JPH03502402A - 冷凍食品などの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「冷凍食品などの製造」 ３男９背量 本発明は食品とその他生物製品の冷凍製品製造に関するものである。

これまで、食品やその他生物製品を上首尾に凍結するには、過冷却の問題を避け るために、食品など製品の理論的凍結温度よりかなり低い温度で凍結操作を行わ ねばならなかった。過冷却は食品やその他生物製品の細胞内および細胞外の水に 生じ、満足のいく冷凍が行えなくなる。過冷却の程度は実質的にそれぞれ異なる ため、食品凍結装置を操作する人は過冷却の危険を避けるべく凍結装置の温度を 一４０℃まで下げる。さらに、このような操作では、凍結する食品あるいは他の 生物製品は過冷却の問題が起こらないようにするため、通常上記のような低温で かなり長時間保つ。このように長時間、低温を保持することはエネルギーコ界ト が極めて高くつくばかりでなく、冷凍食品中で氷結晶が大きくなり、ひいては冷 凍食品の官能的あるいは組織学的品質の劣化を招（ことになる。同様に、もし凍 結中に過冷却状態が生じると、解凍時のドリップ量が増加する。ドリップ量は冷 凍製品品質の指標とされている。通常の操作では、製品を急速に冷凍することに よって、過冷却による氷結晶の成長を防止している。その他の方法としては、ア イスクリームでは乳化剤、あるいは他の製品ではグリセロールや糖をはじめとし た冷凍防止材を用いる。しかし、このような解決策には極めて低い温度を用いる ため、多量のエネルギーを必要とする。

各種細菌が生成する特殊な氷核形成因子の氷結晶生成に及ぼす効果は、スキー場 での人工雪の製造、栽培植物の霜害に果たす役割の面から最近注目されている。

特に、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ ）の氷核形成については詳しく報告されている（例：マキ　他、応用細菌学、　 １９７４年９月、　ｐ、　４５６参照）。栽培植物の霜害をもたらすシュードモ ナス・シリンゲあるいはこの細菌が生成するタンパク質の果たす役割が最近特に 研究されている（例ニリンドウ、植物病、　１９８３年３月、ｐ、３２７参照） 。氷核形成タンパク質の合成をつかさどる遺伝子を除去したシュードモナス・シ リンゲのミュータントを大気中での実験に用いて良いか否かの議論が成されてい る。これらミュータントを植物体に天然に存在するシュードモナス・シリンゲと 競合させ、氷核を形成するシュードモナス・シリンゲ数を減少させるのが目的で ある（例ニリンドウ他植物病理学　ｖｏｌ、　７６、　Ｎｏ、　１０．　ｐ、　 １０６９．アブストラクト９５　　（１９８６）参照）。

類似した氷核形成能は、エルウィニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｆａ　ｈｅｒ ｂｉｃｏｌａ）　（例ニリンドウ他、植物病理学　Ｖｏｌ、７３１０９７−１１ ０６　（１９８３）　、コゾロフ他、細菌学雑糺Ｊａｎ、　１９８３．　ｐ、　 ２２２−２３１参照）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ ｓ）　（例：ペルブス龜細菌学雑誌１９８６年８月、　　ｐ、４９６−５０２、 コロット他、　ＥＭＢＯジャーナル　５２３１−２３６　（１９８６））、ザン トモナス・カンへストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ） 　　（プリー、シャイル、植物病理学７６　（１０）　ｐ、１１１７　（１９８ Ｂ））　、シュードモナス・ヴイリドフラヴア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖｉ ｒｊｄｆｌａｖａ）　　（ボーリン他、　Ｐｒｏｃ、植物病原菌に関する第４回 国際会議　Ｖｏｌ、　２１ＮＲＡ　Ｂｅａｕｃｏａｚｅ　Ｆｒａｎｃｅ　１９７ ８　Ｖｏｌ、　２　ｐ、　７２５−７３１及びアンダーンン、アシュワース、植 物生理学、Ｖｏｌ、８０　ｐ、９５６−９６０　（１９８６））をはじめとした いくつかの微生物でも報告されている。

氷核形成にたずされるこれら微生物の特異な遺伝子あるいはタンパク質について は、数多くの報告がある。例えば、グリーンとワーナーは「自然Ｊ　３１７　ｐ 、６４５　（１９８５）でシュードモナス・シリンゲからの氷核形成遺伝子の配 列を決定し、それを１ｎａＺと呼んでいる。この遺伝子にはＧＣＣＧＧＴＴＡＴ ＧＧＣＡＧＣＡＣＧＣＴＧＡＣＣという配列単位がいくつか反復して存在し、全 体数は４４５８である。彼らはさらに１ｎａＺの断片を削除し、これをエシェリ キア・コリに組み入れることにより氷核形成タンパク質を生成する遺伝子の能力 に変化が現れるかを調べた。その結果、多くの場合氷核形成能は保持されること が判明した。

コロツティらは、ＥＭＢＯジャーナル５　ｐ、　２３１−２３６（１９８６）に 氷核形成能をエシェリキア・コリに伝達できる７５　ＫｈのＤＮＡ断片を蛍光菌 から得たことを報告している。彼らはこの遺伝子をｊｎａＷと呼んだ。さらに、 ｊｎａＷミュータントの活性を調べ、特定の３．９ｋｂ配列に挿入すると遺伝子 の活性が変化することを明らかにし、遺伝子によって生成される分子量約１８０ Ｋｄのタンパク質がエシェリキア・コリに氷核形成質（ＩＮＡ”　）を賦与する のに必要であると結論している。

コズロフらは、細菌学雑誌１５３　ｐ、　２２２−２３ＨＩ９８３）で、シュー ドモナス・シリンゲとエルウィニア・ヘルビコーラの氷核形成能はそれらの細胞 壁上にある核形成部位の存在に起因すると推定している。彼らの結果によると、 シュードモナス・シリンゲには細胞あたり４−８個、エルウィニア・ヘルビコー ラには細胞あたり２個の部位があるらしい。

コズロフらはさらに「科学４２２６８４５−８４６（１９８４）にシュードモナ ス・シリンゲとエルウィニア・ヘルビコーラの氷核形成部位には脂質のホスファ チジルイノシトールとタンパク質が存在することを示唆している。

現在、これら仮説になんら疑問は出てきていない。

ウォブラーらは、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｉ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　 ８３７２５６−７２６０（１９８６）に、シュードモナス・シリンゲから得た１ ｎａ２遺伝子を含むプラスミドを組み込んだエシェリキア・コリから氷核形成タ ンパク質を単離したと報告している。このタンパク質（ｐ　１５３）の見かけ上 の分子量は１５３ｋｄであった。

ｐ１５３のアミノ酸含有量は１ｎａＺから予想されるものと極めて類似し、さら にｐ１５３の末端配列（Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌ ｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−）は１ｎａＺ遺伝子のコードから予想される配列と一致 した。彼らは次に、シュードモナス・シリンゲ１ｎａＺ遺伝子を用いた同様の技 法によって得たｐ　ｔｓ。

タンパク質が１ｎａＺ遺伝子を用いて得たｐ１５３と類似した配列と構造を有し ていたと報告している。ＩＮＡ＋形質はこのようなタンパク質によってシュード モナス・シリンゲや蛍光菌に賦与され、またこれらタンパク質はコゾロフがその 存在を不可欠としたリン脂質がなくても氷核形成テンプレート（型板）として働 くことも示唆されている。

生物物理学雑誌　４９２９３ａ（１９８６）に、ウォブラーとワーナーはシュー ドモナス・シリンゲから得た氷核形成タンパク質において、配列の大部分は８． １６．４８個のアミノ酸の繰り返しが組み合わされていることを報告している。

二次構造は４８のアミノ酸ユニットあたり５−６の屈折によって中断される繰り 返しの配列を持つβ−構造である。タンパク質は４８のアミノ酸の繰り返しから 成る通常の構造に折り畳まれ、この構造が氷格子に似た水素結合の側鎖を持って いると言われている。

ベルブスらは、細菌学雑誌１６７　ｐ、　１９６（１９８６）にエルウィニア・ ヘルビコーラから得た氷核形成物質はタンパク質の性質を有し、また氷核形成因 子は外膜の残渣から得ることができ、このような因子は−２〜−１０℃の温度範 囲で水の核化をもたらすことを報告している。マキノは氷核形成活性をシュード モナス−７−ジナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｒｉｇｉｎａｌｉｓ）に 見い出したが、シュードモナス・シリンゲはど強くないことをＡｎｎ、　Ｐｈｙ ｔｏｐａｔｈ、　Ｓｏｃ、　Ｊａｐａｎ　４８４５２−４５７（１９８２）に報 告している。

上記のような氷核形成細菌に関する研究の他に、他の生物における氷核形成能に ついても研究されている。Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　４５２６１ −７０（１０８３）にデスマンとホーワスは、細胞外液をかなり高い温度で凍結 して細胞内液の凍結の危険性を減少させ過冷却を防ぐことによって、かぶと虫に 耐寒性を賦与するかぶと生血リンパ中にある氷核形成タンパク質の役割について 解説している。このようなタンパク質はヴエスブラ（Ｖｅｓｐｕｌａ）に３−６ 種、プントロイデス（Ｄｅｎｄｒｏ　１ｄｅｓ）に１−２種存在することが報告 されている。ヴエスプラ・マキュララ（Ｖｅｓｐｕｌａ　ｍａｃｕｌａｌａ）に よって生成される氷核形成タンパク質の性質はデスマンらが研究して、比較生理 学雑誌Ｂ　１５４７９−８３（１９８４）に発表している。

海洋性渦鞭毛虫であるヘテロカブシア・ニエイ（Ｈｅｔｅｒｏｃａｐｓｉａ　ｎ ｆｅｉ）が生成する氷核形成因子については、フォールとシェネルが海洋研究雑 誌　ＶｏＪ、　４３　ｐ、　２５７−２６５（１９８５）に報告している。

タンパク質食品の組織化をもたらすために、ＩＮＡ＋形質を有する細菌エルウィ ニア　アナカス（Ｅｒｗｉｎｉａ　ａｎａｎａｓ）を使用することは、アライと ワタナベが「農業と生物物理学Ｊ　　５０．１６９−１７５（１９８６）に発表 している。彼らは、異方性の組織化製品を生産するため、タンパク質や多糖質の 水分散液あるいは水性ゲルに細胞を添加し、バルク水を一５〜０℃で方向性のそ ろった氷結晶に返還している。このような製品は、生の卵白。

牛血液、大豆カード、牛乳カード、大豆分離タンパク質の水分散液あるいはゲル 、寒天ゲル、トウモロコシでん粉糊、グルコマンナンやカルシウムグルコマンナ ンのゲルを用いて作る。これら製品は、細菌細胞の存在下で空気浴中で一５℃ま で緩慢に冷却する。次いでスチームによってフレークのような組織とする前に、 −３０℃で真空凍結乾燥する。フレークの層に垂直にスライスすると、繊維状の 製品が得られる。

氷核形成形質（ＩＮＡ　”）は、ここでは−２０℃以上の温度で過冷却水の核化 をもたらす能力を有することを意味する。例えばマキノ（Ａｎｎ、　Ｐｈｙｔｏ ｐａｔｈ、　Ｓｏｃ、　Ｊａｐａｎ　Ｖｏｌ、　４８　ｐ、　４５２−４５７（ １９８２））によると、Ｐ、　ｓｙｒｉｎｇａｅ　ＰＶ　ｐｉｓｉの核化温度は −２゜９℃である。

ここで使う「無害微生物」という言葉は、氷核形成補助のために使用したこのよ うな微生物の通常使用量を人間が摂取した際、何ら悪影響をもたらさないことを 意味する。

発明９！約 本発明の目的は、食品あるいはその他生物製品を保存するための凍結方法にあり 、具体的にはＩＮＡ＋形質を有する無害微生物あるいはそれら微生物から得た氷 核形成因子もしくは同等の機能を有する因子を、対象の食品あるいは生物製品に 添加し、過剰の過冷却を伴わずに凍結を行い、凍結に要するエネルギーを少なく することにある。

さらに、食品あるいはその他生物製品の凍結に要する時間を短縮させることにも 本発明の目的がある。

食品や他の生物製品の凍結にあたって、０〜−５℃の温度域において試料が凍結 される時間をできるだけ短くすることが望ましいと考えられている。これはこの 温度域で、品質を劣化させる酵素の多くが特に活性に富んでいるためである。こ れら温度に長時間曝される危険性を最小とするために、食品やその他生物製品の 凍結時間を一貫させることにも本発明の目的がある。

さらに本発明の目的には、例えば魚肉や畜肉フィシ（骨なし切身）において、筋 肉組織で細胞内凍結が起こる過冷却を防止することにより、冷凍食品の品質改善 の手段とすることにもある。

温度変化が製品品質の劣化をもたらすような冷凍製品の安定性を向上させ、ひい てはこのような製品のシェルフライフを延ばし、フリーザーの使用温度を高（で きる利点も本発明は有する。

それゆえに、−面として本発明は固形食品やその他生物製品を凍結する方法で、 すなわちＩＮＡ＋形質を持つ無害微生物あるいはこれら微生物から得た氷核形成 因子もしくは機能的に同等の因子を添加し、凍結するために温度を下げる方法で ある。

もう−面として、本発明は固形食品やその他生物製品を凍結する方法で、ＩＮＡ ＋形質を持つ無害微生物あるいはこれら微生物から得た氷核形成因子もしくは機 能的に同等の因子を添加し、大気圧下で凍結するために温度を低下させ、その後 それ以上の加工段階を踏まずに対象製品を低温下に保存する方法である。

いずれの理論に拘束されることなく、ＩＮＡ＋形質を有する微生物によって生成 される氷核形成因子はおそらくタンパク質であると信じる。

区面９固巣笠税咀 第１は説明に必要な理論的凍結曲線である。

第２は未処理および本発明に基づいて処理した魚筋肉の凍結曲線である。

旦咄包靭鈎１朋 ＩＮＡ＋形質を持つ無害微生物には、例えばエルウィニア　アナナス。

エルウィニア・ヘルビコーラ、シュードモナス・シリンゲ、蛍光菌のような天然 の細菌がある。さらに食品に天然に存在する他の無害細菌も含み、それらには、 シュードモナス・シリンゲあるいは蛍光菌から得た１ｎａＺまたは１ｎａＷ遺伝 子、ＩＮＡ＋形質を有する他の微生物の氷核形成遺伝子を含むプラスミド、ある いは氷核形成サブユニットまたはそれと同等の合成遺伝子やサブユニットを組み 込んだブルガリア乳酸棹菌（Ｌａｃｔｏｂａｃ１１１ｕｓ　ｂｕｌｇａｒｉｃｕ ｓ）　、好酸性乳酸挿画（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈＬＩｕ ｓ）のような乳酸挿画（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）類、さらに乳酸連鎖球菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｉａｃｔｕｓ）　＋好熱連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｆｌｕｓ）のような連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ）類も該当する。このようなプラスミドを作り出す適正な方法 は、例えばグリーンやワーナー（前掲）並びにウォブラ−（前掲）によって報告 されている。適正な細菌にこのようなプラスミドを組み込んだり、このような細 菌のクローニングは遺伝子工学の標準的手法による。酵母のような成熟核細胞を 有する微生物にこのような遺伝子を組み込むことも可能である。数多くの酵母が 天然に食品や生物製品に存在する。このような酵母には麦酒酵母菌（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｊｓｉａｅ）　、サツカロミセス・カーシェイゲ ンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｃａｒｌｓｈｅｉｇｅｎｓｉｓ）、　　 サツカロミセス−ｏゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｉ）、サツカロ ミセス−ｏクシ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉυ、　サツカロミ セス・ウクサラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｘａｒｕｍ）のような各種 酵母菌属Ｃ５ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅＳ）を含む。このような酵母にＩＮＡ＋形 質を賦与するために遺伝子を組み込むことは、ＩＮＡ＋形質を与える遺伝子を持 つプラスミドシャトルベクターを用いる標準操作、あるいは酵母細胞壁の除去を 伴う集約的ＤＮＡ転移、ポリエチレングリコール存在下でＩＮＡ＋形質の遺伝コ ードを持つＤＮＡ断片の付加とそれによる細胞壁の再生によって行える。

食品中に微生物が生きたあるいは死んだ状態で存在するように、ＩＮＡ“形質を もつ微生物を生きた状態で食品に使用することも可能である。

微生物を例えば加熱処理により使用前に殺す場合、氷核形成因子を変性もしくは 不活性化させるような厳しい条件は避けるようにしなくてはならない。例えば、 微生物懸濁液の加熱は沸騰温度近辺が適当であろう。

この他に、本発明工程において氷核形成タンパク質自体も使用できる。

このようなタンパク質は上述微生物から単離できるし、使用前に該当のタンパク 質を分離するにあたって充分注意を払えばＩＮＡ＋形質を組み込んだエシェリキ ア・コリのような微生物からも単離できる。このような技術において、ＩＮＡ＋ 形質の遺伝子コードは適正な微生物にクローンされる。エシェリキア・コリによ るｐ、　１５３タンパク質の生産はウォブラーらにより、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３７２５６−７２６０（１９８６）に報告され ている。

微生物から氷核形成因子は各種方法で回収する。例えば、氷核形成因子が多量に 細胞内に存在する場合、細胞を遠心分離あるいは口過によって集め、ついで得た 細胞ペレットをＨＥＰＥＳあるいはリン酸緩衝液で膨潤させてから再口過や高速 遠心分離する。場合によっては、例えば超音波処理、圧力剪断、リゾチームのよ うな酸素を用いた酸素消化などによって細胞を破壊する必要がある。細胞を破壊 した後、遠心分離により破壊されなかった細胞を取り除き、氷核形成因子を含む 破壊された細胞膜を回収する。氷核形成因子を分画回収する前にさらに遠心分離 し、中性の緩衝液で洗浄する。得た画分を標準の方法で処理し、氷核形成因子の 存、　　　在を確認する。多くの場合、一種類以上の異なった方法を用いる必要 がある。適正な方法としては、次のようなものがある。

（ａ）各種極性を有する有機溶媒を用いる液−液抽出。これにより極性の低い画 分が除去され、水層にタンパク質が残る。

（ｂ）ゲル口過クロマトグラフィー。例えば５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００を用 い分子量によりタンパク質を分離する。タンパク質の三次、四次構造を変性する ために、必要に応じてＳｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｒｙ　（ＳＤＳ）を添加する。

ＳＯ３を用いた場合、これを除去するため透析が必要となる。

（Ｃ）イオン交換クロマトグラフィー。イオン電荷に基づいてタンパク質を分離 する。この方法は濃縮にも使用できる。すなわち、タンパク質の希釈溶液をカラ ムが飽和になるまでカラムに載せ、ついでタンパク質を溶出する。

（ｄ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー。

（ｅ）高速液体クロマトグラフィー。上記の各種カラムクロマトグラフィーに加 え、高圧下で逆層分離するようなカラムクロマトグラフィーがある。これら方法 により分離速度１分離効率は向上する。

本発明により凍結できる食品素材には魚肉、畜肉のような筋肉食品がある。しか しながら、良好な結果を得るには、魚肉や畜肉はあまり厚い塊であってはならな い。例えば、本発明の技術には、マグロ全体あるいは牛のわき腹よりも魚のフィ レーあるいはステーキ、子牛肉の薄片。

ビーフステーキ、鶏や豚や小羊のチョップのほうが適している。しかし１、　　 例えばマスあるいはシタビラメ、ヒラメ、カレイのような平たい魚は全体でも満 足のいく凍結が可能である。魚肉、畜肉にかかわらず３から４■より厚くならな いように予め切断し、できれば１．５０以下にすると、氷核形成微生物あるいは 因子が肉の中に浸透しやすくなる。肉を細切する代わりに、大きな肉の塊でも深 い切込みを入れることにより満足のい（結果が得られる。本発明の方法は、ソー セージ、牛の挽肉、カマポコのような砕切して作られる畜肉や魚肉製品にも適用 できる。また、本発明の方法は、細胞内凍結により品質が損なわれやすいベリー 類、果実。

豆やトウモロコシのような野菜類の凍結にも使用できる。しかし、例えばトマト やその他の大型果実類よりもベリー類のほうが適用しゃすい。

また、貝類、パスタ、ケーキ、パン、ワツフルのようなパン菓子類にも本発明の 方法は用いることができる。さらに、いわゆる智ディナーのような調理済み冷凍 食品、ピザのような冷凍スナックの凍結にも適用できる。

本発明はアイスクリームや他の酪農製品、例えば豆腐をベースにした製品にも使 用可能である。本発明を利用して凍結できる製品には、これらの他に濃縮果汁、 アイスキャンディ−のような冷凍果実バー、Ｉｔ油。

ソース類、スープ類、ヨーグルト、果実や野菜のピユーレ類も含まれる。

このような場合、前述のアライとワタナベが使用した方法とは異なり、氷核形成 微生物あるいはタンパク質を必要な素材と混合し、全体をひとまとめに凍結する まで冷却する。この操作は通常大気圧下で行い、製品は貯蔵までいかなる操作も それ以上は加えられない。

これら食品製品に加え、本発明は通常凍結貯蔵する血液製゛品、精子。

卵胚および他の生物製品の凍結にも適用できる。例えば、本発明は家畜増殖のた めの精子や卵子を凍結するのにも使える。

本発明に従って食品を凍結する際、ブラストあるいはコンタクトフリーザー、も しくは真空凍結乾燥機のような通常の凍結装置を使用できる。しかしながら、こ れら装置は普通適正と考えられている温度より１０℃から２０℃高い温度で操作 し得る。すなわち、プラストフリーザーは現在−２０℃から一４０℃で使用され るが、この温度の代わりに本発明の方法を用いれば一５℃から一３０℃の温度域 で満足のいく結果を得ることが可能である。同様に、コンタクトフリーザーの場 合、通常の操作温度−３０〜−４０℃を本発明では−１５から一２０’Ｃで操作 できる。

本発明の方法を採用すれば、満足のい（凍結を通常の方法より短時間で得ること ができる。しかし、凍結に要する時間は、凍結する食品の厚さと包装材に依存す る。

本発明で氷核形成を促進するために添加する物質の量は、使用する物質の性質と 特に過冷却水に氷核形成を誘導する温度に依存する。

氷核形成微生物あるいは因子は氷核形成の媒体として有効に作用するため、凍結 する食品あるいは成分製品において、比較的少量の使用で十分である。

前述したように、細菌の氷核形成部位の数は細菌の種類によって異なり、シュー ドモナス・シリンゲでは細胞光たり４−８個、エルウィニア・ヘルビコーラでは ２個である。しかし、ＩＮＡ＋形質を有する細菌の最適使用量の決定は、簡単な 実験で求めることができる。

シュードモナス・シリンゲ懸濁液は、−以上当たり約１０７のコロニー形成ユニ ット（Ｃ，ｆ、　ｕ、）の濃度で、脱イオン蒸留水中で氷核活性を示す。１０’ 　Ｃ，ｆ、ｕ、／−の濃度は、おおよそ−当たり１■の細胞乾燥重量に相当する 。本発明で、シュードモナス・シリンゲを使用した場合、申請者は１０５からｌ Ｏ’ｃ、ｆ、ｕ、／−の好気性生菌数（ＡＰＣ）を持つ細菌懸濁液の使用が便利 であることを見いだした。懸濁液中の細菌濃度は、５２０ｎｍにおける吸光度あ るいは他の懸度法によって求められる。

申請者は、Ｉ　Ｏ”　Ｃ，ｆ、ｕ、／１ｎｌのＡＰＣを有する細菌懸濁液を用い て以下の食品に対して、次のような適用量が適切であることを発見した。

食品　　ＩＮＡ＋形質を持つ細菌　　　　　適　用　量サケ　　シュードモナス ・シリンゲ　　０．０２−０．２−懸濁液７ｇ魚肉マス　　シュードモナス・シ リンゲ　　０．０２−０．２　ｍｌ懸濁液７ｇ魚肉単離した氷核形成因子を使用 する場合、同一の核形成部位濃度を得るにはより少ない添加量ですむ。すなわち 、このような因子を食品あるいは生物製品１ｇ当たり少な（とも０．０００５■ 添加すれば通常効果がみられるが、それ以上または以下の添加量例えば０．１■ ／ｇまでの添加が時として有効である。

氷核形成微生物あるいは因子は氷核を形成する量で、食品や他の生物製品に加え られる。例えば、畜肉、魚肉、野菜では最小１０　’ｃｆｕ／ｇ、普通１０’− １０’の割合で、アイスクリームや凍結豆腐製品では最小ＩＯ’ｃｆｕ／ｇの割 合で細菌は添加される。ｐ１５３のような氷核形成タンパク質を用いる場合、０ ．０００１−０．０１■／ｇあるいはそれ以上の割合で適用する。

氷核形成微生物あるいは因子は、例えばそれらの水懸濁液を噴霧したり、アイス クリーム、果汁、ピユーレなどではそれらを混合したりするといったこれまで用 いられてきた方法で適用される。

本発明の工程を次の例をもって説明する。

概−粟 氷核形成活性細菌源一シュードモナス・シリンゲｐｖ　ｐｉｓｉはアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクション　（ＡＴＣＣ）（Ｃａｔ、　＃１１０４３． 　Ｒｏｃｋｖｉ　ＩＩｅ、ＭＤ）から入手した。本細菌はこれまで報告された氷 核形成細菌の中で最も活性に富んでいることに基づいて選んだ。シュードモナス ・シリンゲの純度を確認してから保存した。

細菌の保存−細菌はＮＡＧプレート上に維持し、毎週植え継ぎを行った。特に断 わられない限り、ＮＡＧプレートから３−７日経ったコロニーをシュードモナス ・シリンゲ源とした。

細菌の調整と適用−細菌を蒸留水中に懸濁させ、濁度の吸光度が１．０となるよ うに調整した。細菌懸濁液ｌ−を魚（ミンチ肉あるいは全体）の表面に添加する か、魚（ミンチ肉）に混合する。すべての懸濁液は使用当日に調整した。

使用魚一本研究で用いた魚は、ロードアイランド大学水産養殖病理学部より入手 した。サケ（Ｓａｌｍｏ　５ａｌｓｒ）または虹マス（Ｓａｌｍｏ　ｇａｉｒｄ ｎｅｒｉ）は、トリ力イン・メタン・スルフォネート（ｔｒｉｃａｉｎ　ｍｅｔ ｈａｎｅ　５ｕｌｐｈｏｎａｔｅ）　　ＭＳ−２２２という魚麻酔薬でワシント ン州しドモンド、アージャント化学研究所によって麻酔した後、動脈を切断して 殺し、内蔵と頭部を除去した。これらは使用するまでシールできるプラスチック 袋に入れて２−４℃で貯蔵した。この他生きた虹マスを小売店より購入した。こ れらの頭部を叩いて殺し、同様に貯蔵した。

試料の調整−魚は３枚におろし、手で皮を剥いた。得られたフィシは、ミンチ肉 にするかあるいはそのままで実験に供した。ミンチ肉はよく切れるナイフでフィ シを微細なサイコロ状にして得た。これをプラスチック類の遠心分離管にとり、 遠心分離管にサーミスターを取り付けて凍結曲線を測定した。フィシ全体を使う 場合、フィシを背骨に対して直角に切って４ｃ＋ｎの大きさとした。一つの断片 をアルミニウム製の容器に入れ、先と同様に凍結曲線を求めるためにサーミスタ ーを用いた。サーミスター装置は一度に４検体の測定ができる。

凍結曲線−凍結曲線はリンセイス・モデル（Ｌｉｎｓｅｉｓ　Ｍｏｄｅｌ）　７ ０４０の４チャンネル式記録計によって得た。市販のＴｙｐｅ　Ｔ−銅一コンス タンチン　サーミスター（モデル　ＴＪ３６−ＣＰＳＳ−１１６Ｇ−６コネチカ ット州、オメガエンジニアリング）あるいは研究室で製作したＴｙｐｅ　Ｔ銅− コンスタンチン　サーミスターをすべての温度測定に用いた。サーミスターの接 続部はヘリウム　サーモカップル溶接機によって溶接した。記録計チャートのｍ Ｖをコンピュータで処理して温度（℃）に変換した。サーミスターをミンチ肉あ るいは全体内４検体に装着してから、チェストフリーザー（ミシガン州アドリア ン、サイエンランプコーポレーション）中に入れた。このフリーザーは±０．４ ℃の誤差で０℃から一２０℃の範囲で温度を調整できる。内側のチャンバーは二 重断熱され、空気循環のためにファンが取り付けられている。チャンバーの蓋に は試料の状態を直接観察できるように１２′平方の三重窓がついている。内部照 明も取り付けた。

試料は一５℃、−１０℃或いは一２０℃に設定したチャンバー中に置き、凍結曲 線を求めた。

定義−図１は一５℃において時間に対する試料温度を求めて得た理論的凍結曲線 である。４チヤンネルの凍結曲線から次のような時間と温度を求めた。

凍結点−凍結が生じた時の温度。

氷核形成温度−凍結が生じる前の試料の最低温度。

過冷却−試料の凍結点と氷核形成温度との温度差。

氷核形成時間−凍結が生じた後試料温度が凍結点を通過する瞬間から氷核形成が 始まるまでの時間。

凍結時間−試料温度が凍結点を通過する瞬間から一５°に達するまでの時間。

例１ 上述のように調整した魚ミンチ肉試料をコントロール区とｌＯ’ｃ、ｆ。

ｕ、／−濃度のシュードモナス・シリンゲ懸濁液で処理する区に分けた。

処理区は魚ミンチ肉ｇ当たり約０．７の懸濁液を噴霧した。コントロール区およ び処理区の凍結曲線を前述の方法で求めた。結果を表１に示す。

表　１−　マスおよびサケの凍結曲線 −５℃の凍結曲線 魚の調理方法＝ミンチ 適用方法−表面一魚Ｌｏｇに対して１ｄの水あるいは懸濁液＊殺してから凍結す るまでの時間 例２ サケのミンチ肉８試料を用いて、例１の実験を繰り返した。凍結曲線はこれら試 料に対する凍結サイクル全般にわたって求めた。結果（標準偏差を括弧内に示す ）を表２に示す。全凍結時間はサケ肉特有の凍結点−１℃から一５℃までで、氷 核形成時間を含む。

コントロール　　　　　　−３，７（０，９）　　　　　　１４４．７（１５５ ，７）　　　　　　　　３３２．３（１５９，６）処理　　　　−０，６（０， ３）　　　　６．１（０，３）　　　　　２１９．４（９，９）次にサケミンチ 肉８検体をコントロール区とｐ、　ｓｙｒｉｎｇａｅ処理した区に分けて、過冷 却の程度と氷核形成時間を求めた。操作１では試料を一５℃で実験した。操作２ では同一の試料を解凍してから再凍結した。表３に結果を示す。

表４−−７℃凍結したサケ全体内のシュードモナス・シリンゲ処理の有無による 凍結パラメーター すべてのデーターは８試料の平均値（括弧内は標準誤差）例３ 例１の方法で、魚フィレ肉について実験を繰り返した。処理区において、魚１ｇ 当たり１０’　Ｃ，ｆ、ｕ、／１ｎｌ濃度の０．１−懸濁液を適用した。表５と 図２において結果を示す。

表　５（−５℃凍結曲線） 例４ 以下の液状食品について、シュードモナス・シリンゲの氷核形成能を調べた。液 状食品２〇−当たりＩ　Ｏ’　Ｃ，ｆ、ｕ、／−濃度のシュードモナス・シリン ゲ懸濁液１１ｄを添加し、核形成温度および凍結温度について無添加のものと比 較した。表６．　７．　８に結果を示す。

表　６（フリーザ一温度＝−６℃） 表　７（フリーザ一温度＝−１０℃） 表　８（フリーザ一温度＝−１６℃） ！ｌ　糖分３７．４％ ；２　糖分４１．９％ ！３　家庭用電子レンジで３分間加熱したシュードモナス・シリンゲ懸濁液を用 いても、実質上同様の結果が得られた。

例５ 食塩および砂糖を含む食品の調製に使う代表的なモデル溶液におけるシュードモ ナス・シリンゲの氷核形成能を例４の液状食品の場合と同様にテストした。結果 を表９に示す。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成　２年　７月１９ 日 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１００２９０ ２、発明の名称 ３、特許出願人 住所（居所）　アメリカ合衆国　ロードアイランド　０２８８１キングストン　 上プレス　ドライブ　２６番地氏名（名称）　　リ−，トゥンーチン。

（国籍　アメリカ合衆国）７ ４、代理人 住所　　〒１０２　　東京都千代田区麹町５丁目７番地請求９範皿（１９９０年 ３月１６日補正）】、収穫した固形食品や他の生物製品を凍結する方法で、すな わちｌＮＡ１形質を有する無害微生物、生物起源の氷核形成因子、あるいは同等 の氷核形成機能を持つタンパク質を表面あるいは表面の切込みに適用し、それら を凍結するために温度を下げる方法。

２、適用した食品を一５℃以下の温度で保存する請求項１の方法。

３、無害微生物にはエルヴイニア　アナナス、エルウィニア・ヘルビコーラ、シ ュードモナス・シリンゲ、蛍光画、シュードモナス・ヴイリドフラヴ７　（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖｉｒｉｄｆｌａｖａ）あるいはザントモナス・カンペス トリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｒｔｒｉｓ）から成るグループか ら選択する請求項１の方法。

４、ＩＮＡ＋形質を移植したプラスミドを組み込んだ無害微生物である細菌ミュ ータント、ブルガリア乳酸挿画、好酸性入棺挿画、乳酸連鎖球菌。

好熱連鎖球菌（Ｓｅｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）から成 るグループから選択した細菌、あるいは麦酒酵母菌、サツカロミセス−ロゼ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｉ）、サツカロミセス・ロクシー（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）　、サツカロミセス参カーシェイゲンシ ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｔｓｈｅｉｇｅｎｓｉｓ）　。

サツカロミセス・ウヴアラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｖａｒｕｍ）か ら選択してＩＮＡ＋形質を組み込んだ酵母ミュータントを使用する請求項１の方 法。

５、ウォブラーらがＰｒｏｃ、　Ｎｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３７２５６ −７２６０に報告したタンパク質ｐ　１５３　、同報告に記載されているタンパ ク質ｐ　１８０　、機能的に同等のサブユニットから成るグループより選択した 氷核形成タンパク質を使用する請求項１の方法。

６、ＩＮＡ＋形質を有する微生物を畜肉、魚肉あるいは野菜に最小１０’／−の 量で添加する請求項１−４のいずれかによる方法。

７、生物起源の氷核形成因子あるいは同等の機能をもつタンパク質を最小０．０ ０１■／ｇの量で、畜肉、魚肉あるいは野菜に添加する請求項１及び５のいずれ かによる方法。

８．１ＮＡ＋形質を有する微生物、生物起源の氷核形成因子、あるいは同等の機 能を持つタンパク質を調理済み食品に添加する請求項１の方法。

９、ＩＮＡ＋形質を有する微生物、生物起源の氷核形成因子、あるいは同等の機 能を持つタンパク質をパスタ製品、パン菓子肌あるいは貝類に適用する請求項１ の方法。

１０、凍結をプラストフリーザー、コンタクトフリーザー、あるいは真空凍結乾 燥機を用いて行う上記請求項のいずれかによる方法。

１１、　ＩＮＡ＋形質を有する無害微生物、これら微生物から得た氷核形成因子 、あるいは同等の氷核形成機能を持つタンパク質を適用し、凍結するために温度 を下げる方法で、処理後はさらにいかなる加工工程も踏まずに低温貯蔵し、凍結 は、−１５℃以下のコンタクトフリーザー、−５℃以下のプラストフリーザー、 あくまいは真空凍結乾燥機で行う非組織化食品や他の生物製品を凍結する方法。

１２、室温で液状または半固体の非組織化食品、例えばアイスクリーム。

シャーベット、濃縮果汁、アイスキャンディ−、ソース、スープ、ヨーグルト、 果実や野菜のピユーレから非組織化冷凍食品を製造する方法、すなわちＪＮＡ＋ 形質を有する無害微生物、これら微生物から得た氷核形成因子、あるいは同等の 氷核形成機能を持つタンパク質を混合し、凍結するまで温度を下げ、凍結してい る状態で保存する方法。

１３、　ＩＮＡ＋形質を有する無害微生物、これら微生物から得た氷核形成因子 、あるいは同等の氷核形成機能を持つタンパク質を混合し、凍結するまで温度を 下げ、凍結している状態で保存し、室温で液状または半固体の非タンパク質食品 素材から非組織化冷凍食品を製造する方法。

１４、　ＩＮＡ＋形質を有する無害微生物、これら微生物から得た氷核形成因子 、あるいは同等の氷核形成機能を持つタンパク質を適用し、凍結するために温度 を下げ、血液製品、精子、卵子、胚および他の組織から冷凍生物製品を製造する 方法。

１５、アイスクリーム、豆腐を用いた菓子類、濃縮果汁、アイスキャンディ−、 ソース、スープ、シャーベット　ヨーグルトを特徴とする請求項１１．１２又は １３による方法。

１６、対象の食品あるいは他の生物製品は一５℃以下の温度域で保存される請求 項１１−１４のいずれかによる方法。

１７、エルヴイニア　アナナス、エルウィニア・ヘルビコーラ、シュードモナス ・シリンゲ、蛍光画から成るグループから選択した無害微生物を用いる請求項１ １−１４のいずれかによる方法。

１８、　ＩＳＡ＋形質を移植したプラスミドを組み込んだ無害微生物である細菌 ミュータント、ブルガリア乳酸挿画、好酸性乳酸挿画、乳酸連鎖球菌。

好熱連鎖球菌から成るグループから選択した細菌を用いる。麦酒酵母菌、サツカ ロミセス・ロゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｉ）、サツカロミセス ・ロクシ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）　、サツカロミセス ・カーシエイゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｔｓｈｅｉｇｅｎ ｓｉｓ）　、サツカロミセス０ウヴアラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｖ ｔａｒｕｔｔｒ）から選択してＩＮＡ＋形質を組み込んだ酵母ミュータントを使 用する請求項１１−１４のいずれかによる方法。

１９、対象の無害微生物は麦酒酵母菌、サツカロミセス・ロゼ（Ｓａｃｃｈａｒ 。

ｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｉ）、サツカロミセス拳ロクシ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ ｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ）　。

サツカロミセスｅカーシエイゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｔ ｓｈｅｉｇｅｎｓｉｓ）　、サツカロミセス・ウヴアラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｕｖａｒｕｍ）から選択してＩＮＡ＋形質を組み込んだ酵母ミュータ ントを使用する請求項１１−１４のいずれかによる方法。

２０、ウォブラーらがＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｉ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　８３７２５６−７２６０に報告したタンパク質ｐ　１５３　、同報告に記載 されているタンパク質ｐ　１８０　、機能的に同等のサブユニットから成るグル ープより選択した氷核形成タンパク質を使用する請求項１１−１４のいずれかに よる方法。

２１、凍結をプラストフリーザー、コンタクトフリーザー、あるいは真空凍結乾 燥機を用いて行う請求項１１−１４のいずれかによる方法。

２２、　ＩＮＡ＋形質を有する微生物を最小１０”／ｄの量で用いる請求項１１ −１４のいずれかによる方法。

２３、生物起源の氷核形成因子あるいは同等の機能を持つタンノ（り質を最小０ ．００１■／ｇの量で、食品あるいは他の生物製品に添加する請求項１１−１４ のいずれかによる方法。

２４、対象の食品は酪農製品である請求項１１による方法。

国際調査報告

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．固形食品や他の生物製品を凍結する方法、すなわちＩＮＡ＋形質を有する無 害微生物，生物起源の氷核形成因子，あるいは同等の機能を持つタンパク質を適 用し、凍結するために温度を下げる方法。
2. ２．食品を−５から−２５℃の範囲で冷却する請求項１の方法。
3. ３．無害微生物にはエルヴィニアアナナス，エルウィニア・ヘルビコーラ，シュ ードモナス・シリンゲ，蛍光画から成るグループから選択する請求項１の方法。
4. ４．ＩＮＡ＋形質を移植したプラスミドを組み込んだ無害微生物である細菌ミュ ータント、ブルガリア乳酸棹菌，好酸性乳酸棹菌，乳酸連鎖球菌，好熱連鎖球菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から成るグループ から選択した細菌、あるいは麦酒酵母菌，サッカロミセス・ロゼ（Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅｉ），サッカロミセス・ロクシー（Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ），サッカロミセス・カーシェイゲンシス（Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｔｓｈｅｉｇｅｎｓｉｓ），サッカロミセス・ウヴ アラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｖａｒｕｍ）から選択してＩＮＡ＋形 質を組み込んだ酵母ミュータントを使用する請求項１の方法。
5. ５．ウォブラーらがＰｒｏｃ．Ｎｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３７２５６−７２６ ０に報告したタンパク質ｐ１５３、同報告に記載されているタンパク質ｐ１８０ 、機能的に同等のサブユニットから成るグループより選択した氷核形成タンパク 質を使用する請求項１の方法。
6. ６．ＩＮＡ＋形質を有する微生物を畜肉，魚肉あるいは野菜に最小１０６／ｍｌ の量で添加する請求項１−４のいずれかによる方法。
7. ７．生物起源の氷核形成因子あるいは同等の機能をもつタンパク質を最小０．０ ０１ｍｇ／ｇの量で、畜肉，魚肉あるいは野菜に添加する請求項１及び５のいず れかによる方法。
8. ８．ＩＮＡ＋形質を有する微生物，生物起源の氷核形成因子，あるいは同等の機 能を持つタンパク質を調理済み食品に添加する請求項１による方法。
9. ９．ＩＮＡ＋形質を有する微生物，生物起源の氷核形成因子、あるいは同等の機 能を持つタンパク質をパスタ製品，パン菓子類，あるいは貝類に適用する請求項 １による方法。
10. １０．凍結をブラストフリーザー，コンタクトフリーザー，あるいは真空凍結乾 燥機を用いて行う上記請求項のいずれかによる方法。
11. １１．ＩＮＡ＋形質を有する無害微生物，これら微生物から得た氷核形成因子、 あるいは同等の機能を持つタンパク質を適用して、それらの凍結を大気圧下で行 うために温度を下げ、処理後はさらにいかなる加工工程を踏まずに低温貯蔵でき る食品あるいは生物製品を凍結する方法。
12. １２．適用される食品あるいは生物製品は室温で液状である請求項１１による方 法。
13. １３．適用される食品はアイスクリーム，豆腐製品，濃縮果汁，アイスキャンデ ィー，ソース，スープ，あるいはシャーベットである請求項１１による方法。
14. １４．生物製品としては血液または精子である請求項１１による方法。
15. １５．食品あるいは他の生物製品は−５から−３０℃の温度範囲に冷却する請求 項１１−１４のいずれかによる方法。
16. １６．エルヴィニアアナナス、エルウィニア・ヘルビコーラ，シュードモナス・ シリンゲ，蛍光画から成るグループから選択した無害微生物を用いる請求項１１ −１５のいずれかによる方法。
17. １７．ＩＮＡ＋形質を移植したプラスミドを組み込んだ無害微生物である細菌ミ ュータント、ブルガリア乳酸棹菌，好酸性乳酸棹菌，乳酸連鎖球菌，好熱連鎖球 菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から成るグルー プから選択した細菌を用いる請求項１１−１６のいずれかによる方法。
18. １８．麦酒酵母菌，サッカロミセス・ロゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏ ｓｅｉ），サッカロミセス・ロクシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘ ｉｉ），サッカロミセス・カーシェイゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　 ｃａｒｔｓｈｅｉｇｅｎｓｉｓ），サッカロミセス・ウヴアラム（Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｖａｒｕｍ）から選択してＩＮＡ＋形質を組み込んだ酵母ミ ュータントを使用する請求１１−１７のいずれかによる方法。
19. １９．ウォブラーがＰｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３７２５ ６−７２６０に報告したタンパク質ｐ１５３、同報告に記載されているタンパク 質ｐ１８０、機能的に同等のサブユニットから成るグループより選択した氷核形 成タンパク質を使用する請求項１１−１８のいずれかによる方法。
20. ２０．凍結をブラストフリーザー，コンタクトフリーザー，あるいは真空凍結乾 燥機を用いて行う請求項１１−１９のいずれかによる方法。
21. ２１．ＩＮＡ＋形質を有する微生物を最小１０■／ｍｌの量で用いる請求項１１ −２０のいずれかによる方法。
22. ２２．生物起源の氷核形成因子あるいは同等の機能を持つタンパク質を最小０． ００１ｍｇ／ｇの量で、食品あるいは他の生物製品に添加する請求項１１−２１ のいずれかによる方法。