JPH03502758A - ポリペプチド類においてノルロイシン含有量を制御するための発酵培地および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチド類においてノルロイシン含有量を制御するための発酵培地および方 法 発明の分野 本発明は生化学エンジニアリングの分野に属する。さらに詳しくは、本発明はポ リペプチド類を生産するための発酵方法およびそれにより生産されたポリペプチ ド類に関する。

Ｒ更９遣屡 微生物類を培養するための合成培地されかつ化学的にはっきりとした培地はよく 知られている。細菌を培養するための通常の栄養培地は異種ポリペプチド類を生 産できる組換体細菌を増殖させるのに使用されてきた。酵母エキスのごときアミ ノ酸源および・カザミノ酸源は、通常、発酵期間を通じて発酵培地に高濃度で含 まれる。かかるアミノ酸は高価である。従って、同時に良質の望ましいポリペプ チド類の発現を高レベルに維持しつつ、発酵培地において補足アミノ酸の量を減 少させることは有用であろう。

情報の開示 ノルロイシンは微生物代謝におけるメチオニンの類似体として作用することは公 知である。外因性ノルロイシンを供給することによるメチオニン利用の競合的抑 制によってイー・コリ（）：、　ｃｏ！ｉ）増殖が妨げられたことが報告されて いる（ジェイ・ハリスおよびエイチ・アイ・コーン（Ｊ、　Ｓ、　Ｈａｒｒｉｓ 　ａｎｄ　Ｈ，１，Ｋｏｈｎ）、ジャーナル・オブ・ファルマコロジ−（Ｊ、　 Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　）、　７３．３８３〜４００頁（１９４１））。ノルロ イシン補足が最適下濃度のメチオニンを含有する培地におけるイー・コリのメチ オニン要求株の増殖を増大させたことも観察されている（ジェイ・オー・ランペ ンおよびエム・ジェイ・ジョーンズ（Ｊ、　Ｏ，Ｌａｍｐｅｎ、　ａｎｄ　Ｍ、 　Ｊ、　Ｊｏｎｅｉ）、アーカイブズ１オブ・バイオケミストリー・アンド・バ イオフィジックス（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、）、　　１３＋　　４７〜５３頁（１９４ ７））、しかしながら、ノルロイシンの生物学的役割を調べる研究は外因性アミ ノ酸源として供給されたノルロイシンを使用してきたに過ぎない。

アール・ムニエおよびシイ・エヌ・コーヘン［Ｒ，Ｍｕｎｉｅｒ　ａｎｄ　Ｇ。

Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ）、ビオシミ力・工・ビオフィジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ 。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ、）、　　３１．　３７８　９０頁（１９５９）］は 、外因的に供給したノルロイシンはメチオニンの代わりに細菌蛋白にｉｎ　Ｖｉ ＶＯにて取り込まれ得ることを示した。イー・コリ蛋白合成におけるメチオニン の代わりとしてのノルロイシンの運命についての詳細な研究は、ノルロイシンが イー・コリ蛋白類に取り込まれる能力を支持する（ディ・シイ・バーカーおよび シイ・ジェイ・ブルドン（Ｄ、　Ｇ。

Ｂａｒｋｅｒ　ａｎｄ　Ｃ，Ｊ、　Ｂｒｕｔｏｎ）、ジャーナル・オブ・モレキ ュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、　　１３３．　２１７ 〜３１頁（１９７９））。

ノルロイシンはｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ双方においてｔＲＮＡ” ｔおよびｔＲＮ　Ａ　ｆＭ”をチャージ（ｃｈａｒｇｅ）　Ｌ得ることが示され ている。

ノルロイシンはアミノアシル−アデニレート・コンプレックスを形成し、メチオ ニル−ｔ　ＲＮＡシンテターゼの存在下でＰＰ、を放出する（ＡＴＰ−ＰＰＩ交 換反応）ことが示されている（ビイ・ニスマンおよびエムーｘル・ヒルシーＬ　 （Ｂ、　Ｎｉｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｍ、Ｌ、　Ｈｉｒｓｃｈ。

アヌ・インスト・パスツール（＾ｎｎ、　　１ｎｓｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ）、　 　９５．　６１５〜３４頁（１９５８）；ジェイ・エム・オールドおよびディ・ ニス・ジョーンズ（Ｊ、　Ｍ、　Ｏｌｄ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｓ、　Ｊｏｎｅｓ）、 バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）、　　１６５．３６７ 〜７３頁（１９７７））。また、ノルロイシンはイー・コリｔ　ＲＮ　Ａ”’の アシル化においてメチオニンと置き換わるとも示されている（ジェイ・トルビン ら（Ｊ。

Ｔｒｕｐｉｎ　ｅｔ　ａｌ）、バイオロジー・アンド・パイフィジカル・リサー チ・コミューニケーンヨンズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、 　Ｃｏｍｍｕｎ、）。

２４．５０〜５５頁（１９６６）；エイ・アール・フェルシュドおよびシイ・デ ィングウオール（Ａ、　Ｒ，Ｆｅｒｓｈｔ　ａｎｄ　Ｃ，Ｄｉｎｇｗａｌｌ）。

６６））。加工て、ノルロイシル−ｔＲＮＡ””はホルミルノルロイシル−ｔＲ ＮＡ””へ容易にホルミル化され、蛋白合成を開始するのにホルミルメチオニル −ｔＲＮＡ”ｅｔに置き換わることができる（ニス・ニス・ケルバーおよびエイ チ・ワイスバック（Ｓ、　Ｓ。

Ｋｅｒｖａｒ　ａｎｄ　Ｈ，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ）、アーカイブズ・オブ・バイ オケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、）。

１４１．５２５−３２頁（１９７０））。また、メチオニンが枯渇してノルロイ シンが供給された場合に、（はとんど絶対的にノルロイシンで）チャージされた ｔＲＮＡ”’合計パーセンテージは、合計ｔＲＮＡ”ｔのく５０％であることも 示されている（バーカーおよびブルドン（Ｂａｒｋｅｒ　ａｎｄ　Ｂｒｕｔｏｎ ）、前掲）。ノルロイシンによる増殖の抑制が報告されている（アール・ムニエ およびシイ・エヌ・コーヘン（Ｒ，Ｍｕｎｉｅｒ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｎ、　Ｃｏｈ ｅｎ）、前掲；ニス・ニス・ケルバーおよびエイチ・ワイスバック（Ｓ、　Ｓ、 　Ｋｅｒｗａｒ　ａｎｄ　Ｈ，胃ｅｉｓｓｂａｃｈ）、前掲；バーカーおよびブ ルドン、前掲）。

従って、外因的に供給されたノルロイシンに関するｉｎ　ｖｉｖｏおよびｉｎ　 ｖｉｔｒｏ実験を通じて、ノルロイシンはメチオニン類似体として作用すること が長い間知られている一方、本発明者らは、イー・コリ培養によるノルロイシン の合成に関するいずれの報告も知らない。

初期の報告はノルロイシンおよび構造的に類縁の化合物ノルバリンの天然の存在 を引用していた。ノルロイシンは動物神経組織中（イ−・アブデルハルデンおよ びケイ・ヘインズ（Ｅ、　Ａｂｄｅｒｈａｌｄｅｎ　ａｎｄＫ、　Ｈｅｙｎｓ） 、ツビシ二ル・フィシオル・ケム（Ｚｖｉｓｃｈｒ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、）、　　２１４．　２６２〜６６頁（１９３３））で、およびトウゴ マ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ）種子類の成分（アール・ヌ、コリニ（ Ｒ，Ｎｕｃｃｏ−ｒｉｎｉ）、アヌ・シム・アプル（Ａｎｎ、　Ｃｈｉｍ、　Ａ ｐｐｌ、　）、　　２４　、　２５−３２頁（１９３４））として見い出されて おり、一方、ノルバリンはバチラス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ ｉｌｉｓ）によって合成された抗菌類蛋白の成分であると報告されている（ビイ ・ナンデイおよびシイ・ビイ・セン（１’、？１ａｎｄｉ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｐ、 　５ｅｎ）、　ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）。

１７１．８７１〜７２頁（１９５３））。

セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のコンプ レックス調節突然変異体によるノルロイシンの形成が報告されている（エム・キ スミら（Ｌ　Ｋｉｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オブ・バイオケミスト リー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ、）、　　８０．　３３３〜３９頁（１９７６）： エム・キスミら（Ｍ、　Ｋｉｓｕｍｉ　ｅｔ　ａｌ）、アプライド・アンド・バ イアロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌ、）。

３４．１３５〜３８頁（１９７７））。ロイシン生合成酵素について抑制解除さ れたニス・マルセセンス（Ｓ、　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）が選択され、スレオニ ンデヒドラターゼを欠くインロイシン−依存性突然変異体をさらに選択するのに 用いられた。この二重突然変異体から、フィードバック−耐性α−イソプロピル マレートシンターゼを含有するインロイシン−非依存性（スレオニン−デヒドラ ターゼ欠損）　突然変異体が選択された。この最終複合突然変異体はノルロイシ ンを蓄積した。

発明の要約 本発明は、一般に、発酵培地において、メチオニン濃度を増加させるか、または ノルロイシンの量を減少させるか、あるいは双方を行うこ・とを特徴とする低濃 度のアミノよりなる発酵培地上で増殖させた微生物によって発現されるポリペプ チド類へのノルロイシンの取り込みを減少させる方法に関する。

さらに詳しくは、本発明は、メチオニン源、システィン源、またはロイシン源、 あるいはその組み合わせの源を培地に補足することを特徴とする低濃度のアミノ 酸を有するはっきりとした発酵培地上で増殖させた微生物によって発現されるポ リペプチドへ類のノルロイシン取り込みを減少させる方法に関する。ノルロイシ ン取り込みはメチオニンまたはロイシン補足によって妨げることができる。

さらに詳しくは、該微生物は組換体微生物であり、かく発現されるポリペプチド は異種ポリペプチドである。

また、本発明は、低濃度のアミノ酸を有し、かつメチオニン源、システィン源、 またはロイシン源、あるいはその組み合わせ源を補足した発酵培地に関する。

また、本発明は、メチオニンを過剰産生できる突然変異体微生物を利用すること を特徴とする微生物によって発現されるポリペプチド類へのノルロイシン取り込 みを阻止する方法に関する。

また、本発明は、低濃度のアミノ酸を有し、かつ蛋白の過剰発現が可能であるは っきりとした発酵培地上で微生物を増殖させることを特徴とする該微生物によっ て発現されたポリペプチド類ヘノルロイシンを取り込む方法に関する。

また、本発明は、低濃度のアミノ酸を有し、かつノルロイシンを補足したはっき りとした発酵培地上で微生物を増殖させることを特徴とする該微生物によって発 現されたポリペプチドへフルロイシンを取り込む方法に関する。

また、低濃度のアミノ酸を有する発酵培地上でエシェリヒア・コリ（Ｅ、　ｃｏ ｌｉ）を増殖させ、次いで、かく生産されたノルロイシンを単離することを特徴 とするノルロイシンの生産方法を提供する。

また、アミノ酸残基５．１２４．１４９および１７９に位置するメチオニンが特 にロイシン、バリンまたはイソロイシンよりなる群から選択される異なるアミノ 酸残基で置き換えられたことを特徴とするｂｓｔ様化合物類を提供する。

また、本発明は、ポリペプチドをコード付けする組換体ＤＮＡ分子中のメチオニ ンをコード付けするコドンを異なるアミノ酸、例えばイソロイシンをコード付け するものに変化させることを特徴とする、該ポリペプチドをコード付けする該Ｄ ＮＡ分子で形質転換し、かつ低濃度のアミノ酸上で増殖させた微生物類によって 発現された異種ポリペプチド類、例えばウシ・ソマトトロピンへのノルロイシン の取り込みを阻止する方法に関する。

発明の詳細な説明 注目する形質転換宿主微生物によって天然には合成されないポリペプチド類をい う。例えば、イー・コリはウシおよびヒト・ソマトトロピン、インシュリン、イ ンターフェロン等を生産することができる。かく生産されたポリペプチド類は「 異種ポリペプチド類」と呼ばれる。本発明において特に注目すべきは、メチオニ ンよりなる異種ポリペプチド類である。

ソマトトロピン類の分子不均質性のため、種々のソマトトロピン類のアミノ酸残 基類の位置番号は異なり得る。「天然噛乳動物ソマトトロビン」なる語は天然に 生じる種を包含する。チャート１は、本発明により修飾された位置５、１２４、 １４９、および１７９残基に対応するｂｓｔの特異的アミノ酸残基を示す。池の ソマトトロピン類についての番号付けは、他の種または類似体類に関する場合は 異なり得る。当業者ならば、チャート１に記載したｂｓｔのメチオニン５、１２ ４、１４９または１７９を用い、別の動物ソマトトロピン類、例えば哺乳動物ソ マトトロビン類における対応するアミノ酸類、例えばブタ・ソマトトロピンまた はその類似体のメチオニン５を容易に位置決めして、ノルロイシン取り込みの所 望の回避を達成したり、本発明の均一性を生じさせたりできる。

本明細書中で用いるごとく、「低濃度のアミノ酸類」は、その上で。

培養される微生物によって、アミノ酸生合成酵素類（例えば、ロインン生合成酵 素類）の生合成を抑制したり、または当該酵素類の活性を効果的にフィードバノ ク抑制するには余りにも低過ぎる外因性アミノ酸濃度と定義される「最小濃度の アミノ酸」まで低下され得るのに十分低い濃度を意味する。特に定義がない限り 、「低濃度のアミノ酸類」は、その上で培養される微生物によって、メチオニル −ｔ　ＲＮＡの正常なチャージングにつき、メチオニンについてのＫ。

より十分低《、かくしてノルロイシンでのメチオニル−ｔ　ＲＮＡの不正確なチ ャージングが可能となる「最小濃度のアミノ酸類」まで減少され得る濃度を意味 する。「低−ｔＩ４度のアミノ酸類」の「最小濃度のアミノ酸類」へのかかる減 少は、所望の蛋白がメチオニンの代わりに７ルロインンの検出可能な取り込みを 含むようなときに起こる。

本明細書中で用いるごと《、「高濃度のアミノ酸類」は、「低濃度のアミノ酸類 」が過剰状態にあって、所望の蛋白の発現の誘導に先立ち、誘導の時に、または 誘導後まもなく「最小濃度のアミノ酸類」まで減少され得ない濃度のアミノ酸類 である。例えば、特別の実施例のイー・フリ宿主類およびｒｂＳｔポリベプチド に関しては、「低濃度のアミノ酸類」は各々約０．５０ｍＭ未満であり、０．１ ％酵母エキス補足から得られる。「低濃度のアミノ酸類」は、各々約０、０５ｍ Ｍ満である「最小濃度のアミノ酸類」まで低下される。

かかるアミノ酸濃度は、特別の実施例のごとき方法に従う定量的なアミノ酸濃度 によって、与えられたいずれの宿主、与えられたいずれのポリペプチドについて のいずれの発酵に関しても容易に決定される。

本発明で用いる組換体宿主微生物類は、当業者によく知られ、例えば、ここに参 照のために挙げる、分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、 ティ・マニアテイスら（Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　ｅｔ　ａｌ）、コールド・ スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（　１　９　８　２　）およびビイ・ペルパル（Ｂ． 　Ｐｅｒｂａｌ）、分子クローニングへの実用的ガイド（Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａ ｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕ−ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ジョン・ウ ィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｙｉｌｅｙ　＆Ｓｏｎｓ）　　（１９８４ ）に記載されたＤ　Ｎ　Ａ組換え技術によって作製される。有用な宿主微生物類 は異種遺伝子類をクローニングしそれを発現するのに適するよく知られたいずれ の宿主類も包含し、例えば、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サツカロミセス（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ ｅｓ）株を包含する。

異種ポリペプチドを生産する組換体微生物類は液体栄養培地中で培養する。該培 地は微生物の細胞増殖要件を満足し、それにより、微生物が増殖し所定の細胞密 度まで増加できる、過剰の通常の栄養物質よりなる。この物質は炭素源、窒素源 および硫黄、リン、マグネシウム、カリウム、銅、亜鉛、マンガンおよび鉄のご ときミネラル類を包含する。アミノ酸類は、カゼイン、大豆ミール、ラクトアル ブミン、動物組織、酵母細胞およびゼラチンのごとき天然に生じる蛋白様物質を 酸または酵素消化に付すことによって通常製造される蛋白加水分解物の形態で添 加することができる。純粋なアミノ酸類の混合物類も添加することができる。本 発明者らは、ノルロイシンの生合成および発現されたポリペプチドへ類の取り込 みが、低濃度のアミノ酸類を補足せずまたは補足したいずれかの最小培地（例え ば、はっきりとした無機塩および炭素源、例えばグルコースまたはグリセロール ）よりなり、かつその中で蛋白の過剰発現が起こる発酵培地中で起こることを見 い出した。また、酸素も該培地に供給する。最大細胞密度を達成するには、培養 は、通常、酸素／液体の界面領域を増すように行う。

培養に影響する重要な環境因子はｐＨおよび温度を含む。温度は最小および最大 増殖温度の間の範囲とする。はとんどの細菌はかなり狭い温度範囲にわたり最大 増殖を示す。イー・コリのごとき中温菌については、最適温度範囲は約２５°Ｃ ないし約４２℃、好ましくは約３７°Ｃである。はとんどの生物類はｐＨ数単位 にわたる範囲の水素イオン濃度に耐える。イー・コリのごとき細菌については、 許容ｐＨは約６ないし８の範囲にあり、約６．８が好ましい。

異種ポリペプチドをコード付けする遺伝子の発現が抑制可能な発現制御配列の制 御下にある場合、適当なリプレッサーを培地に添加びオペレーターの制御下にあ る場合はトリプトファン）によって、その遺伝子の発現を所定レベルの増殖が細 胞培養により達成されるまで抑制することができる。

収穫の後、細胞類を加工して異種ポリペプチドを回収する。これは、通常、細胞 の破壊、ｌまたはそれ以上の抽出工程による粗製異種ポリペプチドの細菌蛋白類 からの分離、（その疎水性度に依存する）当該ポリペプチドの可溶化、適当な場 合には、適当なジスルフィド結合を生成さ、せるためのスルフヒドリルの酸化、 およびさらにゲル濾過、高速液体クロマトグラフィーまたは他の蛋白精製手法に よるポリペプチドの精製を含む。

本発明者らは、微生物類におけるポリペプチド類、特に組換体宿主類における適 当なアミノ酸配列を有する（例えば、メチオニンに代えて置き換えたノルロイシ ン無し）異種ポリペプチド類の過剰発現を効果的に支持する低濃度のアミノ酸よ りなる発酵培地をかなり低減化した価格で作製した。これは重要である。という のは、生産物の精製において付随した節約を伴う同種生産物類の生産が可能にな るからである。また、シアノーゲンブロマイドによって切断できるメチオニン残 基により結合した異種ポリペプチド類の発現が容易となる。

他方、メチオニンの代わりに置き換えたノルロイシンを有するポリペプチド類を 生産するのも望ましいであろう。メチオニン残基のノルロイシンでの意図した置 換により、（メチオニンスルホンまたはスルホキシドへの）酸化に対する大きな 耐性およびメチオニン特異的プロテアーゼ類または修飾剤類に対する耐性を具備 した蛋白の合成が可能となる。

本発明者らは、組換体微生物類によって異種ポリペプチド類を生産するために、 例えばエシェリヒア・コリに一１２株において組換えにより生産されるウシ・ソ マトトロピン（ｒ　ｂＳ　ｔ）を生産するために発酵を行ってきた。これらの発 酵は、比較的高濃度の酵母エキス（例えば、５重量／容量％までの酵母エキス） を補足したはっきりとした培地でまず開始した。比較的高濃度の酵母エキスを使 用した結果、これらの最初の発酵は「高酵母エキス」発酵と名付けた。

しかしながら、特に生産規模における高価格の酵母エキス補足は、これらの発酵 を経済的に不可能なものとした。従って、本発明者らは、５０．５％酵母エキス で補足することによって「低酵母エキス」発行培地およびプロセスを開発した。

低酵母エキス発酵培地を用いた場合、（合計ｒｂＳｔの３０％までの量の）主要 異常ｒｂＳｔ種が、単離したｒｂＳｔロットの逆相高圧液体クロマトグラフィー （ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析に際して見い出された。かかる異常ｒｂＳｔ種は高酵母 エキス発酵の間に生産されたロフトでは検出されなかった。よって、新しく遭遇 したｒｂＳｔ種の生産は価格的に有効な低酵母エキス発酵の使用に直接帰すべき ものであった。

該異常ｒｂｓｔ種はＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムでは正常なｒｂｓｔよりも遅 く溶出することが判明し、遅延溶出ｒｂＳｔ　　（ＬＥ−ｒｂＳｔ）と呼ぶ。Ｌ Ｅ−ｒｂＳｔを単離し、広範な構造分析を行った。構造データにより、ＬＥ−ｒ ｂＳｔはｒｂＳｔ分子中のアミノ酸番号１２４におけるメチオニンに代えるノル ロイシンの置換の結果として低酵母エキス発酵の間に産生されることが確立され た。

さらに、他の内部メチオニン位置、５．１４９および１７９位におけるノルロイ シン置換も検出されたが、ＲＰ−ＨＰＬＣに際してのｒｂＳｔのクロマトグラフ ィー挙動の変化の直接原因ではないようである。

低酵母エキス発酵の間のノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みは予期せぬことで あって、ノルロイシンの源は分からなかった。さらに、低酵母エキス発酵プロト コルの結果、何故ノルロイシンの取り込みが起こるか分からなかった。本発明に 先立っては、ノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みを排除する公知手段はなかっ た。この問題を解決するために、本発明者らは、発酵培地にＬ−メチオニンを補 足し、それにより、ノルロイシンの取り込みを完全に排除した。

外因性り一ロイシンによるα−イソプロピルマレートシンターゼ（ＬｅｕＡ”） のフィードバック抑制もまたノルロイシンの生合成およびｔｒ積、か（してノル ロイシンのｒｂＳｔへの取り込みを完全に排除した。与えられた宿主および所望 のポリペプチドについてのノルロイシン取り込みを排除するために添加されるべ きメチオニンおよびロイシンの量は実施例に記載した方法によって容易に決定で きる。また、システィンでの補足もノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込み量を減 少させた。

天然のｒｂＳｔは第５位にメチオニン残基を有する。他のメチオニン残基に関し 、第５位メチオニンもノルロイシン残基によって置き換えられ得る。理論に拘束 されるつもりはないが、通常メチオニン残基によって占められる位置におけるノ ルロイシンの取り込みは、ノルロイシンでのメチオニル−ｔＲＮＡのチャージン グ（ｃｈａｒｇｉｎｇ）および引き続いてのチャージされたｔ　ＲＮＡ分子とメ チオニンコドンとの相互作用の直接の結果のようである。従って、メチオニン以 外のアミノ酸についてのコドンでのメチオニンコドンの置き換えは、ｒｂＳｔま たはかかるメチオニン残基を有する他の異種ポリペプチド類へのノルロイシンの 取り込みを妨げるであろう。

細菌の培養　イー・コリ株ＢＳＴ−１を用いた。この株は、ラムダプロファージ およびＦプラスミドの除去ならびにｒｏｐＨ，１１２対立遺伝子の導入によって イー・コリに−１２（ＡＴＣＣｅ２３７１６）の野生型株から得られた。次いで 、プラスミドｐＵＲＡ４、プラスミドｐＢＥＵ−１７およびｐＢＲ３２２に由来 し、かツｒｂイ？！製プラスミドでこの株を形質転換した（１９８７年２月１９ 日出願の米国特許出願Ｓ、Ｎ、０１６２９４号およびＰＣＴ特許出願、ＰＣＴ／ ＵＳ８８１００３２８をここに参照のために挙げる）。

培養培地：はっきりとした培地はエイチ・ジエイ・ボーゲルおよびディ・エム・ ボ不ル（）１．　Ｊ、　Ｖｏｇｅｌ　ａｎｄ　Ｄ、　Ｗ、　Ｂｏｎｎｅｒ）、ジ ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ 、）。

２１８．９７〜１０６頁（１９５５）の培地Ｅに基づくものであった。初代種お よび発酵培地を調製するための組成およびプロトコルは以下の通りである。

初代種培地 収−分　　　　　　　　　　　　ＩＱ当たりの量Ｎ　ａ　（Ｎ　Ｈ４）　ＨＰ　 Ｏ−・Ｈｔ　Ｏ１０、９０ｇＫ、ＨＰｏ、　　　　　　　　　　　　　　　　２ ．６１ｇクエン酸・Ｈ，０２，１０ｇ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，００，９９ｇ （ＮＨ，）、Ｓｏ、　　　　　　　　　　　　　　０．６６ｇ酵母エキス　　　 　　　　　　　　　　　１０．４０ｇグリセロール　　　　　　　　　　　　　 ５．　ＯＯｇ逆浸透水 初代種培養については、前記成分を水（逆浸透グレード、Ｒ，Ｏ，）で水和し適 量にて１０００ｍ１２とし、滅菌に先立って３００ｍ１２容量に分割した。種培 地を１２１’Ｃで２０分間滅菌した。滅菌に続き、該種培地を冷却し、０．５ｍ １２滅菌アンピシリン（ＮａＯＨでｐＨ８，０に滴定し、濾過滅菌（０，４５μ ｍ）した逆浸透水中２５ｇ／＋２）を添加した。

発酵培地 成　分　　　　　　　　　　　　　ＩＱ当たりの量Ｎａ（ＮＨ４）ＨＰＯ４・Ｈ ｔＯｌｏ、９０ｇＫ＊ＨＰ０．　　　　　　　　　　　　　　　２．６１　ｇク エン酸（無水物）　　　　　　　　　　　　　１．９２ｇＭｇ５Ｏ，・７Ｈ，０ ０，２５ｇ （ＮＨ，）、Ｓｏ、　　　　　　　　　　　　　　　０．６６ｇ酵母エキス　　 　　　　　　　　　　　　　１．００ｇ５ＡＧ４１３０　　　　　　　　　　　 　　０．７５ｍ＋２逆浸透水 発酵培地は、前記量の成分を２００倍とし、それらを２５０リツトルのファーメ ンタ−にて逆浸透水１６５リットル中で水和させることによって調製した。次い で、発酵培地を１２１°Ｃで２０分間滅菌した（滅菌の間、水蒸気凝縮のため、 ２０リツトルの培地容量の水増しを採用した）。滅菌に続き、培地のｐＨをチェ ックして６．６ないし６．９であることを確認した。冷却に際し、２種の無菌添 加を行い、発酵培地を完成させた。第１の添加は、予め濾過（０，４５μｍ）に よって滅菌した微量養分２０ＯｍＱ分（終濃度：Ｃ０ＣＱ＊−６Ｈ，０２１２０ μＭ；ＣｕＳ○４．３９．９μＭ；ＭｎＣ１２ｔ’４ＨｔＯ１３１９ｇＭ；　Ｚ ｎ５Ｏ，・７Ｈ，０，４０，１，ｉｚＭ）よりなるものであった。第２の添加は 、セレロース（ｃｅｒｅｌｏｓｅ）１５リツトル（８，２４ｋ　ｇセレロースを 逆浸透水適量にて１４リツトルとし、）（、Ｓ　Ｏ，でｐＨ４，０に調整）より なるものであった。

発酵培地は接種に先立って２５％Ｎ　ａ　ＯＨでｐＨ７，２に調整した。

低酵母エキス発酵培地はＢＳＴ−１培養用の０．１％酵母エキスを含有していた 。いつくかの実験において、カザミノ酸類、し−メチオニン、Ｌ−ロイシン、Ｄ 、Ｌ−ノルロイシン、食料−または飼料グレードのり、　　Ｌ−メチオニンまた はし一システィン源を発酵培地に添加した。

プラスミドフピー数アッセイ：発酵の間に周期的に得られた培養試料について粗 製プラスミドコピー数アッセイを行った。かかる試料からの約２ｘｌＯ”細菌を 含有するペレットを再懸濁緩衝液（９０ｍＭトリス、９ＯｍＭホウ酸塩、５Ｏｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、２５％スクロース）１５０μＱに再懸濁した。リゾチウムを添加 しく１０ｍｇ／ｍ＋２の３０μｅ）、懸濁液を３７℃で１０分間インキニベート し、しかる後、リボヌクレアーゼＡ　（２０ｍｇ／ｍｅ　、８０℃で１０分間予 熱）３０μｅを添加した。３７°Ｃでの１０分後、ブロテイナーゼＫ　（１ｍｇ ／ｍＱ）３０ｕＱを添加し、さらに２０分間インキュベーシヲンを継続した。次 いで、混合物を１５分間で６５°Ｃにシフトした。溶解混合物（９０ｍＭトリス 、９０ｍＭホウ酸塩、６０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１．２５％（ｖ／ｖ）　トリトン Ｘ−１００）２１０μＱを添加し、それらを氷上で１０ないし２０分間インキュ ベートすることによって細胞を溶解した。溶解物をミクロ遠心機中、４℃で４０ 分間遠心した。清澄化した溶解物を透明な１．５ｍＱ　ミクロ遠心機遠心管に注 ぎ、−２０℃で保存した。９０ｍＭ）！Ｊス、９０ｍＭホウ酸塩、２．５ｍＭ　 ＥＤＴＡ緩衝液中で調製した０、８％アガロースゲルにて、１ないし５ボルト／ 　ｃ　ｍでの電気泳動によって含プラスミド溶解物を典型的な分析に付した。

実施例１　低酵母エキス発酵培地の使用によるノルロイシン置換ｒｂＳｔの生産 発酵プロトコル：各初代種培養を１の培養アンプル（約１ｍ１２）の内容物で接 種し、２８℃でインキュベートして０．７ないし０．８Ａ　＠　ｓ６の培養密度 とした。インキュベーションに続き、ファーメンタ−の接種に使用するに先立っ て、各初代種培養を水上に乗せた。

すべての初代種培養をアンピシリンで補足して実質的にすべてのプラスミド担持 細菌を含有する培養を得た。６００ｍ１２接種物での接種によってＢＳＴ−１発 酵を開始した。ファーメンタ−のｐＨを無水アンモニアで制御してｐＨを７，２ ないし７．４に維持した。ファーメンタ−の撹拌およびエアレーション速度を、 １０ｐｓ＋の逆圧にて、３２０ｒｐｍおよび３００５１ｍに設定した。２７°Ｃ の許容温間で培養増殖を行った。プラスミドランナウェイ複製およびｒｂＳｔ合 或は自然に誘導されるので、ＢＳＴ−１発酵を終始２７°Ｃに維持した。

分析手法　培養の一部を種々の時点に初代種およびファーメンタ−から取り出し 、一連の分析手法に付して培養密度（５５０ｎｍにおける吸光ｒ！ｉ）、合計細 菌乾燥重量、合計ｒｂＳｔ濃度、グルコース濃度、遊離アンモニア濃度、アセテ ート濃度を定量し、および鏡検同定および封入体の定量を行った。

ＲＰ−ＨＰＬＣ用試料調製：ｒｂＳｔ分析調製物を用いて蛋白のＲＰ−ＨＰＬＣ 単離用に試料を調製した。発酵培養の１０　Ａ　ｓｓｏ・ｍＱ部を遠心によって 収穫し、上澄みを除去した。次いで、細胞ペレットを、１５ｍｇ／ｍＱヂチオス レイトールを含有する６Ｍグアニジン塩酸塩６５０ＪｉＣに再懸濁し、５分間沸 騰した。試料を冷却した後、イソプロパツール３５０μＱを添加した。

ｒｂＳｔのＲＰ−ＨＰＬＣ単離：　Ｖａｒｉａｎ　ＶｉｓＬａ５５００液体クロ マトグラフにて、４．６Ｘ１００ｍｍのＢａｋｅｒｂｏｎｄＪｉｄｅｐｏｒｅ　 Ｃ−３カラムでＲＰ−ＨＰＬＣを行った。グラジェント移動相は各々が０．１％ トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）を含有する水−イソプロパツールであった。波 速は１ｍｆ２／分であった。グラジェントは１１分内で３５ないし５４％Ｂとし た。検出は２１５ｎｍ＋こおけるＵＶによった。試料の一部５００μＱをインジ ェクトし、ｒｂＳｔ画分をスクリュー−キャップのミクロ遠心機遠心管中に収集 した。これらの試料を凍結乾燥し、４℃で保存した。これらの試料は１ないし３ ナノモルの蛋白を含有していた。

ポリペプチドの配列決定二Ｎ−末端アミノ酸配列決定分析はオンラインＡＢＩ　 　１２０Ａ　　ＰＴＨアナライザーを装備したアプライド・バイオシステム（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　（Ａ　Ｂ　Ｉ　）　４７０　Ａシーケ ンサ−で行った。まず、カートリッジフィルターを１．５ｍｇポリブレン（ｐｏ ｌｙｂｒｅｎｅ）で調製し、ＡＢＩプログラム０３ＰＲＥを用いてプレサイクル させた。試料を０．１％ＴＦＡ６０μＱに溶解し、３０μｇ分にて該フィルター に負荷した。該フィルターを適用と適用の間にカートリッジオーブン中で乾燥し た。各試料につき、該ＡＢＩプログラムＱ３ＰＴＨを少な（とも５サイクル用い た。ノルロイシン＋メチオニンの合計ピコモル数で除することによって、第５サ イクルにおけるノルロイシンパーセントをフルロイシンのピコモル数として計算 した。最初の収量は３．９ナノモルから７３ピコモルまで変動した。キャリア無 しの操作で平均収率９１，２％、キャリアを用いた場合は９２．７％であった。

アミノ酸分析：低酵母エキス発酵中に起こるアミノ酸フラックスを調べるために 、培地試料を発酵間に周期的に得、アミノ酸分析に付した。アミノ酸分析は、実 質的にビイ・エイ・ビドリングメイヤーら（Ｂ、　Ａ、　Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙ ｅｒ、　ｅｔ　ａｌ）、　　ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Ｊ、　Ｃ ｈｒｏｍａｔｏｇｒ、）、　３３６．９３　１０４頁（１９８４）に記載されて いるごときＰＴＣ法（アール・エル・ヘインリクソンお゛よびニス・シイ・メリ デス（Ｒ，Ｌ、　Ｈｅ１ｎｒｉｋｓｏｎ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｃ，Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 　　１３６゜６５−７４頁（１９８４））によって行った。

発酵培地試料は株ＢＳＴ−１でのｒｂＳｔ発酵から得、アミノ酸分析に付した。

株ＢＳＴ−１での低酵母エキス発酵は０．１％酵母エキスを含有していた。第１ 表に示すデータは、株ＢＳＴ−１での典型的な低酵母エキス発酵について、アミ ノ酸は０．０４ｍＭ（ヒスチジン）ないし０．３８ｍＭ（ロイシン）の範囲の初 期濃度で存在し、実質的にすべてのアミノ酸がｒｂＳｔ合成の自然誘導に先立っ て（接種後約１５時間）消費されたことを示す。事実、はとんどのアミノ酸は接 種後約１６時間までに消費された。アラニンおよびグルタミン酸は０．０４ｍＭ （接種後１５時間）および０．０３ｍＭ（接種後１７時間後）に達し、各々、０ ．８８ｍＭおよび１．６５ｍＭの終濃度まで増加した。従って、これらのデータ は、はとんどのアミノ酸がｒｂＳｔ合成の自然誘導のほぼ９時間先立って培地か ら枯渇したことを示す。さらに、それらは、培養増殖およびｒｂＳｔ合成に要す るアミノ酸はｄｅ　ｎｏｖｏ合成されるべきだったことを示す。

第２表のデータは、培地中のフルロイシン蓄積とｒｂＳｔにおけるノルロイシン の取り込みとの間の関係を示す。接種後１９時間まで（誘導後約４時間）、ノル ロイシンは培地中に検出されず、一方、Ｎ−末端アミノ酸配列決定により、ｒｂ ＳｔＳ位にすでに２．６モル％のフルロイシンが存在することが明らかとされた （第２表）。

接種後２５および３３．５時間（誘導後約１０および１８．５時間）に得た発酵 試料は、培地中でのノルロイシンの濃度の増加およびｒｂＳｔのＮ−末端および ５位に取り込まれたノルロイシン画分（モル％）の対応しての増加を示した（第 ２表）。これらの結果は、異なるイー・コリ宿主培養で確認された。

実施例２　株ＢＳＴ−１での低酵母エキス発酵間のフルロイシンの合成および分 泌 ノルロイシンがイー・コリ培養によって合成されたことを証明するために、低酵 母エキス発酵（実施例１）間に発酵培地試料を得、アミノ酸分析に付した。特に 、株ＢＳＴ−１での低酵母エキス発酵から得られた試料を用いた。これらの発酵 からのスペント（ｓｐｅｎｔ）培地試料は、ノルロイシンの一時的合成および蓄 積を示した。接種２０時間後に得た培地試料は検出可能なノルロイシンをほとん ど含有しておらず（９，０２分溶出時間）、一方、発酵中６時間後に調査した試 料はアミノ酸クロマトグラフでノルロイシンのピーク（０，１５ｍＭ）を明らか に示した。該ノルロイシンのピークは接種後３０および３２時間後に得られた試 料で増加し続け、０．４７ｍＭの終濃度に達した。

収集したデータは、株ＢＳＴ−１での低酵母エキス発酵間のノルよび分泌は接種 後１０ないし１５時間に開始し、発酵の最後まで継続し、０．６０ｍＭの終濃度 に到達した。株ＢＳＴ−１で行い、長時間行ったｌのｒｂＳｔ発酵の間に、ノル ロイシンの濃度は接種６６．２時間後までに２．４７ｍＭに達した。従って、本 発明者らは、低酵母エキス発酵の間に、イー・コリ培養によってフルロイシンが ｄｅ　ｆｌＯＶＱ合成されたことを証明した。これらの結果は、第２のコー・フ リ株でも確認された。

株ＢｓＴ−１での低酵母エキス発酵間のこれらの２種のアミノ酸間の関係を理解 するために、入手可能なメチオニンおよびノルロイシンの濃度を調べた。データ は、酵母エキス補足によって供給されたメチオニンの濃度は典型的には＜Ｑ、１ ｍＭであり、メチオニンは接種後１５時間までに発酵培地から枯渇したことを示 した。発酵におけるかかる見地より、培養代謝および増殖、ならびにｒｂＳｔ合 成に要するすべてのメチオニンは培養によって合成された。メチオニンの枯渇に 付随して、発酵培地における過剰ノルロイシンの合成および蓄積が観察された。

これらのデータは、ＢＳＴ−１培養によるノルロイシンのｄｅ　１ＩＯＶＯ合成 速度はノルロイシン利用（例えば、蛋白合成）の速度よりもかなり大きかったこ とを示す。

実施例３　低酵母エキス発酵間の外因性アミノ酸での補足本実施例では、本発明 者らは、細胞質アミノ酸プールにおけるノルロイシンおよび他のアミノ酸類の濃 度を変更し、ノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みについての得られた効果を観 察した。

ｒｂｓｔの公知アミノ酸組成、イー・コリ増殖（ジェイ・エル・イングラハムら （Ｊ、　Ｌ、　ｌｎｇｒａｈａｍ　ｅｔ　ａｔ）、細菌細胞の増殖（Ｇｒｏｗｔ ｈｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｅ１ｌ）、１０８−１０および１２２ −２５頁（１９８３））ｉｉｎついてのアミノ酸要求（乾燥重量当たりのダラム ）の見積り、およびディフコ（Ｄｉｒｃｏ）カザミノ酸の実験的に決定したアミ ノ酸組成より、本発明者らは、細胞増殖およびｒｂＳｔ合成に要するすべてのア ミノ酸を供給するには、３％カザミノ酸および６ｍＭグリシンを低酵母エキス発 酵（実施例１）に添加すべきことを見積もった。メチオニンに関しては、この付 加補足は、細胞増殖およびｒｂＳｔ合成についてのアミノ酸要求の見積もりの１ ２５％と計算された。さらに３％カザミノ酸および６ｍＭグリシンを補足した低 酵母エキス発酵を行った場合、Ｎ−末端アミノ酸配列決定法によると、ｒｂＳｔ のＮ−末端にノルロイシンは検出されず、痕跡量（０，３モル％）のノルロイシ ンが５位に検出されたに過ぎなかった。対照的に、非補足（カザミノ酸無し）低 酵母エキス対照発酵間に生産されたｒｂＳｔはＮ−末端に２．８モル％ノルロイ シンおよび５位に１５．３モル％ノルロイシンを含有していた。付加カザミノ酸 補足におけるアミノ酸はノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みを妨げる。これら のデータは、含ノルロイシンｒｂＳｔ　　（ＬＥ−ｒｂＳｔ）は高濃度酵母エキ ス（例えば、５％酵母エキス）を含有する発酵では生産されなかったという観察 に一致する。

実施例４　低酵母エキス発酵間の外因性Ｌ−メチオニンでの補足次に、本発明者 らは、低酵母エキス発酵の５ｍＭ　Ｌ−メチオニンでの補足を調べた。非補足低 酵母二牛ス発酵間に株ＢＳＴ−１によって生産されたｒｂＳｔのＮ−末端アミノ 酸配列決定は、各々Ｎ〜末端および５位において２．１および２２．１モル％ノ ルロイシンを示したく第３表）。低酵母エキス発酵培地の３ｍＭ　Ｄ、Ｌ−ノル ロイシンでの補足は、さらに、Ｎ−末端および５位で検出されるノルロイシンの レベルを増加させた（第３表）。ノルロイシン補足はｒｂＳｔにおけるノルロイ シン含有量を増強させる効果的手段を示した。

５ｍＭＬ−メチオニンでの補足は、ｒｂＳｔ５位におけるノルロイシンの取り込 みを完全に排除し、一方、痕跡量の（０，２モル％）ノルロイシンがＮ−末端で 検出されたに過ぎない。ｒｂＳｔのＮ−末端における痕跡量のノルロイシンの検 出は、発酵の後期段階での、メチオニン制限のため、ホルミル−メチオニンの利 用可能性が減少したことに起因するであろう。メチオニン濃度≧５ｍＭで行った 他の発酵はｒｂｓｔのＮ−末端および５位いずれでもノルロイシンを示さなかっ た。さらに％　１．２５ｍＭと低い濃度のし一メチオニンを用いるタイトレージ １ン実験は、ｒｂＳｔへのフルロイシンの取り込みは５位においてく１モル％ノ ルロイシンまで減少されることを示した。

実施例５　低酵母エキス発酵間のメチオニンの他の源での補足本実施例は、低酵 母エキス発酵（実施例１）が行い得ること、およびノルロイシンのｒｂｓｔへの 取り込みがＬ−メチオニンよりも安価なメチオニン源での補足によって妨げられ ることを示す。

５ｍＭ　Ｄ、Ｌ−メチオニンを使用する最初の発酵（シンテックス・アグリ・ビ ジネス・インコーポレイテノド（Ｓｙｎｔｅｘ　Ａｇｒｉ　Ｂｕｓｉ−ｎｅｓｓ 、　Ｉ　ｎｃ、　）、スプリングフィールド（Ｓｐｒｉｎｇｆ　１ｅｌｄ）、ミ ズリー州）を行い、Ｎ−末端または５位いずれでもノルロイシンが検出されない ごとく、ノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みを防止するのに効果的であること が判明した。従って、食品−または飼料グレードのり、　　Ｌ−メチオニン（デ グサ・コーポレーション（Ｄｅｇｕｓｓａ　Ｃｏｒｐ、）、テオドレ（Ｔｈｅｏ ｄｏｒｅ）、アラバマ州）を濃度５ｍＭで用いて株ＢＳＴ−１での低酵母エキス 発酵を補足した。第４表のデータは、これらの２種グレードのり、　　Ｌ−メチ オニンがノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みを妨げたことを示す。食品グレー ドのり、Ｌ−メチオニンはノルロイシンの取り込みを完全に妨げ、一方、飼料グ レードのり、　　Ｌ−メチオニンで補足して発酵間に生産されたｒｂＳｔの５位 においてはわずかな痕跡量のノルロイシン（０，１モル％）が見いだされたに過 ぎず、これは恐らく後者においては２．５ｍＭＬ−メチオニン成分の消費による ものであろう（第４表）。引き続いての実験において、≧５ｍＭ飼料グレードの り、　　Ｌ−メチオニンでの補足はノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みを完全 に妨げた。高レベルの酵母エキス、カザミノ酸類、Ｄ、Ｌ−メチオニンまたはＬ −メチオニンいずかを介するメチオニン補足はノルロイシンのｒｂＳｔへの取り 込みを排除した。

実施例６　株ＢＳＴ−１によるメチオニンおよびノルロイシン生合成への影響 メチオニン補足がノルロイシン生合成に与える影響を調べるために、メチオニン を補足してまたは補足せずに行った発酵の間の株ＢＳＴ−１によるノルロイシン の合成および分泌をモニターした。データは、メチオニン補足はノルロイシンの 合成を妨げなかったことを示す。むしろ、メチオニン補足は調べた各側について ノルロイシン生合成の特異的活性を減少させた（ミリモル・ノルロイシン／ｇ・ 時・Ａｓ１ａ）。事実、ノルロイシンは、メチオニン補足なくして行った低酵母 エキス発酵の最後までに終濃度０．６０ｍＭまで、およびメチオニン補足での同 時発酵の最後までに０．５７ｍＭまで蓄積した。平均酸素摂取量（ＯＵＲ）およ び二酸化炭素発生（ＣＥＲ）速度がメチオニン補足なくして観察されたものより も５３％および５８％高いごとく、メチオニン補足は細胞の代謝を変化させ、培 養増殖を促進した。培養乾燥細胞重量収率および最終濁度もメチオニン補足では 高かった（各々、２４％および３８％）。

実施例７　　ｒｂＳｔ合成とノルロイシンの生合成および分泌との間の関係 株ＢＳＴ−１での低酵母エキス発酵の間に培養の一部を得、アミノ酸を分析し、 合計ｒｂＳｔを定量した。データは、接種１５時間後までに、培地中のメチオニ ン濃度は０．０５から０．００ｍＭに減少したことを示す。接種１５時間後まも なく、ノルロイシン生合成が開始し、接種後４０時間までに終濃度０．８６ｍＭ に達した。

ｒｂＳｔ合成の自然誘導はノルロイシンの生合成および分ｌ・が開始したのと同 時点で起こった。これらのデータは、イー・コリ培養によるｒｂｓｔの合成およ び蓄積はノルロイシンの生合成を媒介する原因かも知れないことを示唆し、そこ で、本発明者らはこれをテストした。

ＢＳＴ−１培養によるｒｂｓｔの生産はプラスミドランナウェイ復製の自然誘導 に従う。従って、本発明者らは、ランナウェイプラスミド複製およびｒｂＳｔ合 成（ＢＳＴ−１）双方が可能な培養、ｒｂＳｔ合成なくしてプラスミドランナウ ェイ複製が可能な培養（ｐＵＲＡ４　（米国時”許出願０１６２９４号）に由来 するものであってランナウェイ複製が可能であるが、ｒｂＳｔ遺伝子のほとんど のの８５０ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩ［欠失のためｒｂＳｔを合成でき ないプラスミドｐＵＲＡ４　　ΔｂｇｈＥ／Ｈを含有するＢＳＴ−ＩＣ）、およ びランナウェイプラスミド複製もｒｂＳｊ合成も有しない培養（株ＢＳＴ−ＩＣ 、ランナウェイプラスミド複製およびｒｂＳｔ合成から独立して増殖する株ＢＳ Ｔ−１の同系プラスミドフリー誘導体）によってノルロイシン生合成を調べた。

第５表のデータは、株ＢＳＴ−ＩＣおよびＢＳＴ−ＩＣ（ｐＵＲＡ４　　Δｂｇ ｈ８、Ｈ）はＢＳＴ−１よりも２．２ないし２．５倍大きな密度（乾燥重量）ま で増殖したことを示す。また、これらのデータは、株ＢＳＴ−１ＣおよびＢＳＴ −ＩＣ（ｐＵＲＡ４　　ΔｂｇｈｔｚＨ）はそれらの低酵母エキス発酵の間に実 質的に等量のノルロイシン（約０．０１ミリモルノルロイシン／ｇ乾燥細胞重量 ）を合成したことを示す。

しかしながら、株ＢＳＴ−１は調さた他の株いずれよりもかなり多いノルロイシ ン（約１４倍高い）を合成し、平均濃度０．１４ミリモルノルロイシン／ｇ乾燥 細胞重量に達した（第５表）。本発明者らは、両プラスミド担持株がランナウェ イプラスミド複製を有することも確認した。

まとめると、これらのデータは、イー・コリによるノルロイシン生合成は低酵母 エキス発酵間にｒｂＳｔ合成に関与したことを示す。

プラスミドランナウェイ複製の現象とは無関係に、感知されるノルロイシンの蓄 積はｒｂＳｔ合成無合成石は観察されなかった。幾分不十分ではあるが、ノルロ イシンは異種ポリペプチド類を発現していなかった低酵母エキス発酵の間にイー ・コリ株によってノルロイシンが生産された。

ロイシン補足　・ 本実施例では、本発明者らは、低酵母エキス補足および生合成における外因性ロ イシンおよび他のアミノ酸とノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みとの間の関係 を調べた。

発酵培地試料のアミノ酸分析により、実質的にすべての外因性ロイシンが、ノル ロイシンの生合成および分泌が開始する時点にほぼ対応する発酵間での時点であ る接種後１４時間までに枯渇した（最初０．１７ｍＭが０．０３ｍＭまで減少） ことが明らかとされた。

さらに発酵を行って、ロイシン補足がノルロイシンの生合成および分泌、ならび にノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みに与える影響を直接に調べた。データは 、低酵母エキス発酵のロイシン補足がなければ、ノルロイシンの生合成および分 泌は接種後約１５時間に開始し、接種後４０時間までに終濃度０．８６ｍＭに達 したことを示した。第２発酵の１５ｍＭＬ−ロイシンでの補足の結果、ノルロイ シンの生合成および分泌の完全な抑制が生じた。外因性ロイシンによるα−イソ プロピルマレートシンターゼのフィードバック抑制は、ノルロイシン生合成に至 る経路における最初の反応を阻止することによってノルロイシン生合成を妨げた 。データは、ロイシン補足培養の増殖は接種後最初の１９時間は非補足培養のも のと区別できないことを示した。その時点の後、ロイシン補足培養の増殖が停止 し始め、非補足培養についての２４．４Ａｓｓｏと比較して１１．４Ａ５５゜の 経密度に達した。ロイシン補足および非補足培養によるｒｂＳｔの生産について のデータを比較すると、ロイシン補足培養によるｒｂＳｔ生産は接種後２０時間 に減衰し始めた。ロイシン補足および非補足培養についてのｒｂＳｔ合成の初期 速度は非常によく似ており（各々、Ｋ＝０．６６および０．７８／時間）、ロイ シン補足による初期の乱れを示さない。これらの発酵から得た発酵培地の試料の アミノ酸分析により、ロイシン補足培養によってノルロイシンは合成されず、一 方、ノルロイシン終濃度は非補足培養では０．６０ｍＭに達したことが確認され た。

非補足および１５ｍＭＬ−ロイシン−補足発酵から得たｒｂＳｔ試料のＮ−末端 アミノ酸配列決定により、非補足発酵からのｒｂＳｔのＮ−末端および５位にお ける１、３および２２０モル％ノルロイシンが示され、一方、Ｌ−ロイシン−補 足発酵から得たｒｂＳｔについてはいずれの位置にもノルロイシンは検出されな かった（第６表）。

スティン補足の影響 ５または１５ｍＭＬ−システィンで補足したまたは補足しない発酵を行った。当 該補足がノルロイシンの生合成を低減させ、およびｒｂＳｔへのその取り込みを 減少させ得るかを否かを決定するために、ノルロイシンの生合成および分泌なら びにノルロイシンのｒｂＳｔへの取り込みをモニターした。第７表のデータは、 外因性システィンを補足した場合でも、株ＢＳＴ−１によってノルロイシンがい くらか合成されたことを示す。１５ｍＭＬ−システィンで補足した発酵の間に細 胞外培地で検出されたノルロイシン濃度のわずかな減少は高システィンレベルで の増殖の乱れのためであるようだった。１５ｍＭＬ−システィン補足培養につい ての平均最終培養吸光度（Ａ６．。）、合計乾燥重量、およびｒｂＳｔ収率は、 非補足発酵からの培養から得た各レベルの５１％、４８％、および４５％であっ た。５ｍＭＬ−システィンでの補足は、非補足発酵と比較して、培養の増殖を変 更することは感知されず、ノルロイシン量の減少は検出されなかった（第７表） 。しかしながら、５ｍＭＬ−システィンでの補足は、ｒｂＳｔのＮ−末端および ５位で検出されたノルロイシン量を、各々、１．７および２１．８モル％から１ ．６および１８．９モル％に減少させた（第７表）。さらに、１５ｍＭし一シス ティンでの補足はＮ−末端および５位におけるノルロイシンの濃度を、各々、１ １モル％および１３．８モル％まで減少させた。

また、株ＢＳＴ−ＩＣ（ｐＵＲＡ４ｃｍＳ）で発酵を行った。プラスミドｐＵＲ Ａ４Ｃ−３は、ｒｂＳｔの各４個の内部システィン残基をセリン残基で置き換え 、部位定方向化（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発によってｐＵＲＡ ４から得た。この株によるｒｂＳｔの合成は、ｒｂＳｔ合成についてのｄｅ　ｎ ｏｖｏ合成されたシスティンに対しいずれの要求もなくして進行した。株ＢＳＴ −１（ｐＵＲＡ４ｃｍＳ）での非補足低酵母エキス発酵の最後までに、ノルロイ シンは０’−４３ｍＭの細胞外濃度まで蓄積した。さらに、Ｎ−末端アミノ酸配 列決定により、ｒｂＳｔのＮ−末端および５位において、各々、０９および１７ ．７モル％であることが明らかとされた。

システィン補足およびシスティンを欠＜ｒｂＳｔの合成いずれもノルロイシンの 合成に大きく影響することはなかったが、それらはメチオニンのレベルをわずか に上昇させた。メチオニンの利用可能性の増大の結果、ｔＲＮＡ”ｔおよびｔＲ ＮＡ””の正しいチャージングについてノルロイシンとのより効果的な競合が生 じた。さらに、メチオニン生合成の増大の結果はノルロイシンのｒｂＳｔへの取 り込みの量依存性減少であった。

実施例１０　それにより発現された異種ポリペプチド類へのフルロイシンの取り 込みを排除するためのメチオニンを過剰生産する突然変異体微生物の使用 ポリペプチド類を発現する宿主としてメチオニンを過剰生産する微生物を用いる ことによって、ノルロイシンの異種ポリペプチド類への取り込みを排除すること もできる。かかる突然変異体はフィードバック−非感受性ホモセリントランスス クシニラーゼ（ｍｅｔＡ）突然変異体類、またはメチオニンについて抑制された 突然変異体類（ｍｅｔＪまたはもｍｅｔＫ突然変異体）、あるいは双方を包含す る（アール・ジェイ・ロウベリ（Ｒ，Ｊ、　Ｒｏｗｂｕｒｙ）　　ニアミノ酸生 合成および遺伝子調節（Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄｓ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　 ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、ケイ・エム・バーマンおよ びアール・エル・ソメルビル（Ｌ　Ｍ。

）１ｅｒｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｌ、　Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ）ｉｅｉ、　１９ １　２１１頁（１９８３））。

メチオニン−原末養生物を７５−９０％殺傷の結果となるに十分な用量にて紫外 線照射または化学突然変異誘発物質（例えば、メチルメタンスルホネートのまた は１−メチル−３−ニトロ−１−二トロングアニジン）に暴露し、α−メチルメ チオニン、オチオニン、またはノルロイシンで補足したはっきりとした培地の平 板に希釈物を接種する。ミクロシン１５．９３または１３６に対する耐性につい ての選択を使用する別法アプローチを用いてメチオニン過剰生産者を得ることも できる（エフ・バケロら（Ｆ、　Ｂａｑｕｅｒｏ、　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル ・オブ・バタテリオロジー（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、　１３５　、３ ４２−３４７頁（１９７８）　）　、　ｍｅｔＡ、　ｍｅｔＪ、およびｆｆＩｅ ｔＫ突然変異体を得るさらなる別法は、ＩＩ的な形質導入アプローチ（ジェイ・ エイチ・ミラー（Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ）、分子遺伝学における実験（Ｅｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）＋　　２０１ −２０５頁、コールド・スプリング・ハーバ−噂ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１９７１））による 、公知突然変異体メチオニン対立遺伝子（例えば、ｍｅｔＡ　：　：　ＴｎｌＯ 等、イー・フリ遺伝子ストックセンター、エール大学、ｃ　／　ｏ　　ビイ・ジ ェイ・バックマン（Ｂ、　Ｊ、　Ｂａｃｈｍａｎｎ）より入手可能）の導入を包 含する。いずれかのプロトコルから、指標生物として非逆転メチオニン要求菌で 接種した頂部寒天を、メチオニンフリーのはっきりとした培地の平板上で予め増 殖させた推定クローン類のコロニーに重ねることによって、交差育種（ｃｒｏｓ ｓｆｅｅｄｉｎｇ）実験においてメチオニン過剰生産（および分泌）について当 該クローンをテストする。インキュベーションに続き、メチオニン要求株の増殖 を、メチオニンを過剰生産しそれを分泌するコロニー上または周囲で観察する。

前記実施例に記載したごとき定量的アミノ酸分析の方法によって、（乾燥重量１ ｇ当たりの）全細胞メチオニン含量および細胞外環境（細胞フリーのスペント（ ｓｐｅｎｔ）培地）中のメチオニン含量の定量をはっきりとした液体培地中での 増殖により達成する。公知技術による異種遺伝子で形質転換したメチオニン過剰 生産株で行った（メチオニン補足なしの）低酵母二牛ス発酵の結果、ノルロイシ ンの異種ポリペプチド類への取り込みが阻止される。

実施例１１　メチオニンに代えて置き換えたノルロイシンを含有するｒｂＳｔの 酸化安定性の増加 蛋白を３％Ｈ，Ｏ，に暴露し、続いて逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で分析す ることにより、メチオニンがノルロイシンによって置き換えられているｒｂＳｔ の対酸化安定性の増加を測定した。Ｈ＊　Ｏｔへの暴露に際し、天然ｒｂＳｔ（ ノルロイシン−フリー）は、ＲＰ−ＨＰＬＣによると２つのより初期の溶出位置 にシフトした。第１の位置シフトは非常に急速に起こり（半減期約１．２分）、 分子のサイトＡにおける修飾のため、修飾ｒｂＳｔ分子をして、既にＨ，Ｏ。

に暴露されたｒｂＳｔよりわずかに早く溶出せしめた。第２の位置シフトはより ゆっくりと起こり（半減期約１４．３分）、その結果、分子のサイトＢにおける 修飾のため、より大きいＲＰ−ＨＰＬＣシ４個のメチオニン残基を表すために任 意に名付けたものである）。

各々メチオニン−およびノルロイシン補足発酵から得られた天然ｒｂＳｔ（メチ オニン−フリー）およびノルロイシン−置換（ｒｂＳｔ位５．１２４．１４９お よび１７９において約３６％ノルロイシフ）ｒｂＳｔを、室温で、２ｍｇ　ｒｂ Ｓｔ／ｍＱにて、５ｍＭ（ＮＨ，）、Ｃｏ、、ｐＨ１０，０中の３％Ｈ！　Ｏ＊ に暴露した。暴露に続き、該Ｈ，Ｏ，を同緩衝液中で平衡化したファルマシア（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ＰＤ−１０Ｇ−２５カラム上のゲル濾過によって除去した 。次いで、試料をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。４０分の暴露の後、天然ｒ ｂＳｔは、各々、サイ）ＡおよびＢの１００％および８５．６％修飾を呈し、一 方、ノルロイシン−置換ｒｂＳｔはこれらのサイトの４７．６％および５１．４ ％修飾を含有するに過ぎなかった。従って、ノルロイシンによるメチオニンの置 換は、ＲＰ−ＨＰＬＣ挙動によって決定されたごと（、ｒｂＳｔ分子に対する酸 化安定性の増大に寄与した。

遺伝子におけるメチオニン・コドンの置換天然ｒｂＳｔ遺伝子についてのメツセ ンジャーＲＮＡ転写体の翻訳の結果、５位におけるメツセンジャー残基の取り込 みが起こる。

ｒｂＳｔにおけるメツセンジャー残基によって通常占められる他の位置に関して は、位置５をノルロイシン残基によって置き換えることができる。従って、メチ オニン・コドンのメチオニン以外のアミノ酸についてのコドンでの置換はｒｂＳ ｔへのノルロイシン取り込みを阻止するであろう。

当業者によく知られた技術（１９８９年１月１９日出願のＵ、Ｓ。

Ｓ、Ｎ、　０７／２９９．１０７）に従う合成オリゴヌクレオチドの組み込みに よって、ｒｂＳｔをコード付けする遺伝子における５位のメチオニン・コドンＡ ＴＧをイソロイシンをフード付けするＡＴＣに変化させ、その結果、ｒｂｓｔｍ ｏと命名した構築体を得た。

２５０リツトル規模での低酵母エキス培地中での撹拌タンク発酵の間、この遺伝 子を有するベクターを持つベクターを担持するイー・フリ宿主の増殖およびそれ によるｔｂｓｔ合成をモニターした。発酵培地試料を発酵の間に得て、アミノ酸 分析に付した。加えて、ｒｂＳ　ｔを単離し、Ｎ−末端アミノ酸配列決定に付し て５位に見い出されるアミノ酸残基を定量した。発酵の間にノルロイシンが生産 され、発酵の最後までに細胞外に０．３６ｍＭの終濃度まで蓄積された。ｍｏ遺 伝子によってコード付けされるｒｂＳｔのＮ−末端アミノ酸配列決定により、イ ンロイシンのみが５位に存在し、ノルロイシンまたはメチオニンは存在しないこ とが明らかとされた。

同様に、ｒｂＳｔ分子における他の位置のメチオニン・コドンの置換はノルロイ シンのｒｂＳｔへの取り込みを阻止するであろう。

Ｘ線結晶分析は、メチオニン残基５位がはっきりとした２次構造をほとんど持た ないｂｓｔの部分に存在し、残基１２４および１７９はアルファ・ヘリックスに 存在し、１４９は、β巻とほとんど同様に、鎖逆転の領域に存在することを示す （ニス・ニス・アブデルーメギドら（Ｓ、　Ｓ、　Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ、 ｅｔ　ａｔ）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　８４．６４３４−３７頁（１９８７））、チ ョウおよびファスマン（Ｃｈｏｕ　ａｎｄ　Ｆａｓｍａｎ）の予測パラメーター は残基５．１２４および１７９周囲の２次構造を正しく予ａｌｌするが、残基１ ７９はβ−プリーツシートの領域に存在すると誤って示唆する（ビイ・シイ・チ ョウおよびシイ・ディ・ファスマン（Ｐ、　Ｙ、　Ｃｈｏｕ　ａｎｄ　ＧＤ、　 Ｆａｓｍａｎ）、アヌ・レブ・バイオケム（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、）、　　４７゜２５１−７６　（１９７８）；シイ・ジェイ・エイチ・ジエ ンおよびエム・ソネンブルグ（Ｃ，Ｊ、　Ｈ，Ｃｈｅｎ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓｏｎ ｅｎｂｕｒｇ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　　１６．　２１ １０　１８頁（１９７７））。。

ウシ（エル・グラフおよびシイ・エイチ・リイ（Ｌ、　Ｇｒａｆ　ａｎｄ　Ｃ。

１（、Ｌｉ）、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミューニケー ションズ（Ｂｉｏｃｈｅｉ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、）、 　　５６＋　　１６８−７６頁（１９７４））　、ブタ（ビイ・エイチ・シーベ ルブら（Ｐ。

Ｈ，Ｓｅｅｂｅｒｇ、　　ｅｔ　ａｌ）、ディ・エフ・エイ（ＤＮＡ）、２．３ ７−４５頁（１９８３））、ヒツジ（シイ・エイチ・リイら（Ｃ，’Ａ、　Ｌｉ 、　ｅｔａｌ）、インド・ジェイ・ベブ・ブｏ・レス（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐ 、　Ｐｒｏ、　Ｒｅｓ、）。

４、．１５１−５３頁（１９７２））、ウマ（エム・エム・ザキンら（Ｚａｋｉ ｎ、　ｅｔ　ａｔ）、インド・ジェイ・ベブ・ブｏ−レス（Ｉｎｔ、　Ｊ。

Ｐｅｐ、　Ｐｒｏ、　Ｒｅｓ、）＋　　ｓ、　　４３５−４４頁（１９７６）） 、う・／ト（シイ・ニス・ペイジら（Ｇ、　Ｓ、　Ｐａｇｅ、　ｅｔ　ａｌ）、 ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ０ｆｕｅ１．　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、　９ ．　２０８７　２１０４頁（１９８１））、ヒト（エフ・エム・プツトら（Ｆ、 　Ｍ、　ＤｅＮｏｔｏ、　ｅｔａｌ）、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ（Ｎ ｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、　　９＋３７１９−３０頁（１９８１）） 、サル（シイ・エイチ・リイら（Ｃ，Ｈ，Ｌｉ、　ｅｔ　ａｌ）、アーカイブズ ・オブ・バイオケミストリー・アンド・パイフィジックス（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、）、　　２４５゜２８７−９１頁（１９８６）） 、およびニワトリ（エル・エム・スーザら（Ｌ、　Ｍ、　５ｏｕｚａ、　ｅｔ　 ａｌ）、ジャーナル・オブーｘクスペリメンタル・ズーロジ−（Ｊ、　Ｅｘｐ、 　Ｚｏｏｌ、）、　　２３２．４６５　７３頁（１９８３））ソマトトロピン類 のアミノ酸配列の分析は、ｂｓ　ｔ。

ｐＳ　ｔ、○Ｓｔ、ｅＳｔ、ラットＳｔおよびニワトリＳｔにおける５位のメチ オニンはヒトおよびサル・ソマトトロピンにおけるイソロイシンであることを示 す。ニジマス（エル・ビイ・アゲロンおよびティ・ティ・ヘン（Ｌ、　Ｂ、　Ａ ｇｅｌｌｏｎ　ａｎｄ　Ｔ、　Ｔ、　Ｃｈｅｎ）、ディ・エフ・エイ（ＤＮＡ） 、５，４６３−７１頁（１９８６））およびサケ（ニス・七キンら（Ｓ、　５ｅ ｋｉｎｅ、　ｅｔ　ａｌ）、欧州特許出願８５１０７９８７．１号）のアミノ酸 配列は哺乳動物およびニワトリＳｔからかなり発散しており、これらの配列の配 置はこの領域では困難である。

１２４位におけるメチオニンは７種の哺乳動物およびニワトリ・ソマトトロピン 類で不変である。

ウシ、ヒツジ、およびラットＳｔにおける１４９位のメチオニンはブタ、ウマ、 およびニワトリＳｔにおけるロイシンおよびヒトおよびサルＳｔにおけるセリン である。ニジマスおよびサケＳｔにおける対応アミノ酸はほとんどロイシンのよ うである。ヒトおよびサルＳｔの残基１４７〜１４９についてのスレオニン−ア スパラギン−セリンのアミノ酸配列は、イソアスパラギン酸の形成および鎖切断 がそこで起こるｂｓｔおよびｐＳｔの９８〜１００と同一であるので、メチオニ ン１４９をセリンに変化させると同一タイプの切断に至り得る。

ｂｓｔＳｐＳｔ、ｏＳｔ、ラットＳｔおよびニワトリＳｔにおける１７９位のメ チオニンはヒトおよびサルＳｔにおけるバリン、およびニジマスおよびサケＳｔ におけるアラニンである。

哺乳動物およびニワトリ・ソマトトロピンのアミノ酸配列において、ｂｓｔにお いてメチオニン以外のアミノ酸が生じ、メチオニンがもう１つの種からのＳｔで 見い出されるさらに４つの位置がある。

ｂＳｔＳｐＳｔ、ｏＳｔ、ｅＳｔ、ラットＳｔおよびニワトリＳｔにおける１５ 位のバリンはヒトおよびサル・ソマトトロピンにおけるメチオニンである。ｂＳ 　ｔ、ｏＳｔＳｈｓ　ｔ、およびサルＳｔにおける７３位のロイシンはｐＳｔに おけるバリンおよびウマ、ラット、およびニワトリＳｔにおけるメチオニンであ る。ｂｓｔ、ｐＳｔ。

ｏＳ　ｔ、Ｓ　ｔＳ、ｈＳｔ、サルおよびニワトリＳｔにおける１０２位のバリ ンはラットＳｔにおけるメチオニンである。最後に、ｂｓｔ。

ｐ　Ｓ　ｔ　、ｏ　Ｓ　ｔ　１ｅ　Ｓ　ｔ　ｓラットおよびニワトリＳｔにおけ る１６９位のロイシンはヒトおよびサルＳｔにおけるメチオニンである。

哺乳動物およびニワトリ・ソマトトロピンにおける非メチオニン／メチオニン置 換の中では、１６例（例＝位置数＋その位置におけるバリンを持つ種の数）にお いて、バリンが４位におけるメチオニンを置き換え、ロイシンおよびメチオニン は３位および１３例で相互交換可能であり、インロイシンは１位および２例でメ チオニンを置き換える。

前記のことを考慮すると、ｂｓｔにおける４個の含メチオニン部位が独立と考え られると、５位についての好ましい変化は前記したごとくインロイシンへのもの であり、１２４位における不変メチオニンについてもやはりそうである。バリン もまた好ましい。１４９位についてはロイシンが好ましい。１７９位については バリンが好ましい。

ｂｓｔにおけるすべての４個のメチオニン残基が単一の同一アミノ酸に変化する 場合、選択は１）ロイシン、２）バリン、または３）イソロイシンである。

同様の分析により、他の異種ポリペプチド類におけるメチオニンに代えての他の 適当なアミノ酸置換も当業者ならば選択できる。

実施例１３　ロイシン、イソロイシン、およびバリンでの補足が組換体ウシ・ソ マトトロピンを生産するための発酵に与える影響 り一ロイシンでの低酵母エキス発酵の補足は株ＢＳＴ−１によるノルロイシンの 合成を完全に抑制した。加えて、かかる発酵により、Ｎ−末端アミノ酸配列決定 に付した場合に、ｒｂＳｔ分子の５位にノルロイシンを含有しないｒｂＳｔを生 じた。しかしながら、低酵母エキス発酵のし一ロイシンでの補足は、単独で、培 養増殖を乱し、ｒｂＳｔ生産量を低下させた。

Ｌ−ロイシン補足により媒介される可能性のある培養増殖がイソロイシンおよび ／またはバリンのｄｅ　ｎｏｖｏ合成に与えるいずれの抑制をも解消するために 、Ｌ−ロイシン、Ｌ−インロイシン、およびＬ−バリンでの補足を用いて発酵を 行った。各３種のアミノ酸での補足は、Ｌ−ロイシンのみで補足した平行発酵と 比較して大いに培養増殖を促進させた（各々、４４．９および１２．９Ａｓｓｏ の培養密度）。加えて、ロイシン、イソロイシン、およびバリンでの補足の結果 、ロインンー補足発酵からの単に０．４３グラムｒｂＳｔ／リツトルと比較して 、１．９７グラムｒｂＳｔ／リツトルの最終ｒｂＳｔ力価となった。Ｎ−末端ア ミノ酸配列決定データにより、いずれの低酵母エキス発酵から得たｒｂＳｔにつ いても５位にノルロイシンが存在しないことを明らかとされた。さらに、定量的 アミノ酸分析により、いずれの発酵についての発酵培地試料にもノルロイシンは 検出されなかった。まとめると、これらのデータは、ｒｂＳｔの生産についての 低酵母エキス発酵のし一ロイシン補足はノルロイシンｔ７）ｄｅ　ｎｏｖｏ合成 およびｒｂＳｔ分子へのその取り込みを抑制するという観察を支持する。

第１表 接種に先立って得た、およびＢＳＴ−１発酵の間のｒｂＳｔ合成の自然誘導時に 得た発酵培地試料におけるアミノ酸濃度６アミノ酸濃度（ｍＭ）ｂ アミノ酸　　　　　　　　　最初　　　　誘導時アラニン　　　　　　　　０． ３５　　　０．０４アルギニン　　　　　　　０．０７　　　０．００アスパラ ギン　　　　　　０．０６　　　０．００アスパラギン酸　　　　　０．１０　 　　０．００システイン　　　　　　　　ｎｄｅ　　　　ｎｄグル９ミン　　　 　　　　０．１６　　　０．０３グルタミン酸　　　　　　　０．１６　　　　 ０．０３グリシン　　　　　　　　０．１３　　　０．００ヒスチジン　　　　 　　　０．０４　　　０．００インロイシン　　　　　　０．２３　　　０．０ ０ロイシン　　　　　　　　０．３８　　　０．０３リジン　　　　　　　　　 ０．０３　　　０．０２メチオニン　　　　　　　０．０７　　　０．００フエ ニルアラニン　　　　０．１９　　　０．００プロリン　　　　　　　　　０． １６　　　０．０３セリン　　　　　　　　０．１３　　　０．００スレオニン 　　　　　　　０．１３　　　０．００トリプトフアン　　　　　０゜０５　　 　０．００チロシン　　　　　　　　０．０６　　　０．０３バリア　　　　　 　　　　０．２８　　　０．０３６接種約１５時間後に自然に誘導されたｒｂｓ ｔ合成″０．１％（重ｊｌ／容量）酵母エキスでの補足によって発酵培地を調製 した。示されたグルタミンおよびグルタミン酸濃度は定量されたグルタミン＋グ ルタミン酸（Ｇｌｘ）の５０％である。

第２表 ノルロイシンの合成および分泌と非補足低酵母エキス発酵の間に合成されたｒ　 ｂ　Ｓ　ｔへのノルロイシンの取り込みとの間の関係時間（接種後）１１　　ノ ルロイシン取込（モル％）ノルロイシン濃度Ｎ−末端　　　５位　　　　　（ｍ Ｍ）１９．０　　　　　０．０　　　　２．６　　　　　０．０２５．０　　　 　　１．４　　　１８．３　　　　　０．１３３．５　　　　　２．０　　　２ ４．９　　　　　０．６”ｒｂＳｔ合成の自然誘発は接種後約１５時間に起こっ た。

第３表 株ＢＳＴ−１での発酵の間の、Ｄ、１．−ノルロイシンまたはＬ−メチオニンで の補足がｒｂＳｔのＮ−末端および５位におけるノルロイシンの取り込みに与え る影響 培地ノルロイシン取り込み（モル％） 補足″　　　　　　　　　　　　Ｎ−末端　　　５位非補足　　　　　　　　　 　　　　２．１　　　２２．１３ｍＭ　Ｄ、Ｌ−ノルロイシン　　　４．４　　 　３４．３５ｍＭ　Ｌ、−１ｆオ＝７　　　　　０．２　　　　０．０８接種後 ３０時間に収穫した発酵試料 ５前記で示した補足に加えてすべての培地を０．１％醇母エキスで補足した。

第４表 −株ＢＳＴ〜１での発酵の間の、飼料および食品グレードのり、　Ｌ５、　　　 −メチオ°′で０補足がｒｂｓｔＯＮ−末端お２び５位における′ルロイシンの 取り込みに与える影響１ 培地　　　　　　　　　　　ノルロイシン取す込み（モル％）補足”　　　　　 　　　　　　　Ｎ−末端　　　　５位非補足　　　　　　　　　　　　２．０４ 　　　２４．９１５ｍＭ　Ｌ−）ｆｔエニン　　　　０．００　　　　０．００ ５ｍＭ　Ｄ、ｌ、−メチ、ｉ＝７　　　　ｏ、ｏｏ　　　　　Ｏ，０７飼料グレ ード０ ５ｍＭ　Ｄ、　Ｌ−ｙｌ＋オ＝７　　　０．００　　　　０．００食品グレード １接種後３１時間に収穫した発酵試料　１前記で示した補足に加えてすべての培 地に０．１％酵母エキスを補足した。

ｃＤ、Ｌ−メチオニンの飼料および食品グレード源はデグサ・コーポレーシ１ン （Ｄｅｇｕｓｓａ　Ｃｏｒｐ）がら得た。

第５表 ノルロイシン生合成および分泌と株ＢＳＴ−１にょるｒｂＳｔの合成との間の関 係 株　　　　ブラスミＦ　　　　　　　　　　乾燥型１１　　　ノルロイシン　　 　　ノルロイシン濃度（ｇ／リフドル）　濃度（ｍＭ）　（ｍＭ／ｇ乾燥重量） ＢＳＴ−１ｐＵＲＡ４　　　　　　５．４　　　０．７３　　　　０．１４ＢＳ Ｔ−ＩＣ無し　　　　　　ｌ：（，３０，０９０，０１ＢＳＴ−ＩＣｐｕＲＡ４ 　Ａｂｇｈｔｚｏ　　１１．７　　　０．１２　　　　０．０１６発酵は各々二 連で行い、データは平均値として示す。発酵培地は０．１％酵母エキスで補足し た。

第６表 株ＢＳＴ−１での発酵の開の、Ｌ−ロイシン補足がｒｂＳｔのＮ−末端および５ 位におけるノルロイシンの取り込みに与える影響培地　　　　　　　　　　　ノ ルロイシン取り込み（モル％）補足Ｉ′Ｎ−末端　　　　５位 非補足　　　　　　　　　　　１．３　　　　２２．０°　各々、非補足および ロイシン−補足発酵についての、接種後４０および４６時間に収穫した発酵試料 ５前記で示した補足に加えて、発酵培地には０．１％酵母エキスを補足した。

第７表 Ｌ−システィン補足がフルロイシンの生合成および分泌とノルロイシンのｒｂＳ ｔへのフルロイシンの取り込みに与える影響ａ培地　　　　　　　ノルロイシン 　ノルロイシン取り込み（モル％）補足５　　　　　　濃度（ｍＭ）　　　　Ｎ −末端　　　５位非補足　　　　　　０．７３　　　　１．７　　　２１．８５ ｍＭ　　Ｌ−システィン　　　　　　１．１８　　　　　　　　　１．６　　　 　　　　１８．９１５ｍＭ　　Ｌ−システィン　　　　　　０．５９　　　　　 　　　　１．１　　　　　　　１３．８６発酵試料は接種後４０時間に収穫した 。

５前記で示した補足に加えて発酵培地に０．１％酵母エキスを補足した。

チャート１．　ウシ・ソマトトロピンのアミノ酸配列　−ａｈａ　ｐｈａ　ｐｒ ｏ　ａｌａ　ｔＩＩａｔ　ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ｓｅｘ　ｇｌｙ　ｌａｕ　ｐｈａ　 ａｌａ　ａｓｎ　ａｌａ　ｖａｌｐｒｏ　ｔｈｒ　ｇｌｙ　ｌｙｓ　ａｓｎ　ｇ ｌｕ　ＪＬＩＪＬ　ｇｉｎ　ｇｉｎ　ｌｙｓ　ｓａｒ　ａｓｐ　ｔａｕ　ｇｌｕ 　１ａｕｌａｕ　ａｒｇ　ｌｌ＠ｓａｒ　Ｌｅｕ　ｌ＠ｕ　ｌａｕ　ｉｌａ　ｇ ｌｎ　ｓｅｔ　ｔｒｐ　ｌｅｕ　ｇｌｙ　ｐｒｏ　１ａｕｌａｕ　　ａｌａ　　 ｌａｕ　　＋ｎａｅ　　ａｒｇ　　ｇｌｕ　　ｌｅｕ　　ｇｌｕ　　ａｓｐ　　 ｇｌｙ　　ｃｈｒ　　ｐｒｏ　　ａｒ■@　ａｌａ　　ｇｌｙ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年７月２５日　１

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．発酵培地において、メチオニン濃度を増加させるか、またはノルロイシンの 量を減少させるか、あるいは双方を行うことを特徴とする、低濃度のアミノより なる発酵培地上で増殖させた微生物類によって発現されるポリペプチド類へのノ ルロイシンの取り込みを減少させる方法。
2. ２．該培地をメチオニンまたはロイシンあるいは双方で補足することよりなる請 求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該培地をシステインで補足することよりなる請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．該微生物が組換体宿主微生物であってかく発現されたポリペプチドが異種ポ リペプチドである請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．該組換体宿主微生物がバチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ） 、およびエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ．）株よりなる群から選択される請 求の範囲第４記載の方法。
6. ６．該組換体微生物がエシェリヒア・コリであって該異種ポリペプチドがソマト トロピンである請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．該ソマトトロピンがウシ・ソマトトロピンである請求の範囲第６項記載の方 法。
8. ８．低濃度のアミノ酸を有し、かつ培地においてメチオニンの量を増加させるか またはノルロイシンの量を減少させる、あるいは双方を行う化合物を補足した発 酵培地。
9. ９．該補足化合物がメチオニン、ロイシンおよびシステインから選択される請求 の範囲第８項記載の発酵培地。
10. １０．メチオニン生合成酵素類について抑制され、メチオニンを過剰生産する突 然変異体微生物を利用することを特徴とする低濃度のアミノ酸上で増殖された微 生物類によって発現されたポリペプチド類へのノルロイシンの取り込みを阻止す る方法。
11. １１．該突然変異体微生物が組換体宿主微生物であってかく発現されたポリペプ チドが異種ポリペプチドである請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．低濃度のアミノ酸を有する発酵培地上で微生物を増殖させることを特徴と する該微生物によって発現されたポリペプチド類へのノルロイシン取り込みを引 き起こす方法。
13. １３．該微生物が組換体宿主微生物であってかく発現されたポリペプチドが異種 ポリペプチドである請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．さらに、メチオニンを有しない発酵培地へノルロイシンを添加することよ りなる請求の範囲第１２項記載の方法。
15. １５．該微生物が組換体宿主微生物であってかく発現されたポリペプチドが異種 ポリペプチドである請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．低濃度のアミノ酸を有する発酵培地上でエシェリヒア・コリを増殖し、次 いで、該エシエリヒア・コリによって生産されたノルロイシンを単離することを 特徴とするノルロイシンの生産方法。
17. １７．少なくとも１つのメチオニン残基が少なくも１つの異なるアミノ酸で置き 換えられたウシ・ソマトトロピン。
18. １８．該少なくとも１つの異なるアミノ酸がイソロイシン、ロイシンおよびバリ ンよりなる群から選択される請求の範囲第１７項記載のウシ・ソマトトロピン。
19. １９．該少なくとも１つの異なるアミノ酸がイソロイシンである請求の範囲第１ ８項記載のウシ・ソマトトロピン。
20. ２０．異種ポリペプチドをコード付けする組換体ＤＮＡ分子におけるメチオニン をコード付けするコドン類を異なるアミノ酸をコード付けするものに変化させる ことを特徴とする該ＤＮＡ分子で形質転換された微生物によって発現された該ポ リペプチド類へのノルロイシン取り込みを阻止する方法。
21. ２１．該異種ポリペプチドがソマトトロピンである請求の範囲第２０項記載の方 法。
22. ２２．該少なくとも１つの異なるアミノ酸がイソロイシン、ロイシンおよびバリ ンよりなる群から選択される請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．該少なくとも１つの異なるアミノ酸がイソロイシンである請求の範囲第２ ２項記載の方法。
24. ２４．該異種ポリペプチドがウシ・ソマトトロピンである請求の範囲第２１項記 載の方法。
25. ２５．該異種ポリペプチドがウシ・ソマトトロピンである請求の範囲第２２項記 載の方法。
26. ２６．該異種ポリペプチドがウシ・ソマトトロピンである請求の範囲第２３項記 載の方法。