JPH03502042A - グルクロニドパーミアーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、輸送タンパク質、クルクロニドパーミアーゼに関し、かつ生細胞の 透過性を選択的に変えるためのそれの使用に関する。この輸送タンパク質は、化 学的指標および細胞の代謝を変える物質を邑む、β−グルクロニドに共役された 様々な化合物の細胞の取り込みを促進するために用いられ得る。

β−グルクロニドは様々な置換基を有するグルクロン酸エステルからなる（第１ 図）。哺乳動物において、グルクロニド化は、グルクロニルトランスフェラーゼ 系を用いる、化合物の解毒または不活性化の原則的手段である。ヒトにおいては 、コルチゾルおよびアルドステロンを含む多数のホルモン、クロラムフェニコー ルなどの多少の抗生物質、ジニトロフェノールなどの毒素、およびビリルビンな どが、グルクロニルトランスフェラーゼ系によってグルクロニドに共役され、そ れから尿中へまたは胆汁内で小腸内へ分泌される化合物である。バクテリアＥｓ ｃｈｅｒｔｃｈｉａｃｏｌｔは哺乳動物の腸内で生き残るように進化し、かつそ の唯一の炭素源として分泌されたβ−グルクロニドを用い得る。そうするために 、Ｅ、ｃｏｌｌは非常に様々なグルクロニドの取り込みおよび劣化のためのメカ ニズムを進化させ、それらは遺伝的に緊密に関連するプロセスである。

２．２β−グルクロニダーゼ β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）は、酸加水分解酵素活性を呈する酵素であり、 グルクロニドとその置換基との間のエステル結合を切断する。ＧＵＳは、ｕｉｄ Ａ遺伝子座によってコードされる６８．２ＫＤａのサブユニット重量を有する大 変安定したタンパク質として、Ｅ、ｃｏｌｔバクテリア内で広く特徴付けられて きた。それは様々なグルクロニドの切断を触媒し、それの多くは水溶性である。

第１図に示されるように、組織化学的、蛍光的または比色測定的指標を含むがそ れらに制限されない様々な化合物が、グルクロン酸に共役されてエステル、β− グルクロニドを形成し得る。これらのβ−グルクロニド化学的指標はＧＵＳ酵素 のインジケータ基質として用いられ得る。それゆえ、ＧＵＳの活性レベルは、感 度の高い比色測定的、蛍光的、または組織化学的検出方法を用いて決められるこ とができる。

ジエ、およびショウジョウバエドロソフィラ　メラノガステルを含めて、多くの 生物体はβ−グルクロニダーゼをほとんどまたはまったく発現しない。

２．３．遺伝子融合指標としてのＥ、Ｃ０ＬＩからのβ−グルクロニダーゼ β−グルクロニダーゼ構造遺伝子は、それのプロモーター／オペレータおよびシ ャイン・ダルガルノ配列（リポソーム結合性）から分離され、）：、　　ｃｏｌ ｔ　　１ａｃＺプロモ一ター配列と融合され、かつ標準的クローニング方法によ ってプラスミドベクタ内に挿入された。β−グルクロニダーゼ遺伝子を１ａｃＺ プロモーターの制御下に置く、結果としての構成は、）：、ｃｏｌｉ内に移入さ れ、かつ高いレベルのβ−グルクロニダーゼの発現をもたらし得た（Ｊｅｆｆｅ ｒｓｏｎ等、１９８６年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ 、８３：８４４７−８４５１、およびＵＫ明細書第２１９７６５３号も参照され たい）。もし１ａｃＺプロモーターが転写の開始において活性であれば、β−グ ルクロニダーゼ遺伝子が発現された。

クーロン化されたβ−グルクロニダーゼの発現が他の型のプロモーター配列によ って制御され得るかどうかをテストするために、β−グルクロニダーゼ遺伝子が 様々な転写プロモーターに結合された。β−グルクロニダーゼと、カリフラワー モザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターまたはりブロース２リン酸カ ルボキシラーゼプロモーターのいずれかとの間の遺伝子融合が、タバコ植物を形 質転換するために用いられ、かつプロモーターに制御される組織特異性と思われ るものを伴うβ−グルクロニダーゼの発現を達成した（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等、 １９８７年、ＥＭＢＯＪ、６：３９０１−３９０７）。β−グルクロニダーゼを 構造的に発現しない線虫カエノルハビティス　エレガンスの変異体を用いる、類 似の実験は、ｃｏｌ−１コラーゲン遺伝子の、または主要精子タンパク質のフラ ンキング領域をβ−グルクロニダーゼ遺伝子に融合させ、β−グルクロニダーゼ 融合タンパク質の発現をもたらしたが、そのデータは組織特異性または発生的制 御を立証しなかった（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等、１９８７年、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ ｌ、１９３：４ｌ−４６）。重要なことに、β−グルクロニダーゼ融合タンパク 質は、バクテリア、高等植物および下等動物などの様々な生物体における機能的 酵素活性を示した。さらに、ＧＵＳ活性は組織学的手法を用いて個々の細胞内で 検出され得た。

これらの実験は、プロモーター活性のインジケータとしてβ−グルクロニダーゼ の発現を用いた。β−グルクロニダーゼは、遺伝子融合指標、または“リポータ −遺伝子”として働き、その発現はβ−グルクロニドインジケータ基質を用いて 計画された。

Ｅ、ｃｏｌｉにおいて、同じ遺伝子座が、β−グルクロニダーゼと、β−グルク ロニド基質の取り込みを促進する輸送タンパク質とをコードする。上記で説明さ れた遺伝子融合実験において用いられた分離されたβ−グルクロニダーゼ遺伝子 は、β−グルクロニドインジケータ基質の輸送を制御せず、それゆえβ−グルク ロニダーゼ活性の測定は組織抽出物または組織学的断面を用いて行なわれた。

２，４．グルクロニドパーミアーゼ リン脂質二重層膜は、分子を細胞内に選択的に保持し、かつ細胞の内容物と細胞 間の環境との無差別な交換を防ぐように進化してきた。しかしながら細胞は、濃 度勾配に抗し゛こさえも、膜の透過性バリアを横切って選択された化合物を輸送 する能力を発達させてきた。一般的に、特異的な輸送メカニズムなしに、極性分 子は細胞膜を横切る通過から締め出される。β−グルクロニドは、負に荷電した イオン化されたカルボキシル基を持つ、本質的に極性の分子であるので、これら の分子は細胞に対して高度に非透過性であり、かつ輸送のためにグルクロニドパ ーミアーゼを必要この発明は、輸送タンパク質、グルクロニドパーミアーゼをコ ードする遺伝子に関する。グルクロニドパーミアーゼをコードする組換えベクタ がホスト細胞を形質移入するために用いられ得る。形質転換体によるグルクロニ ドパーミアーゼの発現はβ−グルクロニドの細胞の取込みを可能とする。この系 は、生体内でのβ−グルクロニダーゼ活性の検出を可能とし、かっＧＵＳ遺伝子 融合と共に好都合に用いられ得る。

ＧＵＳ系に重要な補体を与える事に加えて、グルクロニドパーミアーゼはまた細 胞の透過性を選択的に変更するための方法においても用いられ得る。β−グルク ロニドに共役され得る様々な物質のために、グルクロニダ−ミアーは多数の化合 物に対する細胞のエントランスを設ける。

４、図面の説明 第１図はβ−グルクロニダーゼによって触媒された反応およびグルクロニドパー ミアーゼによって輸送された基質の構造を示す。

第２図は様々なプラスミドの構造を示す。グルクロニドパーミアーゼをコードす る、ｐＲＡＪ２１０の３′末端のサブクローニングは、Ｐｓｔｌで（ｐＲＡＪ　 ２１０のＸｈｏＩ部位に近位の、ｐＵＣ９のポリリンカ一部位で切断する）およ びｐＲＡＪ２２０のＢ　ａ　ｍ　ＨＩ部位の５′をちょうど切断するＮｓｉ　　 Ｉで、ｐＲＡＪ２１０を切断することによってなされた。この領域の配列はマク サム−ギルバート法によって決められた。

第３図はｐＲＡＪ２８５上のグルクロニドパーミアーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示 す。その配列は第２図に対する凡例において説明されるように決定された。示さ れる配列はＧＵＳ内のＮｒｕ　　１部位から（ジデオキシ法により配列決定）Ｎ ｓｉ　　１部位を介してｐＲＡＪ２１０のあらがじめ配列が決定されていない領 域内に延在する。示される配列はパーミアーゼのターミネータコドンを過ぎての み延在する。これはプラスミドｐＲＡＪ２８５上に示される。ｐＲＡＪ２１０の 残りは配列決定されており、かつｐＲＡＪ２８０−ｐＲＡＪ　２８４上に存在す る。

第４図は、ライスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ比較プログラムを用 いた、グルクロニドパーミアーゼ（上部）およびメリビオースパーミアーゼ（下 部）のアミノ酸配列の比較である。配列の間の線は、２つの配列の間の正確な整 合を示す。相同性を最大とするために小さなギャップが導入された。

第５図は、ライスコンシン大学遺伝学コンピュータグループペブ（Ｐ　Ｅ　Ｐ） プロットプログラムを用いたグルクロニドパーミアーゼの構造の分析である。下 部のパネルはゴールドマンの、またはカイトおよびトウーリトルの基準のいずれ かを用いて生成されたヒトロバシープロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　　ｐｌｏ ｔ）を示す。多（の疎水性の領域は潜在的α−ヘリカルトランスメンブレン切片 を示す。

このプロットはメリビオースパーミアーゼ配列を分析して得られるプロットに非 常に傭でいる。

５、発明の詳細な説明 この発明は、グルクロニドパーミアーゼ遺伝子、キメラ遺伝子構造およびそれら の発現生成物に関する。グルクロニドパーミアーゼ遺伝子を含むように構成され た組換えヌクレオチドベクタは様々なホスト細胞を形質転換するために用いられ 得る。これらの構造が適切な発現制御エレメントを含むように処理されるとき、 形質転換体はグルクロニドパーミアーゼまたはグルクロニドパーミアーゼ遺伝子 によってコードされた誘導体を発現するであろう。

この発明は、部分的に、この態様でのグルクロニドパーミアーゼの発現がβ−グ ルクロニドに対するホスト細胞膜の透過性を変え、したがってβ−グルクロニダ ーゼ基質の侵入を可能とするという発見に基づく。この発明の方法は、代謝的に 活性である化合物を細胞内に導入することに対してと同様、生体内での“リポー タ−′β−グルクロニダーゼの検出を提供し得る。

説明を明快にするために、かつ制限としではなく、３つの部分でこの発明が説明 されるであろう。それらはつまり、（ａ）グルクロニドパーミアーゼ遺伝子およ び発現生成物、（ｂ）グルクロニドパーミアーゼキメラ遺伝子および融合タンパ ク質、および（Ｃ）グルクロニドパーミアーゼおよびグルクロニドパーミアーゼ 融合タンパク質の使用、である。

グルクロニドパーミアーゼ遺伝子配列およびそれの推論されたアミノ酸配列が第 ３図に示される。これらの配列、またはそれらと機能的に等価なものがこの発明 に従って用いられ得る。たとえば、第３図に示される配列は、機能的に等価な分 子をもたらす置換、付加または欠失によって変更され得る。ヌクレオチドのコー ド配列の縮重に起因して、第３図に示されるのと本質的に同じアミノ酸配列をコ ードする他のＤＮＡ配列かこの発明の実施において用いられてもよい。これらは 、配列内の同じまたは機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの 置換によって変更され、したがってサイレントチャージを生成する、第３図に示 されるグルクロニドパーミアーゼ配列の全てまたは一部を含むヌクレオチド配列 を含むが、それに制限されない。

たとえば、配列内の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、機能的に等価なもの として働く類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得る。配列内のアミノ酸 に対する置換は、アミノ酸が属する類の他のものから選択されてもよい。たとえ ば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン 、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。極性 中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システィン、チロシン、アス パラギンおよびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギ ニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アス パラギン酸およびグルタミン酸を含む。

グルクロニドパーミアーゼ配列は下記のサブセクションにおいて説明されるよう に誘導された。

β−グルクロニダーゼに対する遺伝子の配列法めで（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等、１ ９８６年、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１゜Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８３．：８ ４４７−８４５１）、配列分析は少なくとも３４０ｂｐの第２の読み枠（オーブ ンリーディングフレーム）の存在を示し、そのイニシエータコドンはβ−グルク ロニダーゼ遺伝子の翻訳ターミネータと重なる。この読み枠オーブンリーディン グフレーム）は翻訳的に活性であると見出された（ボールダー、コロラド大学、 学術論文、ＪｅｆｆｅｒｓｏｎＳＲ，Ａ、、１９８５年）。第２図はＥ、ｃｏｌ ｉのｕｉｄＡ座を分析するために用いられるクローンを示す。ｐＲＡＪ２２０プ ラスミドがβ−グルクロニダーゼの配列を推論するために用いられ、ｐＲＡＪ２ １０はサブクローン化され、かつ読み枠（オーブンリーディングフレーム）をコ ードするβ−グルクロニダーゼ遺伝子に対する断片３′が配列決定された。結果 としてのＤＮＡ配列および予測されたタンパク質が第３図に示される。

Ｅ、ｃｏｌｉに存在するオペロンとの相似性によって、読み枠（オーブンリーデ ィングフレーム）がβ−グルクロニドの取り込みを促進することができるパーミ アーゼタンパク質をコードしたと当方は提案した。ラクトースおよびメリビオー スオベロンは（たとえば）加水分解酵素をコードする遺伝子と、それに続く輸送 タンパク質またはパーミアーゼに対応するコシストロン遺伝子とからなる。同じ ｍＲＮＡ上に位置付けられかつ同じ制御メカニズムを受ける相互依存機能を伴う 遺伝子のこのフォーマットはバクテリア内に極在する。グルクロニダーゼのため の基質は大変極性であるので、それらがバクテリア膜を横切る能動輸送を必要と することが確かである。ｕｉｄ座上で行なわれる遺伝分析のレベルではβ−グル クロニダーゼ機能を除去した変異と基質の輸送を除去した変異とを識別せず、β −グルクロニダーゼとグルクロニドパーミアーゼとの間の緊密な結合と矛盾しな い。１９６１年に、フランス、パリでのＰｈ、　Ｄ論文において、フランソワ・ スト−バー（Ｆｒａｎｃｏｔｓ　　５ｔｏｅｂｅｒ）は、Ｅ、ｃｏｌｔにおける グルクロニドパーミアーゼの特質を説明した。彼の著作はそのような輸送メカニ ズムの存在を明らかに立証【７たが、その系の遺伝学または分子生物学について 何らのべなかった。

これらの事実のために、読み枠（オーブンリーディングフレーム）がグルクロニ ドパーミアーゼをコードしたという仮説に至った。さらなる分析もまた、グルク ロニドパーミアーゼによって輸送され得るβ−グルクロニダーゼのための２！質 の範囲が、いかなるかつて述べられたグリコシドパーミアーゼのそれよりもずっ と広いことを示した。

（以下余白） ５、　１．　３．アミノ酸配列およびグルクロニドパーミアーゼされているグル クロニドパーミアーゼの予測されたアミノ酸配列は、コンピュータ解析にかけら れ、非常に密接な相同関係にあり実存する配列を決定した。ただ２つの配列がグ ルクロニドパーミアーゼと重要な相同関係にあり、あった。またこれらについて 、第４図に示されるようにメリビオースバーミアーゼとの相同性が最も強いもの であった。興味あることに、メリビオースおよびラクトースパーミアーゼの両方 が、糖輸送物質のクラスの要素であり、これらは濃度勾配に逆らって糖の輸送を 行なうために細胞膜のプロトン勾配を利用しているものである。また、これらの パーミアーゼは、精製され単一の蛋白質として活性が認められた珍し２いクラス に属し、それらの活性は膜小胞への純粋なパーミアーゼの添加によって試験管内 で容易に再構築され得る。

グルクロニドパーミアーゼの論理的に推定されたアミノ酸配列は、コンピュータ 解析にかけられ、その蛋白質の構造が予測された。その結果を第５図に示す。こ の解析での顕著な特徴は、その蛋白質が極端に疎水性であるということと、それ が膜に容易に及ぶことができる疎水性アミノ酸が長く伸びているということであ る。カイトードーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）のヒトロバシー（ｈ ｙｃｊｒｏｐａｔｈｙ）の予測（口枠の底部に示す）は、疎水性の領域がメリビ オースバーミアーゼの疎水性の領域とほとんど同一の位置にあり、かつ、ラクト ースパーミアーゼの疎水性の領域とも非常に似た位置にあることを明らかにして いる。

サブセクションで説明されるように、グルクロニドパーミアーゼは、組換えＤＮ Ａ技術を用いて容易に生産され得る。しかしながら、この発明に従えば、グルク ロニドパーミアーゼの生産は遺伝子工学の手法に限定されるものではない。機能 的に同等の分子をもたらす置換、付加および部分的削除を含む第３図に示される アミノ酸配列の全体または部分は、当業者によく知られた化学合成法によっても 生産され得た。

外来プロモーターの制御下で、推定されるパーミアーゼを−３−インドリル−β −Ｄ−グルクロニド（Ｘ−ｇｕｌｃと示す）を含むＬＢ寒天平板培地に植えた場 合、そのコロニーは白色のままである。一方、たとえば、プラスミドによりコー ドされ細胞中に過剰のグルクロニダーゼが存在する場合、インジゴ色素の析出の ためコロニは青色に変色する。この場合、青色はコロニの多数の細胞が壊れて放 出された（ＧＵＳ）酵素によるものである。コロニ自身のみならずコロニ周辺の 寒天上に色素が沈着されるので、相対的に青色が外へ広がったコロニを与えるよ うになる。しかしながら、ＧＵＳではな（、ｌａｃプロモーターに結合されたパ ーミアーゼ遺伝子を含むプラスミドが野生型の細胞に誘導されると、Ｘ−ｇｕｌ ｃ上のコロニは、暗青色となる。

この表現型は、青色が非常にはっきりと区別できるためより顕著なものであり、 かつ、コロニに厳密に対応するものである。これらのコロニはＸ−ｇｕｌｃが存 在しない場合、検出可能なＧＵＳを生産しない一方、Ｘ−ｇｕｌｃが存在する場 合、その生産が誘導される。これは、Ｘ−ｇｕｌｃが細胞中に輸送され、ｕｉｄ Ｒ遺伝子の生産物（ｕｉｄオペロンのリプレッサ）に結合し、ＧＵＳの発現を可 能にするためである。この現象は、グルクロニドパーミアーゼの作用を必要とし ている。このことは表１にまとめられたクローニングに関する一連の実験に最も よく示されている。

グルクロニドパーミアーゼ遺伝子は、ｐＵｃ１９中で副青色コロニ表現型のため に必要かどうか決定するために、得られたものは種々の変異にかけられた。遺伝 子に配置される制限エンドヌクレアーゼによる切断部位が、選定された。これら のいくつかを第３図に示す。推定される読み枠のシフトによって切断部位の周辺 領域を変異させるため、制限部位は切断され埋め合わせられた。グルクロニドパ ーミアーゼ開始コドンの上流にこのようなシフトが起こった場合（ｐＲＡＪ２１ ８）、得られるコロニの色は変わらなかった。しかしながら、相当するコード配 列の中でのフレームシフトは、着色したコロニを発生させる遺伝子の能力を消滅 させるかもしくは著しく減少させた。特に、Ｎ５ｉ１部位変位株（ｐＲＡＪ２８ ２）は、完全に色が消失し、Ａｃｃ１部位変位株（ｐＲＡＪ２８３）はほとんど 色が消失し、２日後に青色の痕跡が認められる程度に過ぎなかった。Ｂａｎ■部 位フレームシフトは、プレート上で一夜の後、青色のかすかな痕跡を示し、２日 後ははっきりとしているがなお淡青色であった。フレームシフトの前で作られる パーミアーゼの部分が非常に小さく１００アミノ酸のオーダである場合、Ｎｓｉ 変位株による青色の消失が予期される。次のフレームシフトＡｃｃｌ変位株は、 パーミアーゼ作用の形跡を示している。これは形成されたパーミアーゼ（本来の パーミアーゼの半分により近い）が残留活性を有し得たことによるであろう。Ｂ ａｎＩＩ変異株（パーミアーゼの８０％以上がこの中で形成される）は、明確な しかし著しく減少させられた活性を示す。これは予期されたとおりであり、青色 コロニの形成における読み枠（オーブンリーディングフレーム）の役割を結果的 に実証している。

ｂｐ１５１０におけるＮｃｏ部位から３′を伸ばす欠失変位株（ｐＲＡＪ２８５ ）は、明らかな変化を起こさず、暗青色のコロニのままであった。このことは、 ＤＮＡ配列決定により予測されたとおりに遺伝子の３′の範囲を明らかにした。

その位置を確かめるため、遺伝子の開始部位の文脈をオリゴヌクレオチド変異誘 発によって変更させた。

その結果、開始コドンから一１２上流の配列が欠失したパーミアーゼ遺伝子が得 られた。この変異株は、さらに暗い青色コロニ（かつより小さな−おそらく膜蛋 白質の過剰な発現による）を示した。これらの細胞中のより高レベルのパーミア ーゼは、おそらく、抑制する配列の欠失により新しいｍＲＡＮでの翻訳がよりよ くなったためであろう。このクローンＩ）ＲＡＪ２８６は、シャイン／ダルガル ノ配列の５′に隣接して１個のＢａｍＨＩリンカ−を有し、この複製された断片 から生産されるどのハイブリッドｍＲＮＡにおいてもイニシェークコドンが最初 に現われることを確実にしている。より有用なカセットを作成するため、ｐＲＡ Ｊ２８６は、もう１つのＢａｍＨＩリンカ−を３′末端へ付加することにより修 飾された。このベクタｐＲＡＪ２８７は、プラスミドｐＵｃ１９のポリリンカ一 部位の中に、グルクロニドパーミアーゼ遺伝子の全体をＢａｍＨＩ断片として有 している。

次に、グルクロニドパーミアーゼのＸ−ｇｌｕｅよす他の基質の輸送能力につい てテストＩ、た。パーミアーゼがＸ−ｇｌｕｃのような大きなヘテロ環状化合物 を輸送できるならば、他のグルクロニド複合体を輸送できることは理にかなった ことであった。そして、このことはＧＵＳ基質の輸送に一般的な経路を与える。

２通りの細菌が、１つはプラスミドｐＲＡＪ２３０を含み、もう１つはｐＲＡＪ ２１０（ジエフエソン（Ｊ　ｅ　ｆ　ｆ　ｅｓｏｎ）等１９８６）を含む、Ｌ培 地で同濃度まで培養された。これらの培養物はともに細胞中にＧＵＳを生産した 。ｐＲＡＪ２１０は、パーミアーゼをコードするＤＮＡを含む一方、ｐＲＡＪ２ ３０はパーミアーゼ遺伝子のほとんどが欠失している。培養物は培地からＧＵＳ を十分に除去するため洗浄され、ＧＵＳのため蛍光を発生させる基質４−メチル −ウンベリフェリルグルクロニドの溶液とともにインキュベートされた。ｐＲＡ Ｊ　２１０を含む培養では直ちに蛍光が著しく発生したが、ｐＲＡＪ２３０を含 む培養は蛍光が発生しなかった。

次に、蛍光を発する基質の存在下で超音波発生器で溶菌させると、抽出物はとも に完全なβ−グルクロニダーゼ活性を示唆する著しい蛍光を示した。

グルクロニドパーミアーゼ遺伝子は、多くの異なる生物体に利用されることがで き、細胞中にβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のための基質を輸送するであろう 。それは、このパーミアーゼ活性が単一のポリペプチドでコードされているから であり、また、膜中へのその挿入およびその機能のため必要とされるパーミアー ゼの副次的な配列修飾（メリビオースおよびラクトースパーミアーゼとの相同性 により）がないからである。形質転換した生物体において、実質的にどのような プロモーターの制御下でもパーミアーゼの発現は、その生物体の細胞の中にβ− グルクロニドの輸送をもたらすということを予期することは道理に合ったこの発 明の一具体例において、グルクロニドパーミアーゼ遺伝子は同一構造の一部とし て、または、プラスミドや真核ベクタたとえば５Ｖ−４０（マリガンおよびベル ク。

形質転換され得る。このこともまた蛍光性および発色性のβ−グルクロニド基質 を含むβ−グルクロニダーゼに対する基質が生きた分裂されていない細胞に受入 れられることを可能にし、したがって、β−グルクロニダーゼリポータ遺伝子の 生体内活性の検出を可能にし、組織抽出物および組織学的手法の制約を排除し、 さらにＧＵＳ系のより一般的な適用を備えるものとなる。

この発明のもう１つの具体例として、内在性のβ−グルクロニダーゼ活性を有す る細胞にグルクロニドパーミアーゼを導入することができる。細胞膜に存在する グルクロニドパーミアーゼ分子の数を変えることにより、β−グルクロニドに対 する膜の透過性を制御することができ、したがって、グルクロニドパーミアーゼ 自身はリポータ遺伝子として機能し得る。

以上にプラスミドｐＲＡＪ２１０の一部分でグルクロニダーゼ遺伝子から下流の 本来の位置にあるグルクロニドパーミアーゼ遺伝子が、細歯中で機能し得る蛋白 質に積極的に翻訳されることを示してきた。他の実験では、上述【７たように、 分離されたグルクロニドパーミアーゼ遺伝子が、外来のｌａｃプロモーターによ って制御されるとき、機能し得るグルクロニドパーミアーゼが生産された。グル クロニドパーミアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の情報は、制限酵素による特定 化の情報とともに当業者にとってグルクロニドパーミアーゼ遺伝子を種々のプロ モーター要素と結合することを可能にし、したがって、グルクロニドパーミアー ゼ遺伝子を導入された細胞でのパーミアーゼ発現の厳密な制御を可能にする。た とえば、転写活性の異なるプロモーターは、相当するレベルのグルクロニドパー ミアーゼを生産するために用いられ得、またたとえば、組織特異的なプロモータ ーや発生的に制御されたプロモーターも用いられ得たプロモーターのタイプであ る。グルクロニドパーミアーゼの発現を制御するために用いられ得たプロモータ ーは、この発明において提供され、次のものを含むが、これらに限定されるもの ではない。

ＳＶ４０上記プロモーター領域（ベルモイストおよびチャムボン、（Ｂｅ　ｒｎ ｏ　ｉ　ｓ　ｔ　　ａｎｄ　　Ｃｈａｍｂｏｎ）、１９８１．Ｎａｔｕｒｅ　　 ２９０：３０４−３１０）、ラウスザルコーマウィルスの３′長末端繰返し領域 に含まれるプロモーター（山水等、（Ｙａｍａｍｏ　ｔ　ｏ　　ｅ　ｔａｌ、） 、１９８０．Ｃｅ１ｌ　　２２ニア８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼ プロモーター（ワグナ−等９，１９８１　　Ｐｒｏｃ、　　　Ｎａｔｌ、　　Ａ ｅａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ。

うな原核発現ベクタ（ヴイラーカマロフ等、１９７８．Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ 、　　Ａｅａｄ、　　　Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

７５　＋　３７２７−３７３１）　、またはｔａｃプロモーター（デボア等、１ ９８３、Ｐｒｏｅ、　　　Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ。

菌からの有用な蛋白質ＪＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０ ．２４２ニア４−９４参照、ツバリンシンテターゼプロモーター領域を備える植 物の発現ベクタ（ヘレアーエストレラ等、（Ｈｅ　ｒ　ｒｅ　ｒａ−Ｅｓ　ｔ　 ｒｅｌｌａ　　ｅｔ　　ａｌ、）、Ｎａｔｕｒｅ　　３０３：２０９−２１３） またはカリフラワーモザイクウィルス３５ＳＲＮＡプロモーター（ガードナー等 、１９８１．Ｎｕｃ　１゜Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、９：２８７１）および光合成 酵素リブロース２リン酸カルボキシラーゼのためのクロロプラストプロモーター （ヘレアーエストレラ等、（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　　ｅｔ、ａｌ 、）、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ３１旦二１１５−１２０）、および次に示す動物 の転写制御領域、これらは組織特異性を示しく形質転換動物体に用いられてきた 。すい臓の腺房細胞で活性を示すエラスターゼＩ遺伝子制御領域（スイット等、 （Ｓｗｉｆｔ　　ｅｔ、ａｌ、）、１９８４．Ｃｅ１ｌ　　３８：６３９−リ４ ６；オルニッツ等（Ｏｒｎｉｔｚ　　ｅｔ　　ａｌ、）。

１９８６、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｓｙｍｐ、　　Ｑｕａ ｎｔ、Ｂｉｏｌ、５０：３９９−４０９；マクドナルト、（ＭａｃＤｏｎａ　ｌ ｄ）、１９８７．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　　７：４２５−５１５）、すい臓のβ 細胞で活性であるインシュリン遺伝子制御領域（ハナハン、（Ｈａｎａｈａｎ） 、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ３１５：１１５−１２２）、リンパ細胞で活性である 免疫グロブリン遺伝子制御領域（グロスシェド等、（ＧｒＯ８ＳＣｈｅｄｌ　　 ｅｔ　　ａｌ、）、１９８４．Ｃｅ１ｌ　　３８：６４７−６５８；アダムス等 、（Ａｄａｍｅｓ　　ｅｔ　　ａｌ、）。

１９８５、Ｎａｔｕｒｅ３１８：５３３−５３８；アレクサンダー等、（Ａｌｅ ｘａｎｄｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、）、１９８７、Ｍｏｌ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、 ７：１４３６−１４４４）、精巣、乳房、リンパおよびマスト細胞で活性である マウス乳腫瘍ウィルス制御領域（リーダー等、（Ｌｅｄｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、 ）、１９８６．Ｃｅ１ｌ　　４５：４８５−４９５）　、肝臓で活性であるアル ブミン遺伝子制御領域（ピンカート等、（Ｐｉｎｋｅｒｔ　　ｅｔ　　ａｌ、） 。

１９８７、Ｇｅｎｅｓｅ　　ａｎｄ　　Ｄｅｖｅｌ、１：２６８−２７６）　、 肝臓で活性であるアルファーフェトロブロチイン遺伝子制御領域（クルムララフ 等（Ｋｒｕｍｌａｕｆ　　ｅｔ　　ａｌ、）、１９８５．Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ １５３−５８）、肝臓で活性であるα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（ケルシ ー等、（Ｋｅｌｓｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ、）、１９８７．Ｇｅｎｅｓ　　ａｎｄ 　　Ｄｅｖｅｌ、　　　１：１６１−１７１）、骨髄細胞で活性であるβ−グロ ブリン遺伝子制御領域（モグラム等、（Ｍｏｇｒａｍ　　ｅｔ　　ａｌ。

）、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３ｇ−３４０；コロアス等、（Ｋｏｌ　 １ｏａｓ　　ｅｔ　　ａｌ、Ｌ＋　　１９８６゜Ｃｅ１ｌ　　４６：８９−９４ ）、脳中のオリゴデンドロサイト細胞で活性であるミニリン塩基性蛋白質遺伝子 制御領域（レッドヘッド等、（Ｒｅａｄｈｅａｄ　　ｅｔ　　ａｌ、）、１９８ ７．Ｃｅ１ｌ　　４８ニア０３−７１２）、骨格筋で活性であるミオシン軽鎖− ２遺伝子制御領域（サニ、（Ｓａｎｉ）、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ　　３１４： ２８３−２８６）および視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺 伝子制御領域（メイソン等、（Ｍａｓｏｎｅｔ　　ａｌ、）＋　　１９８６．５ ｃｉｅｎｃｅ　　２３４：１３７２−１３７８）。

グルクロニドパーミアーゼは、その遺伝子が活性のある発現ベクタに挿入され、 かつ、たとえば細菌中でその遺伝子が発現させられることによって、大量に生産 され得る。

この発明の１つの具体例において、グルクロニドパーミアーゼは、化学的または 遺伝学的にリガンドに結合され得た。

そしてそれは、リガンド受容体を運ぶ細胞膜中に挿入のためのパーミアーゼを届 けることができた。ラクトースおよびメリビオースパーミアーゼとの類似により 、グルクロニドパーミアーゼは細胞膜中に自発的に集積され得た。たとえばグル クロニドパーミアーゼは哺乳類細胞の個々の群に特異的な免疫グロブリンのＦｃ 領域に結合し得た。これらの細胞上で、抗体は細胞膜中へ挿入のためのグルクロ ニドパーミアーゼを届けることができ、その結果、哺乳類細胞の個々の群がβ− グルクロニドに対する透過性が高められるようになった。この例において、選択 されたβ−グルクロニドは、哺乳類細胞により発現される内因性のβ−グルクロ ニダーゼを利用して、種々の目的に使用され得た（以下参照）。

この発明の関連するもう１つの具体例において、グルクロニドパーミアーゼは、 膜小胞の中に組み入れられ、その後、細胞膜中に挿入された。膜小胞は、β−グ ルクロニド複合化合物に限定されず種々の物質を含有することができた。

この発明は、β−グルクロニド複合体および内在するかもしくは外から供給され たβ−グルクロニダーゼ活性を利用して、種々の化合物に対する膜透過性を変え る場合のグルクロニドパーミアーゼの利用を備えるものである。これらの化合物 は、次に挙げるβ−グルクロニドに複合するかもしくはグルクロニドパーミアー ゼによってそれ自身が輸送される物質を含むが、これらに限定されるものではな い。

（ａ）　　ナフトールおよびナフトールＡＳＢＩを含む組織化学的指標、４−メ チルランベリフェノンおよびフルオレセイン３−ｏ−メチルフルオレセインのよ うな蛍光性物質、ならびにレゾルフィン、ｐ−ニトロフェノールおよびフェノー ルフタレインのような発色性指標で代表される指標物質。

（１））　　細胞中に輸送された場合、β−ゲルクロニダーゼによってグルコー スに代謝される２糖類であり、七ロ２ウロン酸のような異化物質。

（Ｃ）　　種々のペプチド成長ホルモンおよび植物中のザイトカイニシまたはオ ーキシンのような成長因子。

（ｄ）　　蛇毒のような毒性物質で、それぞれの作用に応じて、心筋もしくは神 経細胞の細胞膜の不可逆的な脱分極を引き起こす心臓前、神経伝達物質受容体を ブロックすることにより神経筋の伝達機構を阻１■−する神経毒、ならびにアセ チルコリンエステラーゼおよび神経伝達機構に含まれる同様の酵素を阻害するプ ロテアーゼインヒビタを含むもの。さらには、リジンおよびアブリンのような植 物毒、細菌毒素、ジニトロフェノール誘導体のような除草剤なりびに化学治療薬 が含まれる。

（、ｅ　）　　種々のスデロイドボルモンはβ−グルクロニド複合体として排出 される。グルクロニドパーミアーゼを用いれば、これらのホルモンは循環され得 、かつ、これらの作用機構は選択されｔ：細胞中で強化され得た。この発明のも う１つの具体例において、外から与えられたステロイド−β−グルクロニドは、 グルクロニドパーミアーゼが発現している細胞を標的とすることができた。

（ｆ）　　クロラムフェニコールのようなグルクロニドトヲンスフ″エラーゼに よｔて不活性化される抗生物質（ｊ１循）阜され得、したがってその生物活性の ゛Ｆ減期が延ばされた。

β−グルクロードＩＪ７対する細胞膜の両刃向−・の透過性の、（−昇により、 ・□、ごルク０ニドパーミアーゼは毒性のグルクロ、、、　１．：１７）排出を 促進ｉることができた。！＝とえば、グルクロご一ドバーミアーゼは、胎児性赤 芽球症のような、母体の抗〜・Ｒｈ抗体に対する２次的な大量の溶血によって引 き起こされた、深刻な状態を伴って生まれた幼児の神経系から、ビリルビンの沈 積が除去される速度を速めることができｊ；。

、：のよ、・）な深刻な状態は新生児の脳中に、ｌ＼モグロビンの沈着およびビ リルビンの蓄積を生じ、２次的な精神障害をへたらず。

この発明は、この発明の１つの態様の中−の実施例として意味するよう例示され た遺伝子および蛋白質の範囲に限定されるものではない。実際には、ここに図示 および記載されたものに加えて、この発明の様々な変更例が、これまでの記載お よび添付した因から当業者に明らかとなるであろう。このような変更例は、添付 された請求項の範囲の中に入ることが意味される。

Ｇ　Ｕ　Ｓ遺伝子を含むプラスミドは、］、９９８６１１１月Ｎａｔｉｏｎａｌ 　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　１ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ａｎｄ　　Ｍ ａｒｉｎｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ　（ＮＣＩＭＢ）Ｔｏｒｒｙ　　Ｒｅ５ｅａｒ ｅｈ　　５ｔａｔｉｏｎ、　　ＰＯＢｏｘ　　３１．１３５　　ＡｂｂｅｙＲｏ ａ、ｄ、　　　Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　　　ＵＫ　　ＡＢ９　　８ＤＧ。

に寄託された。これらのプラスミドはｐ　Ｂ　１１．０１として知られるプラス ミドを含み、これらは、ｐ８１１０１．１（以前にｐＴＡＫ］と１．で知られて いる）、（ＮＣＩＢ受託Ｎｏ、１２３５３）、ｐＢｌｌ（１１，２（以前にｐＴ ＡＫ２として知られている）（ＮＣＩＢ受託Ｎｏ、１２３５４）およびｐＢｌｌ ｏｌ、３　（以前にｐＴＡＫ３として知られている）（ＮＣＩＢ受託Ｎｏ、１２ ３５５）を含む。

（以下余白） 表１ ｐＲＡＪ２８０　　　　　　　　　　　青色（ＮａｃＺ／パーミアーゼ融合） ｐＲＡＪ２８１　　　　　　　　　　　青色（ＳｓｔＮｌａｅＺフレームシフト ） ｐＲＡＪ２８２　　　　　　　　　　　白色（Ｎｓｉｌフレームシフト） ｐＲＡＪ２８Ｂ　　　　　　　　　　　　白色（ＡｃｅＩフレームシフト）　　 　　（２日後青色の痕跡）ｐＲＡＪ２８４　　　　　　　　　　　やや白色（Ｓ ｓ　ｔ　Ｉ＆Ｂａｎｎフレームシフト）（非常に淡い青色）ｐＲＡＪ２８５　　 　　　　　　　　　青色（ＮｃｏＩ−Ｐｓｔ１３’欠失） ｐＲＡＪ２８６　　　　　　　　　　　暗青色（小）（５′末端、ＢａｍＨＩリ ンカ−） ｐＲＡＪ　２８７　　　　　　　　　　　暗青色（小）（３′末端、ＢａｍＨＩ リンカ−） β−グル７０ニア°°−ｃ　反Ａｔ゛ 」シ（− 」停こｉｆ二Ｌ−Ｒ＝　４−メ４−ルウンベｌ）７よりンＲ：　７ルオレしイン ３−０−メチＩレフルオし亡イン Ｒ＝ｂン゛ルフイン ユ上Ｊジ”ＭｆＥす匠Ｉ　　　　　　　Ｒ”　　Ｐ−ニトロ７エソー１しＲ＝− フェノールレフ９レイン ぢ１図 Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　グζレワロシド　ハーミ了−セ。

遺伝）／）ｒ）〜Ａ０乙ηリ　７−ｉ＆レーイ清ｊ之れに了ミノ　賎ａｚｙゴＡ ｒｑＧ〕、ｙ工１ｅＡｌａＡｌａＳｅｒＬｅｕＴｈｒＰｈｅＶａｌＣｙｓＬｅｕ ＡｌａＰｈｅＬｅｕ工１ｅＧｌｙＰｒｏｓｅｒｌｌｅ１１ｅＡｌａＧｌｙＭｅセ ＶａｌＬｅｕＴｙｒＰｈｅＩｌｅＣｙｓＰｈｅｌ、ｙｓＳｅｒＴｈｒＡｒｇＧ１ ｕ入５ｎＶａＬＶａ１．ＡｒｇＩｌｅＶａｋＡｌａＧｉｎ？ｒｏｓｅ：ＬｅｕＡ ｓｎ　工１ｅｓｅｒＬｅｕＧ１ｎＴｈｒＬｅｕＬ、ｙｓ八へｇＡｓｎＡｒｑＰｒ ｏＬｅｕＹ）α口 Ｚ３ｂ図 τ４図 国際調査報告 １Ｍ電−°′″゛′−゛＾Ｉ？ｋｍ鴫′・ＩＩ嘩’ＰＣＴ／ＱＢ８８１００９３ ６国際調査報告 ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００９３６

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．グルクロニドパーミアーゼをコードする遺伝子。
2. ２．第３図において、ヌクレオチド番号９４付近からヌクレオチド番号１４６４ 付近までに実質的に示されるヌクレオチド配列を備える、請求項１に記載の遺伝 子。
3. ３．第３図において、ヌクレオチド番号１０６付近からヌクレオチド番号１４６ ４付近までに実質的に示されるヌクレオチド配列を備える、請求項１に記載の遺 伝子。
4. ４．請求項１、２または３に記載の遺伝子を備える組換えＤＮＡ分子。
5. ５．グルクロニドパーミアーゼ遺伝子が、遺伝子発現を制御する副次的なヌクレ オチド配列の制御下にあり、そのため組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中 でグルクロニドパーミアーゼが発現される、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子 。
6. ６．請求項４または５に記載の組換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞形質転換体。
7. ７．グルクロニダーゼ遺伝子をさらに含む、請求項６に記載の宿主細胞形質転換 体。
8. ８．宿主細胞が動物細胞または植物細胞を備える、請求項６または７に記載の宿 主細胞形質転換体。
9. ９．遺伝子または、請求項１から５のいずれかに記載の組換えＤＮＡを生物体に 導入することを備える、生物体の細胞中にグルクロニダーゼの基質を導入する方 法。
10. １０．遺伝子または、請求項１から５のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子を生 物体に導入することを備える、生物体の生きた細胞の透過性を変化させる方法。