強く分裂させることが判った。時 間経過ビデオ記録計は前取って形成させた凝集へのモノクローナル抗体の添加が ２時間以内で分裂を生じ始めることを示した（第１表）。ＬＦＡ−１に対するモ ノクローナル抗体の添加後、凝集中の個々の細胞の仮定運動および形状変化は変 らないまま続いた０個々の細胞は凝集物の周囲から次第に解離し、８時間までに 細胞は殆んど分散した。ビデオ時間経過によれば、ＬＦＡ−１モノクローナル抗 体による前取って形成させた凝集の分裂は時間を逆のぼって行ったＬＦＡ−１モ ノクローナル抗体の不存在下での凝集経過と等価であった。

第１表 ・　占　會 ８ｈ 実験　２ｈ’　−ｍＡｂ　＋顛Ａｂ 定量マイクロタイタープレート中の凝集を観察的に計数した。

アッセイ時間全体を通、じた存在した抗ＬＦＡ−１においては、凝集は１１以下 であった。

ａモノクローナル抗体添加２時間直前の凝集量ｂＴＳ　１／１８　＋ＴＳ　１／ ２２ ＣＴＳＩ／１８ ’ＴＳＩ／２２ 実施例７ ＬＦＡ−１依存性凝集における２価イオンの必要性細胞毒性Ｔ細胞とターゲット 間のＬＦＡ−１依存性粘着はマグネシウムの存在を必要とする（Ｍａｒｔｚ、　 Ｅ、、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｏｉｌ、８Ａ：５８４．５９Ｂ　（１９８０））、 、ＰＭＡ誘起ＪＹ細胞凝集を２価カチオン依存性について試験した。ＪＹ細胞は カルシウムまたはマグネシウムイオンを含まない培地中では凝集しなかった（実 施例２のアッセイを用いて）、２価マグネシウムの添加は０．３ｍ＋？ｌ程の低 い濃度で凝集を行った。カルシウムイオン単独の添加は殆んど効果がなかった。

しかしながら、カルシウムイオンはマグネシウムイオンのＰＭＡ誘起凝集を補佐 する能力を増強することが判った−１．２５ｍ１’ｌのカルシウムイオンを培地 に加えたときは、０．０２１程の低いマグネシウムイオン濃度で凝集を補佐する ことが判った。これらのデータは細胞のＬＦＡ−１依存性凝集がマグネシウムイ オンを必要とすること、およびカルシウムイオンがそれ自体は不十分であるけれ どもマグネシウムイオンと共に凝集を増大させることを示している。

実施例８ 抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗体を発現し得るハイブリドーマ細胞の単離 Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を”　ｌ’１Ｏｉｈｌｅｔｎ＋ Ｒ１等、Ｊ、　Ｉ＋ｕｓｕｎｏ１．土３７　：１２７０−１２７４　（１９８６ ）、”の方法に従って単離した。該文献は参考として本明細書に引用する。即ち 、３匹のＢＡＬＢ／ＣマウスをＬＦＡ−１欠損患者からのＥＢＶ形質転換末梢血 単核細胞で腹腔的免疫した（Ｓｐｒ　ｉｎｇｅｒ。

Ｔ、　Ａ、等、Ｊ、　［１ｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ、１６０：　１９０１　（１９８ ４）　）ｏ　１ｒｎ１．ＲＰＭＬ　ｌ　６４０培地巾約１０７個の細胞を各免疫 に用いた。

免疫はひ臓細胞をマウスから取り出す前の４５日、２９日および４日で行い所望 のハイブリドーマ細胞系を産生させた。ひ臓細胞の取り出し前３日に、マウスに 追加の０．１５ｍｔ’培地中１０７細胞を投与した（静注）。

上記の動物からの単離ひ臓細胞をＰ３ｘ７３Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞と４ ：１の比率で“Ｇａ１ｆｒｅ、　Ｇ８等、Ｎａｔｕｒｅ２６６　：　５５０（１ ９７７）”のプロトコールに従って融合させた。得られたハイブリドーマ細胞の 各アリコートを９６ウエルマイクロタイタープレートに入れた。各ハイブリドー マ上清を凝集抑制についてスクリーニングし、１つの抑制ハイブリドーマ（６０ ０以上のすべてのウェル試験のうちから）をクローニングし限定希釈によりサブ クローニングした。このサブクローンはＲＰＩ／１．１．１゜と表示したく以後 “ＲＰ１／１″と表示する）。

モノクローナル抗体ＲＰ１／１はＬＦＡ−１発現性細胞系ＪＹのＰＭＡ刺激凝集 を一貫して抑制することを見り出した。ＲＰＩ／１モノクローナル抗体はいくつ かのＬＦＡ−）αまたはβサブユニットに対するモノクローナル抗体よりも等価 かわずかに小さく凝集を抑制した。これに対し、コントロールのＨＬＡに対する モノクローナル抗体（これはＪＹ細胞上に多量に発現する）は凝集を抑制しなか った。モノクローナル抗体ＲＰ１／１と結合した抗原は細胞間粘着分子−１（Ｉ ＣＡＭ−１）（！：定義する。

実施例９ ＩＣＡＭ−１を特性決定するための抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体の使用 Ｉ　ＣＡＭ−１の性質を限定するために、特にＩ　ＣＡＭ−１がＬＦＡ−１と異 なるかどうかを決定するために、細胞たん白質をモノクローナル抗体ＲＰＩ／１ を用いて免疫沈降させた。免疫沈降はＲｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等の方法に従っ て行った（Ｊ　ＩＩＩＩｍｕｎｏｌ。

１エｌ：１２７０−１２７４　（１９８６））、ＪＹ細胞を新たに１１フエニル メチルスルホニルフルオライド、０．２単位／−のトリプシンインヒビターアプ ロチニンを加えた１％トリトンＸ−１００，０，１４ｍ（７）　ＮａＣｊ！、１ ０ｍＭ（７１）　’）　ス、ｐＨ８，０（Ｉ解ハフファー）中で５Ｘ１０’細胞 ／−で２０分間、４℃で溶解させた。

溶解物を１０，０００ｘｇで１０分間遠心しＣＮＢｒ活性化グリシン抑制セファ セファローズｃ１の５０％懸濁液５ｏ−で１時間、４℃で前処理した。ＩＭｌの 溶解物をセファローズＣ１−４Ｂに結合させたモノクローナル抗体（ｌａｆ／ａ ｄ）の５０％懸ｓ液の２゜ｐｉｔで４℃で一夜免疫沈降させた［Ｓｐｒｉｎｇｅ ｒ、　Ｔ、　Ａ、等、Ｊ。

Ｅｘｐｅｒ、　？ｌｅｄ、１６０　：　１９０１　（１９８４）　：１．セファ ローズ結合モノクローナル抗体は“Ｍａｒｃｈ、　Ｓ、等、の方法に従ワて炭酸 塩パンファー中のセファローズ（１−４８のＣＮＢｒ活性化法を用いて調製した （Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｏ：　１４９　（１９７４）　）　、洗浄した 免疫沈降物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ｔ；よび銀染色に”ＭＯｒｒｌＳＳｅｙ＋Ｊ、 　Ｈ，Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ（１１７：　３０７　（１９８１）　″の手順 に従って供した。

ＳＤＳサンプＪレバソファ−［Ｔ（Ｄ、　？ｌ、　Ｋ、等、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈ ｅＩＩｌｉｌ：６３６　（１９８３））による１００℃でのたん白質溶出後、各 サンプルを半分に分けて還元（第５Ａ図）または非還元（第５Ｂ図）の各条件下 で電気泳動（ＳＤ３　８％ＰＡＩＣＥ）　に供した１分子量５０Ｋｄおよび２５ Ｋｄを有するバンドはモノクローナル抗体セファローズからの免疫グロブリンの 長鎖および短鎖に相当した（第５Ａ図、レーン３）。２５〜５０Ｍｄ分子量範囲 の可変量の他のバンドも観察したが、ヘアリー白血病細胞からの沈降物中では見 られず、この白血病細胞は９０Ｋｄ分子量バンドのみを与えた。ＬＦＡ−１の１ ７７Ｋｄαサブユニツトおよび９５Ｋｄβサブユニ７）は還元（第５Ａ図、レー ン２）および非還元（第５Ｂ図、レーン２）の同条件下でＩ　ＣＡＭ−１とは異 なって浸透した。

ＰＨＡ−リンパ芽球凝集に対してのモノクローナル抗体ＲＰＩ／１の効果を測定 するために、実施例２で記載した定量凝集アンセイを用いた。即ちＴ細胞芽球細 胞をＰＨＡで４日間刺激し、十分に洗浄し、次いでＩＬ−２状態１！節培地の存 在下に６日間培養した。ＰＨＡはこの６日間培養で取り込まれ凝集アンセイに寄 与しなかった。異なるＴ細胞芽球調製物による３種のアンセイにおいて、Ｉ　Ｃ ＡＭ−１モノクローナル抗体は一貫して凝集を抑制した（第２表）。

第２表 １°　対照　９ ＋　５１　０ 十　ＨＬＡ−＾、Ｂ　５８　−１４’ ＋　ＬＦＡ−１フルフア　３１　３９ ＋　ＩｃＡＭ−１３１３９ ２°　対照　１０ ＋　７８　０ 十　ＬＦＡ−１ベータ　１７　７８ ＋　ＩＣＡＭ−１５０３６ 十　対照　７０ 十　）ＩＬＡ−Ａ、Ｂ　８０　−１４ 十　ＬＦＡ−３８３−１９ 十　ＬＦＡ−１フルフア　２　９７ 十　ＬＦＡ−１ベータ　３　９６ ＋　ＩＣＡｌ１−１　３４　５１ ”　５０ｎｇ／−のＰＨＡで刺激したＰＨＡ誘起リンパ芽球の凝集は実施例２に 記載したようにして非凝集細胞の数を顕微鏡により計数することによって間接的 に定量した。

’　ＰＭＡおよびＸ６３モノクローナル抗体で処理した細胞に対する％抑制 御　凝集はモノクローナル抗体およびＰＭＡの刺激的添加後１時間で測定した。

４　負の数は凝集の％促進を示す。

０　凝集はモノクローナル抗体およびＰＭＡの刺激的添加後１時間で測定した。

細胞は２００ＸＧで１分間でペレフト化し、３７℃で１５分間インキュベートし 、ゆるやかに再懸濁し、１００ｒ四で４５分間振とうした。

ｔ　！Ｂ胞はＰＨＡで３７℃、４時間前処理した。モノクローナル抗体添加後、 各チューブを３７℃で２０分間静置インキュベートし、７５ｒｐ＋Ｉで１０００ ０分間振させた。

ＬＦＡ−１モノクローナル抗体はＩ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗体よりも一貫 して抑制的であり、一方、ＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＬＦＡ−３モノクローナル抗体 は効果なしであった。これらの結果は試験したモノクローナル抗体のうち、ＬＦ Ａ−１またはＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体のみが細胞粘着を抑 制し得ることを示している。

実施例１０ Ｉ　ＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の調製主段 Ｂａ１ｂ／ｃマウスをＲＰＭＩ培地中の２Ｘ１０’ＪＹ細胞０．５−で融合前の １０３日および２４日腹腔内（ｉ、ｐ、）免疫した。融合前４日および３日に、 マウスを０．５　ｙｄのＲＰＭＩ培地中のＰＭＡ分化Ｕ９３７細胞でｉ、ｐ、免 疫した。

Ｕ３７の Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５９３）を１０％のウシ胎児血清、１％グル タミンおよび５０ａｄの２ｎｇ／ｗ４１ホルボールー１２−ミリステートアセテ ート（ＰＭＡ）含をジェタマイシン（完全培地）を含むＲＰＭＩ中５Ｘ１０’／ −で滅菌ポリプロピレン容器中でインキュベートすることによって分化した。こ のインキュベーションの第３日で、２容量の培地を除去し新しいＰ？Ｉ）ｌ含有 完全培地で置き換えた。４日目で、細胞を取り出し、洗浄して免疫用に調製した 。

肚 免疫マウスからのひ臓細胞をＧａ１ｆｒｅ等に従ってＰ３Ｘ６３Ａｇ８、６５３ ミエローマ細胞と４：１の比で融合させた（Ｎａｔｕｒｅ　２６６：５５０　（ １９７，７））、融合後、細胞を９６ウエル平底マイクロタイタープレートに１ ０’ひ臓細胞／ウェルで入れた。

ＩＣＡＭ−の゛ １週間後、５０μｌの上滑を凝集用細胞系としてＪＹおよび５ＫＷ−３の両方を 用いて実施例２の定量凝集アンセイでスクリーニングした。ＪＹ細胞凝集を抑制 するが５ＫＷ−３凝集は抑制しない上清からの細胞を選択し限定希釈を用いて２ 回クローニングした。

この実験により、抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗体を産生ずる３種のハイブ リドーマ系の同定およびクローニングができた。

これらのハイブリドーマ系により産生した抗体は、それぞれ、ＩｇＧｘａ　、Ｉ ｇＧｉｂおよびＴｇ？ｌであった＊　１ｇＧ２ａ抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体は産生ず るハイブリドーマ細胞系は表示Ｒ６’５’Ｄ６’Ｅ９’Ｂ２とした。この好まし いハイブリドーマ細胞系により産生じた抗体はＲ６’５’Ｄ６’Ｅ９’Ｂ２と表 示した（以下、“Ｒ６−５−Ｄ６”と称する）。

実施例１１ １　ＣＡＭ−１の発現と規格化 Ｉ　ＣＡＭ−１発現を測定するために、ラジオイムノアッセイを行った。このア ンセイにおいては、精製ＲＰＩ／１をイオドゲンを用いて１０μＣ４／μｇの特 定の活性にヨー素化した。内皮細胞を９６ウエルプレート中で増殖させ各実験で 述べたようにして処理した。各プレートを直接氷上ではなく冷室に０．５〜１時 間置くことによって４℃に冷却した。各単一層を冷完全培地で３回洗浄し次いで ４℃で３０分間”’ｒ　ＲＰＩ／１でインキュベートした。次いで、単一層を完 全培地で３回洗浄した。結合１！Ｊを０、１　Ｎ　Ｎａ０Ｂを用いて放出し計数 した。”’Ｉ　ＲＰＩ／１の特異活性を未標識ＲＰ、１／１を用いて調整して本 試験において用いる抗原密度範囲に亘って直線状シグナルを得た。非特異結合を １．０００倍過剰の未標＠１ＲＰ１／１の存在下で測定し総結合から差引き特異 性結合を得た。

上述のラジオイムノアンセイを用いて測定したＩＣＡＭＣＡＭ発現ヘソ帯静脈内 皮細胞（ＨυＶＥＣ）およびヒト状状静脈内皮細胞（ＨＳ　Ｖ　Ｅ　Ｃ）上でＩ Ｌ−１、ＴＮＦ−１ＬＰＳおよびＩＮＦガンマ−により増大する（第３表）、状 状静脈内皮細胞は本試験においては成人組織由来の培養大静脈内皮細胞中のヘソ 帯静脈内皮細胞からの結果を確認するために用いた。ＩＣＡＭ−１の基礎的発現 はヘソ帯静脈内皮細胞よりも状状静脈内皮細胞上で２倍高い、ヘソ帯静脈内皮細 胞の組換えＩＬ−１アルフア、ＩＬ−１ベータ、およびＴＮＦへの露出はＩ　Ｃ ＡＭ発現を１０〜２０倍増大させる。ＩＬ−１アルフア、ＴＮＦおよびＬＰＳは 最大効力インデューサーであり、ＩＬ−１は重量基準および応答の飽和濃度では 効力はそれより小さい（第３表）　、１００Ｂｇ／ｄでのＩＬ−１ベータはＩＣ ＡＭ−１９発現をＨ３ＶＥＣ上で９倍、Ｈ３ＶＥＣ上で７．３倍増大させ、半一 最高増加は１５Ｂｇ／−で起りた。５０Ｂｇ／−のｒＴＮＦはＩ　ＣＡＭ−１発 現をＨ３ＶＥＣ上で１６倍、Ｈ３ＶＥＣ上で１１倍増大させ、半一最高効果は０ ．５　ｎｇ／　ｔｄであつた。インターフェロンガンマ−はＩ　ＣＡＭ−１発現 において１０．０００ＬＩ／ｄでＨＵＶＢｃ上テ５．２倍またはＨＳＶＥＣ上で ３．５倍の有意の増大を示した。１０μｇ／ｍｌでのＬＰＳの効果はｒＴＮＦの 効果と強さにおいて同じようであった。これら媒介物の対の組合せはＩ　ＣＡＭ −１発現において追加の効果または追加の効果よりもわずかに小さい効果をもた らした（第３表）　、ｒＴＭＰとｒＩＬ−１ベータまたはｒｌＦＮガンマ−との 交差滴定は次善または最善の濃度での効果において共働作用を示さなかった。

ＬＰＳは培地中でときどき見い出される基準で内皮細胞上でのＩ　ＣＡＭ−１発 現を増大させたので、基礎的Ｉ　ＣＡＭ−１発現がＬＰＳに基づき得る可能性を 試験した。いくつかの血清バッチを試験したとき、低エンドトキシン血清が２５ ％までの低Ｉ　ＣＡＭ−１基礎発現を与えることを見い出した。ここで示した結 果はすべて低エンドトキシン血清中で増殖させた内皮細胞のものであった。しか しながら、ＬＰＳ中相性抗生物質ポリミキシンＢの１０μｇ／−での添加はＩ　 ＣＡＭ−１発現をわずかに追加の２５％に減少させた（第３表）、ＩＬ−１また はＴＮＦによる処理時のＩ　ＣＡＭ−１発現の増大はこれらの調製物中の低エン ドトキシン値と一敗させた１０μｇ／−ポリミキシンＢの存在によっては効果は なかった（第３表）。

第３表 抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体 条件（１６ｈｒ）　’　＋２Ｊ特異性結合（ＣＰＭ）＋１ＵＶＢｃ　ｌｌ５ＶＥ ｃ 対照　６０３±１１　−　１１３２±３３１−１Ｏ０Ｂ／ｍｊ！　ｒｌＬ−１ベ ータ　５６８０±６３３　９Ｘ　８３２０±７６６　７．３Ｘ５０Ｂｇ／ｍｌ！ 　ｒｌＬ−１アルフ、　９９１０±５３８　１６Ｘ５０Ｂｇ／ｍｉ７　ｒＴＮＦ 　７１Ｌ７ｙ　９６５０±１５００　１６Ｘ　１２６９０±６５７　１１．２ｘ １０　μｇ／＋ｙｆ　ｔ、ｐｓ−９５３０±５１２　１６Ｘ　１０４５９±３８ ８　９．２ｘ１０Ｂｇ＃＋＋ｆ　ｒｌＦＮ　Ｓンマー　３１２０±３０８　５． ２Ｘ　４００２±６６４　３．５ｘｒｌＬ−１べ−９＋　ｒＴＮＦ　１４６９± １４１０　２４Ｘ　１６２６９±６６０　１４ＸｒｌＬ−１べ−５＋　ＬＰＳ　 １３９８６±７６１　２３Ｘ　１０８７０±８０５　１０ＸｒｌＬ−］　ベータ 　＋　ｒＩＮＦｆｉンマー　７８４９±６０１　１３Ｘ　８４０１±３９０　７ ．４ＸｒＴＮＦ　＋　ＬＰＳ　１５３６４±１２４１２４Ｘ　１６１４１±１２ ７２１４ＸｒＴＮＦ　＋　ｒｌＦＮ　ｉン２−　１３４８０±１１８９　２２Ｘ 　１３２３８±７６１　１２ＸＬＰＳ　＋　ＩＦＮ　ｎンマ−１０２０６±３２ ０　１７Ｘ　１０９８７±６６８　１０Ｘｉリミキシン［１（１０μｇ／ｍｌ） 　４８０±２３ホリミキシンＢ　＋　ｒｌＬ−１５３９０±９７　１１Ｘボリミ キシ：／Ｂ　＋　ｒＴＮＦ　９７８５±３８９　２０Ｘ１　μｇ／ｍ１Ｌｌ’Ｓ 　７５９８±４３２　１３Ｘｉ’）ミ蛙”ｉＢ　＋　ＬＦ’Ｓ　５１０±４４　 １．１ＸＨＶＥＣお、、及びＨ３ＶＥｃ−１−ＩＵＶＥＣまタハ１１　Ｓ　Ｖ、 Ｅ　Ｃ上（ＤＩＣＡＭ−１発現の上方規格化（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は９ ６ウエルプレートに１：３で融合性単一層から種付し融合状に増殖させた。

次１．）で細胞を各物質または培地で１６時間処理しＲＩＡを方法的に行った。

すべての数値は４回繰返しで行った。

実施例１２ Ｉ　ＣＡＭ−１のインターロイキン１およびガンマ−インターフェロン誘起の動 力学 皮ふ繊維芽細胞上でのＩ　ＣＡＭ−１発現へのインターロイキン−１およびガン マ−インターフェロン効果の動力学をＤｕｓｔｉｎ、　Ｍ。

Ｌｌ等の＋Ｓ１ヤギ抗マウス■ｇＧ結合アフセイを用いて測定した。

（Ｊ、　Ｉａｎｕｎｏｌ、　ＬＬＬ：　２４５−２５４　（１９８６）　；該文 献は参考として本明細書に引用する。〕この結合アンセイを行うために、ヒト皮 ふ繊維芽球を９６ウエルマイクロタイクープレート中で２〜８Ｘ１０’細胞／ウ エル（０，３２ｃｄ）に増殖させた。細胞を実施例１で記載したようにして補充 したＲＰＭ１１６４０培地で２回洗浄した。細胞をさらにハンクス平衡塩溶液（ ＨＢＳＳ）、１０１のＨＥＰＥＳ、０，０５％ＮａＮ３および１０％の熱不活性 ウシ胎児血清で１回洗浄した。この結合用パンファーでの洗浄は４℃で行った。

各ウェルに上記の結合用バッファー５０μｌおよびＸ６３およびＷ６／３２によ る適当なハイプリドーマ上清５〇−を、それぞれ陰性および陽性コントロールと して加えた。３０分間、４℃でのインキュベーシツン後、ウェルを２回結合用パ ンファーで洗浄し、第２の抗体１＊Ｊ−ヤギ抗マウスＩｇＧを１００ｐＥ中５０ ｎＣｉで加えた　ＩｔＪ−ヤギ抗マウス抗体はイオドゲン（Ｐｉｅｒｃｅ社）を 用いてＦｒａｋｅｒ、　ｐ、　Ｊ、等の方法に従って調製した（Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　８０　：　８４９　（１９ ７８）　）。

４℃で３０分後、ウェルを２回２００μＥの結合用パンファーで洗浄し、細胞層 を１００μｌの０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨを加えることによって可溶化した。この 処理および１００μｌ洗浄はバンクマン５５００ガンマーカウンター中で計数し た０分当り結合の特異的カウントを〔モノクローナル抗体によるｃｐｓ）−（Ｘ ６３によるｃｐＩＩ）として計算した。特異的試削による誘起を含むすべての工 程は４回繰返しで行った。

Ｉ　ＣＡＭ−１誘起における半減期２時間を有するインターロイキン１の効果は 半減期３．７５時間を有するガンマ−インターフェロンの効果よりも急速であっ た（第６図）、ＩＣＡＭの静止レベルに戻る時間は細胞サイクルまたは細胞増殖 によっているようであった。静止状態細胞においては、インターロイキン１およ びガンマ−インターフェロン効果は２〜３日安定であり、一方対数期培養におい ては、Ｉ　ＣＡＭ−１発現はこれら誘起剤の除去＠２日で基本線に近い。

組換えマウスおよびヒトインターロイキン１によるＩＣＡＭ−１誘起および組換 えガンマ−インターフェロンによるＩ　ＣＡＭ−１誘起のドーズレスポンス曲線 を第７図に示す、ガンマ−インターフェロンおよびインターロイキン１は１．ｎ ｇ／−で殆んど同一の効果を有する同じような濃度依存性を有することが判った 。ヒトおよびマウス組換えインターロイキン１も同様な曲線を有するが、Ｉ　Ｃ ＡＭ−１発現の誘起においてヒトインターロイキン１製剤よりもかなり低い効果 を示している。

シクロヘキシミド（たん白質合成のインビビター）およびアクチンマイシンＤ　 （ｍＲＮＡ合成のインビビター）は繊維芽球上でのＩ　ＣＡＭ−１発現における インターロイキン１およびガンマ−インターフェロンの効果を壊滅させる（第４ 表）・、さらにまた、ツニカマイシン（Ｎ結合グリコジル化のインヒビクー）の みはインターロイキン１効果を４３％まで抑制した。これらの結果はたん白質お よびｍＲＮＡ合成がＩ　ＣＡＭ−１発現におけるインターロイキン１およびガン マ−インターフェロン誘起増大において必要であるがＮ−結合グリコシル化の方 はそれを必要としないことを示している。

第４表 対照（４ｈｒ）　１５２４＝！−１４０１１９２８：！＝６００÷シクロヘキシ ミド　１５１３±２１０　１０６７８　”４７１＋７クチ／フイシン０　１５９ ０＝！：４６　１２２７６±６０８＋ツニカマイシン　１４６１±１７６　１２ ３４０±９４０ＩＬ−１（１０υ／　ｄ）　（４ｈｒ）　４２６４±２４９　１ ２１５５±５１０＋シクロヘキシイミド　１６１９±３８１　１２６７６±４４ ６÷アクチノマイシンＤ　１６１３±８８　１２２９４±１２３＋ツニカマイシ ン　３０８４±１１３　１３４３４±６６１１ＦＮ−ｒ　（ＩＯＵ／ｗｉ）（１ ８ｈｒ）　４６５９±１０９　２３６７５±５００÷シクロヘキシミン　１４６ １±５９　１０６７５±８００１ヒト繊維芽球を８Ｘ１０’細胞１０．３２ｃｄ ウエルの密度に増殖させた。処理は各試剤を含有する５０μｌ最終濃度で行った 。シクロヘキシミド、アクチンマイシンＤおよびツニカマイシンは、それぞれ、 サイトカインと同じ時間で２０μｇ／ｌＲ１，１０μＭおよび２μｇ／−で加え た。すべての数値は４回重複ウェルの平均上ＳＤである。

実施例１３ Ｉ　ＣＡＭ−１の組織分布 組織化学試験をヒト器官の凍結組織上で行い胸腺、リンパ節、腸、皮ふ、じん臓 および肝臓中のＩ　ＣＡＭ−１の分布を測定した。

そのような分析を行うために、正常ヒト組織の凍結組織切片（４μｍ厚さ）をア セトン中で１０分間固定したモノクローナル抗体、ＲＲ１／１でＣｅｒｆ−Ｂｅ ｎｓｕｓｓａｎｓ　Ｎ、等により開示されたアビジンービオチンコンブレンラス 法（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリンゲーム、ＣＡ）を用 いたイムノパーオキシダーゼ法により染色した（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、上主立： ２６１５　（１９８３））、抗体とのインキュベーシヨン後、切片をビオチン化 ウマ抗マウスＩｇＧおよびアビチン−ビオチン化バーオキシグーゼ複合体で順次 インキュベートした。各切片は最終的には３−アミノ−９−エチル−カルバゾー ル（アルドリンチケミカル社、ミルウォーキー、Ｗｌ）を含有する溶液に浸して 呈色反応を行った０次いで、各切片を４％ホルムアルデヒド中で５分間固定させ てヘマトキシリンで対同染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）させた、コントロー ル（対照）はＲＲＩ／１抗体の代りに無関係のモノクローナル抗体でインキュベ ートした切片を含んでいた。

Ｉ　ＣＡＭ−１は主要組織親和性コンプレックス（ＭＭＣ）クラス■抗原の分布 と殆んど同じ分布を有していることが判った。すべての組織中の血管（大および 小共に）の殆んどはＩ　ＣＡＭ−１抗体による内皮細胞染色を示した。管内及染 色はじん臓、肝臓および正常度ふ中の血管に較べてリンパ節、へん検線およびバ イヤー班中の小胞間（パラコーチカル）領域でより強い、肝臓においては、染色 は殆んど洞様毛細血管ライニング細胞に限定され、門静脈および動脈の殆んどラ イニングしているヘパトサイトおよび内皮細胞は染色されなかった。

胸腺ずい質においては、大細胞の拡散染色および樹木染色模様がみられた。皮質 においては、染色像は巣状であり主として樹木状であった。胸腺細胞は染色され てなかった。末梢リンパ球組織においては、２次りンバ濾胞の胚中心細胞は強く 染色していた。

あるリンパ濾胞においては、染色像は殆んど樹木状であり、リンパ球の認識し得 る染色はなかった。マントル領域の細胞のかすかな染色も観察された。さらに、 細胞質拡大（指間小網細胞）を有する樹木状細胞および小胞内またはバラコーチ カル領域のリンパ球の小数はＩ　ＣＡＭ−１結合性モノクローナル抗体で染色し ていた。

細胞様マクロファージはリンパ節および小腸の薄膜プロプリア内で染色されてい た。試験した器官の殆んどのストローマ内に拡散している繊維芽球様細胞（スピ ンドル形細胞）はＩ　ＣＡＭ−１結合性抗体により染色していた。外皮中のラン ゲルハンス／不定細胞中では染色は認められなかった。平滑筋組織中でも染色は 観察されなかった。

外皮細胞の染色はへん桃線の粘膜中で一貫して見られた。肝細胞、肝管外皮、腸 外皮細胞、およびじん臓中の管状外皮細胞は殆んどの情況において染色されなか ったが、じん細胞がん腫を有するしん摘出片からの正常じん臓組織の切片はＩ　 ＣＡＭ−１の多くの隣接管状軸重の染色を示した。これらの管状外皮細胞はまた 抗ＨＬＡ−ＤＲ結合性抗体によっても染色していた。

要するに、ＩＣＡＭ−１は管状外皮細胞のような非造血細胞上、および組織マク ロファージおよびマイトジェン刺ｉ！ｋＴリンパ芽球のような造血細胞上に発現 する。Ｉ　ＣＡＭ−１は末梢血リンパ球に少量発現することが判った。

実施例１４ モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィーによるＩＣＡＭ−１の精製 ＝３１ｆｆｉ畷 Ｉ　ＣＡＭ−１をヒト細胞または組織からモノクローナル抗体アフイニテイクロ マトグラフイーを用いて精製した。ＩＣＡＭ−１と反応性のモノクローナル抗体 ＲＲＩ／１を最初に精製して不活性カラムマトリックスに結合させた。この抗体 は“Ｒｏｔｈｌｅｉｎ＋　Ｒ。

等、Ｊ　１ｍｍ凹ｆ−上主工：１２７０−１２７４　（１９８６）”および”　 Ｄｕｓｔｉｎ、Ｍ、Ｌ、等、Ｊ　Ｉ＋ａｍｕｎｏｌ　土１１：　２４５　（１９ ８６）’に記載されている。ＩＣＡＭ−１を細胞膜から細胞を非イオン性清浄剤 トリトンＸ−１００中で近中性ｐＨで溶解することによって可溶化した。可溶化 Ｉ　ＣＡＭ−１を含有する細胞溶解物をカラムマトリックス材料に非特異的に結 合する物質を除去するように設計されたプレカラムに通し、次いでモノクローナ ル抗体力うムマトリックスに通してＩＣＡＭ−１を抗体に結合させた。抗体カラ ムをｐＨをｐＨ１１，０まで上昇させた一連の洗浄剤洗浄パンファーで洗浄した 。これらの洗浄中、Ｉ　ＣＡＭ−１は抗体マトリックスに結合したままであり、 結合してないまた弱く結合している不純物は除去された０次いで、結合ＩＣＡＭ ’−１をＰＨ１２，５の洗浄剤パンファーを通用することによってカラムから特 異的に溶出させた。

モ　ロー　ル　ＲＲの　りお　セ　ローズＣＬ−Ｂへの北　七人 抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲＩ／１．をハイプリドーマ含をマウス の腹水またはハイブリドーマ培養上清から標準の硫酸アンモニウム沈降法および プロティンＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した〔Ｅｙ等、Ｉ＋ ＊ｍｕｎｏｃｈｅｍ　１５　：　４２９（１９７８））。精製１ｇＧまたはラフ ト１．Ｇ　（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）をセファローズＣＬ−４ Ｂ　（ファルマシア社、スウェーデン）にＭａｒｃｈ等の方法〔＾ｎａ１．Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、６０　：１４９　（１９７４））の修正法を用いて共有結合させた 。要するに、セファローズＣＬ−４Ｂを蒸留水中で洗浄し、５Ｍのに２１１１’ ０゜（ｐＨ約１２）中の４０　ｔｎｇ／ｍ１．ＣＮ　Ｂ　ｒで５分間活性化し、 次いで０、１　ｍＭ　ＩＩＣｊ！で４℃にて長く洗浄した。濾過し活性化したセ ファローズを等容量の精製抗体＜０．１　Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯｓ　、０．１　Ｍ　 ＮａＣｊ！中２〜１０ｍｇ／Ｉｎ１）で再懸濁させた。懸濁液を４℃で１８時間 ゆるやかな端から端までの回転によりインキュベートした。次いで、上清を未結 合抗体について２８０ｉｍの吸収によりモニターし、活性化上′ファローズの残 りの反応部位をグリシンを０．０５Ｍに加えることによって飽和させた。結合効 率は通常９０％以上であった。

ヒトひ臓から調製した膜の洗浄剤可溶化すべての手順を４℃で行った。ヘアリー 細胞白血病の患者からの凍結ヒトひａ（２００ｇフラグメント）を氷上で１ｍＭ のフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）　、０．２Ｕ／ａｔ’の アプロチニンおよび５ｍＭのイオドアセタミドを含有する２００ｄトリス−塩水 （５０ｍＭのＴｒｉｓ：　０．１４　ＭのＮａＣ１１４℃でｐｌ＋７．４）中に 溶解させた。組織を小片に切断し４℃でチクマー強力ホモジナイザーで均質化し た。容量をトリス−塩水で３００−とし、トリス−塩水中１０％トウィーン４０ （ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）１００ｍｌ！を加え最終濃 度２．５％トウィーン４０を得た。

膜を調製するため、均質化物を３ストロークのドンス（Ｄｏｕｎｃｅ）またはよ り好ましくはテフロンポッターエルブジャムホモジナイザーを用いて抽出し、次 いで１１００Ｏｘで１５分間遠心した。

上溝を残し、ベレットをトリス−塩水中の２．５％トウィーン４０の２５０ｒｎ ｌで再抽出した。１１００Ｏｘで１５分間の遠心後、両袖出物からの上清を一緒 にし１５０，０００ｉｇで１時間遠心して膜をペレット化した。膜を２００艷の トリス−塩水中に再懸濁させることによって洗浄し、１５０，０００ｉｇで１時 間遠心した。

膜ベレフトを２００−のトリス−塩水中に再懸濁させ、モーター駆動ホモジナイ ザーおよびテフロンペストルで懸濁液が濃密になるまで均質化した。容量を次い でトリス−塩水で９００ｉ、ｅまでにし、Ｎ−ラウロイルサルコシンを最終濃度 １％になるよう加えた。

４℃で３０分の攪拌後、洗浄剤溶解物中の不溶性物質を１５０．０００ｉｇ、１ 時間での遠心により除去した。トリトンＸ−１００＋上滑に最終濃度２％に加え 、熔解物を４℃で１時間攪拌した。

ＪＹＢ−１ンパ　の゛　′　ロｒ ＥＢＶ形質転換Ｂ−リンパ芽球細胞系ＪＹを１０％ウシウシ血清（Ｆｅ２）およ び１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭ１１６４０中で０．８〜１．０Ｘ１０ “細胞／−の密度に増殖させた。

Ｉ　ＣＡＭ−１の細胞表面発現を増大させるため、ホルボール１２−ミリステー ト１３−アセテート（ＰＭＡ）を細胞を収穫する前に２５Ｍｇ／−で８〜１２時 間で加えた。バナジン酸ナトリウム（５０ＭＭ）もこの時間中に培養物に加えた 。細胞を５００ｉｇで１０分間遠心することによってペレット化しハンス平衡塩 溶液（ＨＢＳＳ）中で再懸濁および遠心することによって２回洗浄した。細胞（ ５１の培養物当り約５ｇ）を５０−の溶解パンファー（０，１４Ｍ　ＮａＣ７！ 、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ８，０，１％トリトンＸ−１００，０，２μ ／−アプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦ、５０ＭＭバナジン酸ナトリウム）中に４ ℃で３０分間攪拌することによって溶解させた。未溶解核および不溶性片を１０ ．ＯＯＯｘｇで１５分間の遠心、次いで、１５０，０００ｉｇでの１時間の上滑 の遠心および上滑のワンドマン３ｍフィルター紙による濾過により除去した。

構造検討のためのＩ　ＣＡＭ−１のアフイニテイクロマトグラフ、土ニー 構造検討に使用するＩＣＡＭ−１の大規模精製として、１０ｄのＲＲＩ／１−セ ファローズＣＬ−４Ｂのカラム（２，５ｍｇの抗体／ゲルのｄで結合）、および ＣＮＢｒ−活性化、グリシン安定化セファローズＣＬ−４ＢおよびラットＩｇＧ 結合セファローズＣＬ−４Ｂ（２■／−）の２種のプレカラムを用いた。各カラ ムを直列につなぎ、１０カラム容量の溶解バッファー、１０カラム容量のｐＨ１ ２，５バフ７７−　（５０ｍＭ）リエチルアミン、０．１％トリ）：／Ｘ−１０ ０，４℃テｐＨ１２，５）　テ予ＵＯ洗浄り次イテ１０　力５人容量の溶解バッ ファーで平衡させた。１１のヒトひ臓の洗浄剤溶解物を０．５〜１．０ｍｉ！／ 分の流速で負荷させた。２つのプレカラムはＲＲ１／１−セファローズカラムに 通ず前の溶解物から非特異結合物質を除去するのに用いた。

負荷後、ＲＲ１／１−セファローズのカラムおよび結合ＩＣ八Ｍ−１を（１）溶 解バッファー、（２）２０ｍＭ↑ｒｉｓ　ｐＨ８，０／　０．１４　Ｍ　ＮａＣ Ｊｌｏ、１％トリトンＸ−１００、（３）２０ｒｎＭグリシンｐＨ１０，０／　 ０．１１１．０１０．１％トリトンＸ−１００の各々最低５カラム容量で１−７ 分の流速で順次洗浄した。すべての洗浄バッファーは１ｍＭのＰＭＳＦと０．２ μ／艷のアプロチニンを含んでいた。洗浄後、残留結合ＩＣＡＭ−１を５カラム 容量の溶出バッファー（５０ｍＭトリエチルアミン７０．１％トリトンＸ−１０ ０／４℃でｐＨ１２，５＞により１ｄ／３分の流速で溶出させた。溶出Ｉ　ＣＡ Ｍ−１を１ｄフラクシヨンに集め直ちに０．１ｒｎ１のＩＭ）リス、ｐｌ＋６． ７を加えて中和させた。ＩＣＡＭ−１を含有するフラクションを１０μｌのアリ コートの５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動［Ｓｐｒｉｎｇｅｒ等、Ｊ、Ｅｘ 　Ｍｅｄ　：１９０１　（１９８４）　）により次いで銀染色（Ｍｏｒｒｉｓｓ ｅｙ、Ｊ、Ｈ，、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７　：　３　０　７　（１９８ １）　〕によって同定した。これらの条件下で、Ｉ　ＣＡＭ−１のバルクが約１ カラム容量に溶出し、銀染色電気泳動から判断して９０％以上の純度であった（ アフィニティーマトリックスから漏出した少量のＩｇＧが主要不純物であった） 、ＩＣＡＭ−１を含有するフラクションをプールしセントリコン−３０マイクロ コンセントレータ−（アミコン社、デンバース、ＭＡ）を用いて約２０倍に濃縮 した。精製ＩＣＡＭ−１，をプールのエタノール沈降アリコートのローリ−（Ｌ ｏｗｒｙ）たん白質アッセイにより定量した。約５００μｇの純ＩＣＡＭ−１を ２００ｇのヒトひ臓から調製できた。

約２００μｇの精製Ｉ　ＣＡＭ−１を分離用５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動により第２段階の精製に供した。ＩＣＡＭ＝１を示すバンドはゲルをＩＭ ＭｆＪ中にソーキングすることによって可視化させた。ＩＣＡＭ−１を含むゲル 領域を検査して”　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等、ｔ’１ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ 、９１　：　２２７　２３６（１９８３）”の方法によって電気溶出させた。精 製たん白質はＳＤＳ　−ＰＡＧＥおよび銀染色で判断したとき９８％以上の純度 であった。

２°　の・　のＩＣＡＭ−の　ニー　”１官能性試験用のＩ　ＣＡＭ−１を前述 したようなＪＹ細胞からの洗浄剤溶解物から精製したが、小スケール（１ｍｌの ＲＲＩ／１セファローズカラム）で次の修正を加えて行った。すべての溶液は５ ０μＭバナジン酸ナトリウムを含んでいた。カラムを０．１％トリトンＸ−１０ ０含有ｐ）１１１．０パンフアーで洗浄後、カラムを０．１％トリトンＸ−１０ ０に代えて１％のｎ−オクチル−ベーター−Ｄ−グルコピラノサイド（オクチル グルコシド）含有の同じバフファー５カラム容量で再洗浄した。オクチルグルコ シド洗浄剤はＩ　ＣＡＭ−１に結合したトリトンＸ−１００を除去し、トリトン Ｘ−１００と異なりその後透析により除去できる０次いで、Ｉ　ＣＡＭ−１を０ ．１％トリトンＸ−１００の代りに１％オクチルグルコシドを含むｐＨ１２，５ バツフアーで溶出させ、分析し、上述のようにしてｆｉ縮した。

実施例１５ ”ＩＣＡＭ−１の ヒトひ臓から精製したｌ　ＣＡＭ−１は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でＭ ｒ７２，０００〜９１，０００の広いバンドとして浸透する。ＪＹ細胞から精製 したＩ　ＣＡＭ−１もＭｒ７６．５００〜９７．０００の広いバンドとして浸透 する。これらＭｒは種々の細胞源から免疫沈降させたＩ　ＣＡＭ−１の報告され た範囲にある：ＪＹ細胞からのＭｒ−９０，０００、骨ずい卓球細胞系Ｕ９３７ 上の１１４．０００．および繊維芽球上の９７．０００　（Ｄｕｓｔｉｎ等、Ｊ 、Ｔｍｍｕｎｏｌ、３７　：　２４５　（１９８６）　）、　Ｍｒのこの広い範 囲は広汎であるが変化し得る度合のグリコジル化に貢献する。非グリコジル化プ レカーサーはＭｒ５５．０００を有する（Ｄｕｓｔｉｎ等）。

ＪＹ細胞またはヒトひ臓から精製したたん白質は、その元のアフィニティカラム への再結合能力によりまたＲＲＩ／１セファローズによる免疫沈降および５ＤＳ −ポリアクリルアミド電気泳動により明らかなように、その抗原活性を保持して いる。

Ｉ　ＣＡＭ−１のペプチドフラグメントを調製するためには、約２００μｇを２ ｍＭジチオスレイトール／２％ＳＤＳで還元し、次いで５ｍＭの沃化酢酸でアル キル化した。たん白質をエタノールで沈降させ、０．１　Ｍ　Ｎ１（ａｃｏｓ　 ／　０．１ｍＭ　ＣａＣｊ！ｚ　／　０．１％双性イオン剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇ ｅｎｔ　）　３　１４　（カルビオケミ社）中に再溶解させ、１％−／−トリプ シンで３７℃、４時間消化し、次いで１％トリプシンで３７℃、１２時間の追加 の消化を行った。トリプシンヘブチドを逆相ＨＰＬＣにより０，４Ｘ１５ａａＣ ４カラム（ｖｙｄａｃ社）を用いて精製した。ペプチドは０．１％トリフルオロ 酢酸中で０％〜６０％アセトニトリルの直線勾配によって溶出した０選択したペ プチドをガス相マイクロシーケネーター（アブライドバイオシステムズ社）での 配列分析に供した。この試験から得られた配列情報を第５表に示す。

第５表 ＩＣＡＭ−１）リプシンペプチドのアミノ酸配列アミノ酸残基　５０ａ　５０ｂ 　４６ａ　４６ｂＸ　４５　ＫＡＡ　Ｊ　Ｕ　ＯＭｌｌ　（Ｔ／Ｖ）Ａ　（Ｖ／ Ａ）　ＥＶ　Ｓ　ＬＥＡ　ＬＶ　Ｌ２　Ｆ　Ｓ　Ｑ　ＰＥ　Ｆ　ＮＬＧ　ＬＴＬ ／Ｅ３　Ｌ　Ｉ　Ｔ　ＡＬ　Ｐ　ＰＤＳ　ＧＬＰ／（Ｇ）４　↑　ＳＦ　ＡＡＴ ＬＶＩ　Ｐ ５　ν　Ｌ　Ｐ　Ｐ　ＰＶＲＬＥ　Ｇ／Ｙ６　Ｙ　Ｇ　Ｌ　Ｌ　ＮＴＰＶＴＮ／ Ｌ７　Ｐ　Ｗ　Ｐ　Ｐ　ＶＹＱＴＰ　（Ｎ）８　Ｔ　Ｐ　１　１　Ｔ／ＩＧＧＣ Ｐ／Ｖ　（Ｑ）９　Ｓ　Ｆ　Ｇ　（Ｇ）　Ｌ−ＬＳ　Ｋ　（Ｅ）１０　２　Ｅ　 （Ｃ１）−ＤＥＴ　（Ｄ）１１　Ａ　Ｓ　Ｄ／ＰＸＳＬＳ １２　Ｇ／Ｓ　Ｖ　Ｖ　ＰＦＦＣ １３Ａ　ＴＤＯ３ＥＣ １４Ｇ　Ｖ　ＷＶ／ＬＡ−Ｑ １５　１ＫＴＰ 実施例１６ ＩＣＡＭ−１遺伝子のクローニング ＩＣＡＭ−１の遺伝子は任意の種々の手順を用いてクローニングできる。例えば 、ＩＣＡＭ−１のトリプシンフラグメントのシーケンシング（第５表）から得ら れたアミノ酸配列情報を用いてＩ　ＣＡＭ−１遺伝子に相当するオリゴヌクレオ チド配列を同定し得る。また、ＩＣＡＭ−１遺伝子は抗ＩＣＡＭ−１抗体を用い てＩＣＡＭ−１を産生ずるクローンを検出することによってもクロ遺伝子コード ［Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ８口、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｇｅｎｅ。

第３版、−０Ａ、ベンジャミン社、メロノバーク、ＣＡ　（１９７７））を用い て、１種以上の異なるオリゴヌクレオチドを同定でき、その各々はＩＣＡＭ−１ ）リプシンペプチドをコードし得るものである。特定のオリゴヌクレオチドが実 際に現実のＩ　ＣＡＭ−１コ一ド配列を構成する可能性は異常な塩基対関係およ び特定のコドンを現実に真核細胞を用いて（特定のアミノ酸をコードする）頻度 を考慮することによって評価できる。そのような“コドン利用法則”は“Ｌａｔ ｈｅ、　Ｒ，等、Ｊ３Ｍｅｌｅｃ、口ｉｏ１．　１８３　：　１〜１２（１９８ ５）”により開示されている。Ｌａｔｔ＋ａの“コドン利用法則”を用いて、理 論的に“最も可能性のある”　ＩＣＡＭ−１）＋７ブシンペプチド配列をコード し得るヌクレオチド配列（即ち、最低の不要物を有するヌクレオチド配列）を含 有する単一オリゴヌクレオチドまたはオリ、ゴヌクレオチドのセットを同定する 。

ＩＣＡＭ−１７ラグメントをコードし得る理論的に“最も可能性のある２配列を 含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセントを用いて“最も可能 性ある”配列または配列のセントにハイブリッド化し得る相補オリゴヌクレオチ ドまたはオリゴヌクレオチドのセットの配列を同定する。そのような相補配列を 含むオリゴヌクレオチドはＩ　ＣＡＭ−１遺伝子を同定し単離するプローブとし て使用できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ −Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌコールド　スプリング　ハーバ−プレ ス社、コールド　スプリング、ＮＹ（１９８２））。

上記文献のセクションＣに記載されているように、Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子を含有 する可能性ある真核Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌ製物からＩ　ＣＡＭ−１遺伝子をクローニン グすることは可能である。ＩＣＡＭ−またん白質をコードする遺伝子を同定しク ローニングするためには、ＤＮＡライブラリーをその上記のオリゴヌクレオチド プローブとハイブリッド化する能力についてスクリーニングする。正常な二倍体 細胞中にはＩ　ＣＡＭ−１の遺伝子のほんの２つのコピーしか存在しないようで あるので、またＩ　ＣＡＭ−１遺伝子はクローニングが望まれない大きな非転写 介在配列（イントロン）を有し得る可能性があるので、好ましいのはゲノムＤＮ ＡよりはむしろＩ　ＣＡＭ−１産生性細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライ ブラリーからＩ　ＣＡＭ−１コ一ド配列を単離することである。適当なりＮＡま たはｃＤＮＡ調製物は酵素的に開裂させ、ランダムにせん断し、連結反応させて 組換えベクターとする０次いで、これら組換えベクターの上述のオリゴヌクレオ チドプローブとハイブリッド化する能力を測定する。ハイブリッド化の手順は、 例えば、”　Ｍａｎｉａｔｉｓ＋Ｔ、＋？１ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ＋、コールド　スプリング　ハーバ− プレス社、コールド　スプリングハーバ−１ＮＹ（１９８２）″または”　Ｈａ ｙｍｅｓ、Ｂ、？、等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　）Ｉｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ ｎ　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ＋　Ｉ　ＲＬブレス社、オック スフォード、英国（１９８５）”において開示されている。

そのようなハイブリッド化ができることが判っているベクターを分析してベクタ ーが含有するＩ　ＣＡＭ−１配列の程度および性質を分析する。純粋に仮説的な 考察によれば、ＩＣＡＭ−１分子をコードするような遺伝子はほんの１８ケのヌ クレオチドを有するオリゴヌクレオチドを用いて明確に同定できるであろう（ハ イブリッド化スクリーニングにより）。

即ち、要約すれば、ＩＣＡＭ−１ペプチド配列の現実の同定により、そのような ペプチドをコードし得る理論的に“最も可能性ある”ＤＮＡ配列またはそのよう な配列のセットの同定ができる。

この理論的配列に相補性のオリゴヌクレオチドを構築することにより（あるいは “最も可能性ある”オリゴヌクレオチドのセットに相捕的なオリゴヌクレオチド のセットを構築することにより）、Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子を同定し単離するプロ ーブとして機能し得るＤＮＡ分子（またはＤＮＡ分子のセット）が得られる。

第５表のＩＣＡＭ−１ペプチド配列を用いて、ＡＡおよびＪペプチドをコードし 得るオリゴヌクレオチドの“最も可能性ある”配列の配列を決定した（それぞれ 、第６表および第７表）。これら配列に相補性のメリゴヌクレオチドを合成し精 製してＩＣＡＭ−１遺伝子配列を単離するプローブとした。適当なサイズ選定ｃ ＤＮＡライブラリーをＰ　Ｍ　Ａ　ｍ起ＨＬ−６０細胞がらおよびｐｓ刺激へそ 帯静脈内皮細胞からのポリ　＜Ａ）”　ＲＮＡがら調製した。

匹：４０２３−４０２８　（１９８７））の方法に従ってＰＭＡ誘起ＨＬ−６０ 細胞からのボＩＪ　（Ａ）”　ＲＮＡを用いて調製した。

これらの文献は参考として本明細書に引用する。

サイズ選定ｃＤＮＡライブラリーはＰ３５μｇ／−で４時間刺激したへそ帯静脈 内皮細胞からのポリ　（Ａ）°を用いて調製した。

ＲＮＡは上記細胞を４Ｍグアニジニウムイソシアネート中で均質化し上清をＣｓ Ｃ７！勾配により超遠心に供することによって抽出した（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ＋Ｊ 、１１．等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８　：　５２９４−５２９９　（１９７９） 　）　。

ポリ　（Ａ）’　ＲＮＡは全ＲＮＡスペイシスの混合物がらオリゴ（ｄＴ）−セ ルロースクロマトグラフィー（タイプ３、コラボラティブ　リサーチ社）を用い て単離した（Ａｖｉν、Ｈｏ等、丘匹。

第６表 ＩＣＡＭ−Ｉ　ＡＡペプチドをコードし得る最も可能性あるヌクレオチド配列に 相補性のオリゴヌクレオチド第７表 第１のストランドｃＤＮＡを８ｇｇのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡ、トリ骨すい芽球 症ウィルス逆転写酵素（ライフサイエンス社）およびオリゴ（ｄ　Ｔ）プライマ ーと用いて合成した。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはラナーゼＨ（ＢＲＬ社）で 消化、第２ストランドはＤＮＡポリメラーゼＩ　（二ニーイングランド　バイオ ラプス社）を用いて合成した。生成物をＥｃｏＲＩリンカ−にューイングランド 　バイオラプス社）でメチル化し、ＥｃｏＲＩりンカーにューイングランド　バ イオラプス社）にプラントエンド連結反応させ、ＥｃｏＲＩで消化し低融点アガ ロースゲル上でサイズ選定した。５００ｂｐより大きいｃＤＮＡを前辺てＥｃｏ ＲＩ消化させ脱リン酸化させている２ｇ　Ｌ４０に連結反応させた（ストラタジ ーン）。連結反応生成物を次いでパッケージングしたくストラクタシーンゴール ド）。

次に、へそ帯静脈内皮細胞およびＨＬ−６０ｃＤＮＡライブラリーを２０．００ ０　ＰＦ、ｕ／　１５０ｍｍプレートに塗布した。組換えＤＮＡを複製中でニト ロセルロースフィルターに移し、０．５ＭＮａ０ｌｌ／　１．５　Ｍ　ＮａＣ１ 中で変性しＩＭ）リス、ｐＨ７、５／　１．５　Ｍ　Ｎａｉ中テ中和シ、８０℃ で２時間ベーキングした［　Ｄｅｎ　Ｌｏｎ、　１１１．　Ｄ、等、５ｃｉｅｎ ｃｅ　１９６　：１８０−１８２　（１９７７）　〕、フィルターをプレハイブ リッド化し、５　Ｘ　Ｄｅｎｌ＋ａｒｄｔ溶液、５０　ｍＭ　ＮａＰＯ，および ｌμｇ／−のサケ精子ＤＮＡを含む５ＸＳＳＣ中でハイブリッド化した。プレハ イブリッド化は４５℃で１時間行なった。

ハイブリッド化は３２ｂｐ　（’　５−ＴＴＧＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧ ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＣ＞または４Ｔｂｐ（５’　−ＧＡＧＧＴＧＴＴＣ ＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣ ＴＣ）抗感覚オリゴヌクレオチドを上述の方法で、それぞれ、ＩＣＡＭ−１トリ プシンペプチドｊおよびＡＡ（第６表および第７表）上で用いて行なオリゴヌク レオチドはｒ−（”Ｐ）ＡＴＰでＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび製造者（ 二ニーイングランド　バイオラプス社）に推奨される条件を用いて末端標識した 。オーバーナイトＡイブリント化に続いて、フィルター２ｘＳＳＣ１０，１％Ｓ ＤＳで３０分間、４５℃で２回洗浄した。ファージをハイブリッド化を示すプラ ーグから単離し、連続再塗布および再スクリーニングにより精製した。

Ｉ　ＣＡＭ−１の　によるｌ　ＣＡＭ−１の′　−のクローニング Ｉ　ＣＡＭ−１の遺伝子を別法として抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体の使用をＩ　ＣＡＭ −１を発現し得る細胞から抽出し精製する。精製ｃ　ＤＮＡをフラグメント化し くせん断化、エンドヌクレアーゼ消化等により）ＤＮＡまたはＣＤＮＡフラグメ ントのプールを調製する。このプールからのＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメント を発現ベクターにクローニングして各々のメンバーが特異的クローン化ＤＮＡま たはｃＤＮＡフラグメントを含有する発現ベクターの遺伝子ライブラリーを調製 する。

実施例１７ ｃＤＮＡクローンの分析 陽性クローンからのファージＤＮＡをＥＣ０ＲＴで消化し、１つのクローンから のＣＤＮＡをプローブとして用いてサウサーン分析により試験した。交差ハイブ リッド化した最大サイズｃ　ＤＮＡ挿入物をプラスミドベクターｐＧＥＭ４Ｚ　 （プロメガ社）のＥｃ　ｏＲＩサイトにサブクローニングした０両配向でｃＤＮ Ａを含むＨＬ−６０サブクローンをエンドヌクレアーゼ■消化〔ｈ亘胚■」ユ釦 匹　２８：３５１−３５９　（１９８４））により製造者の推奨（エラスーアー ベース、プロメガ社）に従って欠落させた。漸次的に欠落させたｃＤＮＡを次い でクローニングしてジデオキシヌクレオチドｔＪｉＰ一端シーケンシングに製造 者の推奨（シーケナーゼ、Ｕ、Ｓ、バイオケミカル社）に従って供した（Ｓａｎ ｇｅｔ、Ｆ、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ閃、　Ｓｃｉ　（υ５Ａ）７４ ：　５４６３−５４６７　（１９７７））、ＨＬ−６０ｃＤＮＡ５’およびコー ド領域を両ストランド上で完全にシーケンシングし、３′領域を両ストランド上 で約７０％シーケンシングした０代表的な内皮ｃＤＮＡをその長さの殆んどに亘 って４ｂｐＬＩＴＪｓ制限酵素フラグ列を確立した（第８図）、３０２３ｂｐ配 列は短い５′未はん訳領域と位１１２９６６に共通ポリアゾヒル化シグナルを有 する】、３ｋｂ３’未はん訳領域を含む、最長開放読み枠は位置５８の第１ＡＴ Ｇで始まり位置１６５３のＴＧＡ終端終端トリフレフトる。

はん訳アミノ酸配列と合計９１個のアミノ酸の８種の異なるトリプシンペプチド から決定した配列（第８図中でアンダーラインを施している）との間の同一性は 信転できるＩ　ＣＡＭ　−１ｃ　ＤＮＡクローンが単離されたことを認識した。

ＩＣＡＭ−１）リブシンペプチドのアミノ酸配列を第８表に示す。

第８表 Ｕ　３０−３９　ＬＬＧｌｌＥＴＩ’Ｌ　（Ｐ）（Ｋ）５０　７８−８５　（Ｔ ）ＦＬＴＶＹＸ↑Ｘ　８９−９５　ＶＥＬＡＰＬＰ −一配列が次の行に続くことを示す。アンダーラインを施した配列はオリゴヌク レオチドプローブを調製するのに用いた。

疎水性分析［Ｋｙｔｅ、　Ｊ、等、ＪｏＭｅｌｅｃ、口ｉｏ１．　１５７　：　 １０５−１３２　（１９８２）］は２７残基シグナル配列の存在を示唆している 。＋１グルタミンの役目は３種のＩ　ＣＡＭ−またん白質調製物上にＮ−末端配 列を本発明で得ることができないことと一致しており；グルタミンはフィログル タミン酸に環状化しブロックしたＮ−末端をもたらす。１〜４５３のほん訳配列 は主として親水性であり２４残基の疎水性の推定トランスメンブランドメインが 続く。トランスメンブランドメインはその後すぐに２７残基の推定細胞質ドメイ ン内に含まれた数個の荷電残基が続く。

成熟ポリペプチド鎖の予示すイズは５５．２１９ダルトンであり、脱グリコジル 化Ｉ　ＣＡＭ−１の観察されたサイズ５５．０００と良好に一致している［Ｄｕ ｓｔｉｎ、Ｍ、Ｌ、等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７　：　２４５−２５４　（ １９８６））。８個のＮ−結合グリコシル化部位が予示される。これらの部位の ２つのトリプシンペプチド配列中のアスパラギンの不存在はそれらのグリコジル 化とそれらの細胞外配向を確認している。高マンノースＮ−結合カルボハイドレ ート当り２．５００ダルトンを想定すると、７５．０００ダルトンのサイズがＩ 　ＣＡＭ−１プレカーサーについて予示され、観察されたサイズ７３．０００ダ ルトン（Ｄｕｓｔ　ｉｏｎ、　Ｍ、Ｌ、等、Ｊ、　ＩＩＩｌｍｕｎｏｌ、　１３ ７　：２４５−２５４　（１９８６））に匹敵する。高マンノースのコンプレッ クスカルボハイドレートへの転換後、成熟ＩＣＡＭ−１糖たん白質は細胞の種類 により７６〜１１／１ｋｔｌである［　［］ｕｓＬｉｎ。

Ｍ、し０等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：２’４５−２５４　（１９８６）　 〕。

即ち、Ｉ　ＣＡＭ−１は高度にグリコジル化されているが典型的な完全膜たん白 質である。

実施例１８ Ｉ　ＣＡＭ−１は免疫グロブリン超遺伝子群のインテグリン結合性１員である： ＩＣＡＭ−１内部繰返し配列をミクロジココ（ｌＪｉｃｒｏｇｅｎｉｅ）たん白 質配列プログラム［０ｕｅｅｎ、　Ｃ，等、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄ　Ｒｅｓ、　１ ２　：　５８１−５９９　（１９８４）］を用い次いで検査することによって行 なった。ＩＣＡＭ−１のＩｇＭ、Ｎ−ＣＡＭおよびＭＡＧへの配列をミクロジコ コおよびＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｐｏｒｆ、　Ｍ、　０．等、ＭｅＬｈ、 ＥｎｚＩｌｏｌ、９１　：　５２４−５４５　＜１９８３）　］を用いて行なっ た。ナショナル　バイオメゾカル　リサーチ　ファンデーション（Ｎａｔｉｏｎ ａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　）に 保管されている４種のたん白質配列データベースをＷｉｌｌｉａｍｓとＰｅａｒ ｓｏｎのＦＡＳＴＰプログラムを用いてたん白質配列の類似性について調（１９ ８，５））。

ＩＣＡＭ−１はインテグリンのリガンドであるので、免疫グ巳プリン超遺伝子群 の１員であることは予期されなかった。しかしながら、Ｉ　ＣＡＭ−１配列の調 査はその配列が免疫グロブリン超遺伝子群中の身内関係に畏唱されたすべての規 準を満たすことを示している。これらの基準を以下に説明する。

Ｉ　ＣＡＭ−１の全細胞外ドメインを第９Ａ図に配列して示した′５つの相同性 免疫グロブリン様ドメインから構築する。ドメイン１−４はそれぞれ８８．９７ ．９９および９９の残基長であり、かくして典型的な１ｇドメインサイズを有し ており；ドメイン５は６８個の残基中で切り取られている。ＦＡＳＴＰプログラ ムを用いてのＮＢＲＦデータベースの調査はＩｇＭとＩｇＧ　Ｃトメターαサブ ユニット可変ドメイン、およびアルファ１ベータ糖たん白質と有意の相同性を示 していた（ｆ９Ｂ−Ｄ図）。

上記の情報を用いて、Ｉ　ＣＡＭ−１のアミノ酸配列を免疫グロブリン超遺伝子 群の他の１員のアミノ酸配列と比較した。

Ｉｇ超超遺伝子群メインの３つのタイプであるＶ、ＣＩおよびＣ２は分化されて いる。■とＣの両ドメインは内部ドメインジスルフィド結合により一緒に結合し ている２β−シートから構築されており；■ドメインは９つの抗平行β−ストラ ンドを有しＣドメインは７つ有している。定常ドメインを第９Ａ図に示した特徴 的残基に基づいてＣ１およびＣ２−セットに分割した。Ｃ１−セットは抗原認識 中に含まれるたん白質を含んでいる。Ｃ２−セットは数個のＦＣレセプターとＣ Ｄ２、ＬＦＡ−３、ＭＡＧおよびＮＣＡＭを包含する細胞粘着中に含まれるたん 白質とを含んでいる。Ｉ　ＣＡＭ−１ドメインはこのセット中でＩ　ＣＡＭ−１ と置き変っているＣ２−セットのドメインと最も強い相同性を有することが判っ た；このことは第９図のβ−ストランドＢ−Ｆについて示されているように０１ ドメインよりもＣ２中の保持残基により強く類似している点にも反映されている 。また、ＩＣＡＭ−１ドメインはＶおよびＣ１ドメイン中の上記ストランドとよ りもＣ２ドメインのβストランドＡおよびＧとより一層良好に列んでおり、全０ ２ドメイン強度を横切って良好な配列を可能としている。

ＮＣＡＭ、ＭＡＧおよびアルファ１−β糖たん白質からの０２ドメインとの配列 は第９Ｂ図および第９Ｃ図に示されており；同一性は２８〜３３％の範囲であっ た。Ｔ細胞レセプターＶα２７％同−性およびＩｇＭ　Ｃドメイン３３４％同一 性との配列も示されている（第９Ｂ、９Ｏ図）。

免疫グロブリンドメインの最も重要な特徴の１つはβシートサンドイッチを安定 化するＢおよびＦβストランドを架橋するジスルフィド結合システィンであり； ＩＣＡＭｉにおいてはシスティンはすべての場合に保持されているが、ドメイン ４のストランド「においては、上記サンドイッチに面しかついくつかの他のＶ− およびＣ２−セットドメインにおいて提案されたような接触を安定化しているロ イシンが見い出される。システィン（４３，５０，５２および３７残基）間の距 離は０２セツトについて述べたとおりである。

ＩＣＡＭ−１中の鎮間ジスルフィド結合の存在について試験するために、内皮細 胞Ｉ　ＣＡＭ−１を還元および非還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。内皮 細胞１ｃＡＭ−１はこれがＪＹまたは毛状ひ臓細胞ＩＣＡＭ−１よりも小さいグ リコジル化異種原性を示しＭｒ中のシフトにより大きな感応性を示すことがら使 用した。従って、ＩＣＡＭ−１を１６時間ＬＰＳ　（５μｇ／ｍ１）刺激ヘソ帯 静脈内皮細胞培養物から前述したようなイノムアフイニティークロマトグラフィ ーにより精製した。アセトン沈降ＩＣ式Ｍ−１を０．２５％２−メルカプトエタ ノールまたは２５ｍＭイオドアセタミド含有のサンプルバッファ　［Ｌａｅｍｍ ｌｉ、Ｕ、に、、Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５　＜１９７０））中に再 懸濁させ１００℃に５分間もたらした。サンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥ４６７０お よび銀染色４６１３に供した。内皮細胞Ｉ　ＣＡＭ−１は還元条件下で１００ｋ ｄの見掛けのＭｒをまた非還元条件下で９６ｋｄを示し天然ＩＣＡＭ−１中の鎖 間ジスルフィドの存在を強く示唆していた。

二次構造を予想するための一次配列の使用（Ｃｈｏｎ、　Ｐ、　Ｙ、等、Ｉｌｉ ｏｃｈｅｍ、１３：２１１−２４５　（１９７４）　：１は、ｉ９Ａ９Ａ方にａ −ｇと表示され、免疫グロブリンドメインについての予想を正確に満たしまた免 疫グロブリン中のストランドＡ−Ｈの各位置（第９Ａ図下方）に相応する各１ｃ ＡＭ−１ドメイン中の７つの予期されたβ−ストランドを示していた。ドメイン ５はＡおよびＣストランドを欠損しているが、これらはシートの端部を形成して いるので、各シートは依然として恐らくはストランドＤによって形成しておりい くつかの他の０２ドメインで提案されたようにストランドＣの代理をしており； またＢおよびＦストランド間の特徴的ジスルフィド結合は影響を受けないであろ う。即ち、ドメインサイズ、配列相同性、推定ドメイン間ジスルフィド結合を形 成する保持システィン、ジスルフィド結合の存在、および予想βシート構造の基 準はすべて免疫グロブリン超遺伝子群中でのＩＣＡＭ−１の内在を満たしている 。

ＩＣＡＭ−１は０２セツトのＮＣＡＭおよびＭＡＧ糖たん白質と最も強く相同性 であることが判明した。このことはＮＣＡＭとＭＡＧが共に細胞−細胞粘着を媒 介するので特に興味深い。ＮＣＡＭは二二一ロンーニコーロンおよび神経−筋相 互作用において重要であり［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、　Ｂ、　Ａ、等、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２３６　：　７９９−８０６（１９８７））、またＭＡＧはミニリン化 （ｍｙｅｌ　１ｎａｔｉｏｎ）中の二ニーロン−オリゴデンドロサイトおよびオ リゴデントロサイトーオリゴデントロサイト相互作用において重要である（Ｐｏ ｌｔｏｒａｋ。

Ｍｌ等、Ｊ、Ｃｃｌｌ、口ｉｏ１．１０５＋１８９３−１８９９　＜１９８７） ］　。

ＮＣＡＭとＭＡＧの細胞表面発現は神経系形成およびミＩＪエン化中に、それぞ れ、炎症におけるＩ　ＣＡＭ−１の調整された誘起としまた相同性である、何故 ならば、各々はＮ末端細胞外領域を形成する５つの０２ドメインから構成された 完全膜糖たん白質であるからである。ただし、ＮＣＡＭにおいては、ある追加の 非１ｇ様配列が最後の０２ドメインとトランスメンブランドメイン間に存在する 。Ｉ　ＣＡＭ−１はトランスメンプランと細胞質ドメインを含むその全体長に亘 って：＋ｉ　Ａ　Ｇと２１％の同一性を有して列んでおり；同一％の同一性がＩ ＣＡＭ−１とＮＣＡＭ−１の５つのドメインを比較したとき見出される。Ｉ　Ｃ ＡＭ−１とＭＡＧの二次構造の図式的比較は第１Ｏ図に示している。ドメイン対 ドメインの１ヒ較はＩＣＡＭ−１とＮＣＡＭ分子内のドメイン間の相同性のレベ ル（それぞれ、ｘ＋ｓ、ｄ、２１±２．８％および１８．６±３．８％）°はＩ 　ＣＡＭ−１ドメインをＮＣＡＭおよびＭＡＧドメインと比較したときの相同性 のレベル〈それぞれ、２０．４±３．７および２１．９±２．７）と同じである ことを示している。ＮＣＡＭ　［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ。

Ｂ、　Ａ、等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６　ニア９９−８０６　（１９８７）　］ ：Ｂａｒｔｈｅｌｓ、口、等、　ＥＭＢＯＪ、６：９０７−９１４　（１９８７ ））およびＭＡＧ　［Ｌａｉ、Ｃ，等、Ｉ’ｒｏｃ、Ｎａ１ｌ、八ｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、（ＬＩＳ八）　８４　：　４３７７−４３４１　（１９８７）］のＣ−末 端領域における別の接合の証拠は存在するけれども、これが内皮またはＨＬ−６ ０１ＣＡＭ−１クローンのシーケンシングにおいであるいは種々のタイプのＩ　 ＣＡＭ−またん白質バックボーンおよびプレカーサーの研究［１］ｕｓＬｉｎ、 Ｍ、Ｌ、等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３７　：　２４５−２５４　＜１９８６ ））において見出されたという証拠はない。

１、ＣＡＭ−１は多くの種々の細胞種とのリンパ球相互作用におけるＬＦＡ−１ 用のリガンドとして機能する。リンパ球は人工膜２重層に含まれたＩｃＡＭ−１ と結合し、これはリンパ球上にＬＦＡ−１を必要としＩ　ＣＡＭ−１とＬＦＡ− １の相互作用を直接示唆している（Ｍａｒ　ｌ　ｉ　ｎ、　Ｓ、口０等、Ｃｅ１ ｌ　５１　：８１３−８１９＜１９８７））。ＬＦＡ−１は白血球インテグリン であり免疫グロブリン様特徴を有しない。白血球インテグリンは１種のインテグ リン亜族を含む。他の２つの亜族は細胞マトリックス相互作用を媒介し、フィブ ロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンおよびフィブリノーゲンを包含するそ のリガンド内の配列ＲＧＤを認白血球インテグ′リンは白血球上のみに発現し、 細胞−細胞相互作用に含まれ、わずかに公知のリガンドはＩ　ＣＡＭ−１と１Ｃ ３ｂ（即ち免疫グロブリン様特徴を示さない袖体成分Ｃ３のフラグメント）であ り、Ｍａｃ−１によって認識される〔にｉｓｈｉｍｏＬｏ、Ｔ、Ｋ。

特表平３−５０１８６１　（２５） −　ベルラーグ、ニューヨーク（１９８７）　；　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｔ、＾１ 等、八ｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｒｌｌｕｎｏ１．５　：　２２３−２５２　（１９８ ７）　：　八ｎｄｅｒｓｏｎ。

Ｄ、　Ｃ，等、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｅｄ、３８　：　１７５−１９４　（１９ ８７）　）ｏ　配列分析により、ＬＦＡ−１により認識されるＩ　ＣＡＭ−１配 列内の潜在的ペプチドは第９表に示す。

第９表 ＬＦＡ−１に認識され得る Ｉ　ＣＡＭ−１内のポリペプチド −Ｌ　−’Ｒ−Ｇ　−Ｅ　−Ｋ−ε−Ｌ−−Ｒ−Ｇ−Ｅ−に−ＩＥ−Ｌ−に−Ｒ Ｊ−ｒ’−−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｂ−に−［Ｅ−Ｌ−に−Ｒ−ε−Ｆ’−八−Ｊ−へ− Ｅ−１”−＾−Ｅ−−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｓ− −Ｐ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−に− −Ｑ−Ｅ−１１−Ｓ−０−Ｐ−Ｍ− −Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｈ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−３−−Ｒ−Ｒ−Ｄ−１１−１ １−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｆ−３−−Ｉｌ−Ｌ−Ｒ−ｒ’−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｉ　ＣＡＭ −１はインテグリンに結合する免疫グロブリン超遺伝子群の１員の最初の例であ る。これらの群の両方は細胞粘着において重要な役割を発揮するけれども、両者 間の相互作用は以前には予期されてなかった。これに対し、免疫グロブリン超遺 伝子群内の相互作用は全く一般的である。インテグリンと免疫グロブリン群との 間の相互作用のさらなる例が発見されるであろうことは全く可能である。ＬＦＡ −１はＩ　ＣＡＭ−１とは異なるリガンドをｗｍし［Ｓｐｒ　ｉｎｇｅｒ、　Ｔ 、へ０等、八ｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏ＋、５　：　２２３−２５２　（１ ９８７））　、白血球インテグリンＭａｃ−１は好中球−好中球粘着のＣ３ｂ１ と異なるリガンドを認識する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｄ。

Ｃ０等、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｅｄ、３８　：　１７５−１９４　（１９８７）　 ］、さらにまた、精製したＭΔＧ含有ベシクル（小胞）はＭＡＧであるニューリ ット　（ｎｅｕｒｉＬｅｓ）に結合し、かくしてＭＡＧは異種レセプターと異好 性相互作用可能でなければならない［１”ｏｌｔｏｒａｋ、　Ｍ。

等、Ｊ、Ｃｅ１ｌ、Ｄｉａｌ、１０５　：１８９３−１８９９　（１９８７）　 ］。

神経−神経および神経−筋肉細胞相互作用におけるＮＣＡＭの役割は同種親和性 ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用に基づくことは示唆されている［Ｃｕｎｎｉｎｇｔ ＋ａｍ、口、Ａ０等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６　：　７９９−．８０６　（１９ ８７）：ｌ。ミニリン鞘形成中に軸索を取り込むシュヴアン細胞の隣辺回転ルー プ間の相互作用におけるＭＡＧの重要な役割は異種レセプターとの相互作用また は同種親和性ＭＡＧ−ＭＡＧ相互作用に基づき得る。ＮＣＡＭとの相同性および 免疫グロブリン超遺伝子群内でのドメイン−ドメイン相互作用の頻繁な出現はＩ 　ＣＡＭ−１が同種親和性相互作用並びにＩ　ＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１異好性相 互作用に係わり得る可能性を引き起こす。

しかしながら、同様な密度のＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１を共発現するＢリンパ芽 球細胞の人工または細胞単一層中のＩＣＡ’Ｍ−１への結合はＢ−ＩＪンパ芽球 のＬＦＡ−Ｉ　ＭＡｂによる前処理によって完全に抑制され得るが、粘着はＩｃ ＡＭ−Ｉ　ＭＡｂによるＢ−リンパ芽球前処理に、よって影響されない。ＩＣＡ Ｍ−Ｉ　Ｍａｂによる単一層の前処理は結合を完全に壊滅させている［Ｄｕｓｔ ｉｎ。

Ｍ、　Ｌ、等、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ＋、１３７　：　２４５−２５４　（１９８６ ）；Ｍａｒｌｉｎ。

Ｓ０口１等、匡旦、ｌ上：８１３−８１９．（１９８７）：ｌ。これらの知見は 、Ｉ　ＣＡＭ−１間種親和性相互作用が全く起った場合、その作用がＬＦＡ−１ との異好性相互作用よりもかなり弱くなければならないことを示している。

白血球インテグリンが基本的に異なる方法でリガンドを認識する可能性はりガン ト結合において重要でありＲＧＤ認識認識性インリグリン中存在しないそれらの αサブユニット中の１８０残基配列の存在と一致する［Ｃｏｒｂｉ、Ａ、等、Ｅ ＭＢＯＪ、６：４０２３−４０２８　（１９８７））ｏ　Ｍａｃ−１は１ｃ３ｂ ５０８６中に存在するＲＧＤ配列を認識することが提示されているけれども、Ｉ ＣＡＭ−１中にはＲＧＤ配列はない（第８図）。これはフィブロネクチンペプチ ドＧＲＧＤＳＰとコントロールペプチドＧＲＧＥＳｒ’カ月ＣＡＭ−１−ｊｒＡ −１粘着を抑制できないことと一致している［Ｍａｒ　Ｉ　ｉｎ、　Ｓ、　Ｌｌ 、等、Ｃｅ１ｌ、５１　：　８１３−８１９　（１９８７）　）。

しかしながら、ＰＲＧＧＳおよびＲＧＥＫＥのような関連配列はＩＣＡＭ−１中 に、それぞれ、ドメイン２のβ−ストランドａとｂおよびドメイン２のＣと６間 のループに予示される領域において存在しており（第９図）、従って、認識につ いて受け入れられ得る。興味あることは相同性ＭＡＧ分子がドメイン１と２の間 に実施例１９ サウサーンおよびノウサーンプロット サウサーンプロットを３種の細胞系から抽出した５μｇの遺伝子ＤＮＡを用いて 行なった：ＢＬ２、パーキットＩＪンバ腫細胞系（叶、Ｇ１１ｂｅｒｔ　Ｌｅｎ ｏｉｒから供与）；ＪＹおよびＥｒ−ＬＣＬのＥＢＶ形質転換Ｂ−ＩＪンパ腫様 細胞系。

客Ｄ　Ｎ　Ａを５×製造者が推奨する量のＢａ煽Ｈ１とＥｃｏＲＩエンドヌクレ アーゼにューイングランド　バイオラプス社）で消化した。０．８％アガロース ゲルによる電気泳動に続いて、ＤＮＡをナイロン膜（ゼータプローブ、バイオラ ド社）に移した。フィルターをプレハイブリッド化およびα−（”Ｉ’）ｄ　Ｘ ＴＰ’　ｓで標識したＨＬ−６０からのＩｃＡＭ　ｃＤＮＡを用いての標準手法 に従ってランダムブライミングによりハイブリッド化した。ノウサーンプロット ２０μｇの全ＤＮＡまたは６μｇのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡヲ用いて行なった。

ＤＮＡは変性し１％アガローズーホルムアルデヒドゲルにより電気泳動し、ゼー タプローブに電気移動させた。

各フィルターをプレハイブリッド化し”Ｐ標ｍオリゴヌクレオチドプローブ（前 述の））ＩＬ−６０ｃＤＮＡプローブを用いて前述３ｋｂ　ｃＤＮＡプローブお よびＢａｍＨｌとＥｃｏＲｌで消化した遺伝子ＤＮＡを用いたサウサーンプロッ トはそれぞれが単一遺伝子を示しまたコード化情報の殆どが８ｋｂ内に存在する ことを示す２０および８ｋｂの単一主要ハイブリッド化性フラグメントを示した 。３種の細胞系のプロットにおいては、制限フラグメント多形性の証拠はなかっ た。

実施例２０ ＩＣＡＭ−１遺伝子の発現 “発現ベクター”は、（適当な転写性および／またはほん訳性コントロール配列 の存在に基づき）ベクターにクローニングされるＤＮＡ　（またはｃＤＮＡ）を 発現し得、それによってポリペプチドまたはたん白質を産生じ得るベクターであ る。クローニングした配列の発現は発現ベクターを適当なホスト細胞に組み込ん だときに起る。原核細胞発現ベクターを用いる場合は、適切なホスト細胞はクロ ーニングした配列を発現し得る任意の原核細胞であろう。同様に、真核発現ベク ターを用いる場合、適切なホスト細胞はクローニングした配列を発現し得る任意 の真核細胞である。

重要なことは、真核ＤＮＡは介在配列を含み得るので、またそのような配列は原 核細胞中では正確に加工できないので、原核ゲノム発現ベクターライブラリーを 産生ずるためには、Ｉ　ＣＡＭ−１を発現し得る細胞からのｃＤＮＡを用いるこ とが好ましい。

ｃＤＮＡｆｃｌａ製する方法およびゲノムライブラリーを産生ずる方法はＭａｎ ｉａｔｉｓ、Ｊ、等により開示されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ、：八Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｄ−ルド　スプリング　ハー バ−ブＬ／ス社、コールド　スプリング　ハーバ−１ＮＹ（１９８２））。

上述の発現ベクター遺伝子ライブラリーを用いてポスト細胞のバンクを作る（そ の各々はライブラリーの１員を含む）。発現ベクターはホスト細胞に任意の種々 の手段（即ら、形質転換、トランスフェクション、原形質体融合、エレクトロポ ーレーション等）によって組み込み得る。発現ベクター含有細胞のバンクはクロ ーン的に増殖させ、その各員は個々にアッセイして（イムノアッセイを用いて） これらが抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体に結合し得るたん白質を産生ずるかどうかを測定 する。

抗ＩＣＡＭ−１抗体に結合し得るたん白質を産生ずる細胞の発現ベクターはさら に分析してこれらのベクターが全１ｃＡＭ−１遺伝子を発現（または含有）する がどうが、ＩＣＡＭ−１遺伝子のフラグメントのみを発現（または含有）するが どうがあるいは生成物が免疫学的にＩ　ＣＡＭ−１に関係したとしてもＩＣＡＭ −１ではない遺伝子を発現（または含有）するがどぅがを決定する。

そのような分析は任意の都合の良い方法で行なってよいけれども、好ましいのは 発現ベクターにクローニングされるＤＮＡまたはｃＤＮＡのヌクレオチド配列を 決定することである。そのようなヌクレオチド配列を検査してＩＣＡＭ−１のト リプシン消化フラグメント（第５表）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチド をコードし得るかどうかを決定する。

Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子を含む発現ベクタ ーは、かくして、（ｉ）抗１ｃへＭ−１抗体に結合し得るたん白質の発現を行な う能力；および（ｉｉ）　ＩＣＡＭ　−】のトリプシンフラグメントの各々をコ ードし得るヌクレオチド配列の存在によって認識し得る。そのような発現ベクタ ーのクローニングＤＮＡ分子は発現ベクターから取り出して純粋な形で単離でき る。

実施例２１ 精製ＩＣＡＭ−１の機能活性 細胞中では、ＩＣＡＭ−１は細胞膜と会合した表面たん白質として通常は機能す る。従って、精製ＩＣＡＭ−１の機能は分子を人工脂質ＪｌｌｌＥ（リポソーム またはベシクル）中にたん白質を洗浄剤可溶化脂質中に溶解し次いで洗浄剤を透 析により除去することによって再構成させたのち試験した。ＪＹ細胞から精製し 洗浄剤オクチルグリコシド中に上述のようにして溶出したＩＣＡＭ−１をベシク ル中に再構成し、Ｉ　ＣＡＭ−１含有ベシクルをガラスカバースリップまたはプ ラスチック培養ウェルに融合させてたん白質に結合する細胞の検出をできるよう にした。

平坦膜およびプラスチック結合ベシクルの調製ベシクルはＧａｙ等の方法により 調製した（Ｊ、　Ｉ＋ｎｍｕｎｏ＋、１３６　：２０２６　＜１９８６））。即 ち、たまごホスファチジルクロリンとコレステロールをクロロホルム中に溶解し ７：２のモル比で混合した。脂質混合物をチッ素ガス流下に回転させながら薄膜 に乾燥させ、次いで１時間で凍結乾燥させすべての痕跡量のクロロボルムを除去 した。脂質膜を１％オクチルグリコシド１０．１４ＭＮａＣ１／　２０　ｍＭ　 ）リス（ｐＨ７、２＞中にホスファチジルクロリン最終濃度０．１ｍＭに溶解し た。約１０μｇの精製Ｉ　ＣＡＭ−１またはコントロール模糊たん白質としての ヒトグリコホリン（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）を溶解脂質の各− に加えた。

たん白質−脂質−洗浄剤溶液を２００容堡の２０ｒｎＭ　トＩＪス１０．１４Ｍ 　ＮａＣｊ２．　ｐＨ７、２の３回交換およびＨＢＳＳの１回交換に対して４℃ で透析した。

１１ｍｍ）を１７×洗浄剤（Ｌｉｎｂｒｏ）の１＝６希釈液中で１５分間煮沸し 、−夜蒸留水中で洗浄し、７０％エタノール中に浸し、風乾させた。ＩＣＡＭ− １またはグリコホリンのいずれかを含有するベシクル懸濁液の８０μ！小滴を２ ４ウエルクルスタープレートのウェル底部に入れ、上記で調製したガラスカバー スリップを静かに頂部に浮かした。室温での２０〜３０分のインキュベーション 後、各ウェルを１−１　Ｂ　Ｓ　Ｓで満し、カバースリップをひっくり返して平 坦面を上向きにした。次いでウェルをＨＢＳＳで十分洗浄して未結合ベシクルを 除去した。平坦膜表面は全く空気にさらさなかった。

ガラス表面に融合させた平坦膜による実験途中で、ＩＣＡＭ−１を含むベシクル はマルチウェル組織培養プレートのプラスチック表面に直接結合し、特異的細胞 結合により明らかなような機能活性を保持していることが判明した。そのような ベシクルは以後“プラスチック結合ベシクル（ＰＢＶ）と称する。というのは、 プラスチックに結合した脂質ベシクルの性質を測定するのではないからである。

プラスチック結合ベシクルは３０μ！のベシクル懸濁液を直接９６ウ工ル組織培 養トレイ　（ファルコン社）中のウェル底部に加え次いで平坦膜について述べた ようにしてインキユベーションおよび洗浄を行うことによって調製した。

細胞粘着アッセイ 平坦膜またはプラスチック結合ベシクルを用いた細胞粘着アッセイの両方を本質 的に同じ方法で行ったが、Ｉ）’ＢＶアッセイの細胞数および容量は平坦膜アッ セイで用いたものの１１５に減じた。

正常コントロールおよびＬＦＡ−１を発現できない白血球粘着６６８　（１９８ ５）：ｌからの１９７３球を、１μｇ／−のコンカナバリアーＡ　（Ｃｏｎ−Ａ ）を含む末梢血単核細胞ＲＰＭＩ−１６４０＋２０％ＦＣ３中で５Ｘ１０Ｓ細胞 ／ｒｄで３日間培養することによって調製した。次いで、細胞をＲＰＭＩで２回 ；５ｍＭメチル−アルファーｂ−マノフィラノシドで１回洗浄して残留レクチン を細胞表面から除去した。細胞をｌｎｇ／ｍｆの組換えＩＬ−２を含むＲＰＭＩ ／２０％ＦＣ３中で増殖させ、培養開始後１ｏおよび２２日の間で使用した。

平坦膜またはＰＢＶに結合する細胞を検出するため、Ｃａｎ　Ａ芽球、Ｔ−ＩＪ ンバ腫５ＫＷ−３、ＥＢＶ形質転倹Ｂ−リンパ腫様細胞系ＪＹ　（ＬＦＡ−１陽 性）およびＬＦＡ、−１欠損リンパ腫様細胞系（ＢＢＮ）［患者１由来、Ｓｐｒ 　ｉｎｇｅｒ、　Ｔ、＾０等、Ｊ、εｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ。

１６０二１９０１−１９１８　（１９８６）：ｌをｌｄのＲＰＭｌ−１６４０／ １０％ＦＣ３中のＩＸ、１０’細胞を１００μＣ１（７）Ｎａ　”　Ｃｒ口、で ３７℃、１時間インキュベートし、次いでＲＰＭＩ−１６４０で４回洗浄し未結 合標識を除去することによって放射性標識させた。モノクローナル抗体ブロッキ ング試験においては、細胞またはプラスチック結合ベシクルはＲＰＭｌ−１６４ ０／１０％ＦＣ３中の２０μｇ／ｍ１．の精製抗体で４℃にて３０分間前処理し 、次いで４回洗浄して未結合抗体を除去した。細胞結合に関しての２価イオンの 効果の実験においては、細胞をＣａ”、Ｍｇ”　’ｃ含マナイＨＢ　Ｓ　Ｓ　＋ 　１０％透析Ｆｃｓで１回洗浄し、ＣａＣｌとＭｇＣＪを決められた濃度に加え た。すべての実験において、細胞および平坦膜またはＰＢＶは適当な温度（４℃ 、２２℃才たは３７℃）で適当なアッセイバッファー中で予備平衡させた。

精製Ｉ　ＣＡＭ−１に結合する細胞を測定するために、”Ｃｒ標識細胞（平坦膜 アッセイでの５Ｘ１０’ＥＢＶ形質転換体；　ｐｎｖアッセイでの１Ｘ１０’Ｅ ＢＶ形質転換体または５ＫＷ−３細胞、２　Ｘ　１０’　Ｃｏｎ−Ａ芽球）を平 坦膜またはＰＢＶ上で２５Ｘｇで２分間遠心し、次いで４℃、２２℃または３７ ℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、未結合細胞を適当 な温度での予備平衡させたバッファーによる充填、吸引の８回のサイクルによっ て除去した。結合細胞はウェル内容物の０．　Ｉ　Ｎ　Ｎａ０ｌｌ／１％トリト ンＸ−１００による可溶化およびガンマ−カウンターでの３１数によって定量し た。％細胞結合は結合細胞がらのｃｐｍを入力細胞のｃｐｓで割ることによって 決定した。平坦膜アッセイにおいては、入力ｃｐ＋ｍはカバースリップの表面積 を培養ウェルの表面積と比較した比に対して集めた。

これらのアッセイにおいて、ＥＢＶ形質転換Ｂ−リンパ腫細胞、５ＫＷ−３Ｔ− ＩＪンバ腫細胞、およびＣｏｎ−八ｔ”！Ｉンバ芽球は人工膜中のＩＣＡＭ−１ に特異的に結合した（第１１図および第１２図）。結合は、細胞が等価の量の他 のヒト細胞表面糖たん白質グリコホリンを含んだコントロールの平坦膜またはベ シクルに極めて貧弱にしか結合しなかったことから特異的であった。さらにまた 、ＬＦＡ−１陽性ＥＢＶ形質転換体およびＣｏｎ　Ａ芽球も結合したが、それら のＬＦＡ−１陰性等価物は何ら有意の程度に結合せず、結合が細胞上のＬＦＡ− １の存在に依存していることを示した。

細胞結合の特異性および細胞ＬＦＡ−１への依存性の両方はモノクローナル抗体 のブロッキング試験において確認したく第１３図）。ＪＹ細胞の結合はＩＣＡＭ −１含有！’ＢＶを抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲＩ／１前処理したき き９７％まで抑制できた。同じ抗体による細胞の前処理は殆んど効果がなかった 。

逆に、抗ＬＦＡ−モノクローナル抗体Ｒ３Ｉ／１８は９６％まで結合を抑制した がＰＢＶでなく細胞を前処理したときはわずかであった。ＬＦＡ−３と反応性の コントロール抗体ＴＳ２／９　（異なるリンパ球表面抗原）は細胞またはＰＢＶ のいずれを前処理したときも有意の抑制効果はなかった。この実験は人工膜の若 干量の不純物のないＩＣＡＭ−１自体が観察された細胞粘着を媒介していること および粘着は結合性細胞上のＬＦＡ−１に依存していることを示している。

人工膜中のＩＣＡＭ−１への細胞の結合はまたＬＦＡ−１依存性粘着系の２つの 他の特性：温度依存性と２価カチオンの必要性を示した。第１４図に示すように 、（、ｏｎ−Ａ芽球はＰＢＶ中のＩＣＡＭ−１に３７℃で最も効果的に、２２℃ で部分的に、４℃で極めて貧弱に結合した。第１５図に示すように、結合は完全 に２価カチオンの存在に依存している。生理学上の濃度においては、Ｍ　ｇ　２ −は単独で最高の細胞結合を示したが、Ｃａ”の単独は極めて低レベルの結合を 示した。しかしながら、Ｃａ２＋と組合せた通常濃度の１／１０のＭｇ２４は相 乗効果を有し最高の結合を示した。

要約すれば、人工膜中に含有させた精製Ｉ　ＣＡＭ−１に対する細胞結合の特異 性、モノクローナル抗体による特異的抑制、および温度および２価カチオンの必 要性はＩ　ＣＡＭ−１がＬＦＡ−１依存性の粘着系の特異的リガンドであること を示している。

実施例２２ アレルギーおよび毒性バッチ試験反応におけるＩ　ＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの 発現 ５人の正常人の皮ふ生検をそのＩＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲ発現について行 った。ある血管中の内皮細胞は通常ＩＣＡＭ−１を発現するけれども、正常度ふ からのケラチン細胞にはＩＣ八へ＝１は発現しないことが判った。正常度ふ生検 からの任意ケラチン細胞上のＩ−Ｉ　Ｌ　Ａ　−”　Ｄ　Ｒの染色は観察されな かった。Ｉ　ＣＡＭ−１とクラス■抗原の発現動力学をアレルギー性および毒性 成ふ傷害の生検の細胞において検討した。検討した６人の対象者の半分がハプテ ンの適用後４時間でＩＣＡＭ−１を発現したケラチン細胞を有していることが判 った（第１０表）。ハプテンへの露出時間によりケラチン細胞上にＩＣＡＭ−１ を発現する人の割合が増大し、また４８時間までにケラチン細胞当りより多くの ＩＣＡＭ−１発現を示す染色強度も増大した。事実、この時点で、すべての生検 のケラチン細胞の部分がＩ　ＣＡＭ−１に対して陽性に染色した。７２時間（ハ プテン除去後２４時間）で、８人の対象者の７人がケラチン細胞にＩＣＡＭ−１ を発現しており、１人の対象者のＩＣＡＭ−１発現は４８〜７２時間の間に弱く なった。

第１０表 アレルギーバッチ試験生検からのケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１およびＨＬＡ −ＤＲの誘起の動力学正常度ふ　５　０００ ４　６３’００ ４８’　８　５　０　３ １サンプルは少なくとも小群のケラチン細胞が染色した場合に陽性とみなした。

組織学上、ハブテンの適用後４時間で採取した生検からのケラチン細胞上のＩ　 ＣＡＭ−１の染色像は通常小群生状であった。

４８時間後、Ｉ　ＣＡＭ−１はケラチン細胞の大部分の表面上に発現し、傷害の 中心および周辺間に差異はなかった。染色強度はケラチン細胞が爪角質層に近づ いたとき減少した。これは傷害の中心および周辺から採られた生検において見い 出された。また、この時間でも、バッチ試験は陽性であった（湿潤、紅斑、小胞 ）。

異なるハブテンを感受性個々人に適用してもＩ　ＣＡＭ−１発現における差異は 見られなかった。ケラチン細胞以外にも、Ｉ　ＣＡＭ−１は傷害部位でいくつか の単核細胞および内皮細胞上にも発現した。

アレルギー皮ふ傷害のケラチン細胞上でのＨＬＡ−ＤＲの発現はＩｃＡＭ−１の 発現よりも頻度は小さかった。検討した対象者のうち、ハブテン適用後２４時間 までにｌ（Ｌ　Ａ　−Ｄ　Ｒに陽性に染色したケラチン細胞による傷害を有する ものはなかった。事実、わずかに４人の生検サンプルがＨＬＡ−ＤＲを発現した ケラチン細胞を有するに過ぎず、）ＩＬＡ−ＤＲに陽性でＩＣＡＭ−１に陽性で ないケラチン細胞を有する生検はなかった（第１０表）。

アレルギーバッチ試験傷害と対照的に、まず油またはラウリル硫酸ナトリウムで 誘発させた毒性バッチ試験傷害は試験のすべての時点でその表面にＩＣＡＭ−１ を殆んど示さないケラチン細胞を有していた（第１１表）。実際に、パッチ適用 後４８時間で、これはアレルギー性バッチ試験対象者における最適の時点である が、１４人の毒性バッチ試験対象者のうちの１人が傷害中にＩ　ＣＡＩＪ−１を 発現するケラチン細胞を有していた。また、アレルギー性バッチ試験生検と対照 的に、毒性バッチ試験傷害のケラチン細胞上にＨＬＡ−ＤＲは発現しなかった。

これらのデータはＩｃＡＭ−１が免疫系炎症中で発現し毒性系炎症では発現しな いことを示しており、かくして、ＩＣＡＭ−１の発現は、疾患が免疫抑制治療剤 の拒絶または床形性によるのかどうかの判断が難しい腎移植患者における急性腎 疾患のような免疫系および毒性系炎症を区別するのに使用できる。腎生検および ＩＣＡＭ−１発現の向上の評価が免疫系拒絶と非免疫系毒性反応の区別を可能に するであろう。

第１１表 毒性パンチ試験生検からのケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲ の誘起動力学８　３　１′″　００ ４８ゝ　１４　１　０　０ 纂サンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色された場合陽性とみなした。

ゝすべでのパンチはこの時点で除去した。

実施例２３ 良性成ふ病中のＩ　ＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現種々のタイプの炎症性皮ふ 病を有する患者からの傷害の皮ふ生検からの細胞をそのＩ　ＣＡＭ−１とＨＬＡ −ＤＲの発現について検討した。アレルギー性接触湿疹、天庖遺、および扁平苔 宿の生検中のケラチン細胞の１部はＩ　ＣＡＭ−１を発現した。扁平苔宿は４８ 時間アレルギー性パンチ試験生検で見られた結果と同等か幾分強い像により最も 強く染色を示した（第１２表）。アレルギー性パンチ試験の結果と同様に、最も 強いＩ　ＣＡＭ−１染色は高単核細胞浸潤部位で見られた。さらにまた、試験し た１１の扁平苔痕生検のうちの８つはケラチン細胞上でＨＬＡ−ＤＲ発現につい て陽性であった。

発疹とじんま疹を存する患者の皮ふ生検からのケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１ の発現は少なかった。これらの疾患を有する試験した７人の患者のうち４人のみ が傷害部位でＩ　ＣＡＭ−１を発現したケラチン細胞を有していた。ＨＬＡ−Ｄ Ｒ発現は１人の患者においてのみであり、これはＩ　ＣＡＭ−１と関連していた 。

試験した良性炎症皮ふ病のすべてからの内皮細胞および単核細胞浸潤の部分は変 化度合でＩ　ＣＡＭ−１を発現していた。

第１２表 良性成ふ病からのケラチン細胞上の Ｉ　ＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現 扁平苔！ｉ！　１１　３　０　８ 天庖渣　２　２０　０ 発疹　３　２０　０ じんま疹　４　１　０　１ 島サンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色された場合陽性とみなした。

実施例２４ 乾盲皮ふ病のケラチン細胞上でのＩ　ＣＡＭ−１発現乾宿を有する５例の患者か らの皮ふ生検中のＩ　ＣＡＭ−１発現をＰｔＪＶＡ治療の開始前および治療途中 で周期的に検討した。生検は組織学によって認識した古典的乾徊を有する５例の 患者がら得り、生検はＰＵＶＡ治療の前および指示された時間中に連続的に採取 した。ＰＵＶＡは通に３〜４回投与した。生検は５例の患者の乾廊斑の周辺から 採取し、生検以外に、これら患者の４人の。

臨床的に正常な皮ふからも採取した。

各新鮮度ふ生検試料を凍結し、液体チッ素中に保存した。６ミクロンの保存切片 を一夜室温で風乾し、アセトン中で１０分間固定し、直ちに染色しまたはアルミ ニウムホイルで包み染色するまで一８０℃で保存した。

染色は次の方法で作った。切片をモノクローナル抗体でインキュベートし、ジア ミノベンジジンＨ２０□、基質を用いて３段階のイムノパーオキシダーゼ法によ り染色した［５ｔｅｉｎ、　）１．等、Ａｄｖ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　ｉＪＬ：　６７−１４７、（１９８４））、へん検線 およびリンパ節を抗Ｉ　ＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲ染色用の陽性コントロー ルとして用いた。−次抗体の不存在下で染色した組織は陰性コントロールであっ た。

ＨＬＡ−ＤＲに対するモノクローナル抗体をＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ 社（カリホルニア州マウンテンビュー）から購入した。抗ＩＣＡＭ　−１モノク ローナル抗体はＲ６−５−Ｄ６であった。バーオキシグーゼ接合ウサギ抗マウス Ｉｇおよびパーオキシダーゼ接合ブタ抗ウサギＩｇはスウェーデン、コペンハー ゲンのＤＡＫＡＰＡＴＴＳよす購入した。ジアミノベンジジン−テトラヒドロク ロリドはシグマ社（セントルイス）より得た。

試験の結果は数種の血管の内皮細胞が疾患および正常度ふの両方でＩ　ＣＡＭ− １を発現していることを示したが、染色強度およびＩＣＡＭ−１を発現する血管 の数は乾盲皮ふ病変内で増大した。

さらに、５例の患者からの未治療乾廚皮ふ病変のケラチン細胞中のＩ　ＣＡＭ− １の発現像はわずかに小群の細胞染色から多数のケラチン細胞が染色されている までに変化した。ＰＵＶＡ治療の途中では、２例の患者（患者２と３）のＩ　Ｃ ＡＭ−１発現は臨床的軽快に先行しであるいは同時に著しい低減を示した。患者 １．４および５は、それぞれ、臨床的軽快あるいは悪化に相関してＰｔ１ＶＡ治 療中にＩ　ＣＡＭ−１発現を減少あるいは増大させた。ＰＵＶＡＵＶ前後の正常 度ふからのケラチン細胞上ではＩ　ＣＡＭ−１発現はなかった。このことはＰＵ ＶＡは正常度ふからのケラチン細胞上にＩ　ＣＡＭ−１を誘起しないことを示し ている。

注目すべきことは単核細胞浸潤密度はケラチン細胞上のＩＣＡ？Ｉ−１発現量と 相関していることであった。このことはＩ　ＣＡＭ−１発現も弱まったときＰＵ ＶＡＵＶ中の傷害中の単核細胞の数も減少することおよびケラチン細胞上のＩ　 ＣＡＭ−１発現がより顕著になったときＰＵＶＡＵＶ中の単核細胞の数が増大す ることの両方に関係している。内皮細胞および皮ふ単核細胞もまたＩ　ＣＡＭ− １陽性である。臨床的に正常な皮ふにおいては、Ｉ　ＣＡＭ−１発現はケラチン 細胞の標識化なしで内皮細胞に確認された。

ケラチン細胞上のＨＬＡ−ＤＲの発現は可変的であった。　ＩＣＡＭ−１陽性で ないＨＬＡ−ＤＲ陽性生検は存在しなかった。

要約すれば、これらの結果は、治療前では、Ｉ　ＣＡＭ−１発現はケラチン細胞 上で高く、単檎Ｉ！ｌ胞浸潤密度と相関していることを示している。ＰｔＪＶＡ 治療中は、Ｉ　ＣＡＭ−１染色の著しい減少が臨床的改善と平行して見られる０ 組織学的には、皮ふ浸潤は消失していた。臨床的悪化が治療中に見られる場合に は、ケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１の発現並びに皮ふ浸潤密度も増大した。

臨床的軽快が治療中に見られたときは、ケラチン細胞上のＩＣＡ？ｌ　−１染色 の同時の減少並びに皮ふ浸潤の減少があった。即ち、ケラチン細胞上のＩ　ＣＡ Ｍ−１の発現は皮ふの単核細胞浸潤密度に相応していた。これらのデータはＰＵ ＶＡ治療に対する臨床的応答は単核細胞のよりおだやかな下陣と平行してケラチ ン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１発現の促進された減少をもたらすことを示している。

このことはケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１発現が皮ふ８！：潤の開始および持 続に応答性であること、およびＰＵＶＡ治療がＩＣＡＭ−１を下方調整し皮ふ浸 潤および炎症応答を緩和していることを示している。データはまたＰＵＶＡＵＶ 中のケラチン細胞上のＨＬＡ−ＤＲが発現が変化性であったことも示している。

乾宛傷害のケラチンＩ胞上のＩ　ＣＡＭ−１発現は傷害臨床上の厳正さおよび皮 ふ浸潤の大きさと相関している。即ち、ＩＣＡＭ−１は乾癲において中心的役割 を発揮し、その発現の抑制および／またはその単核細胞上でのＣＤ１Ｂコンプレ ツクスとの相互作用の抑制は本病変の有効な治療となるであろう、さらにまた、 ケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１発現をモニターすることは乾宿の診断、予防、 および治療経過を評価するための有効な手段となるであろう。

第１３表 ＰｔＪＶＡ治療中および治療前の乾面皮傷害および臨床的に正常な皮ふのケラチ ン細胞ｌ胞によるＩ　ＣＡＭ−１発現１０週　（＋） ÷＋＋強陽性ケラチン細胞 ÷十　明らかな陽性ケラチン細胞 ＋　弱陽性ケラチンｗＡ胞 （→）極めてわずかな拡散陽性ケラチン細胞−陽性染色なし 傘　臨床的軽快 ０　〃　悪化 実施例２５ 悪性成ふ病中のＩ　ＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現良性成ふ状態の病変とは異 なり、悪性成ふ傷害からのケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１の発現は変化に冨ん でいた（第１４表）。

試験した皮ふＴ−細胞リンパ腫２３例のうち、Ｉ　ＣＡＭ−１陽性ケラチン細胞 は１４例のみにおいて同定された。菌状息肉臘病変。

の生検からのケラチン細胞では、病気の進行がより前の段階に進むにつれてその Ｉ　ＣＡＭ−１発現を消化する傾向にあった。しかしながら、Ｉ　ＣＡＭ−１発 現は皮ふＴ細胞リンパ腫病変の殆んどからの変化割合の単核細胞浸潤上に見られ た。試験した残りのリンパ腫のうちでは、８つのうち４つがＩＣＡＭ−１を発現 したケラチン細胞を有していた。試験した悪性成ふ病を有する２９人の患者のう ち、５例はＩ　ＣＡＭ−１を発現することなしにＨＬＡ−ＤＲを発現したケラチ ン細胞を有していた（第１４表）。

第１４表 悪性成ふ病からのケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲの発現 ＣＴＣＬ、ＭＦＩ　８　１”　０　４ ＣＴＣＬ、？１ＦＩＩ−１１１１０１２５ＣＴＣＬ、ＳＳ　３　１　０　２ ＣＴＣＬ、ラージ細胞　２　０　２　０ＣＢＣＬ　２　０　０　１ 皮ふ白血病　３　１　１　１ Ｅスチオサイトシス　Ｘ　１　００　０１各サンプルは少なくともケラチン細胞 の小群が染色された場合陽性とみなした。

実施例２６ ヒト末梢血単核細胞の増殖上の抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体の効果ヒト末梢血単核細胞 を抗原またはマイトジェンの存在および認識より誘起させ増殖させる。マイトジ ェン、コンカナバリンＡまたはＴ細胞結合性抗体ＯＫＴ、のようなある種の分子 は末梢血単核細胞の非特異的増殖を引き起こす。

ヒト末梢血単核細胞はこれらが特異的抗原を認識し得る細胞の軸側体群（ｓｕｂ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）からなる点で不均質である。特定の特異抗原婆認識し得 る末梢血単核細胞がその抗原に出会った場合、単核細胞の上記軸側体群の増殖は 誘起される。破傷風トキソイドおよびキーホールリンペットヘモシアニンは末梢 単核細胞の軸側体群により認識される抗原の例であるが感応化した個体中のすべ ての末梢単核細胞によって認識されるものではない。

細胞−細胞粘着を必要とすることが知られている系中でのヒト末梢血単核細胞の 増殖的応答を抑制する抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６の能力 を試験した。

末梢血単核細胞をフイコールーベーグ（Ｆｉｃｏｌｌ−ｒ’ａｑｕａ、ファルマ シア社）勾配で製造者が推奨するようにして精製した。界面を集めたのち、細胞 をＲＰＭ１１６４０培地で３回洗浄し平底９６ウエルマイクロタイタープレート 中で１０％ウシウシ血清、２ｍＭグルタミンおよびジェンタマイシン（５０μｇ ／ｍｊりを加えた２２Ｍ１１６４０培地中で１０６細胞／−の濃度で培養した。

抗）Ｆｆｔ、Ｔ−細胞マイトジエンくコンカナバリンへのいずれか＜０．２５μ ｇ／＋＋＋ｆ）；Ｔ−細胞結合性抗体０にＴ、＜０．００１μｇ／ｉｄ）；キー ホールリンペットヘモシアニン（１０ｇ／ｍｉ’）または破傷風トキソイド（供 給源からの１：１００希釈物）を上記のようにして培養した細胞中に抗Ｉ　ＣＡ Ｍ−１抗体（Ｒ６−５−Ｄ６；最終濃度５ｇ／ｄ）の存在または不存在下に加え た。細胞はアッセイが終了する前の３．５日（コンカナバリンＡ試験）、２．５ 日（ＯＫＴｓｔＵｔ＞　、または５．５日（キーホールリンペントヘモシアニン および破傷風トキソイド試験）で培養した。アッセイ終了前１８時間で、２．５ μＣ４の″Ｈ−チミジンを培養物に加えた。細胞増殖を末梢血単核細胞によるＤ ＮＡへのチミジンの取り込みを測定することによってアッセイした。取り込まれ たチミジンを集め液体シンチレーションカウンター中で計数した（Ｍｅｒｌｕｚ ｚ＋等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

ユニ」）１６６−１６８　（１９８７））。これらの実験の結果は第１６図（コ ンカナバリンＡ試験）、第１７図（ＯＫＴｓ試験）、第１８図（キーホールリン ペントヘモシアニン試験）、および第１９図（破傷風トキソイド試験）に示す。

抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体は単核細胞中の非特異Ｔ−細胞マイトジエン、ＣｏｎＡ１ 非特異的Ｔ−細胞会合抗原、０ＫＴ−３；および特異抗原、キーホールリンペン トヘモシアニンおよび破傷風トキソイドに対する増殖的応答を抑制することが判 明した。抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体による抑制は抗ＬＦＡ−１抗体の抑制効果と匹敵 し、Ｉ　ＣＡＭ−１はＬＦＡ−１の官能性リガンドであることおよびＩ　ＣＡＭ −１のアンタゴニストは特異的防御系応答を抑制するであろうことを示唆してい る。

実施例２７ 混合リンパ球反応についての抗Ｉ　ＣＡＭ−１の効果前述したように、Ｉ　ＣＡ Ｍ−１はＬＦＡ−１依存性細胞粘着より媒介された免疫応答中の有効な細胞相互 作用のために必要である。免疫応答または炎症疾患中のＩ　ＣＡＭ−１の誘起は 白血球の相互または内皮細胞との相互作用を可能にする。

２例の無関係の個人からのリンパ球を各互いの存在下で培養したときは、芽球形 質転換およびリンパ球の細胞増殖が観察される。

１つの集団の白血球を第２集団の白血球の存在へのこの応答は混合リンパ球反応 （Ｍ　Ｌ　Ｒ）として公知であり、リンパ球のマイトジェンの添加に対する応答 と同類である［　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ＴｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　５ｅ ｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ　Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ、　Ｋｌｅｉｎ、Ｊ、Ｊ ｏｈｎ　１ｌｌｉｌｅｙ＆　５ａｎｅ社、ＮＹ　（１９８２）　、ｐｐ４５３− ４５８）。

抗ＩＣＡＭモノクローナル抗体のヒトＭＬＲに対する効果について試験した。こ れらの実験は次のようにして行った。末梢血を正常な健康ドナーから静腺穿刺に より採取した。血液をヘパリン化チューブに集め、室温でｒ’ｕｎｋ’ｓ　Ｇ　 （ＧｌＢＣＯ社）平衡塩溶液（ＢＳＳ）でｌ：ｌに希釈した。血液混合物（２０ −）を１５＋ｄのＦｉｃｏｌｌ／１１ｙｐａｑｕｅ密度勾配（ファルマシア社、 密度１．０７８、室温）上に層化し、１１０００Ｘで２０分間遠心した。次いで 界面を集め、Ｆ’ｕｎｋ’ｓ　Ｇ　中で３回洗浄した。細胞をヘマシトメーター 上で３４数し、０．５％のジェンタマイシン、１ｍＭＬ−グルタミン（Ｇｉｌｌ （”０社）および５％加熱不活化（５６℃、３０分）ヒ）ＡＢ血清（フローラボ ラトリーズ社）とを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（［、ｌ　ｎｃＯ社）　（以下 、ＲＰＭ！培地と呼ぶ）中に再Ｍ濁させた。

マウス抗−ＩＣＡＭ−１（Ｒ６−５−Ｄ６）をこの実験で用いた。すべてのモノ クローナル抗体（ジャックソンイムノリサーチラボラトリーズ社、ボストン、Ｍ Δにより腹水から調製された）を精製１ｇＧ調製物として用いた。末梢血単核細 胞（ＰＢＭＣ）はリンプロ（Ｌｉｎｂｒｏ）丸底マイクロタイタープレート（＃ ７６−０１３−０６）　中テロ、２５　ｘ　１０’　細ＩＬ’ｍｃテ培Ｌｂ中テ 培養シタ。

別々のドナーからのスチミュレーター細胞を１００ＯＲで照射し、レスボンダー 細胞と同じ濃度で培養した。培養当りの総容量は０．２−であった。コントロー ルはレスボンダー細胞単独およびスチミュレーター細胞単独を含んでいた。培養 プレートを３７℃で５％ＣＯｔ　−湿潤空気雰囲気中で５日間インキュベートと した。

各ウェルを０．５μＣｉのトリチウム化チミジン（”ＨＴ）にューイングランド ニュクレア社）で培養の最後の１８時間脈動させた。ある場合には、２経路（ｔ ｗｏ−ｗａｙ）　ＭＬＲを行った。そのプロトコールは第２ドナー細胞を照射に より不活化しなかった以外は同じであった。

細胞をガラス繊維フィルター上で自動化マルチプルサンプルハーベスタ（Ｓｋａ ｔｒｏｎ社、ノルウェー）を用いて採取し、水およびメタノールですすいだ、フ ィルターをオーブン、乾燥させ、アクアゾル中でベングマン（ＬＳ−３８０１） 　液体シンチレーションカウンターで計数した。結果は６例の個々の培養物につ いて平均ＣＰＭ±１準誤差として示している。

第１５表は精製抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗体が２０ｇｇ／ｍで明らかな 有意の抑制でもって投与量依存の形でＭＬＲを抑制していた。精製マウスＩｇＧ は殆んどあるいは全く抑制効果を示さなかった。抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクローナ ル抗体によるＭＬＲの抑制は抗体を培養の最初の２４時間以内で加えたとき生じ る（第１６表） 第１５表 １経路（ｏｎｅ−ｗａｙ）リンパ球反応についての抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体の効果 −−４４５’±１４３ ＋　＋　＋ｎ１ｇＧ　（１０，０，１７ｇ）　３６，８８２ｆ１．８２３（１４ り＋　＋　ｍｌｇＧ　（０，４μｇ）　３５．５００±１，３８３（１７Ｘ）＋ 　＋　Ｒ６−５−０６（１０，０μｇ）　８．２５０±５２０　（８１χ）＋　 ＋　Ｒ６−５−０６（０，４μｇ）　１６，１４２±８５８　（６２χ）＋　＋ 　Ｒ６−５−０６（０，０３ｇｇ）　２８．８４４土１　、７８０　（３２χ） 為レスホンターＩＢ胞（６，２５ｘ　１０　’　／１ｄ）ゝスｆ　ミｓ　レ−タ ー細胞（６，２５ｘ　１０’　／ｗ！！、１０００Ｒでの照射） Ｃ最終濃度（μｇ／−）でのＩ　ＣＡＭ−１に対する精製モノクローナル抗体（ Ｒ６−５−Ｄ６）または精製マウスＩｇＧ（ｍｌｇＧ） ４５〜６個の培養物の平均上標準誤差、（）内の数はＭＬＲの％抑制を示す。

第１６表 ＩＣＡＭ−の“、ヨ Ｒ論　ｓ”：、’　”ＨＴ　’入　（ＣＰＭ）−たは立１の゛、日 ０　日　１日　２日 −−培地　２０５４　±１４　４７６±１３２　２４７±７５−　十　培地　１ ８９土１６　ｎｄ”　ｎｄ十　−培地　１　、８６０±６１５　ｎ　ｄ　ｎ　ｄ 畠しスボンダー細胞＜６．２５　Ｘ　１０’＃ｄ）ｂスチミュレーター細胞（６ ，２５Ｘ　１０Ｓ／＋ｄ）Ｃ培養培地またはＩ　ＣＡＭ−１に対する精製モノク ローナル抗体（Ｒ６−５−Ｄ６）　、１０μｇ／−で日Ｏで２４時間間隔で加え た。

４４〜６個の培養物の平均値上標準誤差・ｎｄ−測定せず ２％抑制 要約すれば、Ｉ　ＣＡＭ−１に対する抗体のＭＬＲを抑制する能力はＩ　ＣＡＭ −１モノクローナル抗体が急性移植拒絶に治療的利用性を有していることを示し ている。ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体はまたＬＦＡ−１／ｌ　ＣＡＭ−１調 整細胞−細胞相互作用に依存する関連免疫媒介不整における治療的利用性を有し ている。

上記の実験はＩ　ＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の添加が反応の最初２ ４時間中に加えたときに混合リンパ球反応（？ＩＬＲ）を抑制することを示して いる。さらにまた、Ｉ　ＣＡＭ−１は且旦上旦培養中のヒト末梢血単核細胞につ いて状態向上なる。

さらにまた、Ｉ　ＣＡＭ−１は静止ヒト末梢血リンパ球または単核細胞上には発 現しないことが見い出された。ＩＣＡＭ−１は単独培養細胞または混合リンパ球 反応での無関係ドナー細胞との共培養細胞の単核細胞上で、通常のフローサイト メトリンク分析を用いることにより状態向上される。単核細胞上でのこのＩ　Ｃ ＡＭ−１の状態向上は炎症の指示剤として、特に、Ｉ　ＣＡＭ−１が急性または 慢性炎症を有するヒトの新鮮単核細胞上で発現する場合に使用できる。

活性化単核細胞に対するＩ　ＣＡＭ−１の特異性およびＩＣＡＭ−１に対する抗 体のＭＬＲを抑制する能力はＩ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗体が急性移植拒絶 および細胞−細胞相互作用を必要とする関連免疫媒介不整における診断上および 治療上の潜在力を有し得ることを示している。

実施例２８ 抗Ｉ　ＣＡＭ−１および抗ＬＦＡ−１抗体の混合投与の相乗効果実施例２７で示 したように、ＭＬＲは抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体によって抑制される。ＭＬＲはまた 抗ＬＦＡ−１抗体によっても抑制できる。抗Ｉ　ＣＡＭ−１および抗ＬＦＡ−１ 抗体の組合せ投与が促進されたあるいは相乗的効果を有するかどうかを決定する ために、ＭＬＲアフセイ　（実施例２７に記載したようにして行った）を２つの 抗体の種々の濃度の存在下で行った。

このＭＬＲアンセイは抗Ｉ　ＣＡＭ−１＋抗ＬＦＡ−１の組合せが、抗体単独で は劇的にＭＬＲを抑制しない濃度において、ＭＬＲ応答を抑制するのに著しい効 力があることを示した（第１７表）。

この結果は抗ＩＣＡＭ−１抗体（またはそのフラグメント）と抗ＬＦＡ−１抗体 くまたはそのフラグメント）を共投与することを含む治療が改善された抗炎症治 療を与える能力を有することを示している。そのような改善された治療は治療上 有効である他の方法よりもより低い抗体投与量の投与を可能にし、また高濃度の 個々の抗体が抗イデオタイブ応答を誘起するような場合に重要性を示す。

第１７表 混合リンパ球反応において抗Ｉ　ＣＡＭ−１と（Ｒ３，１＞濃度（μｇ／′）　 抗−１ｃＡＭ−１（Ｒ６−５−〇６）抗−ＬＰ八−１０：００４　．０２　．１ 　．５　２．５０．０　０　？　３１　５４　６９　７００．０００８　１　７ 　２ｇ　４８　６２　７１０．００４　０　１３　３０　５０　６４　７２０． ０２　２９　３８　６４　７５　８４　Ｒ６０，１９２，５９０９１９２９２９ ２ 実施例２９ ＭＬＲにおける抗ＩＣＡＭ−１と他の免疫抑制剤との次善投与量での混合投与の 付加的効果 実施例２８で示すように、ＭＬＲは抗ＩＣＡＭ−１抗体と抗ＬＦΔ−１抗体の組 合せによって抑制される。抗ＩＣＡＭ−１と他の免疫抑制剤〔デキサメタソン、 アゼチオピリン、シクロスポリンＡまたはステロイド（例えば、プレドニソン等 の）のような〕との混合投与も改善された効果を有するかどうかを見るために、 ＭＬＲアッセイを、実施例２７のプロトコールによるようにして、他の免疫抑制 剤と組合せたＲ６−５−Ｄ６の次善温度（即ち、薬剤を単独で対象物に対して投 与する最適濃度よりも低いであろう濃度）を用いて行った。

データはＲ６−５−Ｄ６の抑制効果が次善投与量のデキサメタソン（第１８表） 、アゼチオピリン（第１９表）およびシクロスポリンＡ（第２０表）の抑制効果 を少なくとも付加されていることを示している。このことは抗Ｉ　ＣＡＭ−１が 公知の免疫抑制剤の必要投与量の低減、即ち、その有毒副作用の低減において有 効であり得ることを意味する。抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体（またはそのフラグメント ）を用いてそのような免疫抑制を得るのに、この抗体（またはそのフラグメント ）と単一の追加の免疫抑制剤または２種以上の追加の免疫抑制剤の組合せとの投 与を行うことが可能である。

第１８表 ヒトＭＬＲでの抗Ｉ　ＣＡＭ−１とデキサメタソンの効果培地　１５６− スチミユレーター（Ｓ）　−１０１− レスポンター　（Ｒ）　−４，４６１−Ｒ″ＸＳ　３４，２２４　− ＲＸ　Ｓ　Ｒ６−５−０６（８）　２６，２２４　２３ＲＸ　Ｓ　Ｄｅｘ　（５ ０）　１４．１５８　５９ＲＸ　Ｓ　Ｒ６−５−Ｄ６（８）＋Ｄｅｘ（５０）　 ７，７５９　７７Ｄｅｘ　：　デキサメタソン 第１９表 ヒトＭＬＲでの抗ＩＣＡＭ−１とアゼチオピリンの効果培地　７８− スチミュν一タ−（Ｓ）　−１７４− レスポジター　（Ｒ）　−３，４１９−ＲｘＳ　４９，５７０　− Ｒｘ　Ｓ　Ｒ６−５−Ｄ６（８）　４４，３７４　１１ＲＸＳ　７ゼチオビ’） 　７　４２，７１０　１４ＲＸ　Ｓ　Ｒ６−５−Ｄ６（８）＋７ｆチｔピリン（ １）　３４．２４６　３１第２０表 ヒトＭＬＲでの抗Ｉ　ＣＡＭ−１とシクロスポリンＡの効果スチミュレーター（ Ｓ）　２０６　− レスポジター　（Ｒ）　９８７　一 実施例３０ 移植した同種異系臓器の拒絶を抑制するのにおける抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体の効果 同種異系移植臓器の拒絶を抑制するのにおける抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体の効果を示 すために、カニクイザルにＣｏ５１ｍ１等の方法［Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、　Ｐ ｒｏｃ、１３　：　４９９−５０３　（１９８１））に従って同種異系の腎臓を 移植した、ただし、麻酔薬としてバリウム（ｖａｌｉｕｓ）とケタミンを用いる 修正を加えた。

即ち、腎臓移植を木質的に次のようにして行った。異型腎アログラフトを３〜５ ｋｇのカニクイザルに、バリウムとケタミンによる麻酔の誘起後、本質的にＭａ ｒｑｕｅｔにより開示されたようにして行った（　Ｍａｒｑｕｅｔ等、Ｍｅｄｉ ｃａｌ　Ｐｒｉｍａｔｏｌｏｇｙ、　ＰａｒｔＩｌ　、Ｂａ５ｅｌ＋Ｋａｒｇｅ ｒ、　ｐ、１２５　（１９７２））　、大動脈または大静脈のパンチ上のドナー 腎臓の末端−側面アナストモーシス（ａｎａｓｔｐｍｏｓｅｓ）を７−〇プロシ ン（Ｐｒｏｌｅｎｅ）縫合線を用いて構築した。ドナー尿管をスパチュラ処理し 外のう的方法によってプラングー中に埋め込んだ〔丁ａｇｕｃｈｉ、　Ｙ、等、 Ｄａｕｓｓｅｔ等編−Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏ ｎ。

バルチモア、ウィリアムス　アンド　ゥイルキンス、ｐ３９３（１９６８））、 腎機能を１週間毎にまたは２週間毎の血清クレアチニン測定によって評価した。

さらに、頻ばんなアログラフト生検を組織病理学検査用に採取し、完全解剖をす べての死んだ受容体で行った。殆んどの受容体において、両側性腎摘出を移植時 に行い、その後の床形症死をアログラフト生存の終点とみなした。

いくつかの受容体においては、片側の生腎摘出と対何尿管ライゲーションを移植 時点で行った。アログラフト拒絶が生じたとき、同原尿管上のライゲーチュアを 除去し、正常腎機能の再生と受容動物の免疫学的モニターを続ける機械を得た。

モノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６を１２日間毎日投与したが、移出前２日から １〜２■／ｋｇ／日の投与量で開始した。クレアチニンの血清量を周期的に試験 して拒絶をモニターした。同種異系腎の免疫系拒絶に対する抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗 体の効果は第２１表に示す。

第２１表 カニクイザルの予防的プロトコールにおける腎アログラフト生存を延長するのに おけるＲ６−５−Ｄ６の活性Ｍ　１５　１．０　２０ Ｍ１９　１．０　７１ Ｍ　１　７　１．０　３０ Ｍ２５　１．５　２９ Ｍ２３　１．０　１１ｃ Ｍ２７　２．０　３４ Ｍ７　０．５　２２ Ｍ　１１　０．５　２６ Ｍ　１０　０．５　２２ Ｍ８　０．５　２６’ １サルは移植前２日から１２日間毎日Ｒ６−５−Ｄ６が投与された。

１死因はわからなかった。潜在的マラリャの証拠があった。

３腎梗塞死 ’　１９８８年８月１５日でまだ生存中上記の結果はＲ６−５−Ｄ６が同種異系 移植を受け入れたサルの寿命延長にを効であることを示している。

実施例３１ 移植臓器の急性拒絶を抑制するのにおける抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体の効果 抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体が移植拒絶の急性モデルにおいて有効であることを示すた めに、Ｒ６−５−Ｄ６の治療中のまたは急性腎拒絶モデルにおいても試験した。

このモデルにおいて、サル腎臓を移植しく実施例３０のプロトコールを用いて） 、１５■／ｋｇのシクロスポリンＡ（ＣｙＡ）を筋注で組織周辺的に安定な腎機 能が得られるまで投与した０次に、ＣｙＡ投与量を血液クレアチニン値の上昇で 示されるような拒絶が生しるまで２．５■／ｋｇ１分量で２週間毎に低減した。

この時点で、Ｒ６−５−Ｄ６は１０日投与し、生存時間をモニターした。重要な ことは、このプロトコールにおいては、ＣｙＡの投与量が急性拒絶状態が生ずる と同時に変化しないので次善のままであるということに留意することである。

このモデルにおいては、抗体援助を有しない組織学的対照（Ｎ−５）は拒絶状態 の開始から５〜１４日間生存する。これまで、６匹の動物をこのプロトコールに おいてＲ６−５−Ｄ６を用いて試験した（第２２表）。これら動物の２匹はまだ 生存している（Ｒ６−５−Ｄ６の投与後にＭ１２：３１日間、およびＭ５：４７ 日間）、２匹の動物はＲ６−５−Ｄ６治療開始後３８日および５５日間生き、２ 匹の動物は急性拒絶以外の原因で死亡した（−匹はＣ７Ａ毒性で死亡し、−匹は 麻酔下でＲ６−５−Ｄ６を投与している間に死亡した）、このモデルはＲ６−５ −Ｄ６を最初から用いたｎ床状態とより密接に近似している。

第２２表 カニクイザルでの治療プロトコールでの腎アログラフト生存を延長するのにおけ るＲ６−５−０６の活性対照ｃ　１４−９８　５−１４ Ｍ２４　４１　３日 Ｍ２１　３４　４’ Ｍ３　４１　５５ Ｍ９　１２　１１＠ Ｍ１２　３７　＞３１’ Ｍ５　２６　＞４７’ １サルは拒絶開始後１０日間毎日１〜２■／　ｋｇのＲ６−５−Ｄ６を投与され た。

ゝクレアチニン値がＣｙＡ投与量の低減の結果として増大しＲ６−５−Ｄ６治療 を開始した日 Ｃ５匹の動物は援助治療を用いなかった以外は前述の治療プロトコールを用いて 試験した。生存／後治療の日数はクレアチニン値が上昇し始めたすぐからの日数 を示す。

−麻酔中に死亡、クレアチニン値は低かった。

”　Ｃ）’Ａ毒性による死亡、クレアチニン値は低かった。

’　１９８８年８月１５日でまだ生存している。

実施例３２ Ｉ　ＣＡＭ−１の末端切取り誘導体の遺伝子構築および発現天然状態において、 Ｉ　ＣＡＭ−１は５つの免疫グロブリン様ドメインの細胞外領域トランスメンブ ランドメインおよび細胞質ドメインを含有する細胞膜結合たん白質である。望ま しいのはＩＣＡ？１−１から分泌した可溶物を発現できる点でトランスメンブラ ンドメインおよび／または細胞質ドメインを欠落するＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘 導体を構築することであった。これらの官能性誘導体はＩ　ＣＡＭ−１遺伝子の オリゴヌクレオチド関連変異誘発および７の後の変異遺伝子による投入後のサル 細胞中での発現により構築した。

アミノ酸置換および／または末端切取り（Ｔｒｕｎｃａ　ｔｅｄ）誘導体を与え るＩ　ＣＡＭ−１遺伝子の突然変異はＸｕｎｋｅｌ、　Ｔ、の方法により発生さ せた（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｌｌ、Ｓ、Ａ、）　 ８２　：　４８８−４９２　（１９８５））。上記のようにして調製したＩ　Ｃ ＡＭ−１ｃＤＮＡを制限エンドヌクリアーゼ５ａｉｌおよびＫｐｍｌで消化し、 得られた１、８ｋｂＤＮＡフラグメントをプラスミドベクターＣＤＭ８にサブク ローン化した（　５ｅｅｄｔ　Ｂｏ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）８４　：　３３６５−３３６９　（１９８７））、次 にＥ、　Ｃｏ１１　（ＢＷ３１３／Ｐ　３）の」旦−１」−株をｐ　ＣＤ　１． ８０と表示する上記構築物で形質転換した。隼−ストランドウラシル含有鋳型を 形質転換体からヘルパーファージＲ４０８（ストレータジーンＲ）で感染させる ことによって数援（ｒｅｓｃｕｅ）　Ｌ／た。

次いで、変異体Ｉ　ＣＡＭ−１ｃＤＮＡを不整合ベースを有するオリゴヌクレオ チドとの第２ストランド合成および引き続り」■゛宿主ＭＣ１０６１／Ｐ３）の 得られたヘテロ二本鎖体による形質転換を開始することによって産生させた。変 異体を上記変異オリゴヌクレオチドを導入した新たに創生したエンドヌクレアー ゼ制限サイトについてスクリーニングすることによって単離した。

変異体Ｉ　ＣＡＭ−またん白質は標準ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｓｅｌｄｅｎ 、　Ｒ，Ｆ、等、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｅｂｅｌ、　Ｆ、　Ｍ、等編集）、９．２．１− ９．２．６（１９８７））を用いて真核発現ベクターＣＤＭＢ中で上記変異体Ｄ ＮＡによるＣｏ５−７細胞の移入によって発現させた。

トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを欠落するが５つの免疫グロ ブリン様ドメインのすべてを含有するＩ　ＣＡＭ＝１の末端切取り官能性誘導体 を調製した。３０ｂｐ変異体オリゴ３２、　フレｔ　チ）’　（ＣＴＣＴＣＣＣ ＣＣＣＧＧ　ＴＴＣＴＡＧ　ＡＴＴ　ＧＴＣＡＴＣＡＴＣ”）を用いて位置４５ ２および４５３のアミノ酸チロシン（Ｙ）およびグルタミンａ（Ｅ）のコドンを 、それぞれ、フェニルアラニンＣＦ）およびほん訳停止コドン（ＴＡＧ）に形質 転換した。変異体はその特異的Ｘｂａｌ制限サイトにより単離し、Ｙ′Ｓ２Ｅ／ Ｆ、ＴＡＧと表示した。

変異体たん白質を発現させるために、ＣＯ３！Ｂ胞に３種の変異体サブクローン （＃２、＃７および＃８）を移入した。これら３種の変異体サブクローンによる 移入の３日後、培養上清および細胞溶解物を抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクローナル抗 体ＲＲＩ／１による免疫沈降および５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＩＣＡ Ｍ−１は変異体サブクローン＃２および＃８を移入した細胞の培養上清からは沈 降したがこれら細胞の清浄剤溶解物からは沈降しなかった。培養上滑中に見い出 されるＩ　ＣＡＭ−１の分子量はＩＣＡＭ−１の膜体に比し約６Ｋｔ！低下して いたが、これは変異体ＤＮＡから予想した大きさに一致する。即ち、このｌ　Ｃ ＡＭ−１の官能性誘導体は可溶性たん白質として分泌している。これに対し、Ｉ ＣＡＭ−１は対照の天然Ｉ　ＣＡＭ−１を移入した細胞の培養上清がらは免疫沈 降せず、Ｉ　ＣＡＭ−１の膜体はＣＯ８細胞からは発現しなかったことを示して いた。さらにまた、Ｉ　ＣＡＭ−１は陰性対照の偽移入細胞からの培養上清また は細胞溶解物からは免疫沈降してこなかった。

移入細胞から分泌した末端切取りＩ　ＣＡＭ−１をＩ　ＣＡＭ−１特異性抗体（ Ｒ６−５−Ｄ６）によるイムノアフィニティクロマトグラフによって精製し、細 胞結合アンセイでの官能活性について試験した。清浄剤オクチルグルコサイドの 存在下での精製後、天然Ｉ　ＣＡＭ−１または末端切取り型分泌体を含有する調 製物を０．２５オクチルグルコサイドの最終濃度に希釈したく清浄剤の臨界ミセ ル濃度以下の濃度）。Ｉ　ＣＡＭ−１のこれら調製物をプラスチック９６−ウェ ルプレート（Ｎｕｎｃ社）の表面に結合させて固相に結合したＩ　ＣＡＭ−１を 調製した。未結合物を洗い出したのち、表面上にＬＦＡ−１を含有する５ＫＷ− ３細胞の約７５〜８０％および約８３〜８５％が、それぞれ、Ｉ　ＣＡＭ−１の 天然体および末端切取り体に特異的に結合した。これらのデータは分泌型の末端 切取り可溶性Ｉ　ＣＡＭ−１官能性誘導体が免疫学的反応性および天然Ｉ　ＣＡ Ｍ７１の特徴であるＩ　ＣＡＭ−１依存性粘着を仲介する能力の両方を保持して いることを示している。

細胞質ドメインのみを欠落するＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体を同様な方法で調 製した。２ｓｂｐオリゴヌクレオチド（ＴＣＡＧＣＡＣＧ　ＴＡＣＣＴＣＴＡＧ 　ＡＡＣＣＧＣＣＡ　）を用いてアミノ酸４７６（Ｙ）のコドンをＴＡＧはん訳 停止コドンに変えた。この変異体はＹ４７＆／ＴＡＧと表示した。この変異体を 移入したＣｏｓ細胞の免疫沈降分析および５ＤＳ−ＰＡＧＥは陰性Ｉ　ＣＡＭ− １よりも約３Ｋｄ小さい分子量を有するＩ　ＣＡＭ−１の膜結合体を検出した。

上記変異体移入Ｃｏｓ細胞の間接免疫蛍光分析はＬＰＳ刺激ヒト内皮細胞上に発 現した天然Ｉ　ＣＡＭ−１と同様な点状染色像を示した。また、上記変異体ＤＮ Ａを移入した細胞は天然１’ＣＡＭ−ＩＤＮＡを移入したＣｏｓ細胞と同じよう な形でプラスチック表面上の精製ＬＦＡ−１に特異的に結合した（第２３表）。

第２３表 Ｉ　ＣＡＭ−１発現性細胞またはＩ　ＣＡＭ−１官能性誘導体のＬＦＡ−１結合 活性 偽　００ 天然１ｃＡ？！−１２００ Ｙ”’／ＴＡＧ　２０　０ 実施例３３ Ｉ　ＣＡＭ−１官能性ドメインのマンピングＩ　ＣＡＭ−１の研究はその分子が ７つのドメインを有することを見い出した。これらドメインのうちの５つは細胞 外であり（ドメイン５は細胞表面に最も近く、ドメイン１は細胞表面から最も遠 い）、１つのドメインはトランスメンブランドメインであり、１つのドメインは 細胞質である（即ち、細胞内に存在する）、どのドメインがＩ　ＣＡＭ−１のＬ ＦＡ−１に結合する能力に貢献するかをみるために、エピトープマツピング（地 図作製）試験を用いた。そのような試験を行うためには異なる欠落変異体を作製 し、そのＬＦＡ−１を結合する能力について特徴決定した。別に、Ｉ　ＣＡＭ、 １のＬＦＡ−１に結合する能力を干渉することが知られている抗ＩＣＡＭ抗体を 用いた試験を行った。かかる抗体の適当な例にはＲＲ１／　１　（Ｒｏｔｈｌｅ ｉｎ、　Ｒ，等、Ｊ、　Ｌｎｕｎｏｌ、１３７　：１２７０　１２７４　（１９ ８６）　）、Ｒ６，５（Ｓｐｒｉｎｇａｒ、　Ｔ、　Ａ。

等、米国特許出願第０７／２５０，４４６号）、Ｌ　Ｂ　−２（Ｃ１ａｒｋ、Ｅ 。

Ａｏ等、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ　Ｉ　（Ａ、　Ｂｅｒｎａｒｄ等編 集）　、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ、３３９　３４６（１９８４））、 またはＣＬ２０３［５ｔａｕｎｔｏｎ、ロ、　Ｅ、　等、　Ｃｅ１ｌ、　５６： ８４９−８５３（１９８９））がある。

Ｉ　ＣＡＭ−１の欠落変異体は種々の任意の方法によって調製できる。しかしな がら、そのような変異体は部位特異的変異誘発によりまたは他の組換え手段（特 定のたん白質領域をコードする配列を欠落させたＩＣＡＭ−１発現性遺伝子配列 を構築することによるような）により産生させるのが好ましい。そのような変異 体を産生ずるのに適する手順は当該技術において周知である。そのような手順を 用いて、３つのＩＣＡＭ−１欠落変異体を調製した。

第１の変異体はアミノ酸残基Ｆ１８５〜Ｐ２８Ｊを欠落するく即ち、ドメイン３ の欠落）。第２の変異体はアミノ酸残基Ｐ２８４〜Ｒ４５１を欠落する（即ち、 ドメイン４および５の欠落）。第３の変異体はＹ４７６より後のアミノ酸残基を 欠落する（即ち、細胞質ドメインの欠落）。そのような試験の結果はドメイン１ ２および３が抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体およびＬＦＡ−１とのＩＣＡＭ−１相互作用 中に主として含まれていることを示す。

実施例３４ ＬＦＡ−１結合に対してのＩＣＡＭ−１変異の効果Ｉ　ＣＡＭ−１がＬＦＡ−１ に反応し結合する能力はＩ　ＣＡＭ−１分子のドメイン１中に存在するＩ　ＣＡ Ｍ−１アミノ酸残基によて仲介される（第８．９および１０図）。しかしながら 、そのような反応はＩＣＡＭ−１のドメイン２および３中に存在するアミノ酸の 貢献によって促進される。即ち、本発明の好ましい官能性誘導体の内には、ＩＣ ＡＭ−１のドメイン１．２および３を含有するＩ　ＣＡＭ−１分子の可溶性はフ ラグメントが存在する。より好ましいのはＩＣＡＭ−１のドメイン１および２を 含有するＩＣＡＭ−１分子の可溶性フラグメントである。最も好ましいのはＩＣ ＡＭ−１のドメイン１を含有するＩ　ＣＡＭ−１の可溶性フラグメントである。

第１１ＣＡＭ−１ドメイン内の幾つかのアミノ酸残基はＩＣＡＭ−１とＬＦＡ− １の反応中に含まれている。これらアミノ酸の他のアミノ酸による置換はＩ　Ｃ ＡＭ−１のＬＦＡ−１に結合する能力を変化させる。これらのアミノ酸残基およ びその置換体を第２５図に示す、第２５図は得られた変異体Ｉ　ＣＡＭ−１分子 のＬＦＡ−１に結合する能力についてのそのような変異の効果を示す、第２３〜 ２５図においては、各残基はアミノ酸の１文字コードについて記載し、次いでＩ 　ＣＡＭ−１分子中のその残基の位置を示している。即ち、例えば“Ｅ９０”は Ｉ　ＣＡＭ−１の位置９０でのグルタミン酸残基を称す、同様に、“Ｅ９０Ｖ” は位置９０のグルタミン酸残基と位置９１のバリン残基とからなるジペプチドを 示す。置換配列はスラッシュじ／”）マークの右に示されテイル。Ｉ　ＣＡＭ− １ｆ７）Ｖ　４、Ｒ１３、Ｑ２７、Ｑ５８およびＤ６０Ｓ６１残基はＬＦＡ−１ 結合中に含まれる。

これらアミノ酸の置換はＩ　ＣＡＭ−１のＬＦＡ−１への結合能力を変化させる ０例えば、ｖ４０Ｇによる置換はＬＦＡ−１により少なくしか結合しない変異体 Ｉ　ＣＡＭ−１分子の形成をもたらす（第２５図）、ＩＣＡＭ−１のＲ１３残基 の已による置換は実質的に小さいＬＦＡ−１への結合能力を有する変異体分子の 形成を与える（第２５図）。Ｉ　ＣＡＭ−１のＱ５８残基のＨによる置換は実質 的に通常のＬＦＡ−１への結合能力を有する変異体分子を与える（第２５図）、 　ＩＣＡＭ−１のＤ６０Ｓ残基のＫＬによる置換は実質的に小さいＬＦＡ−１へ の結合能力を有する変異体分子を与える（第２５図）。

第２ドメイン中のグリコジル化部位もまたＬＦＡ−１結合中に含まれる（第２３ 図）、Ｎ１０３のＫによるまたはＡ１５５ＮのＳＶによる置換はＬＦＡ−１を実 質的に結合し得ない変異体ＩＣＡＭ−１分子の形成をもたらす、対照的に、グリ コジル化部位Ｎ１７５のＡによる置換はその変異体Ｉ　ＣＡＭ−１のＬＦＡ−１ 結合能に実質的に影響しないようであった。

第３１ＣＡＭ−１トメイア０）変異はＩ　ＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１結合性を認知 し得る程度化させないようであった（第２４図）。

実施例３５ 増大した生物学的半減アフィニチイとクリアランス能力を有するＩ　ＣＡＭ−１ の多量体形 Ｉ　ＣＡＭ−１のドメイン１と２をその免疫グロブリン長鎖のヒンジ領域に結合 させたキメラ分子を構築する。好ましい構築物はＩ　ＣＡＭ−１ドメイン２のＣ 末端をヒンジ領域対しての丁度Ｎ−末端の免疫グロブリン長鎖のセグメントに結 合させて、ヒンジ領域により付与されたセグメントフレキシビリティを可能にす る。

Ｉ　ＣＡＭ−１ドメイン１と２はかくして抗体のＦａｂフラグメントを置換する であろう、Ｉｇ１ｍｙ類の長鎖への結合および動物細胞の生成はキメラ分子の産 生をもたらすであろう、ＩｇＡまたは１．門に由来する長鎖を含有する分子の生 成は２〜１２個のＩ　ＣＡＭ−１分子を含有するより高多量体の分子の産生をも たらすであろう。

Ｉ　ＣＡＭ−１長鎖キメラ分子を産生ずる動物細胞中での長鎖遺伝子の共発現は ４〜６ケのＩ　ＣＡＭ−１分子を含有するＩｇＡ分子と約１０ケのＩ　ＣＡＭ− １分子を含有するＩｇＭのケースとを主として与えるＩｇＡとＩｇＭ多量体の適 当な集合体を与えるであろう、これらのキメラ分子は幾つかの利点を有する。第 １は、１ｇ分子を循環系中で長く滞在するよう設計し、これにより生物学的半減 期を改善できる。

さらにまた、これら加工分子の多量体性は、治療清秋のいかんによって、これら 分子がより高い結合活性によってライノウィルス並びに細胞表面ＬＦＡ−１と反 応できるようにし、かくして有効投与量を与えるべき投与に必要な組換えたん白 質の量を大いに低減させる。ＩｇＡおよびＩｇＭは鼻におけるような粘膜部位の 分泌物中に通常存在する高グリコジル化分子である。その高親水性は粘膜中で結 合する微生物およびウィルスを保持するのを助長し細胞への結合を防止しまた上 皮細胞膜バリヤーの交差を防止する。即ち、これらの分子は増大した治療効果を 有する。ＩｇＭと特にＩｇＡとは粘膜環境で安定でありＩ　ＣＡＭ−１構築物の 安定性を増大させる。そのようなＩＣＡＭ−１官能性誘導体を血液流中に投与す る場合、この誘導体も生物学的半減期を増大する。

ＩｇＡは補体を固定せず、従って、それが有害である用途において理想的であろ う。ＩｇＧの［１キメラを望む場合には、袖体への結合曲びにＦｃレセプターと の反応中に含まれる領域を変異させることが可能であろう。

実施例３６ ＩＣＡＭ−１変異体の発現 オリゴヌクレオチド特異性変異誘発 １．８ＫｂＳａｌｌ−ＫｐｍｌフラグメントバンＩ　ＣＡＭ　−１ｃ　ＤＮＡの コード領域を発現ベクターＣＤＭＢ中にザブクローニングした［５ｅｅｄ、　Ｂ 、等、Ｉ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、＾、）８４ 　：　３３６５〜３３６９　（１９８７）　）ｏ　Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、の方法 ［ｒ’ｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（Ｉｌ、Ｓ、Ａ、）８２　：４８８−４９２　（１９８５ ）　〕および５ｔａｕｎｔｏｎ　Ｄｏ等の変法（ＳＬａｕｎｔｏｎ　Ｄ、　Ｅ、 等、Ｃｅ１ｌ　５２：９２５−９３３　（１９８８）：ｌに従って、この構築物 （ｐｃＤｌ、８）を用いてオリゴヌクレオチド特異性変異誘発で使用する単一ス トランドウラシル含有鋳型を調製した。

要するに、Ｅ、　Ｃｏス１ａＸｓ１２７をｐ　ＣＤ　１．８で形質転換した。

単一コロニーを１３μｇ／−のアンピシリンと８μｇノーのテトラサイクリンを 含有する１−のルリア　ブロス（Ｌ　Ｂ）培地（Ｄｉｆｃ。

社）中で近飽和まで増殖させた。１００μｌの培養物をＲ４０８へルバーファー ジ（Ｓ　ｔｒａ　ｔｅｇｅｎｅ社）で１００）感染多重度（Ｍｏｌ）で感染させ 、アンピシリンとテトラサイクリンを含む１０−のＬＢ培地を３７℃で１６時間 培養で加えた。１０．　ＯＯ０ｒｐｔｓで１分間の遠心および上滑の０．２２μ ｍ濾過の後、ファージ懸濁液をＥ、Ｃｏ１１ＢＷ３１３／Ｐ３を感染し、次いで 、これをアンピシリンおよびテトラサイクリンを加えたＬＢ寒天（Ｉｌｉｆｃｏ 　４）プレート上に塗布した。コロニーを採取し、アンピシリンとテトラサイク リンを含むｌ＋ａｆｆのＬＢ培地中で近飽和に増殖させ、ヘルパーファージでＭ ＯＩＩＯで感染させた０次いで、培養容量を２５０ｗ１１に増大させ、細胞を一 夜培養した。単一ストランドＤＮＡを標準のファージ抽出により単離した。

変異体オリゴヌクレオチドをリン酸化し、第２ストランド合成反応にｐ　ＣＤ　 １．８鋳型と共に用いた（Ｓｔａｕｎｔｏｎ　Ｄ、　Ｅ、等、Ｃｅ１１５２：９ ２５−９３３　（１９８８））。

蔓−λ ＣＯ３細胞を１６〜２４時間で５０％の集密性となるように１０口の組織培養プ レート中にシード付けした。次いで、ＣＯ８細胞をＴＢＳで１度洗浄し、１０％ のＮｕ血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ社）、５、ｕｇ／ｄのクロロキーネ（ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）　、３μｇの変異プラスミドおよび２００μ８／−の ＤＥＡＥ−デキストラン　サルフェートを含有する４−のＲＰＭＩで４時間培養 した。ｆｉ！Ｉｌ胞をそのａｌＯ％のＤＭＳＯ／ＰＢＳ次いでＰＢＳで洗浄し、 培養培地中で１６時間培養した。培養培地を新鮮培地で入れ替え、４８時間で、 後移入ＣＯＳ細胞をトリプシン／　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（Ｇｊｂｃｏ社）処理によ り懸濁し、ＨＲＶ結合用の２、Ｌｏａｍプレート並びに２４ウ工ル組織培養プレ ート中に細分した。７２時間で、細胞を１０ｃｃプレートカラ、５ｍＭＥＤＴＡ ／ＨＢＳＳで採集し、ＬＦＡ−１：Ｉ−ティングプラスチックへの粘着および免 疫蛍光分析用に加工した。

ＬＦＡ−おＨＲＶム ＬＦＡ−ＩＧＳＫＷ−３からＴＳ２／４ＬＦＡ−１ｍＡｂ　セファローズ上でイ ムノアフィニティクロマトグラフにより精製し、２ｍＭの？１ｇｃｌ、および１ ％のオクチルグルコシドの存在下にｐＨ１１，５で溶出させた。ＬＦＡ−１（１ ０μｇ／２００μｍ／６にプレート）を微生物学的ペトリ皿に２ａ＋Ｍの？１ｇ ＣＺ、を含むＰＢＳ　（リン酸塩緩衝塩水）中でオクチルグルコシドを０．１％ に希釈し４℃で一夜インキユベートすることによって結合させた。各プレートを １％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）でブロックし、２１のｌ′Ｉｇｃ！２．０ 、２　％Ｂ　Ｓ　Ａ−０，０２５％（Ｄ１’す４　Ｆ、および５０　ｐｇ／ｗｔ （Ｄジェンタマイシンを含有するＰＢＳ中で保存した。

５％ＦＣ３（ウシ胎児血清）、２ｍＦのＭｇα、、０．０２５％のアザイドを含 有するＰＢＳ　（バッファー）中の５ｌｃｒ標１６ｃＯ３細胞をＬＦＡ−１コー テイングマイクロタイタープレート中で５μｇ／ｄのＲＲＩ／１およびＲ６，５ の存在または不存在下に２５℃、１時間でインキュベートした。粘着してない細 胞をパンファーで３回洗浄することにより除去した。粘着細胞はＥＤＴＡの添加 により１０＋ｅＭに溶出し、γ−計算した。

膳−来 ＲＲＩ／ｉＲ６，５、ＬＢ−２、またはＣＬ　２０３（Ｄような抗Ｉ　ＣＡＭ− １抗体は同定されている。これら抗体がＩ　ＣＡＭ−１機能を抑制し得るならば 、これらの抗体はＩ　ＣＡＭ−１分子の特定の部位（これがまたＩ　ＣＡＭ−１ 機能に重要である）に結合し得なければならない。即ち、前述のＩ　ＣＡＭ−１ の欠落変異体を調製し、上記の抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体が上記欠落体に結合し得る 程度を測定することによって、欠落ドメインが機能上重要であるかどうかを見る ことができる。

Ｉ　ＣＡＭ−１は複合膜たん白質であり、その細胞外ドメインは５つの１ｇ様Ｃ −ドメインからなるものと予測される。ＬＦＡ−１を結合するのに含まれるドメ インを同定するには、ドメイン３、およびドメイン４と５　（カルボキシル未満 ）をオリゴヌクレオチド特異性変異誘発により欠落させ、ＣＯＳ細胞中で発現後 官能的に試験した。さらに、全細胞質ドメインを欠落させてＩ　ＣＡＭ−１反応 へのその潜在的影響を確認した０期待したように、細胞質ドメイン欠落体、Ｙ４ ７６／”はＲＲ１／１、Ｒ６，５、ＬＢ−２およびＣＬ２０３の反応性の喪失を 示さないのに対し、ドメイン３の欠落体Ｆ１８４−Ｒ４５１はＣＬ２０３反応性 の減少および喪失をもたらした（第２０図）、即ち、ＣＬ２０３エピトープはド メイン４中に存在するようであるが、ＲＲ１／１、Ｒ６，５およびＬＢ−２は２ ケのアミノ末端ドメイン中に存在するようである。

３つの欠落変異体はすべてＬＦＡ−１に対し野生型レベルの粘着性を示した（第 ２１図）、ドメイン１．２および３中の予測β−ターンでのアミノ酸置換体も調 製しＣＯ８細胞中での発現後機能性試験した。Ｒ６，５エピトープはドメイン２ の配列ＥＩＩＩＧＧＡに局在化しまたドメイン１中にＲ３９を含み得るが、ＲＲ Ｉ／１とＬＢ−２は共にドメイン１のＲ１３に依存している（第２２図）。

さらに、ＲＲ１／１結合性は配列Ｄ７１ＧＯ３中での変異により減少した。Ｎ１ ０３およびＮ１６３のＮ−結合グリコシル化部位を削減する変異はＲＲ１／１、 Ｒ６，５とＬＢ−２、Ｌ　Ｆ　Ａ　−１１１ＲＶ結合性を減少させた。これらの 変異はＩ　ＣＡＭ−１ダイマーを発生させるような加工を行うようである。

らさなかった（第２３および２４図）、ドメイン１のアミノ酸、Ｒ１３とＤ６０ の両方はＬＦＡ−１と結合することによって含まれる（第２５図）。

即ち、ＬＦＡ−１およびＨＲＶ結合性はＩ　ＣＡＭ−１のアミノ末端１末端ドメ インの機能であるようである。第２６図はＩＣＡＭ−１末端ドメインの配列を示 す。

本発明をその特定の実施態様について説明して来たが、更なる修正が可能である ことは理解し得ることであり、本出願は、一般に、本発明の原理に従いかつ本発 明が関係する技術内での公知または慣用的実施に含まれるようなまた特許請求す るような本質的な特徴に適用し得るような本明細書の記載からの回避を包含する すべての変形、用途または適用を含むものとする。

ＦＩＧ、１゜ 正常細胞／ＬＦＡ−１欠損細胞粘着 時間（分） 患者番号 １　２３　Ａ　５ ＥＢＶ形質転換Ｂ−細胞 ＦＩＧ、５ Ａ、　Ｂ。

Ｓｌ　２　３　４ｆ２３４ ＦＩＧ、　６゜ ５ＬＪＢＳＴＪＴＬｉＴＥ；１４ｇ＝７Ｃ） ＳＵＤＳＴｉＴＵ７二ことミＥＴ ＦＩＧ、１１゜ ＦＩＧ、１２゜ ＦＩＧ、１．！、。

温度０口 ＣＰＭ　Ｘ　１［］００ ＣＰＭ　Ｘ　１０００ ＣＰＭ　ｘ　１１００ ＯＣＰ　Ｘ　１００１ ００ＯＩＣＡ欠落変異体へのＭａｂ結合性Ｆ１８５−Ｐ２８４　Ｐ２ＢＩ！、− Ｒム５１　ＹＡ７５／◆ＩＣＡＭ−１欠落変異体、ρＬＦＡ−１への結合性ＩＣ ＡＭ−１ドメイン２変異体のＬＦＡ−１への結合性ＩＣＡＭ−１ドメイン３変異 体のＬＦＡ−１への結合性ＩＣＡＭ−１ドメイン１変異体のＬＦＡ−１への結合 性ＦＩＧ、　２６ ＩＣＡＭアミン末端ドメイン相同性 Ｏ 国際調査報告 １１１１＄１ＭａＩｎｌ’ｎｌ　Ａｍｅ１４ａ１ｍｌＲ１１ａ、　ｐ（τ／ｒｓ Ｅ９１０４２＜２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然不純物を実質的に含まないＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体。 ２．前記ＩＣＡＭ−１がリンパ球表面上に存在する分子にさらに結合し得る請求 項１記載のＩＣＡＭ−１。 ３．ＩＣＡＭ−１分子が次の群から選ばれた少なくとも１種のポリペプチドをさ らに含有する請求項２記載のＩＣＡＭ−１分子：（ａ）−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｔ− Ｓ−Ｃ−Ｄ−Ｑ−Ｐ−Ｋ；（ｂ）−Ｘ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｔ− Ｓ−Ｃ−Ｄ−Ｑ−Ｐ−Ｋ；（ｃ）−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｉ−Ｅ−Ｔ−Ｐ−Ｌ；（ｄ）− Ｆ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｙ−Ｘ−Ｔ；（ｅ）−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｐ；（ｆ）− Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｏ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｆ−Ｅ；（ｇ）−Ｌ−Ｎ−Ｐ− Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｘ−Ｄ−Ｓ−Ｆ−Ｓ−Ａ−Ｋ；（ｈ）−Ｓ−Ｆ−Ｐ−Ａ− Ｐ−Ｎ−Ｖ；（ｉ）−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ；（ｊ）−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ− Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｅ−Ｐ；（ｋ）−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｅ− Ｐ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｅ；（ｌ）−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｓ； （ｍ）−Ｐ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｋ； （ｎ）−Ｑ−Ｅ−Ｄ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｍ；（ｏ）−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｅ−Ｌ− Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｓ；（Ｐ）−Ｒ−Ｒ−Ｄ−Ｈ−Ｈ−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｆ−Ｓ；およ び（ｑ）−Ｄ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ。 ４．前記官能性誘導体がリンパ球表面上に存在する分子に結合し得るＩＣＡＭ− １のフラグメントである請求項２記載の官能性誘導体。 ５．前記官能性誘導体がリンパ球表面上に存在する分子に結合し得るＩＣＡＭ− １の変異体である請求項２記載のＩＣＡＭ−１の官能性誘導体。 ６．前記官能性誘導体がリンパ球表面上に存在する分子に結合し得るＩＣＡＭ− １のアナログである請求項２記載のＩＣＡＭ−１の官能性誘導体。 ７．前記官能性誘導体がリンパ球表面上に存在する分子に結合し得るＩＣＡＭ− １の化学誘導体である請求項２記載のＩＣＡＭ−１官能性議導体。 ８．ＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体を発現し得る組換えＤＮＡ分子。 ９．前記ＩＣＡＭ−１またその官能性誘導体が次の群からなる少なくとも１種の ポリペプチドをコードし得る請求項８記載のＤＮＡ分子： （ａ）−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｄ−Ｑ−Ｐ−Ｋ；（ｂ）−Ｘ−Ｇ−Ｓ− Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｄ−Ｑ−Ｐ−Ｋ；（ｃ）−Ｌ−Ｌ−Ｇ− Ｉ−Ｅ−Ｔ−Ｐ−Ｌ；（ｄ）−Ｆ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｙ−Ｘ−Ｔ；（ｅ）−Ｖ−Ｅ− Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｐ；（ｆ）−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｌ− Ｆ−Ｅ；（ｇ）−Ｌ−Ｎ−Ｐ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｘ−Ｄ−Ｓ−Ｆ−Ｓ−Ａ− Ｋ；（ｈ）−Ｓ−Ｆ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｎ−Ｖ；（ｉ）−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｅ− Ｌ；（ｊ）−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｅ−Ｐ；（ｋ）−Ｌ−Ｒ−Ｇ− Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｅ；（ｌ）−Ｐ− Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｓ； （ｍ）−Ｐ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｋ； （ｎ）−Ｑ−Ｅ−Ｄ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｍ；（ｏ）−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｅ−Ｌ− Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｓ；（ｐ）−Ｒ−Ｒ−Ｄ−Ｈ−Ｈ−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｆ−Ｓ；およ び（ｑ）−Ｄ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ。 １０．（ａ）ＩＣＡＭ−１を発現する細胞の膜からＩＣＡＭ−１を可溶化して可 溶化ＩＣＡＭ−１調製物を調製すること、（ｂ）上記可溶化ＩＣＡＭ−１調製物 をアフィニティマトリックスに導入すること、このマトリックスがＩＣＡＭ−１ に結合し得る固定化抗体を含有していること、（ｃ）上記ＩＣＡＭ−１を上記ア フィニティマトリックスの抗体に結合させること、 （ｄ）上記マトリックスから上記抗体に結合し得ない化合物を除去すること、お よび （ｅ）上記ＩＣＡＭ−１を実質的に純粋な形で上記マトリックスから溶出させる ことによって回収すること、の各工程を含むことを特徴とするＩＣＡＭ−１の回 収方法。 １１．（ｆ）工程（ｅ）の回収ＩＣＡＭ−１を分離用ゲル電気泳動によって精製 すること、および （ｇ）上記回収ＩＣＡＭ−１を工程（ｆ）で用いたゲルから溶出させること、 の各工程をさらに含む請求項１０記載の方法。 １２．請求項１０〜１１のいずれか１項記載の方法によって調製したＩＣＡＭ− １。 １３．ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群がら選ばれた 分子に結合し得る抗体。 １４．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１３記載の抗体。 １５．Ｒ６−５−Ｄ６である請求項１４記載のモノクローナル抗体。 １６．前記分子がリンパ球表面上に存在するレセプターに結合し得かつ前記分子 への前記抗体への結合が前記分子の上記リンパ球のレセプター分子への結合能力 を損う請求項１３記載の抗体。 １７．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１６記載の抗体。 １８．標識した形の請求項１３〜１７のいずれか１項記載の抗体。 １９．請求項１４、１５または１７のいずれか１項記載のモノクローナル抗体を 産生し得るハイブリドーマ細胞。 ２０．モノクローナルＲ６−５−Ｄ６を産生し得るハイブリドーマ細胞。 ２１．前記分子に結合し得る、請求項１３〜１７のいずれか１項記載の抗体のフ ラグメント。 ２２．（ａ）動物をＩＣＡＭ−１発現性細胞で免疫すること、（ｂ）上記動物の ひ臓細胞をミエローマ細胞系と融合させること、 （ｃ）融合させたひ臓およびミエローマ細胞に抗体産生性ハイブリドーマ細胞を 形成させること、および（ｄ）上記ハイブリドーマ細胞をＩＣＡＭ−１に結合し 得る抗体を産生し得る所望のハイブリドーマ細胞についてスクリーニングするこ と、 の各工程を含むことを特徴とするＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体を産生する所望 のハイブリドーマ細胞の調製方法。 ２３．工程（ａ）において、動物をＩＣＡＭ−１を発現するがＬＦＡ−１は発現 しない細胞で免疫し、さらに、スクリーニング工程（ｄ）が、 （１）前記ハイブリドーマ細胞のいずれかから産生した抗体をリンパ球調製物と 一緒にインキュベートすること、該リンパ球調製功が凝集し得る複数の細胞を含 有すること、（２）上記の産生した抗体を上記リンパ球調製物の上記細胞の凝集 を抑制する能力について試験すること、および（３）前記所望のハイブリドーマ 細胞として、上記リンパ球調製物の上記細胞の凝集を抑制し得る抗体を産生する ハイブリドーマ細胞を選択すること、 の各工程を含む請求項２２記載の方法。 ２４．スクリーニング工程（ｄ）が、 （１）前記ハイブリドーマ細胞のいずれかから産生した抗体を、（ａ）凝集し得 る特性および（ｈ）ＩＣＡＭ−１を結合し得る抗体の存在下では凝集し得ない特 性を有する複数の細胞を含有するリンパ球調製物と一緒にインキュベートするこ と、（２）前記ハイブリドーマから産生した前記抗体がＬＦＡ−１群分子の１員 に結合しないことを確認すること、（３）前記ハイブリドーマ細胞として、上記 リンパ球調製物の細胞の自発性凝集を抑制し得る抗体を産生するハイブリドーマ 細胞を選択すること、および （４）前記ハイブリドーマから産生した抗体がＬＦＡ−１群分子の１員に結合し ないことを確認すること、の各工程を含む請求項２２記載の方法。 ２５．請求項２２〜２４のいずれか１項記載の方法から得られたハイブリドーマ 細胞。 ２６．請求項２５記載のハイブリドーマ細胞により産生させた抗体。 ２７．（ａ）細胞間粘着のアンタゴニストであり得る非免疫グロブリン剤をリン パ球調製物と共にインキュベートすること、該リンパ球調製物が凝集し得る複数 の細胞を含有すること、（ｂ）上記リンパ球調製物を試験して上記非免疫グロブ リン剤の存在が上記リンパ球調製物の上記細胞の凝集を抑制するかどうかを測定 すること、上記凝集の抑制が上記非免疫グロブリン剤を細胞間粘着のアンタゴニ ストとして同定すること、を特徴とする細胞間粘着の非免疫グロブリンアンタゴ ニストの同定方法。 ２８．哺乳動物の特異的防御系の応答に由来する炎症の治療方法において、 そのような治療を必要とする対象体に上記炎症を抑制するのに十分な量の抗炎症 剤を投与することを含み、該炎症剤がＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ −１に結合し得る抗体フラグメント、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導 体、およびＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストからなる群より選ば れることを特徴とする上記治療方法。 ２９．ＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストがＬＦＡ−１以外のＩＣ ＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストである請求項２８記載の方法。 ３０．ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体がＩＣＡＭ−１のフラグメントである請求項 ２８記載の方法。 ３１．ＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１の官能性誘導体が可溶性たん白質である 請求項２８記載の方法。 ３２．前記可溶性たん白質がＩＣＡＭ−１のトランスメンブランドメインを欠落 している請求項３１記載の方法。 ３３．前記可溶性たん白質がＩＣＡＭ−１の細胞質ドメイッを欠落している請求 項３１記載の方法。 ３４．前記抗炎症剤がＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体である請求項２８記載の方 法。 ３５．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項３４記載の方法。 ３６．前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６である請求 項３５記載の方法。 ３７．前記抗炎症剤が抗体のフラグメントであり、このフラグメントがＩＣＡＭ −１に結合し得るものである請求項２８記載の方法。 ３８．前記フラグメントが抗体Ｒ６−５−Ｄ６のフラグメントである請求項３７ 記載の方法。 ３９．前記炎症が特異的防御系の反応である請求項２８記載の方法。 ４０．前記炎症が遅延型過敏反応である請求項２８記載の方法。 ４１．前記炎症が乾癬症である請求項２８記載の方法。 ４２．前記炎症が自己免疫疾患症である請求項２８記載の方法。 ４３．前記自己免疫疾患がレイナード症候群（Ｒｅｙｎａｕｄ′ｓ　ｓｙｎｄｒ ｏｍｅ）、自己免疫甲状腺炎、ＥＡＥ、多発性硬化症、リウマチ様関節炎および 紅班性狠瘡からなる群より選ばれる請求項４２記載の方法。 ４４．前記炎症が臓器移植拒絶に対する応答に存在する請求項２８記載の方法。 ４５．前記臓器移植が腎臟移植である請求項４４記載の方法。 ４６．前記炎症が組織移植拒絶の応答に存在する請求項２８記載の方法。 ４７．ＬＦＡ−１に結合し得る抗体、ＬＦＡ−１に結合し得る抗体の官能性誘導 体、およびＬＦＡ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストからなる群より選ばれ た薬剤を投与することをさらに含む請求項２８記載の方法。 ４８．免疫抑制剤を投与することをさらに含む請求項２８記載の方法。 ４９．前記免疫抑制剤を前記対象体に次善の投与量で投与する請求項４８記載の 方法。 ５０．前記免疫抑制剤がデキサメセゾン、アザチオピリンおよびシクロスポリン Ａからなる群より選ばれる請求項４８記載の方法。 ５１．前記抗炎症剤を前記対象体に予防的に投与する請求項２８または４８のい ずれか１項記載の方法。 ５２．前記抗炎症剤を前記対象体に治療的に投与する請求項２８または４８のい ずれか１項記載の方法。 ５３．移行にＬＦＡ−１群の官能性１員を必要とする造血腫瘍細胞の転移を抑制 する方法において、 そのような治療を必要とする患者に上記の転移を抑制するのに十分な量の抗炎症 剤を投与することを含み、この抗炎症剤がＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣ ＡＭ−１に結合し得る抗体フラグメント、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性 誘導体およびＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストからなる群より選 ばれることを特徴とする上記方法。 ５４．ＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストがＬＦＡ−１以外のＩＣ ＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストである請求項５３記載の方法。 ５５．前記抗炎症剤がＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体である請求項５３記載の方 法。 ５６．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項５５記載の方法。 ５７．前記モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６である請求 項５６記載の方法。 ５８．前記抗炎症剤が抗体のフラグメントであり、このフラグメントがＩＣＡＭ −１に結合し得るものである請求項５３記載の方法。 ５９．前記フラグメントが抗体Ｒ６−５−Ｄ６のフラグメントである請求項５８ 記載の方法。 ６０．ＩＣＡＭ−１発現性腫瘍細胞の増殖を抑制する方法において、そのような 治療を必要とする患者に上記の増殖を抑制するのに十分な量の毒素を投与するこ とを含み、この毒素がＩＣＡＭ−１に結合し得る毒素由来抗体、ＩＣＡＭ−１に 結合し得る毒素由来抗体フラグメント、ＬＦＡ−１群分子の毒素由来１員および ＬＦＡ−１群分子の１員の毒素由来官能性誘導体からなる群より選ばれることを 特徴とする上記方法。 ６１．ＬＦＡ−１発現性腫瘍細胞の増殖を抑制する方法において、そのような治 療を必要とする患者に上記の増殖を抑制するのに十分な量の毒素を投与すること を含み、この毒素が毒素由来ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の毒素由来官能性 誘導体からなる群より選ばれることを特徴とする上記方法。 ６２．特異的防御系の応答に由来する炎症を有する懸念のある哺乳動物対象体の 該炎症の存在および位置を診断する方法において、（ａ）上記対象体にＩＣＡＭ −１を発現する細胞を同定し得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する 組成物を投与すること、および （ｂ）上記結合性リガンドを検出すること、を特徴とする上記方法。 ６３．特異的防御系の応答に由来する炎症を有する懸念のある哺乳動物対象体の 該炎症の存在および位置を診断する方法において、（ａ）上記対象体の組織サン プルをＩＣＡＭ−１を発現する細胞を同定し得る検出可能に標識した結合性リガ ンドを含有する組成物と共にインキュベートすること、および（ｂ）上記結合性 リガンドを検出すること、を特徴とする上記方法。 ６４．前記結合性リガンドを前記組織サンプル中に結合させる請求項６２または ６３のいずれか１項記載の方法。 ６５．前記結合性リガンドがＩＣＡＭ−１に結合し得、このリガンドが抗体また は抗体のフラグメントからなる群より選ばれる請求項６２または６３のいずれか １項記載の方法。 ６６．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項６５記載の方法。 ６７．モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６である請求項６ ６記載の方法。 ６８．前記結合性リガンドがＩＣＡＭ−１のＤＮＡ配列およびＩＣＡＭ−１遺伝 子のｍＤＮＡ配列からなる群より選ばれた分子に結合し得る核酸分子である請求 項６２または６３のいずれか１項記載の方法。 ６９．前記核酸分子が次の群からなる少なくとも１種のポリペプチドをコードす る請求項６８記載の方法：（ａ）−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｄ−Ｑ−Ｐ− Ｋ；（ｂ）−Ｘ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｄ−Ｑ−Ｐ− ｋ；（ｃ）−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｉ−Ｅ−Ｔ−Ｐ−Ｌ；（ｄ）−Ｆ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｙ− Ｘ−Ｔ；（ｅ）−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ａ−Ｐ−ＬＰ； （ｆ）−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｌ−Ｆ−Ｅ；（ｇ）−Ｌ− Ｎ−Ｐ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｘ−Ｄ−Ｓ−Ｆ−Ｓ−Ａ−Ｋ；（ｈ）−Ｓ−Ｆ− Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｎ−Ｖ；（ｉ）−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ；（ｊ）−Ｒ−Ｇ− Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｅ−Ｐ；（ｋ）−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ−Ｋ− Ｒ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｅ；（ｌ）−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｓ； （ｍ）−Ｐ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｋ； （ｎ）−Ｑ−Ｅ−Ｄ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｍ；（ｏ）−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｅ−Ｌ− Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｓ；（ｐ）−Ｒ−Ｒ−Ｄ−Ｈ−Ｈ−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｆ−Ｓ；およ び（ｑ）−Ｄ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ。 ７０．ＩＣＡＭ−１発現性腫瘍細胞を有する懸念のある哺乳動物対象体のかかる 細胞の存在および位置を診断する方法において、（ａ）上記対象体にＩＣＡＭ− １に結合し得る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する結合性リガンドを 投与すること、このリガンドは抗体および抗体フラグメントからなる群から選ば れ、該フラグメントはＩＣＡＭ−１に結合し得ること、および （ｂ）上記結合性リガンドを検出すること、を特徴とする上記方法。 ７１．特異的免疫系の応答に由来する炎症を有する懸念のある哺乳動物対象体の 該炎症の存在および位置を診断する方法において、（ａ）上記対象体の組織サン プルをＩＣＡＭ−１を発現する細胞を同定し得る検出可能に標識した結合性リガ ンドを含有する組成物と共にインキュベートすること、および（ｂ）上記結合性 リガンドを検出すること、を特徴とする上記方法。 ７２．前記結合性リガンドを前記組織サンプル中に存在するＩＣＡＭ−１に結合 させる請求項７０または７１のいずれか１項記載の方法。 ７３．前記結合性リガンドがＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体、お よびＩＣＡＭ−１に結合し得る上記モノクローナル抗体のフラグメントからなる 群より選ばれる請求項７０または７１のいずれか１項記載の方法。 ７４．モノクローナル抗体がモノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６である請求項７ ３記載の方法。 ７５．ＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫瘍細胞を有する懸念のある対象体の かかる細胞の存在および位置を診断する方法において、 （ａ）上記対象体にＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得る検出可能に標識した結 合性リガンドを含有する組成物を投与すること、このリガンドはＩＣＡＭ−１お よびＩＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群より選ばれること、および（ｂ）上 記結合性リガンドを検出すること、を特徴とする上記方法。 ７６．ＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫瘍細胞を有する懸念のある対象体の かかる細胞の存在および位置を診断する方法において、 （ａ）上記対象体の組織サンプルをＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得る検出可 能に標識した結合性リガンドを含有する組成物の存在下にインキュベートするこ と、このリガンドはＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群 より選ばれること、および （ｂ）上記組織サンプル中に存在するＬＦＡ−１群分子の１員に結合させた上記 結合性リガンドを検出すること、を特徴とする上記方法。 ７７．（ａ）ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体フ ラグメント、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体、およびＩＣＡＭ−１ の非免疫グロブリンアンタゴニストからなる群より選ばれた抗炎症剤、および（ ｂ）デキサメセゾン、アザチオピリンおよびシクロスポリンＡからなる群から選 ばれた少なくとも１つの免疫抑制剤、を含む薬剤組成物。 ７８．１種の免疫抑制剤を含有し、この免疫抑制剤がデキサメセゾン、アザチオ ピリンおよびシクロスポリンＡからなる群より選ばれる請求項７７記載の薬剤組 成物。 ７９．前記フラグメントがＩＣＡＭ−１のドメイン１、２および３を含有する請 求項４記載の官能性誘導体。 ８０．前記フラグメントがＩＣＡＭ−１のドメイン１および２を含有する請求項 ４記載の官能性誘導体。 ８１．前記フラグメントがＩＣＡＭ−１のドメイン１を含有する請求項４記載の 官能性誘導体。 ８２．前記フラグメントがＩＣＡＭ−１のドメイン１、２および３を含有する請 求項３０記載の方法。 ８３．前記フラグメントがＩＣＡＭ−１のドメイン１および２を含有する請求項 ３０記載の方法。 ８４．前記フラグメントがＩＣＡＭ−１のドメイン１を含有する請求項３０記載 の方法。 ８５．哺乳動物対象体の非特異的防御系の応答に由来する炎症の治療方法におい て、 そのような治療を必要とする対象体に上記炎症を抑制するのに十分な量の抗炎症 剤を投与することを含み、この抗炎症剤がＩＣＡＭ−１のドメイン１、２および ３を含有するＩＣＡＭ−１のフラグメント、ＩＣＡＭ−１のドメイン１および２ を含有するＩＣＡＭ−１のフラグメント、およびＩＣＡＭ−１のドメイン１を含 有するＩＣＡＭ−１のフラグメントからなる群から選ばれることを特徴とする上 記方法。