JPH03501884A - 生化学種を検出する方法およびその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生化学種を検出する方法およびその装置背景技術 本発明は、例えば、リガンド（配位子）・アンチリガンド反応によシ形成され、 特定の抗体及び抗原、細胞、細胞片、タンパク質、酵素が存在することを、それ らが生物的プロス又はその他の液体内にある間に示すような生物親和性化学物質 の検出と定量辿」定とを行うための改良された方法及び装置に関する。

上記生物的ブロスは、そこにおいてリガンド又はアンチリガンドが形成される培 養液であることが多い。

例えば単クローン性抗体や薬物、受容体保持酵母基質などの特定の生物親和性化 学物質を検出するという分野において、膨大な量の研究がなされてきている。大 部分のそのような作業は、標示薬として放射能化学物質に頼っている。そのよう な試験は同位体試験と呼ばれている。本発明は、特に非同位体方法で有益である が、同位体方法も利用できるものである。

免疫化学の分野において、そのような検出処理や分析は、いわゆる異種分析と、 いわゆる同種分析とに分かれている。異種分析はアナライト（検体）に選択的に 結合されている分析試薬を、そのように結合していないものに対して検出又は分 析の前に、試験子の合成物から分離することが必要である：うな方法であると定 義されている。米国特許第４，６５２，５３３号（発明者：　Ｊｅｌｌｅｙ）は そのような方法を開示している。従来周知のＥＬＩＳＡ（酵素リンク型免疫溶媒 分析）及びＲＩＡ（放射能免疫分析）方法はそのような異種分析の典型的なもの でおる。

異種分析において必要である非結合体からの結合体の分離は、数多くの洗浄・分 離ステップにより容易になることが多い。磁気ビーズをフィルター又はマイクロ タイター飯の代わシに使用することもしばしばあシ、それによシ、そのような分 析方法を実施する前に、非結合様を含む一切の合成物から結合種の分離及び除去 を行うのに役立てる。同種分析では、非結合体から結合体を測定する場合に、そ れらを互いに分離する必要がなく、すなわち、両者は、分析又は検出方法を実施 している間、同じ室（コンノく−トメント）にとどめておくことができる。既存 の同種試験は速度が非常に速いわけではなく、又、感度が非常によいわけでもな い。それらのいくつかは現場作業に適応しておシ、すなわち、監視されるプロセ スで大部分を占める生物体の成長又は放出が進行中であるような処理に適用でき る。そのような処理の全ては、異種試験よシも一般に所要労力が少ないが、以前 として機械や人員による多量の操作を必要とする。従来利用可能な同種分析のい ずれも、従来周知の異種分析と同じ程度に感度が高いとは考えられず、又、大部 分のものは、例えば約３００００ダルトン以上の大形分子を効果的に測定できる とは考えられない。例えば、放射・免疫拡散（ＲＩＤ）分析と「比濁分析」技術 では、大形分子を測定できるが、感度が低いという不具合がちる。

米国特許第４，６８０，２７５号（発明者：　ｗａｇｎｅｒ他）は、同種試験方 法で蛍光バックグランドの存在を回避するために時間遅延方法を開示している。

同種非同位体免疫分析のための別の技術（例えば、Ｅｌｉｎｇｓ及びＮ１ｃｏｌ ｉの米国特許第４，５３７，８６１号が言及している発明）では、分析中の生物 化学的合成物内（又は近傍）の複数の間隔を隔てた電極又は磁石によシ形成され ている空間的パターンを走査する。上記走査は、検出したいラベル村き結合反応 に伴う概ね無秩序の出力と概ね無秩序のバックグランド蛍光出力とを速やかに識 別できるような方法で実施される。

蛍光を刺激させてそれを処理する技術は、分析化学の分野で周知でちる。そのよ うな技術は米国特許第４，６７５，５２９号（発明者：　Ｋｕｓｈｉｄａ　）、 上記引用のＷａｇｎｅｒ特許及び上記引用のその他の文献に充分に記載されてい る。

最近発行された米国特許第４．６８３，１２０号には、遠心力的に組み立てた物 質の「パッチ」が示されておシ、その幾何学構造は、パッチがそこから組み立て られる複合物の特性基準として測定される。

無論、背景技術の以上の説明は、本願に記載した発明のあと知恵的知識で必然的 になされるもので、そこに引用された種々の文献は説明のために以上又は以下に 組み合わせられる知識によるものにすぎない。

発明の要旨 本発明の主要な目的は、非ラベル付きＤＮＡ片（例えば遺伝子）と、ＤＮＡ片に ついて特定されるＲＮＡ片のような対応する核酸との間の反応で形成されるよう なリガンド・アンチリガンド反応生成物や、それに類似する反応生成物などの特 定のアナライト・アンチアナライト反応生成物を検出するための新規な同種型方 法と、その方法に役立つ新規な装置とを提供することにある。実際に、本願の目 的としては、ＤＮＡ／ＲＮＡ親和体は、一般に、アナライト・アンチアナライト 反応生成物の種として扱われる。

本発明の具体的な目的は、上述の形式の方法において、リガンド・アンチリガン ド反応生成物がそこで形成される生物的ホスト合成物（すなわちブロス）から放 射されたバックグランドエネルギーによる干渉を回避するために手の込んだ手段 を設ける必要が実質的にないようにする現場手段を提供することにある。

更に本発明の目的は、そのような方法を実施するための手段と、そこで使用する 装置であって、生物的合成物の体積が非常に小さく、場合によっては超マイクロ リッターであっても、その試験に利用するのに適した手段や装置を提供すること にある。

更に本発明は、感度の高い方法とそれに使用する装置でちって、特定のアンチリ ガンド・リガンド反応生成物の量が非常に少なく、又、検出又は分析を行ってい る合成物において多量の干渉蛍光が存在する可能性がある場合でも、検出を非常 に速やかに行えるような方法及び装置を提供することにある。

更に本発明の目的は、小さいリガンドの他に、例えば５０００ダルトン以上、実 際には３００００ダルトン以上、更に、数十万ダルトン以上のような太きいリガ ンドを検出するための、感度及び汎用性の高い同種分析技術を提供することにあ る。

本発明の別の目的は、小量のアナライト（すなわち、検出中の物質）の高速分析 を行うことにおる。

本発明のその他の目的は、以下の説明から明らかである。

上述の目的を達成するために利用する方法によると、基質手段（好ましくは磁鉄 鋼粒子などの低透明度物質）を使用して、好ましくは不透明である検出対象の分 離した物質の「パッチ」内へラベル付キリガント・アンチリガンド生成物を運ぶ 。本発明の好ましい実施例では、パンチが評価中の領域をバックグランド干渉か ら遮蔽し、この遮蔽はそのソース（源）が非結合タッグ物質、おるいは、そこか らパッチが分離した液体生物的物質又はブロスのいずれの場合でも行われる。こ こで使用する「バックグランド干渉」は、残留ラベル付は染料からの反射光を含 み、すなわち、パッチの測光評価に有益となシ、それ本来の特性の結果として放 射線を発生せず、しかも、本発明の方法において有益なラベルでちる残留ラベル 付は染料からの反射光を含む。但し、適当な状況では、同位体タッグを含む別の タッグも使用できる。ガラスなどの基質物質を使用できるが、そこから光を受け 取る一切の手段に焦点を合わせ、バックグランド蛍光が、例えば蛍光タッグの測 定のような光学的測定から外れるようにしなければならない。

「不透明」基質物質は、実質的に不透明なパッチを形成できるものを意味してい る。パッチは薄いほど望ましく、従って、酸化鉄系磁気粒子などの透明度が限定 された磁気粒子が、薄い不透明パッチを形成する上で特に効果的である。約４％ 以下の透過度のパッチを容易に実現できる。

リガンドという言葉は、化学分野での広い意味で使用しておシ、アンチリガンド と呼べるような別の化学物質について特定の親和力を有するものとしてここでは 使用している。この限定は生物化学技術で一般に認められているもので、ｌ、リ ガンドが中心金属イオンの周囲の原子群であることを妥件とする古い限定に既に 置き代わっているものでちる。

「液体」という言葉は、粘性を有し、そこを通して、リガンド及びアンチリガン ドを有する粒子が試験パッチ内へ移動できるような一切の物質を表すものとして 使用している。すなわち、数多くのゲルは、本発明を実施する場合の適当な「液 体」でちる。

一部の従来技術では、検出される物質を「アナライト」と呼び、それに対する生 物的親和性力を有する物質をアンチアナライトと呼ぶ。ここではリガンド及びア ンチリガンドを使用しているが、それらは、そのようなアナライト・アンチアナ ライト生成物をカバーするものと広く解釈するものとする。

本発明の一実施例の方法では、生物的親和性物質を引き付けるのに生物化学技術 で使用されるような形式の磁気ビーズを、不透明パッチを形成するためのキャリ ヤ粒子手段として利用する。但し、例えば炭素や金属ベリラム又はその他の物質 を基とする粒子を比較的不透明なキャリヤとして使用することもできる。そのよ うなキャリヤは、均一な化学的及び寸法分布特性を有し、無論、評価中の生物学 的方法及び物質との干渉が最小となるように選択すると最もよい。非日気又は磁 気粒子をパッチ内に分離させる場合、遠心力によシ行うことができ、場合によっ ては、一部のプラスチツクや中空粒子のようにその浮力で浮上して分離できる場 合には、それを利用することもできる。但し、ミス形式の粒子の都合のよめ形態 としては、適当な磁界を及ぼすことによシネ透明パッチ内へ移動させることがで き、又その場合、必ずしも必要ではないが、試験中の生物学的室の壁領域の近傍 の所定位置へ都合良く移動させられるということがちる。そのような所定位置に 、検出手段（例えば、パッチに当てる励起光の源と、その範囲からの蛍光を検出 する手段）を使用すると、分離した物質の非常に小さい特定のパッチからの蛍光 につ゛いて試験を容易に行うことができる。移動可能な微粒子基質物質として磁 気粒子を使用した場合の別の利点として、分析又は検出を行っている生物的坑内 に、それらを再び分散させることが比較的容易であるということがある。いずれ にしても、対象とするタグ付きアンチリガンド・リガンドを保持するキャリヤが 、分析中の液体を入れた容器又は室の壁に隣接する検出スポットで不透明パッチ に組み入れられると、バックグランド又はノイズに対して著しく効果的なスクリ ーンが形成されることが分かつている。

上記バックグランド又はノイズは、例えば、生物学的又はその他の源からの非結 合蛍光プロビード又は蛍光干渉である残留放射線発生物質を有する液体で行われ る同種分析を妨害すると考えられるものである。キャリヤは単一基質構造でもよ く、又、ビーズのような複数の粒子でもよい。

すなわち、成長中の培養媒質の自然のバンクグランド、すなわち、蛍光バックグ ランド、が全体的に遮蔽されるだけではなく、非結合ラベル又はタッグ、すなわ ち、蛍光誘導タッグ、からの全てのバックグランドも、不透明粒子基質によシ全 体的に遮蔽される。非利用（非結合）タッグの遮蔽は特に重要であシ、その理由 は、遮蔽によシ、測定前の蛍光タッグの大部分又は全てを使し果たすことに対す る検出方法のバリューの依存性を著しく減少させるためでおる。ここでの「タッ グ」又は、「ラベル」は、例えば、放射性反射蛍光又は化学ルミネッセンスタッ グのような検出可能なプルーブを形成するためのアンチリガンドに結合できる。

パッチ内へ分離させるべきビーズが重力技術で分離される場合、室の形状は、室 （通常はそこにおいてアナライトが形成される反応器）の底部に留まるビーズが パッチに集中するように設定すると都合がよい。これを確実に行うためには、室 はチューブの軸に沿う方向にはさほど長くせず、概ね球形にするか、場合によっ ては、チューブの軸に沿っである程度直角に延びるような形状にすることが望ま しい。

そのような室を、ここで述べるような寸法及び形式でポリマーチューブに形成す ると、試験対象の生物培養液の室は、好ましくは約２５センチストークでちって 、Ａｕｓｉｍｏｎｔ　Ｇｒｏｕｐ　（Ｍｏｎｔｅｆｌｕｏｓの子会社）からＤ− ２５として得られるようなパーフルオロカーボン液体を使用する体積を、１マイ クロリツター以下（例えば、約０．５マイクロリツター又はそれ以下）まで減少 させることができる。

反応室を囲むチューブの表面をパーフルオロカーボン液体被覆で「閉塞」すると 有益であることが分かつている。ＢＳＡの１％溶液も閉塞に役立つ。

「プルーブ」は、典型的な例では、例えば蛍光タッグである検出剤と組み合わせ るか、又は連結したアンチリガンドである。これらのプルーブは最初に懸濁状態 にされ、続いて、被検出リガンドの基質への結合が行われる。基質へのリガンド の結合は、アンチリガンドの存在によシ生じる（アンチリガンドは、プルーブに 存在するアンチリガンドと同じ又は別のものでよい）。無論、アンチリガンド及 びリガンドという言葉は互換性があシ、抗体は、抗原が抗体を引き付けることが できるのと同じ程度に容易に抗原を引き付けることができる。すなわち、本願に おけるそのような言葉の全ては相対的に使用されておシ、一般的々規則として、 「アンチリガンド」は、通常、基質で不動化されてプルーブに存在する誘引剤と して指定され、−万、リガンドは、アンチリガンドに選択的に引き付けられる液 体合成物内の物質でちる。

無論、プルーブは、ラベルに付けた公知のりガントでも形成できる。これは競合 分析において特に有益でちる。この場合、プルーブは、試料の競合するリガンド に応じた量だけアンチリガンド基質に直接付くことになる。又、試料のリガンド の量に比例する量だけ置換されたラベル付きリガンド及びアンチリガンドで処理 された基質から形成されるプルーブに基質を含ませることも可能である。

本発明には更に別の優れた効果がある。例えば、キャリヤ粒子は、不透明パッチ として組み立てた時、基質とアンチリガンドとリガンド及びプルーブの複合物で ちる特にめようとするアナライトタッグ付きアンチアナライト生成物からのごく 小食の光をもそれに対して検出できる極めて有効なベースラインを提供する。

この検出方法の更に別の効果として、例えばガラスやクォーツのように、そこを 通して検出を行えるような正確な光学的レンズや光学的物質を必要としないとい うことがちる。実際に、検出のために選択した容器の壁に任意の適当な角度で焦 点を合わせた光で有効に作用することが分かつている。多くの状況ではＮ工と蛍 光（ｅｐｉｆｌｕ　ｏｒｅｓｃｅｎｅ　）を測定することが最も都合がよく、又 望ましい。多くの場合、容器は評価のために分離した液体「泡」とな９、その泡 は、例えばフルオロカーボン・チューブのヨウなプラスチックチューブの内側を 、一連の複数の容器の一つとして移動する。

本発明では、「光学的にラベルを付けた」という言葉は、染料でラベルを付け、 そのラベル付けの結果として、適当な光源及び検出手段を使用して検出できる免 疫化学成分を指すものとして使用する。蛍光発生染料はラベルに非常に適してお ｐ、又、それを使用する技術は当該技術分野で周知であるが、その他の染料原料 をいくつかの状況では利用することもできる。蛍光検出技術の生きている細胞と 共存できる能力及び感度が優れているので、本発明の数多くの実施例について、 それらが好ましい技術となっている。例えば放射性同位タッグなどのその他のタ ッグを使用してプルーブを形成する場合、放射線を検出する適当な方法を使用で きる。ラベル付けはあらゆる適当な方法で実施でき、−例として蛍光物質を、第 ２２組のガラス又はプラスチックビーズ（すなわち、主キヤリヤビーズに最終的 に引き付けられ得るプルーブビーズ）内に入れ、その後に、ビーズをアンチリガ ンドで被覆して完全なプルーブを形成するという方法がちる。

又、蛍光タッグを２次ビーズに取シ付けてプルーブビーズを形成し、その後に、 アンチリガンドで処理してプルーブを形成することもできる。

更に、主ガラスビーズを、磁気ビーズと組み合わせて基質物質とｊ−て使用する こともできる。異なるパラメータの測定は、各種類のビーズ（例えば、各種類の ビーズの異なるアンチリガンド）で行うことができる。

本発明の主張な効果の１つは、現場で測定される被検出生物化学物質で実施され 、すなわち、被検出物質が生成される媒質内で実施されるということである。す なわち、被検出生物体を含む容器（すなわち室）内の体積が、試験のために実質 的に損なわれることが全くない。このことは、分析される体積が非常に小さく、 すなわち、０，２５〜１０マイクロリツターである場合に非常に重要となる。

第７図から明らかなように、本発明の検出分析技術は、分泌細胞が成長し、グリ コプロティン又はグリコリピド又はカーボッ・イドロネートが細胞によシ分泌さ れている場合でも、微量の生物的合成物を含む小形の閉鎖室で実施することがで きる。典型的な状況では、容器又は反応器が、１８ゲージ、すなわち、内径が０ ．０４２インチで壁厚さが０．０１２インチでちる、ＦＥＰ　（フッ化エチレン ポリマー）で形成されたポリフルオロカーボンチューブ内で限定されることにな る。そのようなチューブは、内径が約０．０３〜０．０４インチで壁厚さが約０ ．０１〜０．０２インチのものがＺｅｕｓ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｐｒ０ｄｕ ＣｔＳ＋Ｉｎｃ、　（住所：　Ｒａｎｔａｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅ）’）によ シ商品名ｒＺｅｕｓ　Ｊで販売されている。チューブは殺菌可能で毒性がなく、 水による湿潤性がなく、ガス透過性がある。

特定の単クローン性抗体の早期検出が特に問題となる。適当々分泌パイブリドー マ細胞の存在も、検食中の培養液内の特定の抗体の存在によシ識別される。ここ では、抗体を分泌することができる成長中かつ分割中の（すなわち現場の）パイ ブリドーマの存在する状態で、抗体の同種検出によυ、特定の単クローン性抗体 の存在を検出するための同種分析技術が記載されている。

例えば単クローン性抗体を分泌する細胞の存在を速やかに標示できることが非常 に望ましい。そのような検出性力は、室寸法を小さくすると強化され、その理由 は、分泌細胞が、よシ大きい体積内にある場合と同じ数の抗体を分泌する傾向に ちるためである。更に、室をよシ小さくしてより球形（又は垂直に細長い形状） に近付けると、室へのガス交換のための室体積当りの相対的な表面面積を大きく できる。

このよう々小さい寸法は、チューブ内へ吐出されるパーフルオロカーボン流体と 生物培養溶液の体積を慎重に比例させることによシ実現できる。すなわち、室の 寸法を小さくして適当な形状にすると、評価対象のパッチを容易に集中させるだ けではなく、そのような室において（分泌細胞の存在を示すものとして）検出さ れる単クローン性抗体々どの濃度を高めて、検出性を強化することができる。本 発明は、単クローン性抗体を表すことができる能力について既に選択されている 分泌パイブリドーマ細胞によυ生成されつつある抗体について以下に詳細に説明 するが、本発明は、単クローン性生成物に使用するためにパイブリドーマ細胞を 選択する方法において形成される特定の抗体の存在を検出する場合にも利用でき る。

ここで具体的に記載した方法は、図示の実施例に記載したような形式の室におい て、１０マイクロリツターの培養媒質当り１０未満の分泌細胞が存在することを 検出できるという非常に優れた能力がちる。

ミリリッター当シ４０ナノグラム以下の濃度でも抗体を検出できる。

当業者にとって明らかなように、粒子パッチからのちる種類又はその他の種類の 放射線の測定が、本発明を利用するための唯一の方法というわけではない。そこ から粒子が引き出された後の液相に留まっているタッグや蛍光又はその他のラベ ルの量も、「パッチ」範囲に引かれるか又はとどめられた物質の逆の測定として 使用できる。この方法では、タッグの放射線特性はバックグランドとは実質的に 異なるも、のにする必要がある。

又、検出される第１アナライトは、磁気又は重力手段によシ、分離した基質に併 合させることもでき、その場合、検出対象の別のアナライトは、別の方法で分離 される。すなわち、検出対象の一部の物質は磁気技術で分離し、他方を重力で分 離することができる。ちるいは、分析対象の物質は、例えば光学的測定により分 析される媒質内に結合形態で分散させたままにし、−万、別の物質を重力や磁気 技術によシ物理的に分離させることもできる。この最後の技術は、タッグに蛍光 性がない場合や、バックグランドの（生物学的に発生させた）蛍光が非常に低い 場合に特に有益である。

これらの方法の全ては、当該技術分野で公知の生物学的処理方法の専門家が、本 件開示内容を読むことによシ、容易に実施できる。

説明を分かシやすくするために、単一のアンチリガンド、すなわち、特定の単ク ローン性抗体リガンドの検出に役立つものと、単一の蛍光源から放射される光と を使用する場合について本発明を説明する。

但し、当然のことながら、本発明は、２個以上の抗体を、異なるアンチリガンド を使用することによシ同時に検出できるような方法で利用することもできる。各 アンチリガンドは、別のラベル（例えば、異なる蛍光タッグ）であって、光学的 手段により互いに識別できる（すなわち、異なるラベルが放射又は反射する異々 る波長によシ識別できる）ラベルを有するプループとすることができる。

又、本発明の方法の実質的な効果として、分析前に室から被分析粒子を除去して も実施できるということがある。例えば、除去後に、洗浄ステップを経ずにパッ チを光学的に評価することもできる。

濃度強化 本発明の方法の特に価値の高い変形構造として、対象とする分泌細胞の早期検出 を非常に容易に行うことができ、その方法では、固体相マトリックスの細孔ネッ トワークに、対象とする全ての分泌生成物と細胞自体を結合することによる「濃 縮効果」が使用される。マトリックスは、不透明なアンチリガンド保持粒子又は ビーズで形成できる。そのようなマトリックスの主な目的は、運動性を制限する とともに、アナライトが複数のプループでラベルが付けられた細胞のすぐ周囲近 傍に集中させられるアナライト（例えば、細胞によシ形成されたアナライト）の 濃度を最大にすることにある。これにより、特定の分泌細胞又はそのような細胞 の存在の識別を非常に速やかに行えるようになる。

実際には、マトリックスは空間を有しており、すなわち、マトリックス内に液体 で満たされる空間がある。空間をより小さくすることが、細胞のすぐ周囲の分泌 された生成物の濃度をよシ高くしやすいという意味において好ましい。パッチの 細孔率は、リガンドとプループがそこを通して拡散できるだけの充分な値にしな ければならない。但し、細孔率の最も好ましいレベルは、細胞寸法やアナライト 寸法、質、プループの性質などの要因に関連する。

細胞全体がマトリックス内にある必要はないということを強調しておく。例えば 、細胞の直径はマトリックスの厚さよりも大きくてもよい。そのような場合、細 胞体積の大部分をマ）　ＩＪツクス内に入れることが好ましい。

アナライトとの反応前に、ペインティング又はその他の一般的な方法によシ、細 胞自体を基質（例えば、アンチリガンド保持ビーズ及びプループを含むこともで きる被覆パッチなどの予め形成されたパッチ基質）内に置けることが分かつてい る。細胞によシ所望の抗体が分泌されると、抗体が即時的にアンチリガンド被覆 基質に付き、それに続いて、蛍光プループ物質を付け、それによυ、細胞の近傍 での細胞の存在が最も容易に検出できるようになる。プルーブ保持抗体は細胞の 周囲に比較的集中することになる。多くの場合、それらは「ハロー」効果を形成 し、その理由は、アナライト分泌生成物（実際にはリガンド・アナライト、典型 的な例では単クローン性）が、よシ大きい培養試料での希釈にょシそのプロセス が低速化又は曖昧化されるようなことはなく、プループに付くためである。すな わち、固体基質マトリックスは、被検査領域での液体量を制限し、又、システム での液体（通常は培養媒質）に対するアナライト（又は単純な細胞）とその生成 物との濃度が高くなることを促進するように思える。そのような方法によシ、細 胞とその分泌生成物との運動性が減少し、同時に、その検出性が増加する。この 方法を使用すると、単一の細胞生成（例えば、所望の単クローン性分泌生成物） を検出することもできる。又、分泌細胞はパッチの一部でもよい。そのような場 合、プループはパッチに含まれたままでちるか、又は、パッチの位置決め後に添 加された液体合成物の一部でよい。

この高密度効果を実現するための優れた方法として、例えば磁気ビーズモあるア ンチリガンド処理ビーズに対して細胞集団を密着させる方法がちることが発見さ れている。アナライト生成物について監視しようとする細胞及びアンチアナライ ト保持ビーズを備えた基質混合物は、反応器表面上、すなわち、９６ウエルマイ クロタイター板などの底の室へ残シの培養液を供給する前に、管状室の内面上で 被覆することができる。これに代えて、アンチアナライト保持ビーズは、ビーズ の頂部に細胞を添加する前に、反応器表面上で被覆することもできる。

又、無論、いわゆる９６ウエル板のウェルの表面上と、例えば明瞭な光学的表面 上であるビーズの多孔パッチのすぐ上又は下に対して細胞を重ねることもできる 。

細胞・ビーズのパッチの形成及び利用を行うための別の方法として、シート状フ ィルム上にそれを配置し、必要な場合にゲル被覆で不動状態にしたシ；所望の抗 体又は細胞を分泌する細胞を有する範囲が識別された後、細胞取シ入れ処理の一 部としてその範囲を切シ取って除去するという方法がちる。シートは特に手軽な 装置であシ、具体的には、所望の分泌細胞を有する範囲の孔開は及び回復よ容易 に行える。

これらの処理の全てによシ、アナライト保持パッチは透明表面のすぐ近傍に位置 し、そこにおいて、光（最も好ましくはエビ反射光又はエビ蛍光）により監視で きるようになる。

不透明ビーズは、基質として利用する他に、アンチリガンドで被覆されていない 時にバックグランド遮蔽剤としても役立つ。

この例では、その代わシに、マイクロタイター板又はフィルム又は膜でちる透明 基質上で、アンチリガンドが被覆されている。

具体的な試験システムの光学的密度によっては、プループと反応した後に不透明 パッチを細胞層又はその他の非不透明基質パッチの裏側へ引き、それにより、バ ックグランド放射線から検出システムを遮蔽することが望ましい場合もある。そ のような不透明パッチは、エビ反射光又はエビ蛍光システムにおいて特に役立ち 、光透過システムでは全く役に立たない。そのような反応では、不透明パッチ形 成粒子を生物化学物質で被覆することは必要でない。

一般に磁気ビーズで行われる不透明遮蔽は、アナライトの反応後であっても、「 予め位置決めしたパッチ」を使用して効果的に実施できる。そのような状況では 、元の培養液と、発明に使用する基本物質とが測定容器に入れられる。２次ビー ズ集団（一般には、予め位置決めするか又は「ペイント」シタパッチに使用され る可能性のあるビーズ以列の一般的な磁気ビーズ）が培養液に添加されてパッチ を覆う。

この第２集団の不透明ビーズは、次に、（例えば磁力、又は、磁力を必要としな い適当な場合には重力にニジ）ペイントされたパッチ又は不動化された基質の裏 側へ引かれて、蛍光又はリン光又は検出処理に使用するあらゆる光パラメータの 光の測定中に、媒質でのバックグランド光放射線からそれを遮蔽する。

これに関し、上述の患者腫瘍細胞詞食方法は、バックグランドを反応後に磁気ビ ーズによシ逗蔽できる状況の典型的なものでちる。無論、全ての反応剤が所定位 置にある時、不透明遮蔽パッチは反応前にそれらの後に引くことができる。この 場合も、この遮蔽パッチでの拡散と細孔率とによシ、パッチ全体及び最も重要な その光刺激表面でラベル付けが生じることが許容される。

特に効果的なこととして、基質上に抗原（アンチアナライト）を含む層を形成で き、すなわち、９６ウエル板の基質が不透明ビーズでアンチアナライト層を覆い 、その次にのみ、アンチリガンドタッグ付プループを含む細胞保持培養液をビー ズに対して添加される。細胞から分泌された全てのアナライトは、不透明遮蔽ビ ーズを通してアンチアナラ、イトへの通路を見い出す。プループは、遮蔽層の通 過前及び通過中及びその後のいずれでも、アナライトに付くことができる。不透 明ビーズを遮蔽だけに使用する場合、ＢＳＡなどでその表面を閉塞し、ビーズに 対する生物化学物質の望ましくない付着を回避することが最も効果的である。

細胞表面分析の使用又は分析などに、本発明を使用して細胞間機能を分析するこ とも可能でおる。すなわち、当該技術で現在利用可能な蛍光マーカーなどの内部 細胞マーカーを使用してもよい。これらは、細胞環境に入るまで検知されること のないタッグ物質を利用できる。それによシ生じたマーカー・プループは、特定 の細胞機能を質的及び量的に示すようになる。利用できるそのようなマーカーと しては、酵素マーカーやカルシュラムマーカー及ヒ１））（形？−力−がある。

そのようなマーカーの多くは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ、　Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、　ａｎｄ　Ｄｉｖｉｓ ｏｎ　ｏｆ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できる。

同様に、細胞は、ＤＮＡと相互に作用し、例えば臭化ニジラム（０ｏｌｙｓｃｉ ｅｎｃｅ　Ｉｎｃ、　ｏｆ　Ｗａｓｈｊｎｇｔｏｎ＋ＰＡ、が販売しているＤＡ ＰＩ又はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｉｍｍｕｎｉｃｈｅｍｉｃａｌ　）などのＤＮ Ａ？−カーとなる染料で細胞間的にラベルを付けることもできる。

本発明の一実施例では、マイクロタイターウェルが一連の物質で被覆される。そ の物質は、アナライトについての試験で培養媒質を含んでいる。培養媒質の下で は、ビーズ又はいくつかのその他の基質を基にできる細胞の下側壁の次に、アン チリガンド保持層が被覆される。これらの２個の層の中間は光学的で非常に薄い 層でちるか、又は、アガ・ゲルなどの不動ゲルである。

無論、表面はマイクロタイターウェルでちる必要はない。本発明の重要な点は、 発明の感度がエビ蛍光を利用していることでちる。

本発明の実施例のうち、予め配置したパッチでの細胞に関連するいくつかのもの では、細胞集団を、例えばアナライト基質である基質として作用させることがで きる。そのような用途では、不透明スクリーンをパッチの裏側、例えば、蛍光源 に対して反対側に形成できる。そのような用途において、パンチから腫瘍細胞の 表面に結合するために、単クローン性抗体のパネルを遮蔽部として設けることが 望ましい場合、バッチの腫瘍細胞をターゲットとして使用し、そこを通して検出 を行おうとする透明容器表面の次の基質としてそれらを置く。実際には、腫瘍細 胞の数多くの試料を異なる室、すなわち、９６ウエルマイクロタイター板のウェ ルに添加することになる。

次に、各ウェルには、異なる細胞表面抗原ｅｐｔｉ。

ｐｅ　にそれぞれ対応することが知られている異なる単クローン性抗体を添加す る。単クローン性抗体が患者腫瘍細胞に結合すると、これはグループ（例えば蛍 光・反・抗体）に作用してそれを細胞菱面に併合させる。この細胞併合蛍光は、 次に、好ましくはエビ蛍光によシ測定される。後述する如く、光学的範囲は、焦 点の深さを制限するか、又は遮蔽粒子を使用してそれらを細胞の裏側へ弓１いて 不透明スクリーンを形成することによシ、細胞基質パッチに限定本願では、発明 の好ましい実施例を記載するとともに、その種々の変形技術及び変更技術を示唆 しているが、本発明はそれらに限定されるものではなく、本発明の範囲において それら以外の変更や変形を行うこともできる。ここに示唆されている内容は、説 明のために選択して盛９込んだものであわ、それによシ、当業者が本発明とその 処理を充分に理解できるとともに、それを変更して種々の形態で実施し、個々の 状況に合わすことができるようにするためのものである。

図面の簡単な説明 第１図は、第８図に最も明瞭に示すプラスチックチューブ内の室において孤立化 されたパイブリドーマ細胞合成物を含む生物培養液を示す略図でちる。

第２図は上記Ｍ５胞によシ抗体が表された後の第１図に示すものと同じ培養液の 図である。

第３図は抗体と蛍光プルーブとの両方が磁気ピーズに実質的に結合した後の同じ 培養液を示す図である。

第４図、第５図、第６図は、室の側において不透明パッチ内へ引かれた磁気物質 を示す図である。

第７図は光集合及び測定システムの略図である。

第８図は、一連の生物化学的複合物を取シ扱うための典型的なチューブ処理装置 の略図でちる。

第９図は本発明の方法が最も好ましい形で実施される室の好ましい形状を示す略 図である。

第１図〜第６図に関連する以下の例では、組織培養媒質においてパイブリドーマ 細胞によ）分泌された抗体の存置を検出するための現場同種分析が示されている 。反応器室の管状構造は、米国特許第３，４９１．１４１号（発明者：　Ｓｙｍ ｔｈｅ他）で採用されたものと類似している。チューブは適轟に殺菌し、過フル オロカーボン・キャリヤ液体を使用する。

例１ この分析は、１０００００ダルトンを超える寸法の抗体の検出を立証するもので ある。

第１図の如く、ポリスチレン磁気ビーズ２ｏは、公称直径が１．７５マイクロメ ーターで、Ｓｅｒａｇｅｎ社が供給しているものでちシ、吸収にょシ、ボート・ アンチマウス（ＣＡＭ）で被覆されている工ｇＧ抗体（Ｚｙｍｅａ社が販売して いる重・軽鎖形式）が使用されている。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し て、磁気ビーズ上のそれ以外の反応部位を閉鎖した。ビーズ２０はプルーブのた めの基質として作用し、そのプルーブは、ビーズに結合されて最終的には不透明 バッチ内へ引かれる。ビーズはチューブ結合型反応器、すなわち、室２２内に分 散してお９、室２２は組織培養媒質２４を含んでいる。室２２にはいわゆるタッ グ化学物質又はプルーブ２６も分散してお９、プルーブ２６は、Ｚｙｍｅｄから 入手できるＦＩＴＣ−タッグ付きボートアンチマウス複りローン性抗体である。

又、予め選択したパイブリドーマ細胞２８　（工ｇｃ、２ａ　を発生させる５５ ．２バイプリドーマ細胞）も室２２に分散している。使用前に、細胞は約４回に わたってハンクス液で洗浄して、全ての自由抗体を除去する。別の室には、負制 御体としての非分泌６５３マウス骨髄腫細胞、又は、正抗体制御体として使用さ れる工ｇＧ２ａマウス骨髄腫プロティン（ＩＣＮ社の製品）のいずれかが含まれ ている。

第２図には新た々状況が示されておシ、そこでは、ある時間が経過した後、抗体 ３０が少なくともいくつかの細胞２８（すなわち、分泌細胞）から分泌されてい る。

ボートアンチマウス抗体（Ｍ　Ｂ　／　Ｇ　Ａ　Ｍとも呼ぶ）の被覆を通して磁 気ビーズ２０は、「プルーブ」ＦＩＴＣタッグ句ゴートアンチマウス複クローり 性抗体２６（ＧＡＭとも呼ぶ）と同様に、新たに分泌された抗体３０（Ａｂとも 呼ぶ）と結合する。その結果生じた複合物が、第３図に、上述の呼び方を使用し た以下の式の化学的合成物３２として示されている。

ＭＢ／Ｇ　ＡＭ−Ａｂ−ＦＩＴＣ／ＧＡＭプルーブ抗体２６は、その上にマウス 抗体がちるために、ビーズと併合されるだけである。

第４図〜第６図に示す如く、礎石４０は、寸法が約Ｉ　Ｘ　１．４　Ｘ　７セン チメードルの７キロガウス磁石であり、それを使用して、磁気粒子保持物質を室 ２２の周辺の小さい範囲へ引き、それにょシ、第６図に見られるように、パッチ ４２においてそのヨウなビーズの概ね不透明な集団を形成する。

当該技術分野で公知の適切に適合する刺激光に応答して放射される蛍光の量は、 必ずしも、細胞２８で分泌され、かつ、ＭＢ／Ｇ　ＡＭ−Ａ　ｂ−ＦＩＴＣ／Ｇ ＡＭ　物質を形成するためにＭＢ／ＧＡＭ及びＦＩＴＣ／ＧＡＭの両刃に付く抗 体の量に直接的に関連するわけではない。無論、依然として抗体に付いているな んらかの磁気物質がある場色、それも磁気パッチ４２に入れられるが、それは蛍 光発光には寄与しない。

典型的な動作では、ラベル付き生成物の量を測定するのに使用する蛍光は蛍光顕 微鏡によシ発生及び測定される。該顕微鏡は、蛍光を量的に測定する蛍光源手段 、すなわち、増位型光電管（ＰＭＴ）及び適当な読み出し手段を備えている。通 常、顕微鏡には、後述するように、ＰＭＴなどの受容体を収容する複数のボート が設けである。なお、この例はＦＩＴＣを使用する場合のものである。それ以外 の光源の場合、別の発光ラベル及び異なる最良励起属波数を使用して最も効果的 に使用できる。

その他の光学的システムも、パスにおけるプルーブの存在を検出するのに有益で ある。例えば、アルゴンレーザー４６を使用して（波長が４８８ナノメーターの ）光ビーム６６を発生させ、そのビームがフィルター６８を通過してボア光、す なわち、そのようなレーザーで通常は放射される非干渉光が除去される。そのよ うにして生じたビームは、ビーム拡張（エキスパンディング）及び平行化（コリ メーティング）光学レンズの組合体７０を通過して任意のビーム直径となる。そ の直径は、例えば、パッチ７２に対して約１０ミクロンで６ｐ、典型的な例では 、磁石８４で集められている平均直径で約１００ミクロンである。パッチ上での ビームの具体的な寸法は、蛍光プルーブの過度の不可逆「ブリーチング」（蛍光 放射能力の損失）を回転できるような強さくワット／ｃ＋＋＋２）となるように 選択される。

ビームは２色ビームスプリッタ−７６から４５度の角度で反射し、次に、ビーム ７４の焦点を合わせる対物レンズ７５を通過する。ビームスプリッタ−７６は、 アルゴンレーザービーム６６の９０％以上を反射し、１０％以下を透過させるも のが選択されている。更に、ビームスプリッタ−は蛍光刺激ビーム７４に応答し てパッチから放射された（約５１８ナノメーターに集中させた）蛍光スペクトル を９０チ以上通過させ、それらの波長の１０％以下を反射させる。パッチから放 射されたこの蛍光７８は、光を平行にする対物レンズ７５を透過し、次に、ビー ムスプリッタ−７６を通過する。ビーム７８は、刺激ビーム７４の多量の反射光 を運んでおシ、そのために、別のレンズ８１を通過する前に、バリヤーフィルタ ー８０を通してフィルター処理される。レンズ８１は集めた光の焦点を、一般に はシリコンフォトダイオードである検出器８２に合わせる。フォトダイオード出 力は、ビーム７８の光の量に対応しておシ、増幅されて出力信号となる。

当業者でちれば、以上の説明を読めば、適当なハードウェアー、すなわち、レン ズ！フィルター、鏡、増幅回路、信号出力装置を容易に選択できる。

特に注目すべき点として、非反応蛍光プルーブ及び組織培養液自体に割り当てら れるバックグランド蛍光全体は、磁気パッチの不透明性質によシ、パッチ４２か ら反射した光に実質的な影響を全く持たないように遮蔽されている。特にパッチ に光を入射させる手段は、光学技術で公知の数多くのプロセスを含むことができ 、パッチへ光を運ぶためや、パッチから分析のために光を運ぶために光フアイバ 一手段を含むようにもできる。

第８図は、一般に公知の概念を利用した典型的な連続処理工程の略図で、それに よると、分析対象である約１０マイクロリツターの体積の室２２を、気泡５０で 分離させた状態で、ポリテトラフルオロエチレン・チューブ５２内で移動させる 。液体物質は過フルオロカーボン液体合成物で、３Ｍ社がＦｌｕｏｒｔｎｅｒｔ 　ＦＣ−７７の商品名で販売しているものでらシ、その物質が、分離を容易化す るとともに、反応チューブ５２の内壁に沿って反応器が充分に潤滑された状態で 連続的に容易に移動させるための手段を形成している。チューブ５２は、充分な 栄養ガス及びＣＯ２がそこを通過できる手段を形成している。

室の間のガス又は空気の泡は、ガス泡及び生物培養液を入れた室の両刃を囲むＦ ｌｕｏｒｉｎｅｒｔキャリヤ相６０をガスが通過するための別の表面を形成する ことができる。臨床作業は以下の通シでちる。

被覆及び閉塞した磁気ビーズを、９６ウ工ル組織培養場所へ添加する。その場所 は、分泌又は非分泌細胞のいずれかを含んでおシ、又、実験的制御の場合、工ｇ Ｇ２ａ又は栄養媒質（又は「組織培養」媒質）を含んでいる。

全ての室は、処理された磁気ビーズを、ミＩＪ　ＩＪフッタ当シ約１．１２　Ｘ 　１０　ビーズの典型的な濃度で含んでいる。ビーズの濃度は更に下げてもよい 。プルーブは、ミリリッター当りＦＩＴＣ／ＧＡＭの３７５ナノグラムの濃度で 添加されている。４〜２５０の・・イブリドーマ又は非分泌骨髄腫細胞が最初に 適当な反応室に置かれた。ＩＣＮ社が供給しているＩＧＧ２ａ　マウス骨髄腫プ ロティンも、磁気ビーズ及び蛍光プルーブと組み合せ、正制御体として使用する 。

それは３７．５ナノグラム／ｍｌ　の濃度で別の反応器に置いた。

チューブの内部はキャリヤ液体で軽く被覆した。

該流体はＦｌｕｏｒｉｎｅｎｔ　ＦＣ−７７でアシ、安定しておシ、チューブを 濡らし、ガス透過性がちシ、又、光学的分析を可能にするために適当な透過性を 有している複合物である。反応混合物は別のウェルからテフロンチューブ内ヘマ ニホールド及び注射器ポンプシステムを使用して吸入し、それによシ、チューブ 内に反応室を形成した。充分なＦＣ−７７もチューブ内ヘボンブ作用で送シ込み 、反応混合物である生物培養液の室の回シにバリヤ一層を形成した。当該技術分 野で公知の如く、空気をチューブに導入して隣接する室同士を分離した。次にチ ューブ内の室を培養器に３７℃及び５％ＣＯ２９５％空気環境で２４時間にわた って置いた。その上で、磁気ビーズが不透明パッチ内へ引かれ、パッチの蛍光が 測定された。

分泌細胞又は工ｇＧ２ａ　のいずれかを含むウェルからの全ての反応器は、蛍光 発光について正（ポジティブ）であった。非分泌細胞又は媒質だけを入れた室は 蛍光に対して敗（ネガティブ）でちった。

上記例は基質独立細胞を使用している。又、基質従属細胞、例えば、肝臓細胞及 び繊維芽球もある。

それらは当該技術分野で公知であってＮｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ社が販売して いる適当なマイクロキャリヤに最初に付けなければならない。

例２ 例１の各ステップを、磁気粒子の代わりに、透明度が比較的高い粒子、すなわち 、ガラスピーズを使用して繰シ返した。ガラスピーズは重力によシ・ゞツチ内へ 分離させた。ノくツテが光を透過させる程度に充分に薄い場合、集めた光がパッ チからのものだけとなるように注意をはらう必要がある。励起ビームと放射ビー ムをある程度傾けることにより、この効果を実現できる。

例３ 単一リガントの２個以上の特性を、異なる複数のプルーブを利用して検出できる ことも重要である。

すなわち、例えば、あるアナライトが１つのアンチリガンドについて特効性がち シ、その他のものには特効性がないということを証明したい場合がある。

ラベルはその場合でも同じ一般的な種類、例えば、２個の異なる蛍光タッグでよ い。例えば、１つのグループを使用して、リガンドについてのアンチリガンド特 効性から生じる蛍光スペクトルを検出し、別のプルーブを使用してリガンドのク ラスと同基準標体とを測定することができる。

すなわち、人のヘモグロビン（α鎖であってβ鎖でないもの）に対するハイブリ ドーマ分泌抗体は以下の手段を使用して選択できる。ＧＡＭｒ−１を、磁気ビー ズ基質上の被覆として使用する。プルーブ１は蛍光タッグ参１（すなわち、ＦＩ ＴＣ）　でラベルを付けた人のヘモグロビンα鎖でちる。プルーブ２は、蛍光タ ッグ参２（例えばＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ）でラベルを付けた人のヘモグロビンβ鎖 である。そして、人のヘモグロビンα鎖に特効性があるバイプリドーマ細胞分泌 ＩｇＧ、抗体が室で識別されることになシ、その室では、パッチがタッグ４１１ でラベル付けされておシ、タッグ舎２ではラベル付けが全く々されておらず、（ プルーブ参２ではない）プループ舎１の特効性を備えた抗体を分泌する細胞集団 が存在する。抗体がプルーブ参２について特効性があるような細胞では、逆のこ とが当てはまる。両刃のラベルがパッチで検出されるような室は第３の場合、す なわち、２個のプルーブのそれぞれに特効性がある細胞の混合物、又は、両プル ープに特効性がちる抗体を意味する。これらの可能性を区別するために、第３の 場合では、室の細胞のクローンが同じシステムで形成される。すなわち、本発明 によると、細胞が異なる室の間で広がυ、それにより、各室毎に１つの細胞だけ が存在するようになる。各室は２個のグループのそれぞれを使用して改めて試験 され、１つのプルーブだけに特効性を有する全ての室が測定される。

第９図はほぼ球形の室９１を示す略図で、室９１はプラスチックチューブ９３内 で空気泡９２により分離されておシ、チューブ９３には、室と気泡の分離を容易 化するとともに、気泡の移動、特にチューブ９３に沿う室の移動を容易化する過 フルオロカーボン液体９４が入っている。

集中効果１が観察できる典型的な手順は以下の通ａｓａｋｉ板３　ウェルに添加 する。殺菌技術を使用し、以下の試薬溶液を３．５〜４．Ｏｕｌ添加する。

媒質：２０％のＦＣ３を含４むＲＰＭＩ　１６４０又は２０チのＦＣＳを含、む Ｏｐｔｉｍｕｒｎ’　のいずれか。

ボートアンチマウス被覆ラテックス凪気ビーズ５：直径０．７ｍｍ、密度１．９ ５　ｇ／ｍｌ　、又は、直径１．７ｍｍ、密度１．０７　ｇ／　ｍｌ、濃度０． ００１０　ｓｗ／Ｖ〜ｏ、　００３　％ｗ／ｖ　０ゴートアンチマウスＦＩＴＣ ６：密度０．３７５ｍｇ／ｒｎｌ〜１．　ｓ　ｍ　ｇ　／ｍ　１　ａ 時間）、バイブリドーマ細胞濃度が２５細胞／ウエルでＲＰＭＩ　１６４０　＋ 　２０％ＦＣ３又はＯｐｔｉｍｕｍ　＋　２０％ＦＣ８から成るマウスバイプリ ドーマ細胞溶液を３．５ｍｌ　添加する。

細胞を添加した後の約３〜２４時間のいずれでも、蛍光７のハローが、ＧＬＭ　 ＢＭでそれら自身が囲まれたマウスバイプリドーマ細胞を囲んでいるのを見るこ とができる。ＧＬＭ　ＭＢのベレット内にない細胞は、それらに最も近いビーズ の縁に作用してそれを発光Ｈｅ　ｎ、ａにし、細胞添加後３〜２４時間以内に、 蛍光発光がＧＬＭ　ＭＢベレット内及びその周囲に「ホット・スポット」として 見られる。更に、細胞添加後２４〜４８時間経つと、「ホット・スポット」が溶 は込んで全体的なペレット蛍光発光となる。

ＩＧＬＭＭＢのペレット内又はその近傍にあるマウスパイブリドーマ細胞によシ 分泌されたマウス抗体の結合、及び、自由ＧＬＭ　ＦＩＴＣのマウス抗体への結 合により引き起こされる蛍光発光。

２Ｌ４５−５０油−Ｕｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ製シリコン油”　Ｔｅｒａｓａ ｋｉ板−Ｒｏｂｂｉｎｓ　５ｃｊｅｎｔｊｆｉｃ　’ＪＪ’　Ｏｐｔｉｍｕｍ− Ｇｉｂ社製 ５Ｌａｔｅｘａ気ビーズ−５ｅｒａｄｙｎ製６　ボート及びマウスＦＩＴＣ−Ｂ ｉｏｍｅｄｉａ製７０１Ｙｍｐｕｓ　ＩＭＴ２蛍光顕微鏡で観察できる蛍光発光 又、以下の請求の範囲は、ここに記載した発明の一般的及び具体的＆！徴の全て 、ならびに、そこに含まれる本発明の範囲についての全ての説明内容を被うもの である。

浄書（内容に変更なし） ■ 翫 手続補正書く方式） 平成　年　月　日 ３．２．−（３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．室に入れられた液体合成物において基質手段に形成されてむり、検出可能に ラベルを付けた第１のアンチリガンド・リガンド製品の存在を検出するための同 種方法であつて、 （ａ）上記検出自在にラベルを付けた第１のアンチリガンド・リガンド生成物に ついての上記基質手段と同じように第２アンチリガンドで被覆したキャリヤ粒子 を設け； （ｂ）バツチにおいて上記室内の上記液体から上記キャリヤ粒子で保持した上記 検出自在にラベルをつけたアンチリガンド・リガンド生成物の少なくとも一部分 を集合させ； （ｃ）上記バツチに存在する検出自在にラベルを付けた生成物の量を測定するス テツプを備えたことを特徴とする方法。 ２．評価中の上記バツチから上記室内の上記合成物の少なくとも一部分からの光 学的バツクグランド干渉を遮蔽するように上記キャリヤを利用して、上記室にあ る間に上記バツチを測定する請求項１記載の方法。 ３．検出中の上記範囲から上記室内の上記合成物からの光学的バツクグランド干 渉を遮蔽する手段として不透明キャリヤを利用して上記評価を行う請求項２記載 の方法。 ４．検出自在にラベルを付けた生成物の量の測定が、上記集合ステツプにより上 記基質保持アンチリガンド・リガンド生成物を実質的に解放した後に液体合成物 に残留するプループの逆関数として行われる請求項１記載の方法。 ５．上記ラベル付きアンチリガンド・リガンドがラベル付き核酸補足核酸生成物 である請求の範囲に記載の方法。 ６．複数の異なる検出可能なラベルが使用されて畏なるプループが形成されてお り、各プループが、上記リガンドの異なる特性を示すアンチリガンドを保持して いる請求項１記載の方法。 ７．上記粒子に磁気があり、上記バツチが不透明である請求項１記載の方法。 ８．上記評価が光学的に検出可能なラベルによるものである請求項１記載の方法 。 ９．上記バツチが不透明である請求項１記載の方法。 １０．上記検出可能にラベルを付けたアンチリガンド・リガンド生成物が、上記 プループビーズ内に蛍光ラベル付き合成物を有するプループビーズを備えている 請求項１記載の方法。 １１．上記方法を生きた細胞が存在する状態で行う請求項１、２、３、４、５、 ６又は７に記載の方法。 １２．上記磁気粒子が、上記評価ステツプよりも前磁界により上記不透明バツチ に集合させる請求項９記載の方法。 １３．上記集合ステツプが重力又は遠心力により行われる請求項１記載の方法。 １４．上記集合が上記室の壁の透明範囲に沿つて行われる請求項２、３、４、５ 又は６に記載の方法。 １５．上記光学的ラベル付きアンチリガンド・リガンド生成物が少なくとも１個 の蛍光発光ラベルでラベル付けが行われる請求項１、２、３、４、５又は９に記 載の方法。 １６．付加的左ステツプとして（ａ）上記バツチから検出されるべき上記ラベル 付き基質保持アンチリガンド・リガンド物質を再分散させることと、（ｂ）その 後に、別の上記光学的評価のために上記物質の再集合及び光学的再評価を行うス テツプとを備えている請求項１、２、３、４、５又は９に記載の方法。 １７．検出されるべき上記リガンド・アンチリガンド複合物が単クローン性抗体 を含んでいる請求項１〜１０に記載の方法。 １８．検出されるべき上記リガンド・アンチリガンド複合物が単クローン性抗体 を備え、上記抗体を分泌した上記室内の細胞の密度が１０マイクロリツターの上 記培養媒質当り１０細胞未満であり、上記単クローン性抗体の密度がミリリツタ ー当り４０ナノグラム未満である請求項１２記載の方法。 １９．上記基質に保持される上記第１アンチリガンドと、上記第２アンチリガン ドの両方が単クローン性抗体である請求項１記載の方法。 ２１．上記基質に保持される上記第１アンチリガンドと、上記第２アンチリガン ドの両方が複クローン性抗体である請求項１記載の方法。 ２２．上記第１アンチリガンドが複クローン性又は単クローン性であり、上記第 ２アンチリガンドが、第１アンチリガンドが単クローン性の場合は複クローン性 であり、第１アンチリガンドが単クローン性の場合は単クローン性である請求項 １記載の方法。 ２３．上記室の寸法が約１マイクロリツター以下であり、水平方向には実質的に 細長くない請求項１記載の方法。 ２４．公知のリガンドとラベルを備えたプループを使用して公知のリガンドの量 的又は質的な量について試験される試料の競合評価てあつて、（１）上記プルー プが、公知のリガンド化合物を通して、試験中の試料に最初に存在する上記リガ ンドの競合量の大きさに依存する量だけにおいてアンチリガンド保持基質に付い ており、 （２）バツチにおいて上記アンチリガンド保持基質に付いている上記プループを 集合させ、（３）試験中の試料に最初に存在する競合リガンドの存在及び量の逆 測定として上記アンチリガンド基質に付いた上記プループを検出することを特徴 とする分析方法。 ２５．公知のリガンド及びラベルを含むラベル付きプループを利用する分析方法 であつて、（１）上記プループが、アンチリガンドで処理した基質とラベル付き リガンドとで形成されており；（２）リガンドの存在について試験される試料を 上記ブプープに添加し； （３）試験する試料に赴けるリガンドの量に比例する量だけプループ保持基質か らラベル付きリガンドを置換し； （４）バツチに残留しているプループ保持基質を集合させ； （５）上記リガンドの存在又は量の逆測定として上記アンチリガンドに付いた上 記プループを検出することを特徴とする分析方法。 ２６．光学的ラベル付き化学物質を検出するための装置であって、 （ａ）透明な壁部分を有する少なくとも１個の室と；（ｂ）上記室内のバツチに 上記化学物質を集中させる手段とを備え； （ｃ）上記室の上記透明壁が、そこを通して上記パツチを観察ができる手段を形 成しており；（ｄ）上記小さい範囲の部分の放射線放射又は光反射特性を光学的 に評価する手段を備えたことを特徴とする装置。 ２７．上記化学物質を集中させる上記手段が、磁気粒子を引き付ける手段として 磁石を備えており、該粒子が、一旦引き付けられると、光学的に評価するための 上記手段からバツクグランド放射を遮蔽するための手段を形成するとともに、上 記磁石を、検出される上記化学物質のための基質を形成する手段、及び、蛍光発 光ラベルを保持するための手段として備えている請求項２６記載の装置。 ２８．上記室の軸が、該室に衝突する上記検出装置の光進路に対して直角であり 、上記室がその上記軸に沿つて実質的に延びておらず、光学的評価を行う上記手 段の近傍の上記透明壁において上記バツチを集中させる手段として重力が使用さ れている請求項２６記載の装置。 ２９．検出される上記リガンドが５０００ダルトンを超える請求項１記載の方法 。 ３０．検出される上記リガンドが１００００ダルトンを超える請求項１記載の方 法。 ３１．上記バツチが不透明でたい請求項１記載の方法。 ３２．生物化学環境においてフナライトを分析するための方法であつて、 （ａ）基質上でアンチリガンドを不動化し、（ｂ）上記不動化されたアンチリガ ンドについてのラベル付きリガンドを含む培養媒質に上記アンチリガンドを接触 させ； （ｃ）上記リガンドと上記アンチリガンドとを組み入れた複合物質を形成し、上 記物質が上記基質に結合される上記アンチリガンドと上記リガンドとを含んでお り； （ｄ）光評価機構で上記物質により反射又は放射された光の特性を評価すること により上記複合物質の特性を光学的に評価するステツプを備えた方法。 ３３．上記基質がビーズで、上記方法が、いくつかの上記小さいビーズを上記不 透明バツチ内へ形成して上記バツチの小さい部分で上記光学的評価ステツブを実 施するステツプを備え；上記小さい部分が上記培養媒質と反対側、かつ、光評価 装置の側を向いている請求項３２記載の方法。 ３４．培養媒質において分泌細胞の同種検出を容易化するための方法であつて； （ａ）上記媒質の試料を１０マイクロリツター未満の室内で形成し； （ｂ）上記細胞の増殖に充分な時間にわたつて上記試料を培養し； （ｃ）上記分泌細胞の存在を示すものとして各室に赴ける上記細胞の上記分泌生 成物を検出することを特徴とする方法。 ３５．上記室の体積が１マイクロリツター未満である請求項３２記載の方法。 ３６．上記室の体積が１マイクロリツター未満である請求項３３記載の方法。 ３７．上記室の体積が１マイクロリツター未満である請求項３４記載の方法。 ３８．上記分泌された生成物が、１０００００ダルトンを超える寸法の抗体であ る請求項３４記載の方法。 ３９．上記分泌された生成物が、１０００００ダルトンを超える寸法の抗体であ る請求項３５記載の方法。 ４０．培養媒質におけるアンチアナライト・アナライト複合物を検出するための 方法であつて、上記複合物が、少なくとも、検出可能なラベルに結合されたアン チアナライトで形成されるプループと細胞とを含み、上記細胞が、上記プループ でそこからアナライトの分泌のラベル付けにより検出され、上記方法が、 （ａ）細孔マトリツクス内で上記細胞の一部分を位置決めすることにより上記細 胞の一切のアナライト分泌と細胞に接近した上記培養媒質の量とを減少させると ともに、上記マトリツクスが混合不可能な物質で形成されて、上記培養媒質とそ こに支持される上記ラベル保持アナライトにより通過可能であり；（ｂ）同様に 、上記細孔マトリツクスの使用により上記細胞の内部及び近傍及び上記マトリツ クス構造内の一切のラベル付きアナライトプループの運動性を減少させ、それに より、細胞の周囲の上記ラベル付きアナライトプループの集中を実現し；（ｃ） 上記細胞が上記アナライトを分泌しているかどうかという基準により、上記細胞 のすぐ近傍にある検知可能なラベル付きプループの範囲の検出可能左出力を測定 することを特徴とする方法。 ４１．上記細胞が、そこを通して上記蛍光検出が行われる上記表面に隣接してい る請求項４０記載の方法。 ４２．上記目標範囲が１つの上記分泌細胞の周囲に限定されている請求項４０記 載の方法。 ４３．上記検出が、目標範囲からのエピ蛍光の測定により行われる請求項４０記 載の方法。 ４４．培養媒質内の蛍光ラベルと結合したアンチアナライト・アナライト複合物 を検出する方法であつて、上記プループが最初に上記細胞を備えた媒質内に何等 かのアナライトと接触できる時間だけ置かれて、 上記プループ・アナライトの一切の結合生成物が、容器の透明表面に沿つて形成 されるようにし、その上で、 上記媒質からいくつか磁気ビーズを、上記媒質内のバツクグランド蛍光から、一 切の上記結合生成物と上記培養媒質との間の位置に不透明遮蔽部を設けるように 引き付けて、次に、 上記遮蔽部が上記位置にある間に上記アナライトに対する上記プループの上記結 合の測定として、上記目標範囲からの光のエピ蛍光を測定することを特徴とする 方法。 ４５．上記プループとアナライトが細胞内で結合している請求項４４記載の方法 。 ４６．上記プループとアナライトが細胞の外で結合している請求項４５記載の方 法。 ４７．目標範囲から放射されたエピ蛍光を分析するための方法であつて、光源に よる刺激に応答して放射された上記エピ蛍光についての目標範囲を調査すること により結合した蛍光タツグ付きアンチリガンドを備えた方法において、 １．透明板の底部のような観察表面上で上記タツグ付きリガンド・アンチリガン ドの形成及び被覆を行い、 ２．上記光源から上記目標範囲の反対側へ磁気粒子の不透明スクリーンを引き、 ３．上記光源から最も離れた上記不透明スクリーンの側で全てのバツクグランド 蛍光から目標範囲を遮蔽することを特徴とする方法。 ４８．（ａ）上記アンチアナライト、又は（ｂ）培養媒質からの細胞の少なくと も一方が、透明表面のごく近傍の被覆において不動化されているラベル付きアン チアナライト・アナライト複合物を検出する方法であつて、該方法が、 １．上記細胞により生成されたアナライトと、上記（ａ）アンチアナライトとを 反応させ；２．上記透明表面を通してエピ照射分析によりアナライト・アンチア ナライト反応生成物について上記反応生成物を分析するステツプを更に備えた方 法。 ４９．上記分析がエピ蛍光によるものである請求項４８記載の方法。 ５０．上記バツチが不透明である請求項４８記載の方法。 ５１．上記分析ステツプの前にバツクグランド蛍光に対する遮蔽部として作用す るように不透明磁気バツチを引くステツプを備えた請求項４９記載の方法。 ５２．上記第１アンチリガンドが複クローン性であり、上記第２アンチリガンド が単クローン性である請求項１記載の方法。 ５３．上記第１アンチリガンドが単クローン性であり、上記第２リガンドが複ク ローン性である請求項１記載の方法。