JPH03502043A

JPH03502043A - 高周波電気パルスによる細胞ポレーションと細胞融合用の方法及び装置

Info

Publication number: JPH03502043A
Application number: JP63509129A
Authority: JP
Inventors: チャン，ドナルド　シー．
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1987-10-09
Filing date: 1988-10-05
Publication date: 1991-05-16
Anticipated expiration: 2013-04-15
Also published as: US4822470A; IL87932A0; JP2739978B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２４、前記抗体生成細胞が人間のリンパ球であり、がん細胞が人間の細胞線である請求の範囲第２２項に記載の雑種細胞。２５、複数の生体粒子を電極間の異種遺伝子を含育する溶液中に配置し、かつパルス高周数の振動電界を前記電極の間に印加する段階よりなり、異種遺伝子を生体粒子に挿入する方法。２６、前記パルス高周数が約１０ＫＨｚからＩＯＭＨ２の周波数範囲、約１０ｔｔｓｅｃから１０ｍ５ｅｃのパルス幅範囲、約１から２０ＫＶ／ｃｍの、（ルス振幅よりなっており、前記生体粒子が人間の細胞、動物の細胞、植物の細胞、原形質体、バクテリア、酵母よりなる群から選択される請求の範囲第２５項に記載の方法。２７、請求の範囲第２５項により、遺伝子をとトロ状で細胞内に挿入し、この挿入された遺伝子を有する前記細胞を遺伝子欠陥のある生体内に移植する段階よりなる遺伝子病を治療する方法。２８、生体が人間である請求の範囲第２７項に記載の方法。２９、遺伝子が挿入されている細胞が挿入の段階の前に、遺伝子欠陥を有する生体から摘出される請求の範囲第２７項に記載の方法。３０、遺伝子病が鎌状赤血球貧血病であり、該細胞が骨髄幹細胞であり、該遺伝子が該正常なヘモグロビン遺伝子である請求の範囲第２７項に記載の方法。３１、遺伝子屑が血友病、糖尿病、高コレステロール血病、生長病よりなる群から選択され、細胞が骨髄幹細胞、膵臓インシュリン細胞、肝臓細胞、他の人間の細胞よりなる群から選択され、遺伝子が正常な血液凝固因子■の遺伝子、正常なインシュリン遺伝子、正常な低濃度脂たんばく質し七ブター遺伝子、成長ホルモン遺伝子よりなる群から選択される請求の範囲第２７項に記載の方法。３２、前記細胞が骨髄幹細胞である請求の範囲第２７項に記載の方法。３３、液体を保持できる非導電性材料よりなる容器、この容器が前記生体粒子を取り出すための操作口を有し、前記容器内に相互に等距離に位ｌした電極、パルス高周数電界よりなる電界を印加するための前記電極に取り付けられた強力な発振器よりなる生体粒子のボレーションと融合のための装置。３４、前記容器が生体粒子を重力により集合せしめることができる形状を有する請求の範囲第３３項に記載の装置。３５、前記高周波がパルス高周波振動電界であり、かつ約１０ＫＨｚからＸＯＯＭＨｘの周波数範囲、約１μｓｅｃから１０ｍ５ｅｃのパルス幅範囲、約ＩＫＶ／ｃｍから２０に’／／ｃｍのパルス振幅範囲よりなっている請求の範囲第３３項に記載の装置。３６、前記発振器がその他に前記生体粒子を融合のために極めて接近させるための連続的低出力交流電流を供給する能力を有している請求の範囲第３３項に記載の装置。３７、低出力交流電流が約６０Ｈｚから１０ＭＩＬｚの周波数範囲、約１００Ｖ　／　ｃｖｎから８００Ｖ／ｃｍの電界強度よりなっている請求の範囲第３６項に記載の装置。３８、透明な底部を有する容器と、容器内に挿入された電極、前記１１極が相互に等距離にあり、かつ少なくとも１０マイクロリツターの細胞が電極に密着する様式で配置され、高周波の電界を印加するための前記電極に接続した高出力発振器とよりなり、生体粒子のボレーションと融合とを光学顕微鏡による観察のための装置。３９、前記装置を操作するための非導電性材の７）ンドルと、相互に等距離に位置し、前記ハンドルに取り付けられた電極と、この電極を高出力発振器へ取り付けるための接続手段とよりなり、生体粒子の細胞ボレーションと融合のための装置。４０．前記電極が２重螺旋状に非導電性コアの回りに巻き付けられている請求の範囲第３９項に記載の装置。４１、前記電極が分割された形の部分と、前記分割された形の部分を分離するための絶縁空間とより構成されている請求の範囲第３９項に記載の装置。４２、前記電極が螺旋、同心環、同心方形、平行板、櫛歯がらみ配列よりなる群から選択された底面接触の電極である請求の範囲第３９項に記載の装置。４３゜前記電極が同軸状で、約０．５から２．０ｍｍ離れており、約０．５から３　ｃｍの長さと、多数の凹部のある培養皿の凹部に入れるために十分に小さい直径とを有する請求の範囲第３９項に記載の装置。４４、高周波発振器の出力をゲート制御するためのゲート回路と高周波発振器の制御出力から高出力ＲＦパルスを発生するための出力増幅器より構成されているＲＦパルス発振器と、交流電界発振器と、ＲＦパルスと交流電界とを切換えるための水銀スイッチとより構成されている高出力発振器。４５、　ＲＦ波形とＡＣ波形とを合成し発生するためのデジタルコンピュータと、このデジタルコンピュータにより形成された波形を高出力波形へ変換するための増幅器と、電界を生体粒子に印加するための前記増幅器と接続している電極とよりなる細胞ボレーションと細胞融合のための装置。４６、情報記憶装置をその他に有する請求の範囲第４５項に記載の装置。明　　　　　細　　　　　書３０匹ノと名」於ユ・　　パルスによる′　ボレーション７　　　　ム　　の　　法　　び上」１Ωｊ１引この発明は、高電力高周波パルス電界の印加による生物細胞のボレーション（ｐｏｒａｔｉｏｎ）及び融合の分野に係わる。特に、遺伝子トランスフェクション、細胞の顕微注射、単クローン性抗体の生成、雑種交配による新しい生物的種の形成を含む広い多様な領域における細胞の透過及び融合に係わる。！−−１細胞ボレーションと細胞融合は、近代生物工学において重要な役割を演じている。例えば、遺伝子工学において基本的方法の１つは、宿主細胞内に外因性の遺伝子的物質を誘導することである。遺伝子のこの挿入は、細胞膜を透過して遺伝子物質を侵入させるか（すなわち遺伝子トランスフェクション）、あるいは要望する遺伝子物質を含む細胞で、宿主細胞を融合することにより行なわれる。細胞融合はまた、単クローン性抗体の生成に重要である。単クローン性抗体の生成過程では、連続的に分裂するがん細胞で、抗体生成の細胞を融合することが必要である〔ガフレ（Ｇａｌｆｒｅ）　Ｇ、他、ネイチュア誌（Ｎａｔｕｒｅ）　２６６　：　５５０−５５２　（＋９７７）　　；　ｏつ（ＬＯ）　、Ｍ、Ｍ、Ｓ。他、ネイチュア誌（Ｎａｔｕｒｅ）　３］０　：　７９４−７９６　（＋９８４）　：ｌ。その他に、一般に細胞に侵入できない薬剤の投与に非常に有効な方法の１つに、リポソーム、あるいは、特定の薬剤を予め投与された赤血球ゴーストにより、細胞を融合する方法がある〔シュレーゲル、リーバ−著（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ　＆　Ｌｉｅｂｅｒ）　＋ｔｖフユージＥｌ　＞　（Ｃｅｌｌ　Ｆｕｓｉｏｎ）　Ａ、Ｅ、ソワーズ編（Ｓｏｗｅｒｓ）、プレナム　プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）　　（＋９８７）　）。細胞融合の従来技術は、主にウィルス〔ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）。Ｊ、池、セル　バイオロジー誌（Ｊ、ＣＣ１１Ｂｉｏｌ、）　、　８９　：　６７４−６７９　（１９８１）　）　、または、ポリエチレン　グリコールのような化学薬品〔ダビットメン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）　Ｒ，Ｌ、他、ソーマチック　セル　ジネスチックス（Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　２　：２７１−２８０　（１９７６）　）の作用によるものである。ウィルス誘導及び化学薬品誘導の融合法には、多くの欠点がある。融合は、収量が非常に低い場合が多く、一般に０，０１％以下であるだけでなく、標準的融合技術もまた、融合される細胞に重度の副作用を発生する。従って、多くの組織体に対する有効性はかなり制約される。電界により細胞融合と細胞ボレーションを誘導する方法が、他に開発されている〔ボール（Ｐｏｈｌ）　、米国特許番号４、４７６、００４　；ソワーズ（Ｓｏｗｅｒｓ）米国特許番号４，６２２，３０２　；ショーナー（Ｓｃｈｏｎｅｒ）　、米国特許番号４，５７８，１６７　；ノイマン（Ｎｅｕｍｍａｎ）　、　Ｅ、他、ナトウルビッシエンシャフテン（Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｈａｆｔｅｎ）　６７　：　４１４−４１５　（１９８０）　　；ツインメルマン（Ｚｉｍ＋＋＋ｅｒｍａｎ）　、　Ｕ、及びニーケン（Ｎｉｅｋｅｎ）　、Ｊ、、メンプレイン　バイオロジー誌（Ｊ、Ｍａｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｌ、）　６７　：　１６５−１８２（１９８２）　　、ベイン（Ｂａｔｅｓ）　Ｇ、　Ｗ、Ｊｊｌ、　’ ｔｔｋフユージ′！′（Ｃｅｌｌ　Ｆｕｓｉｏｎ）　、プレナム　プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）　Ｐ、３６７−３９５　（１９１１７）。これらの電気融合の基本原理は、細胞にパルス状の強い直流（ＤＣ）電界を印加することである。このＤＣ電界は、　ＤＣ電源を入力するか、またはコンデンサーを放電するだけで、一般に発生する。印加ＤＣ電界の強さは、数ＫＶ／ａｍである。この外部電界は細胞膜に高い電位を誘起する。膜の電位が十分に高い場合、細胞膜の小部分に可逆性破壊が起る。この破壊により、細胞の表面に物理的細孔が形成される。この過程を電気ボレーションという。細胞内及び細胞外の物質は、細孔が開いているときには、細孔を通って交換される。ＤＣ電界が取り去られると、細孔は正常に迅速に再び密閉される。細孔が２つの隣接した細胞の間に発生した場合、細胞質のブリッジが細孔を経て形成される。ＤＣ電界が消滅すると、その細孔は再び密閉しない。その代りに、その細胞質ブリッジは一般に拡大を始め、その結果、２つの細胞は融合する。このＤＣ電気融合法は、植物の原形質体〔ツインメルマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）　、　Ｕ、他、バイオケミストリー　バイオフイジンクス（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　ＡＣＴＡ　６４１　：　１６０−１６５　（１９８１）；ベイン（Ｂａｔｅｓ）　、　Ｇ、Ｗ、他、＋ｙＬ＝　　フュージョン（ＣｅｌｌＦｕｓｉｏｎ）　、プレナム　プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）　Ｐ、４７９−４９６（１９８７）　］　、血液〔ソワーズ（Ｓｏｖｅｒｓ）　Ａ、Ｅ、、セル　バイオロジー誌（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　１０２　：　１３５８− １３６２（１９８６）　：チヤツク（Ｃｈａｎｇ）及びハント（ｈｕｎｔ）、　　ムの　　　カニズム（る　、シンボジュ　ム・　　、バッファロー、ニューヨ −ク、ｌ”、　２６　（１９１１７）　　：　、’、　ｉ　’、−ジャー　（Ｓｔｅｎｙ、ｅｒ）　、　Ｄ、Ａ、及びフライ（Ｈｕｉ）　、　ＳＪ、ソニー１／イン　バ（＝にシー誌（Ｊ。Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉ、ｏｌ、）　９３　：　４３−５３　（ｉ９．１ｂ＋Ｊ　　；　鴨瘍細胞〔ロウ（Ｌｏ）、Ｍ、＋ｔ、Ｓ、他、ネイチュブ（Ｎａｔｕｒｅ）　、　３１０　：　７９４−７９６（１９８４）　　；テンシー（Ｔｅｓｓｉｅ）　、　Ｊ、他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１６　：　５３７−５３８　（１９８２）　　；酵母細胞〔ハーフマン（Ｈａｌｆｍａｎ）　。ＩＬＪ、他、アーチブ（Ａｒｃｈｉｖ）　、マイクロバイオロジー（ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）　、　１３４：　１−４　（１９ｇ３）　〕：分割球及び卵〔クバイアック（Ｋｕｂｉａｃ）　、　Ｊ、Ｚ、及びジャルコウスギー（Ｊａｒｋｏｗｓｋｉ）　、　Ａ、に、、研究発表、細胞研究（Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ、）　１５７　：５６１−５６６　（１９８５）　、などを含む多くの生物細胞に適切に使用されているが、この方法の使用に当ってはなおも多くの制約がある。第１に、すべての種類の細胞が、同じように容易に融合できるものではない。実際に、多種類の細胞はＤＣパルスで融合することが非常に困難である。第２に、融合を効果的に行う因子には、多くの未知のものがある。数種類の細胞の融合は、ある実験室では適切に行われるが、ほかの実験室ではそうでない。ＤＣパルス法は、周知の方法よりさらに優れた技術である。第３に、ＤＣパルスを使用して大きさの異なる細胞を融合することは難かしい。この後者の問題は、外部のＤＣ電界により誘起された膜の電位が、細胞の直径に比例するので、発生ずる。従って、誘起電位は、大きい細胞はど高い。大きさの異なる２種類の細胞を融合するために、外部電界の電界強度を適切に選択することは、不可能に近い。外部電界が大きい細胞を膜破壊するに適当な強度である場合には、小さい細胞に臨界の膜電位を誘起するには不十分である。他方で、小さい細胞に膜破壊を発生するために、外部電界を高めた場合、大きい細胞内に誘起された高い電位によって、非可逆的膜破壊が起り、細胞を破壊する。この発明は、前記の問題を解消する細胞ボレーションと細胞融合の改良された方法を提供するものである。ＤＣパルスを印加して膜破壊を発生する従来の電気融合法と異なり、この発明は、高周波（ＲＦ）電界の１つ以上のパルスを使用して、細胞を可逆的に透過し細胞破壊を誘起する。高出力ＲＦ電界は、電気的に圧縮状慇にして、細胞膜の振動運動を発生する。細胞膜の透過は、ＲＦ［界による電気的破壊と局部的音数作用とにより行われる。従って、振動電界は、細胞膜を破壊する場合、ＤＣ電界よりも一層効果がある。この新しい方法は、物理的手段（すなわち、ＲＦ＠気エネルギー）のみを使用して細胞ボレーションと細胞融合を誘起するので、生物学的及び化学的汚染はない。この発明によれば、数秒間で結果が得られ、従来の方法によりさらに高い収量が生成され、生物学的副作用は最低限に抑えられる。このように、この発明は、完全にして、作用が速く、効果的に、かつ安全な方法である。この発明の方法によって可能となった細胞ボレーションと細胞融合の改善された効率は、医学上の応用において特に重要である。−例として、治療用抗体の生成がある。人体は通常、動物の抗体に拒否反応を示すので、治療用抗体は人間の細胞より成る雑種細胞によって生成されなければならない。しかし、人間の雑種細胞は、従来の方法（ＤＣ電界による電気融合を含めて）により生成することは非常に難しい、この発明の方法は人間の雑種細胞生成における効率改善に有用である。この方法の医学応用のほかの例に、遺伝子の治療がある。遺伝子病の多くは、治療遺伝子を−ζ二二五１．．Ｍｉ■（転）−太で患者の細胞に挿入し、その細胞を患者の身体に移植することにより治療される。細胞ボレーション（ＤＣ電界法を含めて）の従来の方法では、一般に、遺伝子トランスフェクションを行うには多数の細胞（通常、５〜・１０百万個の細胞）が必要であり、結果として、人体の治療に使用するには適切でない。これと対照的に、この発明の方法は、細胞を少数で効率よく形質変換できることが立証されており、従って遺伝子治療に非常に有用である、呈ユ五１笠この発明の目的は、細胞のボレーションの方法である。この発明の他の目的は、細胞融合の方法である。この発明のさらに池の目的は、細胞のボレーションと融合に使用する装置である。この発明のその他の目的は、遺伝子物質を生体細胞内に挿入するための方法である。この発明のさらに他の目的は、患者に移植される細胞内に治療用遺伝子を挿入することにより、遺伝子病を治療することである。この発明の他の目的は、ＲＦ電界を印加して細胞融合により雑種細胞を形成するための方法である。この発明の他の目的は、単クローン性抗体生成の効率を大きく高める方法である。この発明の他の目的は、高電力ＲＦパルスを使用して異なる種から細胞融合により、新しい種を形成することである。この発明の他の目的は、ボレーション及び／または融合により、化学的及び生物学的分子を細胞に投入することである。このように、前記の目的の達成において、この発明の１つの態様に従って、複数の生体粒子を２個の電極間の溶液内に配置し、粒子をボレーションする電極間に高電力パルスＲＦ振動電界を印加する手段よりなる生体粒子ボレーションの方法が提供される。生体粒子は、溶液中の浮遊細胞、もしくは細胞培養において付加された細胞である。この方法の他の実施態様には、パルスＲＦ電界を印加する前に、生体粒子を集合させる容器内に、浮遊生物粒子を置くことによって、生体粒子を融合する方法がある。その他の方法には、パルスＲＦ振動電界を印加する前後に、低強度（例えば、１００−４００〜’／ａｍ）交流（ＡＣ）電界を印加して、生体粒子を融合する方法がある。低強度電界により、粒子は誘電伝導的に動いて、“真珠の鎖゛を形成する。生体粒子は、生体細胞（人間、動物、または植物などの細胞）、リポソーム、小胞、赤血球ゴースト、原形質体、バクテリア、酵母などを含む各種の物質である７細胞のボレーションと融合に印加されるパルスＲＦ電界は、単一周波数もしくは混合周波数の振動電界であっても良い。ＲＦ振動電界は、パルス幅が約１μｓｅｃ〜１０ｍ５ｅｃ、パルス振幅が最大約２０ＫＶ／ｃｍで、周波数範囲が１０ＫＨｚ〜１００ＭＨｚ内にある。好適な実施態様では、ＲＦ振動電界は約０．０２〜ＩＯＭＨ２、パルス幅は約２０〜２００μｓｅｃ、パルス振幅は約２０〜ｌ０ＫＶ／ｃｍである。ＲＦ電界の波形は、正弦、三角、鋸歯、矩形などの波形とすることができる。この発明の他の態様は、新しい種を形成する細胞融合、化学物質及び自然または人工の遺伝子物質の細胞内への投入、雑種細胞の生成である。細胞の種類と物質を適切に選定することにより、新しい種は、細胞融合により２種類の異なる種の遺伝子物質の結合、または遺伝子物質の分離もしくは合成によるか、ボレーションまたは融合により遺伝子物質の細胞内への投入により形成される。雑種細胞は、連続的に分裂するがん細胞と共に細胞を形成する抗体により生成される。化学薬品、薬剤、ＤＮＡ、　ＲＮＡ、及び他の分子は、標的細胞の融合の前に、小胞、リポソーム、あるいは赤血球ゴーストを混入することにより細胞内へ投入される。この発明の他の態様は、液体の保持が可能な非導電性材で作られた容器より成り、生体粒子の取出し口を具えた、生体粒子のボレーション及び融合のための装置である。装置にはまた、相互に等間隔に位置して容器内に挿入された電極が具えられている０強力な機能を有する発振器が電極に接続しており、ＲＦ電界及び／または交流電界を発生することができる。 −例では、容器は生体粒子が寄せ集まるような形状となっている。その他の態様は、ガラス製室よりなり、細胞のボレーションと融合を観測するための光学顕微鏡を具えて使用される、生体粒子のボレーションと融合のための装置である。さらに他の態様は、手持ち可能な細胞ボレーションと融合装置である。装置にはハンドルと等距離に設置された電極が具えられている。電極は側面取付または底面取付ができ、多様な形状に設計することが可能であり、その形状は、環状。円形、二重螺旋状、方形、楕円形、同心環状、同心方形、櫛歯がらみ状配列、渦巻形、平行板状である。他の目的、特徴、利点は、添付図面に関連して開示するために示された発明の好適な実施態様についての、以下の説明から明らかになろう。旦工旦且亙皇双里この発明は、明細書の一部を構成している添付図面を参照して、以下の明細書を読むことにより、一層容易に理解される０図面には、この発明の実施態様の諸例が次のように示されている。第１図は、重力により細胞が寄せ集まる室を使用しているこの発明の詳細な説明図である。第１Ａ図はこの装置の平面図であり、第１Ｂ図はこの装置の断面図であって、融合室を示している。第２図は、この発明に使用されているＲＦパルスの諸例のグラフである。第２Ａ図は単一周波数の対称ＲＦパルス、第２Ｂ図は非対称ＲＦパルス、第２Ｃ図は多重周波数のＲＦパルス、第２Ｄ図は異なる周波数が連続しているＲＦパルス、第２Ｅ図は、低強度のＡＣ電界に続いて高強度ＲＦパルスが発振し、これに低強度のＡＣ電界が続いている。第３図は、この発明の詳細な説明図であり、細胞ボレーション及び／または細胞融合のための大容積の室を示している。第３Ａ図はこの融合室の平面図であり、第３Ｂ図は断面図であって、室内の電極の配置を示している。第４図は、光学顕微鏡による観察のための細胞ボレーション及び／または細胞融合の室の説明図である。第４Ａ図は斜視図であり、第４Ｂ図は室の断面図である。第５図は、側面接触の形式を採用しており、細胞ボレーションと細胞融合のための手持ち可能な装置の説明図である。第５Ａ図はこの装置の斜視図であり、第５Ｂ図は、細胞容器の内側に挿入された電極の断面図である。第６図は、側部接触の電極組立の二重螺旋方式設計の説明図である。第６Ａ図は電極組立の螺旋設計の斜視図を示し、第６Ｂ図は同螺旋設計の側面図を示す。第７図は、側部接触の電極組立の分割された環状設計の説明図である。第７Ａ図は電極組立の斜視図を示し、第７Ｂ図は電極内の電極環の接続を示しており、第７Ｃ図は電極環単体の平面図を示す。第８図は、細胞ボレーションと細胞融合とのための方形電極組立の説明図である。第８Ａ図は電極組立の斜視図を示し、第８Ｂ図は電極組立内の方形電極の接触を示している。第９図は、電極の底部接触の形式を採用した細胞融合と細胞ボレーションとの装置の説明図である。第１θ図は、底部接触電極組立の二重渦巻設計の説明図である。第１０Ａ図は斜視図を示し、第１０Ｂ図は電極の平面図を示す。第１１図は、底部接触電極組立の同心環設計の説明図である。第１１Ａ図は斜視図を示し、第１１Ｂ図は電極の平面図を示す。第１２図は、底部接触電極組立の各種設計の説明図である。第１２Ａ図は方形渦巻組立の平面図、第１２Ｂ図は同心方形組立の平面図、第１２Ｃ図は櫛歯がらみ組立の平面図、第１２Ｄ図は平行板組立の平面図である。第１３図は、ＲＦ法を採用した少数の細胞に使用される細胞ボレーションと細胞融合用プローブの説明図である。金属製電極の外部は、９６−凹みの細胞培養皿の凹みに挿入するように設計されている。第１３Ａ図はプローブの斜視図、第１３Ｂ図は断面図、第１３Ｃ図は電極の部分的斜視図である。第１４図は、誘電伝導用のＡＣ電界と細胞ボレーション及び／または細胞融合の高強度ＲＦパルスとの発生器を具えた装置の構成図である。第１５図は、ＲＦボレーションの処理後の人間の赤血球の表面を示す電子顕微鏡写真である。　ＲＦ電界が３回、１秒間隔て印加された。細胞は、液体窒素により冷却された（＠度９０’Ｋ）液体フレオン内で急速に凍結された。凍結サンプルは、凍結破面電子顕微鏡により調べられた。倍率ｘ　５０．０００゜第１６図は、人間の赤血球間の融合を示す蛍光電子顕微鏡写真である。赤血球は、誘電伝導の作用により、真珠の鎖状に並んでいる。赤血球の約１０％には、蛍光顕微鏡で明るい像を形成する蛍光染料が予め付着された。付着されていない細胞は見ることができない。第１６Ａ図は、ＲＦパルスを印加する前に、細胞がどのように見えるかを示している。第１６Ｂ図は、ＲＦパルス（幅４０μｓｅｃ、３００ＫＨｚ、５ＫＶ／ｃｍ）が３回印加されて、４秒後に細胞がどのように見えるかを示している。染料が付着した細胞の一部は、付着していない隣接の細胞と融合して、蛍光染料がその間に移動している。第１７図は、測定した融合が、３回の電気パルス（４ＫＶ／ｃｍ、１００μ５ｅｃ）により人間の赤血球の間に発生していることを示すグラフである。融合の発生は、発振局ａ数により変化することが明らかにされている。第１８図は、パルスＲＦＩＩ界の誘導による魚の腫瘍細胞と黄色素細胞との融合を示す時系列の光学顕微鏡写真である。第１８Ａ図は融合の前であるが、黄色素細胞（矢印で示す）が誘電伝導により２個の腫瘍細胞と近接している。第１８Ｂ図は、ＲＦパルス印加後、２分間経過した写真であり、黄色素細胞はすでに腫瘍細胞の１つと融合を始めていることを示す。第１８Ｃ図は、ＲＦパルス印加後、４分間経過したもので、ズサンソーと腫瘍の細胞は、完全に１つの丸い細胞に結合していることを示している。 ■ＪＬＬ皮囲− 皮下−説明において、同様な部品は、明細書及び図面の全般に亘って、同一参照番号で示されている。図面は必ずしも縮尺されたものでなく、この発明の特徴のいくつかは、大きさで強調されるか、または明確さと簡潔さのために図の形式で示されている。各種の代替及び修正が、この発明の範囲と精神から逸脱することなく、ここに開示されたこの発明について行われることは、当技術に精通した人にとっては容易に理解されるものである。１つの実施態様は、第１図に示すように、２個の電極の間の溶液中に生体粒子を置き、パルス高周波（ＲＦ）の振動電界を電極の間に印加する手段よりなり、生体粒子をボレーションするための方法より構成されている。各種の生体粒子は、生体細胞、赤血球ゴースト、リポソーム、原形質体、バクテリア、酵母を含めて使用することができる。生体粒子は、溶液中の浮遊細胞か、あるいは細胞培養器中の付着細胞とすることができる。細胞が電界中に置かれた場合、電位が細胞膜に誘起される。球状の細胞の場合、外部電界により誘起される膜の電位は次式で与えられる。 ■ｍ＝　１．５ｒＥｃｏｓθ　　　　　　　　　　　　　（１）ここで、ｒは細胞の直径、Ｅは外部電界の強度、θは外部電界の方向と特定の位置における膜の標準ベクトルとの角度Ｅ＋＝Ｖｍ／ｄ＝１．５　（ｒ／ｄ）ｒＥｃｏｓθ　　　　　　　（２）ここで、ｄは膜の厚さである。ｄはｒよりかなり小さいので（ｄは約６Ｘ１０−７ｃｍ、ｒは数ミクロンのオーダ）　、　Ｅｎ＋は印加電圧Ｅの約１，０００倍である。膜内の強い電界は、２つの影響を及ぼす。第１に、電界は膜内の脂質分子のりん酸塩先頭グループに強い力を加え、分子を電界の方向動かす傾向がある。第２に、電界は膜を圧迫する。外部電界が振動すると、膜内の脂質分子はまた振動運動を行う。この構成において、細胞自体はアンテナとして働き、膜は電気振動を機械振動に変換するトランジューサである６従って、外部ＲＦ電界を印加することにより、超音波運動を細胞膜内に起すことは可能である。膿の与えられ位置に誘起した電位は、膜の方向と電界ベクトルとのなす角度の関数であるので、誘起電位は、細胞の全表面で一様ではない。加えられたエネルギーは、細胞の極に集中する。すなわち、θ＝Ｏ″または１８０１において。外部電界の大きさは、細胞膜を極において破壊するが、膜の他の部分は破壊はないように十分な超音波処理力を有するように、調節することができるので、超音波処理は局部化することができる。実験の結果、外部より印加されたパルスＲＦ電界によって誘起された膜の局部破壊は可逆性であることが明らかにされた。すなわち、ＲＦ電界により誘発した細孔は、電界が取り去られると、迅速に（数分以内）再び閉じる。その上、細胞の大部分は、明らかに正常な状態で存続する。このような細胞膜の一時的透過化は、細胞のボレーションと言われる。細孔が形成されるこの期間に、細胞内及び細胞外の物質の交換が短時間に行われる。薬剤、抗体、遺伝子の切片を含む多くの分子は、通常、細胞膜を透過することはできないが、パルスＲＦ電界により誘起されて一時的に開いた細孔を通って、細胞内に入ることができる。この発明の他の実施態様は、細胞を融合するための方法より構成されている。生体粒子を融合するため、生体粒子は接近し７ていなければならない。細胞が接近している場合、集合していると言う。２つの選択できる方法が、融合の前に細胞を集合させるために使用される。１つの方法では、生体粒子が重力により集合するような形状の容器が使用される。例えば、容器の底は凹状に製作することができる（第１図２第３図を参照）。これによって、細胞は集合する。細胞膜が、印加されたＲＦｇ界により透過されると、接近して隣接した細胞は、細胞質ブリッジを形成する二とができる。この方法により、細胞が融合する。この方法に代るものとして、低損幅の連続交流（ＡＣ）電界を２個の電極の間に印加することができる。周渡数は、約６゜ｆ（ｚ　〜約１０ＭＨｚの範囲にある。一般に、電舅強度１００〜４００Ｖ／ｃｍが使用される。低振幅のＡＣ電界の下で、細胞は双極子として働き、電界に平行に並び、この結果、“真珠の鎖”に見える細胞の長い鎖を形成する。この方法は、誘電伝導〔シュワン（Ｓｅｈｗａｎ）　、　Ｈ，Ｐ、及びシャー（Ｓｈｅｒ）　、　Ｌ、Ｄ、、　ｘレフトロケミストリー　ソシエテ誌（Ｊ、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１１６　：　２２Ｃ−２６Ｃ（１９６９）　　；ボール（Ｐｏｈｌ）　、　Ｈ，Ａ、他、バイオロジカルフィジックス誌（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｐｈｙｓ、）　９　：　６７−８６　（１９８１）　）と呼ばれている。この真珠の鎖は、通常、約数秒から１分間で形成される。この発明には、細胞をポレーション及び／または融合するために、パルスＲＦ電界が使用されており、パルスＤＣ電界を使用している従来の電気融合法より侵れた明確な利点がある。第１に、ＲＦ電界は、ＤＣ電界より、エネルギーを細胞膜へ伝達するはるかに高効率の装置である。この発明は、細胞膜を破壊するため、局部的超音波処理を採用している。この方法は、単に電気的破壊に依存しているＤＣパルス方法よりも、一層効果的である。細胞膜は、熱運動の周波数特性を有する高分子より構成される。印加された振動電界の周波数が、これらの高分子の固有振動数と一致する場合、共振状態に達して、エネルギーの転送の効率が非常に高くなる。実際の生体細胞の場合、共振ピークは非常に広い。パルスＲＦ電界は、対象の細胞に対し適切な共振周波数を得るために、注意深く変化させることができる。従って、膜を破壊するには、ＤＣ電界を使用する場合より低い電力を必要とするだけであり、細胞を非可逆的に損傷する危険が少ない。第２に、この発明は、従来の方法が異なる大きさの細胞を融合する際に遭遇する諸困難を克服する。細胞膜の電気的破壊を行うために、電界で誘起された膜の電位は、成る臨界値Ｖｃ　（一般的にＩＶ）を超えなければならない、このような破壊は可逆性であり、誘起膜電位がＶｃより余り高くなければ、膜は、外部電界が打ち消された後に再び密閉する。細胞は、一般に、このような可逆性破壊の後でも存続する。これに対し、誘起電位がＶＣよりかなり高い場合、膜破壊は非可逆性であり、膜は恒久的に損傷し、可逆的機能状態では存続しない。第１図より、異なる大きさの細胞が電界内に置かれた場合、誘起された膜電位は、小さい細胞の場合より大きい細胞の場合の方が高い。膜電位の大きさ依存性によって、ＤＣ電界を使用して各種の大きさの細胞を融合しようとする時に１つの問題が起る。２つの細胞ＡとＢが融合されるものとし、細胞Ａの直径ｒ、は細胞Ｂの直径ｒｂの約２倍と仮定する。細胞Ｂに可逆性膜破壊を発生させるためには、印加された外部電界は、１．５Ｅｒｌ、がＶｃより大きくなるように十分に高くなければならない。しかし、同一の印加電界では、細胞Ａには余りに高いＶｍが誘起されて、この細胞にとって損傷となる膜の非可逆性破壊が発生する。従って、著しく大きさの異なる数種の細胞を融合するために、ＤＣパルスを使用することは非常に困難である。この問題は、パルス高周波電界を印加することにより解決される。印加電界が、ＤＣ電界の代りに高周波振動電界の場合、誘起膜電位の大きさは、周波数の関数である。式（１）に設定された膜電位は、定常状態の下で誘導されている。誘起電位は、外部電界の印加により瞬間的に上昇するものではない。外部電界が静止しているならば、誘起電位は十分な時間を経てＶｍに到達するであろう。この定常状態の膜電位を得るに必要な時間は、緩和時間と呼ばれており、すなわちτであり、これは次式で表わされる。１／　ｒ　＝　１／ＲｍＣｍ＋　Ｉ／ｒＣｍ　（Ｒｉ　十〇、　５Ｒｅ）　　　　　　（３）ここで、ＲｍとＣｍは膜の固有抵抗と固有キャパシタンスであり、Ｒ４とＲｅは細胞内媒質と細胞外媒質の固有抵抗であるＣＣ。ホルツアフエル（Ｈｏｌｚａｐｈｅｌ）他、メンブレン　バイオロジー＃　　、Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｌ、　　、　６７　：　１３−２６　（１９ｇ２）　）　、直径が数ミクロンの細胞に関しては、τは、一般に、１μｓｅｃ程度である。大部分の細胞のＲｍは非常に大きいので、実際の使用に当っては、式（３）は次のように単純化することができる。＝　＝　ｒ　Ｃｍ　（Ｒｉ＋０．５Ｒｅ）　　　　　　　　　　（４）従って緩和時間は、細胞の直径にほぼ比例する。膜電位の形成には、緩和時間τにより特性化された時間が必要であるので、ＲＦ電界により誘起された膜電位は周波数に依存する。高周波電界が１７でより低い周波数で印加された場合、膜電位は、外部電界に準じて全く問題がない、印加電圧がＶｍの場合、細胞は１００％応答する。一方、印加高周波電界の周波数が１／τより大きいならば、膜電位は印加電界の変化に追いつくことはできず、膜電位の応答は１００％より小さい。一般に、ＲＦ電界により誘起される最高膜電位は、次の通りである。Ｖ（ω）＝１，５ｒＥｃｏｓθ　Ｘ（Ｑ））（５）ここで、ｒ、Ｅ、　　θは式（１）と同じ意味を持ち、ωは角周波数、Ｘ（ω）は次のように周波数の関数である。Ｘ（ω）＝［１＋（ωτ）２）−１／２　　　　　　　　（６）ωく１／τの場合、Ｘ（ω）は１（単位）に近い。 ω〉１／τの場合、Ｘ（ω）は、周波数が高くなるにつれて。急速に低下する。この周波数依存の効果は、異なる大きさの細胞を融合するために使用することができる。式（４）から、細胞τは、はぼτに比例する。従って、大きい細胞は長いτを有する。ＡとＢの細胞を融合するために、周波数ωのパルスＲＦ電界は次のように印加される。ｌ／τ１くω〈１／τ、（７）周波数は１／τｂより小さいので、Ｘ（ω）は細胞Ｂの１（単位）に近づき、電界は小さい細胞に十分な作用を及ぼす。他方、その周波数は、１／τ、より大きいので、誘起された細胞Ａ内の膜電位は、印加電界の変化に完全には追随できない。すなわち、細胞ＡのＸ（ω）は単位より小さい。従って、パルスＲＦ電界において、小さい細胞が感知した擬似電界の作用は、大きい細胞に及ぼされた作用より大きい、従って、パルスＲＦ電界は印加されて、大きい細胞を非可逆性損傷することなく、小さい細胞の膜に可逆性破壊を誘起する。生体粒子のボレーション及び／または融合用の装置１００１つの実施態様を第１図に示す。それは、生体粒子１９の溶液１６を保持するための非導電性容器１３よりなる融合室である。容器には、生体粒子１９が重力を受けて電極２５の間に寄せ集まるように、僅かに凹んだ底がある。電極２５は、白金または外科用ステンレススチールのような非毒性材で製作され、等距離に位置した１対の金属製線もしくは金属製帯である。電極は平行な線であるか、またはほとんどどのような形状もしくは設計とすることができる。容器１３には生体粒子１９を追加するか、取り去ることができる操作口２８がある。細胞ボレーションまたは細胞融合を誘起するため、高出力の発振器３１が、１対の電極２５により印加される１つまたは多数の強力なＲＦパルスを発振する。パルスの形状は、第２図に示された諸形状の１つよりなっている。第２Ａ図では、パルスは単−周波数の対称ＲＦ捩振動ある。第２Ｂ図において、ＲＦパルスは単一周波数の非対称正弦波である。第２Ｃ図において、　ＲＦハルスは多周波数正弦波の混合パルス（この例では、２周波数）である、第２Ｄ図において、異なる周波数の交流設計とすることができる。容器１３には生体粒子】９を追加するか、取り去ることができる操作口２８がある。細胞ボレーションまたは細胞融合を誘起するため、高出力の発振器３１が、１対の電極２５により印加される１つまたは多数の強力なＲＦパルスを発振する。パルスの形状は、第２図に示された諸形状の１つよりなっている。第２Ａ図では、パルスは単一周波数の対称ＲＦ捩振動ある。第２Ｂ図において、ＲＦパルスは単一周波数の非対称正弦波である。第２Ｃ図において、ＲＦハルスは多周波数正弦波の混合パルス（この例では。２周波数）である。第２Ｄ図において、異なる周波数の交流正弦波が使用されている。好適な実施態様では、第２Ｂ図に示されたパルスが使用されており、その理由は、印加された電界エネルギーが、細胞のボレーションまたは融合の誘起に一層効率よく使用することができるからである。好適なＲＦ電界波形は正弦波であるが、同一形状を反復する他の波形を使用することができる。例えば、三角波、矩形波、鋸歯波は、各種細胞の融合もしくはボレーションを行うために、使用される。当技術の熟練者は、パルス電界の変数が、各種生体サンプルの特性に適合するために変わるものであることを容易に理解する。パルスの高周渡は、ｌ０ＫＨｚから１００ＭＨｚの全域で変化する。一般に、０．０２〜１０ＭＨｚの程度の値が、生体細胞のボレーション及び／または融合に使用される。パルスの幅は、約１μｓｅｃから１０ｍ５ｅｃまで変化する。好適な実施態様では、約２０μＳｅｔから２ｍ５ｅｃが使用される。電界強度は、パルス振幅を変化させて制御される。細胞の融合とボレーションには、１〜２（ＩＫＶ／ｃｎ＋の範囲が採用される。好適実施態様では、約１０ＫＶ／ｃｍまでの電界強度のパルスが使用される。パルスは、単一パルス、連続パルス、あるいは多重連続とすることができる。連続パルスは、間に間隔を有する多重パルスである。例えば、幅が０．５ｍ５ｅＣのパルスが０．５ｓｅｃだけ間隔を置いている１０個のパルスのつながり。ＨＬ −６０細胞の例では、最大融合量は多重パルスを印加することにより増加する。細胞融合と細胞ボレーションに使用するＲＦパルスは類似している。主な差異は、細胞融合の場合、細胞が高強度ＲＦパルスが印加される前に集合すること（非常に接近して）が必要である。その他に、細胞はＲＦパルスが印加された後に接近した状態で維持されなければならない。前記の装置では、細胞を重力により集合させている。細胞集合の他の一層効率よい方法は誘電伝導であり、この場合、連続した交流（ＡＣ）電界が、強力なＲＦパルスの印加の前及び／後に電極間に印加される。この連続ＡＣ電界の振幅は、一般に、１００〜４０ＱＶ／Ｃｍである。周波数は、約６０Ｈｚから約１０ＭＨｚである。好適な実施態様では、細胞融合の間、電極間に加えられた実際の電界は、第２Ｅ図に示す波形に似ている。比較的多量の細胞のボ１／−ジョン及び／または融合用の他の装置が第３図に示されている。単なる１対の電極の代りに、等距離に配列された電極群２５はＡＣ電界とパルスＲＦ電界とを印加するために使用される。この融合室の底部は平坦かもしくは僅かに凹んでいる。それは、ガラスまたは無色のプラスチックのような透明な材料で製作されている。この室は細胞融合及び／または細胞ボレーションの進行が直接に監視できるように、逆さに配置された光学顕微鏡の上方に置かれる。各種実験条件の結果は設計によって適時に評価できるので、細胞の融合及び／または細胞のボレーションの最適条件の設定には有用である。電極は、相互に等距離に維持されている限り、どのような様式にも配列することができる。好適な実施態様では、様式は櫛歯がらみ配列、同心円、２重螺旋などよりなっている。細胞ボレーション及び細胞融合用の他の好適な装置ｌＯは、第４図に示されている。この装置１０は受容量の細胞浮遊器を使用して光学顕微鏡により観察できるように設計されている。この装置はガラス板３４０間に挟まれた細胞浮遊器１９を有し、約０．３ｍの厚さのスペーサ３７により分離された２枚のガラス板３４より構成されている。実施態様の］一つでは、カバーが滑るような薄いガラス板が使用されている。電極２５は約０．５ｍｍ離れている２本の平行な白金線である。白金線の１ｉ極２５は強力発振器３１に接続している６強力発振器はＡＣ電界とパルスＲＦ電界のいずれも発振することができる。挿入管４１と取出し管４４は細胞を挿入し、電極の間の空間から細胞を取出すために使用される。細胞ボレーションと細胞融合とに間するこの発明の他の実施態様が第５図に示されている。この装置の目的は、非常に多量の浮遊している生体細胞、原形質体、バクテリア、酵母などの生体粒子をボレーションあるいは融合することである。この装置２０は使用、維持、清掃を容易にするために設計されている。細胞の浮遊器は非導電性の同情状容器１３内に収納されている。電極組立５０は絶縁性ハンドル４７へ取り付けられている。浮遊細胞をボレーションまたは融合するために、電極組立はハンドル４７を操作して細胞容器１３の中に下ろされる。電極２５は接続器４９により高出力発振器３１へ接続される。細胞融合用ＡＣ電界及び細胞ボレーション及び／または細胞融合用強力ＲＦパルスが電極組立５０内の電極２５により印加される。この装置２０において、電極組立５０は垂直な円筒５３であり、金属製電極２５は側面（すなわち、円筒面）に露出している。円筒は非導電性素材であれば、例えばガラス、プラスチック、テフロンなどどのような材料でもよい。電極組立５０が細胞容器１３の中に下ろされると、浮遊細胞１９は移動して、電極組立５０の周囲に浮遊細胞の薄い層を形成する。このようにして、細胞はすべて電極に接近する。電位が電極の間に印加されると、細胞は電界に露出する。を極組立５０の設計の一例が第６図に示されている。、２個の金属線または帯が巻きつけられて、２重螺旋状電極２５を形成している。螺旋は１個の螺旋が他の螺旋の間にあることを除いて、螺旋としては同一である。この２個の螺旋は同情状支持器５３に取り付けられている。２個の螺旋の間の間隔は、一定に保持されている。従って、電位が２個の金属線間に印加されると、２個の螺旋の間に発生する電界の大きさはその全長に沿って一様である。細胞ボレーション及び細胞融合用の電極組立５０の他の実施態様が第７図に示されている。ここで、電極組立５０は一定の厚さの非導電性絶縁スペーサ５３により分離された積み重ね状の金属製環状電極２５より構成されている。この環状電極２５は交互に一緒に接続されて２組の電極２５を形成している。次に。それぞれの電極は強力発振器の出力端子へ接続している。この環状電極内には、取付は部５６と線を他の電極２５へ通すための中空部５９がある。電極２５は円形である必要はなく、どのような形状であっても良い。使用できる形状には円形、第８図の矩形、楕円形がある。細胞ボレーション及び細胞融合のさらに他の実施態様が第９図に示されている。細胞浮遊器１９が非導電性容器１３に収納されている。電極組立５０は電極の位置を操作するために使用するハンドル４７に取り付けられている。前述の装置とは異なり、この実施態様の電極は電極組立５０の底部に露出している。このように、この装置は培養皿の底に付着した培養細胞をボレーション及び／または融合するのに特に有用である。　底ｎ接触電極組立５０の設計の一例が、第１０図に示されている。電極組立５０は金属帯の２個の渦巻きより構成しており、これは“接地”（−）と“高圧”　（＋）の電極２５である。２個の渦巻きは各渦巻きの間の間隔が一定に維持されているように配置されている。等間隔に配置することにより、２個の電極２５の間に印加された電界は電極組立により覆われた全領域に亘って確実に一様になる。螺旋設計のほかに、同心環、矩形、櫛歯がらみ配列、または楕円形を含む他の構造を使用することができる（参照　第１１図と第１２図）、これら環または形状は２つのグループに交互に接続している。この環または形状の１つのグループは。 “接地”　（−）端子に接続し、一方、その環または形状は強力発振器の“高圧 ”　（＋）端子へ接続している。環またはその形状の間の間隔は、隣接した環またはその形状の間に発生した電界強度が、全電極組立において一様であるように接続している。好適な実施態様において、電極の幅は、細胞浮遊器の深さより大きい。細胞ボレーション及び細胞融合に関するこの発明のその他の実施態様が第１３Ａ図、第１３Ｂ図、第１３Ｃ図に示されている。プローブ２０は少量の細胞浮遊用の細胞融合または遺伝子トランスフェクションを考慮している。プローブ２０は平底面の９６−ウェル細胞培養皿、例えばコーニング型式２５８６０に合っている。プローブ２０には２個の同軸電極２５がある。内側型ｗｉ２５　ａは無垢の円筒であり、外側電極２５ｂは中空管である。同軸電極２５は各種の導電性材料で製作することができる。好適な実施態様において、同軸電極２５はステンレススチール製である。同軸電極２５は好ましくはテフロンまたはプラスチック製の非導電性絶縁ホルダー５４に取り付けられる。内側電極２５ａと外側電極２５ｂとの間の空隙は約０．５〜２．　Ｏｍｍの範囲にある。好適な実施態様では電極２５の空隙は０．７ｍである。このプローブ２０によって、融合またはボレーションされるべき浮遊細胞の全量は約８０μｍであり、２０μｍ程度の少量の細胞浮遊まで細胞融合または細胞ボレーションを行うことが可能である。プローブ２０には、好ましくはテフロンの非導電性材料製のハンドル４７がある。保持装置５５は外側電極２５ｂを所定の位置に保持する。この設計にはいくつかの利点がある。細胞融合または細胞ボレーション用の少量の細胞浮遊の使用を考慮されているほかに、使用が簡単であり、非常にコストが安くなる効果がある。１個の細胞サンプルをトランスフェクションするために１キユーベツト（Ｃｕｖｅｔｔｅ）を必要とするたいていの市販の機械と異なり、このプローブは操作ウェル付の皿を使用して、多くの細胞のサンプルを連続的にトランスフェクションすることができる。細胞ボレーションと細胞融合に関するこの発明の他の実施態様が第１４図に示されている。この図は誘電伝導用のＡＣ電界と細胞ボレーションと細胞融合用強力ＲＦパルスのいずれも誘起する強力な発振器の構成図を示している。ＡＣ電界とＲＦ電界との間の切換えは水銀リレーによって行われる。ＲＦパルスは高周波発振器の出力をゲート制御して発振し、出力が２０ＫＷＯＭＯＳ型ＦＥＴの出力増幅器を通る。または、ＡＣ電界とパルスＲＦ電界は所要の電気波をデジタルコンピュータで合成し、出力増幅器を使用してこの波形を増幡することにより発振することができる。この実施態様の場合、プロトコルはコンピュータにより完全に制御されるので、切換えすｌ／−は不要である。このコンピュータ合成の強力発振器にはいくつかの利点がある。第１に、非常に複雑な波形は各種細胞の融合及び／′またはボレー・ジョンが最適になるように形成することができる。第２に、強ノｊ発振器が１つ以上のプロトコルまたは１Å以上の＝１−ザーにより使用される場合、各プロトコルはデータ記憶装置、例えば磁気ディスケットに記憶される。プロトコルは敏速に呼び出すことができるので、強ノ〕発振器は手動で変数をすべて再調整せずに、希望の波形を形成するためにプログラムが作り直される。第３に、そのコンピュータはデジタルオッシロスコープとして、細胞に印加された実際の電界を記録することができる。この記録はどのような特別な細胞融合または細胞ポレーションの実験の恒久記録として、データ記憶装置に保管される。過電流はそれにより発生する熱的作用とｐＨの変化のため、細胞に育害である。電界を印加中に、過電流と発生する作用の発生を避けるために、細胞の浮遊媒質は一般に低イオン強度の溶液である。非常に低濃度の塩分を含有していることが好ましい。代表的浮遊媒質は、０゜４ｍＭのＭｇアセタートとｔｌ、ＩｍＭのＣａアセタートよりなる１ｍＭの電解質を含有する。この媒質は緩衝されて、ｐＨは生理学上の範囲、例えばｐＨ＝７．５に維持される。生物学上のために一般に使用される緩衝剤、例えば、１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２ハイドロキシエチル −ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）は細胞ボレーションと細胞融合に適している。非電解質が添加されて、媒質の浸透性を余分な細胞の体液の浸透度程度に維持する。好適な実施態様では、サクロース及びマニトールのような比較的高分子量の細胞の不透過性炭水化物が、浸透性を維持するために使用される。数種類の細胞に関して、媒質中のイオン強度が僅かに高い場合、融合収量が改善されるように見える。例えば、人間の赤血球は３０ｍＭのＮａりん酸塩に容易に融合する。従って、この方法は、細胞の種類によって、０．１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲のイオン強度の浮遊媒質が使用される。細胞ボレー・ジョンと細胞融合に関するこの発明は多様な用途を持っている。　ＤＮＡ、　ＲＮＡ、有機化学薬品、無機化学薬品、薬剤、抗体、たんばく質、ホルモン、成長因子、酵素、放射性物質または蛍光物質付分子を含む生物学的活性物質は、一般に、細胞により容易には取りとげられない。この発明はこれらの生物学的活性物質を細胞内に転移する有効な方法を提供する。この発明の１つの実施態様では、細胞は強力なＲＦパルスを印加することにより、一時的に透過し、ボレーションされて、生物学的活性物質はそのポレーションの過程で細胞内に入る。ボレーショ〉・される細胞は生体細胞（動物、人間、植物の細胞を含む）、原形質体、バクテリア、または酵母である。この発明の他の実施態様では、生物学的活性物質は、活性物質を事前に付加された他の生体粒子により標的細胞を融合することにより、その細胞内に挿入される。この種の生体粒にはリポソームと赤血球ゴーストがあり、これらは標準的浸透衝撃及び透析法により、希望の物質を容易に付加される〔（シュレーゲル及びリーベル（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ　＆　Ｌｉｅｂｅｒ）、土ル　フュージョン　Ｃｅ１ｌ　Ｆｕｓｉｏｎ　、　Ａ、Ｅ、ソワーズ（Ｓａｖｅｒｓ）纂、プレナム　プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）　　（１９ｇ？）　）　＃　この標的細胞は生物学的活性物質を受容する細胞であればよく、これには分離された細胞、卵細胞、未発達の細胞、最初のまたは形質変換した培養細胞、ビトロ、の　ｉｎ　ｖＮｒｏ　　細胞がある。同様に、生物学的物質は生体細胞から摘出することができる８例えば、ホルモン、成長因子、酵素、たんばく質、核酸などの多くの分子は膜の障壁を越えることはできない。この発明のボレーション法を使用して、一時的細孔が細胞膜に生成される０次に、非透過性分子は細胞内に入る。この方法は生物学的分子を生成するために、細胞成長を採用している多種の工業では有用である。この方法により、細胞を殺す必要はなく、これの分子を摘出することができる。例　　　１異なる遺伝子を標的細胞内へ挿入するＲＦ電気ボレーション法の能率と効率は、培養された真核繊維状細胞列ＣＯ３Ｃ０３−Ｍ６（を使用して調べる。クロラムフェニコール　アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）　ＤＮＡは遺伝子の標識として使用された。バクチクリアのＣＡＴ　ＤＮＡは遺伝子副体の保有生物（ｐｓＶ２−ＣＡＴ）内に挿入された。ＣＡＴ酵素は乳頭状細胞、例えばＭ６、の中に内因的に生成されない。従って、標的細胞に組込まれたＣＡＴ遺伝子の量はトランスフェクション後に生成したＣＡＴ酵素の量を測定することにより調べられる。そのプロトコルは、連続した強力ＲＦパルス１０秒間隔で３回印加することであった。各連続パルスは５パルスよりなっている（周波数１００ＫＨｚ、電界強度２．５ＫＶ／ｃｍ、パルス幅０．５ｓｅｃ）。この発明のＲＦボレーションのプロトコルは、遺伝子トランスフェクションの非常に有効な方法である。遺伝子トランスフェクションの従来の方法、例えば、カルシウムりん酸塩法またはＤＥＡＥデキシトラン法では、各トランスフェクションに対し少なくとも５〜１０μｇの遺伝子副体ＤＮＡが通常必要である。ＤＣパルスを使用した以前の電気ボレーション法では、さらに多量のＤＮＡ　（一般に、１０〜４０μｇ）が必要であった〔アンスベル（Ａｒｉｓｕｂｅｌ）他、カレント　プロトカル　イン　モレキュラー　バイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃａｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｉｏｇｙ）　、ジョン　ウィリー及ソング、　１９８８〕。この発明のＲＦボレーション法を使用して、ＣＡＴ　ＤＮＡを僅か０．１μｇでＭ６細胞をトランスフェクションした場合、ＣＡＴの活動度（２５μｇのたんばく質あたりアセチル置換７６％）は高水準であった。さらに、Ｍ６細胞を０．Ｏ１μｇのＣＡＴ　ＤＮＡでトランスフェクションした場合、たんばく質２５、ｇあたりアセチル置換】０．６％が観測された。このように、ＲＦボレーション法は遺伝子トランスフェクションの効率が非常に高いことが明らかである。この改善された効率によって、ＤＮＡを製造するに必要な労力と材料を非常に節減するだけでなく、前にトランスフェクションが困難であった細胞のトランスフェクションが可能となる。ＲＦボレーション法の他の利点は、遺伝子トランスフェクションに必要とされる細胞が非常に少ないことである。従来の化学的方法とＤＣ電気ポレーション法は、一般に、１回のトランスフェクションを行うために、２〜１０　Ｘ　１００万個の細胞が必要である。ＲＦ法によってＭ６細胞は、０．１　ｘ　１００万個の少ない細胞を使用して、非常に効率よ＜　ＣＡＴ遺伝子でトランスフェクションした。さらに、実験は、一層少ない細胞（ＩＸＩＯ’万個）でも使用できることを示した。最近では、最小細胞数が、ＣＡＴの分析評価を行うに必要な細胞たんばく質の全量に制約されており、トランスフェクションする能力には制約されていない（一般に、細胞たんばく質の全量２５μｇがＣＡＴ反応に対し必要である）。例　　　２ＲＦボレーション法はその特有の能力により、細胞を少量で効率良くトランスフェクションするので、この方法は、遺伝子治療の開発に特に有用である。多くの病気は、遺伝子の欠陥により起ることが知られている。このような病気は、治療遺伝子を人間の細胞、例えば骨髄の細胞に挿入し、その後、その細胞を人体に移植して治療することができる。例えば、鎌状赤血球貧血の患者は、正常でないヘモグロビンを作り出す欠陥のある遺伝子を持っている。このような遺伝子病を治療するために骨髄の幹細胞が摘出され、正常なヘモグロビンの遺伝子でトランスフェクションされる。トランスフェクションされた幹細胞は患者に移植される。適切な保菌生体により、正常な遺伝子はゲノム内に安定して融和し、患者は正常なヘモグロビンを作ることができる。この治療の重要な段階は、骨髄を正常な遺伝子でトランスフェクションすることである。摘出される幹細胞の数は比較的に少ないので、非常に少数の細胞に適している高効率な遺伝子トランスフェクション法が必要である。ＲＦパルスを使用したボレーションのこの発明の方法は、特にこの能力を持っている。従って、この方法は、遺伝子治療に対し非常に有用である。遺伝子治療に対するこの方法の有用性は、鎌状赤血球貧血に限られるものでない。この方法は多くの遺伝子病を治療するため、正常な遺伝子を人間の細胞に挿入することに使用できる。他の例には、血友病患者を治療するため、血液凝固因子 ■の遺伝子を骨髄の幹細胞内に導入；糖尿病を治療するため、インシュリンの遺伝子を膵臓細胞群の細胞または他の人間の細胞に導入；高コレステロール血症患者の血流内のコレステロール濃度を下げるため、人間のＬＤＬ（低濃度脂たんばく質）の受容体の遺伝子を肝臓の細胞または他の人間の細胞内に導入；成長の欠陥を直すため、人間の成長ホルモンを人間の細胞内に導入などがある。このように、遺伝子病を治療するため、遺伝子を人間の細胞内に挿入する方法を使用する可能性は限られていない。例　　　３ＲＦ電界による電気ボレーションの過程における細胞膜の形態学上の変化人間の赤血球がＲＦパルスに露出されて僅か１秒後、赤血球は液体窒素により冷却された液体フレオンの中で急速に凍結した。細胞膜の構造は、冷凍破面電子顕微鏡を使用して調べた。第１５図に、電子顕微鏡写真が、３回のＲＦパルス（４，０ＯＫＨｚ、４０μｓｅｃ幅、５ＫＶ／ｃｍ電界強度）が印加された後の赤血球の表面の構造を示している。直径が０．１〜０．３μｍの膜の細孔が明確に見える。細孔は十分に大きく、ＤＮＡの大きい部片が細胞外媒質から細胞内へ容易に拡散できる。このように、印加したＲＦ電界が細胞の表面に大きい孔を誘起するという明確な証拠がある。この形態上の証拠は、この発明の方法が細胞外の遺伝子による細胞のトランスフェクションを行うために膜ポレーションを誘起することに有効であること、をはっきりと示している。例　　　４この発明が、従来のＤＣ電気融合法より優れているという利点を示す一例は、人間の赤血球の融合に見られた。融合作用は、少数の浮遊細胞の膜を親脂性螢光色素、例えば、１．１′−ダイヘクサデシル−３，３，３’、３’−テトラメチレンドカーボシアニン塩素酸塩で標識付けをすることにより、分析評価された。細胞は螢光顕微鏡により観測された。ＲＦパルスを印加する前は、予め標識付けされた細胞が螢光色の像として見えるだけで、分離した細胞に見えた（第１６Ａ図参照）。細胞がパルスＰ、Ｆ電界に露出された後、標識付けされない細胞は標識付けされた細胞と融合を始め、色素は標識付けされた細胞から標識付けされない細胞へ次第に移った。その結果、どちらの細胞も標識付けされた状態になった。この融合過程は、ＲＦパルスの印加に続いて、数分間を要しただけであった。２種類の細胞融合が、この実験で観測された。すなわち、（１）膜融合、この場合、螢光色素が標識付けされた細胞から標識付けされない細胞へ転移したが、この２個の細胞はその細胞質を合体していない；（２）細胞質融合、この場合は、融合している細胞が合体して、単一の大きい細胞を形成する。細胞質融合を経た細胞の割合は、印加ＲＦ電界の発振周波数に強く依存する。各種周波数のＲＦパルスが印加された後の融合収量は第１７図に示されている。融合細胞の最高収量は印加ＲＦ電界が１００ＫＨｚで振動している時に得られた。融合収量は周波数があまりに高いか、低い場合、非常に低い量に低下する。印加電界がＲＦパルスと同じパルス振幅とパルス幅のＤＣパルスの形である場合、細胞質の融合は検出されなかった。これらの結果は、この発明のＲＦパルス法がＤＣパルス法より細胞融合の誘起にははるかに有効であること、をはっきりと示している。ＤＣ電気融合法より侵れているこの発明の利点の他の例は、人間の赤血球を人間の白血病の培養細胞列、ＨＬ　−６０、で融合仁る場合である。この２種類の細胞の融合は、ＤＣパルス法を使用しては得られなかった。この失敗は多分、細胞の大きさの差によるものであろう、つまり、赤血球はＨＬ−６０細胞よりかなり小さい。しかし、螢光色素による評価分析とこの発明のパルスＲＦ電界を使用して、ＨＬ−６０細胞との赤血球の融合を得ることができた８例　　　５ＲＦパルス法は、雑種細胞を作り出すため、細胞の融合に使用中ることができる。金魚の顔料細胞（黄色素細胞）は魚の皮の細胞から摘出ｌ−だ腫瘍細胞列と融合した。黄色素細胞は組込まれた組織化学的標ｆｆ１（カロチノイドの小滴）を持っているので、着色されない腫瘍細胞との融合を分析評価することは比較的に容易である。第１８図は黄色素と皮の腫瘍細胞の融合の連続した段階を示す。第１８図において、細胞は誘電伝導により密着した。ＲＦ電極（幅４０μ５ｅＣ１周波数４００ＫＨｚ、電界強度３．ｏｖ／ａｍ）の３パルスが、次に印加された。２分以内に、２個の細胞の細胞質が合体し始めた（第１８Ｂ図参照）、４分後に、細胞は、単一の大きい細胞に完全に合体したく第１８Ｃ図）。ＲＦパルス法による雑種細胞形成の重要な用途は、抗体、特に人間の単クローン性抗体を作ることである。この場合、融合される生体粒子には抗体を作る細胞（例えば、リンパ球Ｂ細胞）と連続的に分裂する細胞（例えば、がん細胞）がある。選択過程を経て生成された雑種細胞は、特定の単クローン性抗体を作るために培養することができる。当技術に熟練した者は、この発明が本来のものの他に、口約を実行し２、前述の目標と利点を得るに良く適合されるごどを容易に理解するであろう。ここに記載された装置、方法、手順、技術は、好適な実施態をここに代表するものであり、模範とするものであって、適用の範囲とするものではない。変更及び他の用途は、この発明の精神の以内に包含されるか、あるいは、添付請求の範囲に定義されている技術の熟練者に管芯されるであろう。ＦＩＧ、　１５Ｆ／（３，／６細胞質融合％１）訃　還　存　報　失矛１＋、＋〜、、、−、、、＋＋、、、、、−＋、−ＰＣＴ／ｌｌＳ　ｌｌｌＲ１０３４Ｒ７ＳＡ　　　　２５３２１

Claims

【特許請求の範囲】

１．複数の生体粒子を電極の間に配置し、パルス高周波数の振動電界を前記電極の間に印加する段階よりなる生体粒子のポレーションまたは透過を行うための方法。
２．前記生体粒子が動物の細胞、人間の細胞、植物の細胞、原形質体、バクテリア、酵母よりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。
３．化学薬品または生物的活性分子を生体粒子に注入するために、前記化学薬品または生物的活性分子がＤＮＡ，ＲＮＡ、抗体、たんぱく質、薬剤、ホルモン、成長因子、酵素、有機化学薬品、無機化学薬品よりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。
４．生体粒子から分子を摘出するために、前記分子がたんぱく質、核酸、ホルモン、成長因子、酵素、他の生物的活性分子よりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の方法。
５．前記パルス高周波電界が約１０ＫＨｚから１００ＨＨｚの周波数範囲、約１ μｓｅｃから１０ｍｓｅｃのパルス幅範囲、約１ＫＶ／ｃｍから２０ＫＶ／ｃｍのパルス振幅範囲より構成されている請求の範囲第１項に記載の方法。
６．前記パルスが単一パルス、パルス列、多重パルス列よりなる群から選択される請求の範囲第５項に記載の方法。
７．前記パルス高周波の振動電界が約０．０２から１０ＭＨｚの周波数、約２０から２０００μｓｅｃのパルス幅、２から１０ＫＶ／ｃｍのパルス振幅より構成されている請求の範囲第１項に記載の方法。
８．前記パルス高周波の振動電界が種々の波形により構成されている請求の範囲第１項に記載の方法。
９．複数の生体粒子を電極の間の溶液中に配置し、前記粒子を極めて接近させて位置せしめ、パルス高周波の振動電界を前記電極の間に印加することにより前記生体粒子を融合する段階よりなる生体粒子を融合するための方法。
１０．前記位置設定段階が浮遊した生体粒子を集合せしめる容器内に前記生体粒子を配置することよりなっている請求の範囲第９項に記載の方法。
１１．前記位置設定段階が前記粒子を極めて接近させるため前記電極の間に交流電界を印加することよりなっている請求の範囲第９項に記載の方法。
１２．前記交流電界の印加が前記融合段階の前後に起こる請求の範囲第１１項に記載の方法。
１３．前記生体粒子が、標的細胞と、化学薬品と分子とを細胞内に誘導するための化学薬品と分子が事前に付加されている粒子とよりなっている請求の範囲第９項に記載の方法。
１４．前記化学薬品と分子が事前に付加されている前記粒子が赤血球ゴースト、リボソーム、小胞、分離した細胞、培養された細胞よりなる群から選択され、かつ前記標的細胞が、動物の細胞、人間の細胞、植物の細胞、バクテリア、酵母よりなる群から選択される請求の範囲第１３項に記載の方法。
１５．前記化学薬品と分子が抗体、たんぱく質、薬剤、分子プローブ（ｐｒｏｂｅ）、ホルモン、成長因子、ＤＮＡ，ＲＮＡ、酵素、有機化学薬品、無機化学薬品よりなる群から選択される請求の範囲第１３項に記載の方法。
１６．前記生体粒子が少なくとも２種類の異なる種よりなっている請求の範囲第９項に記載の方法。
１７．前記生体粒子が抗体を生成する細胞と連続的に分裂するがん細胞よりなっている請求の範囲第９項に記載の方法。
１８．前記生体粒子が過度免疫のネズミの脾臓細胞と骨髄腫細胞よりなついる請求の範囲第９項に記載の方法。
１９．前記生体粒子が人間のリンパ球と人間のがん細胞よりなっている請求の範囲第９項に記載の方法。
２０．前記生体粒子が少なくとも異なる２種類の細胞よりなついる請求の範囲第９項に記載の方法。
２１．複数の生体粒子を電極の間の溶液中に配置し、前記生体粒子が動物の細胞、人間の細胞、植物の細胞、小胞、赤血球ゴースト、リボソーム、原形質体、バクテリア、酵母よりなる群から選択され、前記粒子を誘導伝導により極めて接近させるために、低振幅交流電界を前記電極の間に設け、前記電界が約６０Ｈｚから約１００ＭＨｚの周波数範囲と約１００から８００Ｖ／ｃｍの電界強度を有しており、前記粒子を融合するために、パルスの単一または多重周波数の振動電界を前記電極の間に印加し、前記高周波振動電界が約１０ＫＨｚから１００ＭＨｚの周波数範囲、約１μｓｅｃから１０ｍｓｅｃのパルス幅、約１ＫＶ／ｃｍから２０ＫＶ／ｃｍのパルス振幅よりなっており、かつ前記粒子を融合のため極めて接近させるために交流電界を的証電極の間に設け、前電界が約６０Ｈｚから約１０ＭＨｚの周波数、約１００Ｖ／ｃｍから８００Ｖ／ｃｍの電界強度を有している段階よりなり、生体粒子を融合するための方法。
２２．抗体生成細胞とがん細胞を電極の間の溶液中に浮遊させ、細胞を誘電伝導的に移動させて、電界が真珠の鎖を形成する交流電界を設け、高出力のパルス高周波の振動電界を前記電極の間に印加する段階よりなり、物質の組成として、抗体生成細胞を連続分裂のがん細胞と融合させるための方法により生成された雑種細胞。
２３．前記抗体生成細胞が過度免疫のネズミ脾臓細胞であり、がん細胞が骨髄腫細胞である請求の範囲第２２項に記載の雑種細胞。
２４．前記抗体生成細胞が人間のリンパ球であり、がん細胞が人間の細胞線である請求の範囲第２２項に記載の雑種細胞。
２５．複数の生体粒子を電極間の異種遺伝子を含有する溶液中に配置し、かつパルス高周波の振動電界を前記電極の間に印加する段階よりなり、異種遺伝子を生体粒子に挿入する方法。
２６．前記パルス高周波が約１０ＫＨｚから１０ＭＨｚの周波数範囲、約１０μ ｓｅｃから１０ｍｓｅｃのパルス幅範囲、約１から２０ＫＶ／ｃｍのパルス振幅よりなっており、前記生体粒子が人間の細胞、動物の細胞、植物の細胞、原形質体、バクテリア、酵母よりなる群から選択される請求の範囲第２５項に記載の方法。
２７．請求の範囲第２５項により、遺伝子をビトロ状で細胞内に挿入し、この挿入された遺伝子を有する前記細胞を遺伝子欠陥のある生体内に移植する段階よりなる遺伝子病を治療する方法。
２８．生体が人間である請求の範囲第２７項に記載の方法。
２９．遺伝子が挿入されている細胞が挿入の段階の前に、遺伝子欠陥を有する生体から摘出される請求の範囲第２７項に記載の方法。
３０．遺伝子病が鎌状赤血球貧血病であり、該細胞が骨髄幹細胞であり、該遺伝子が該正常なヘモグロビン遺伝子である請求の範囲第２７項に記載の方法。
３１．遺伝子病が血友病、糖尿病、高コレステロール血病、生長病よりなる群から選択され、細胞が骨髄幹細胞、膵臓インシュリン細胞、肝臓細胞、他の人間の細胞よりなる群から選択され、遺伝子が正常な血液凝固因子ＶＩＩＩの遺伝子、正常なインシュリン遺伝子、正常な低濃度脂たんぱく質レセプター遺伝子、成長ホルモン遺伝子よりなる群から選択される請求の範囲第２７項に記載の方法。
３２．前記細胞が骨髄幹細胞である請求の範囲第２７項に記載の方法。
３３．液体を保持できる非導電性材料よりなる容器、この容器が前記生体粒子を取り出すための操作口を有し、前記容器内に相互に等距離に位置した電極、パルス高周波電界よりなる電界を印加するための前記電極に取り付けられた強力な発振器よりなる生体粒子のポレーションと融合のための装置。
３４．前記容器が生体粒子を重力により集合せしめることができる形状を有する請求の範囲第３３項に記載の装置。
３５．前記高周波がパルス高周波振動量界であり、かつ約１０ＫＨｚから１００ＭＨｚの周波数範囲、約１μｓｅｃから１０ｍｓｅｃのパルス幅範囲、約１ＫＶ／ｃｍから２０ＫＶ／ｃｍのパルス振幅範囲よりなっている請求の範囲第３３項に記載の装置。
３６．前記発振器がその他に前記生体粒子を融合のために極めて接近させるための連続的低出力交流電流を供給する能力を有している請求の範囲第３３項に記載の装置。
３７．低出力交流電流が約６０Ｈｚから１０ＭＨｚの周波数範囲、約１００Ｖ／ｃｍから８００Ｖ／ｃｍの電界強度よりなっている請求の範囲第３６項に記載の装置。
３８．透明な底部を有する容器と、容器内に挿入された電極、前記電極が相互に等距離にあり、かつ少なくとも１０マイクロリッターの細胞が電極に密着する様式で配置され、高周波の電界を印加するための前記電極に接続した高出力発振器とよりなり、生体粒子のポレーションと融合とを光学顕微鏡による観察のための装置。
３９．前記装置を操作するための非導電性材のハンドルと、相互に等距離に位置し、前記ハンドルに取り付けられた電極と、この電極を高出力発振器へ取り付けるための接続手段とよりなり、生体粒子の細胞ポレーションと融合のための装置。
４０．前記電極が２重螺旋状に非導電性コアの回りに巻き付けられている請求の範囲第３９項に記載の装置。
４１．前記電極が分割された形の部分と、前記分割された形の部分を分離するための絶縁空間とより構成されている請求の範囲第３９項に記載の装置。
４２．前記電極が螺旋、同心環、同心方形、平行板、櫛歯がらみ配列よりなる群から選択された底面接触の電極である請求の範囲第３９項に記載の装置。
４３．前記電極が同軸状で、約０．５から２．０ｍｍ離れており、約０．５から３ｃｍの長さと、多数の凹部のある培養皿の凹部に入れるために十分に小さい直径とを有する請求の範囲第３９項に記載の装置。
４４．高周波発振器の出力をゲート制御するためのゲート回路と高周波発振器の制御出力から高出力ＲＦパルスを発生するための出力増幅器より構成されているＲＦパルス発振器と、交流電界発振器と、ＲＦパルスと交流電界とを切換えるための水銀スイッチとより構成されている高出力発振器。
４５．ＲＦ波形とＡＣ波形とを合成し発生するためのデジタルコンピュータと、このデジタルコンピュータにより形成された波形を高出力波形へ変換するための増幅器と、電界を生体粒子に印加するための前記増幅器と接続している電極とよりなる細胞ポレーションと細胞融合のための装置。
４６．情報記憶装置をその他に有する請求の範囲第４５項に記載の装置。