JPH03503314A - 蛍光測定器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光測定器 本発明は、蛍光測定器に関する。

現在の蛍光測定器は、かなりの大きさの研究所計器であり、１５０ワツトのキセ ノン・ランプ源の如き高電力の光源と高電圧の光電増倍管（フォトマルチプライ ヤ）検出器を使用する。

このような計器は、良好なものであっても、研究所の諸条件において習熟したオ ペレータによる使用に限定される。

本発明の目的は、研究所の条件に制限されることがない蛍光測定器を提供するこ とにある。

本文に使用される蛍光測定器なる用語および類似の用語は、当業者には理解され るように類似する蛍光、燐光およびルミネセンス、および蛍光の分析基準を用い る較正ステップを含む類似技術の少なくとも１つを使用する計器を包含する。

本発明によれば、励起時に第１の特定の蛍光放射を生じることが予期される試料 の閃光蛍光分析法が提供され、この方法は、 「ブランク（ｂｌａｎｋ）　Ｊ分析（空試験）の実施に際して：励起時に第２の 特徴的な基準放射を生じることが予期される基準発蛍光団をテスト位置に支持し 、 励起放射のパルスを前記テスト位置へ加え、テスト位置からの放射を、前記第１ の放射に対する各検出器および第２の放射に対する各検出器により調べ、検出器 の相対的な応答から、試料がない時のテスト位置からの放射に対する「ブランク 」値を決定し、またある試料分析の類似の実施に際して：入射放射による励起時 に前記特定の放射を生じることが予期される試料を、基準発蛍光団の維持された 存在時に前記テスト位置に支持し、 前記テスト位置からの放射を前記各検出器により調べ、検出器の相対的な応答か ら、試料の存在時にテスト位置からの放射に対する試料値を決定し、 前記「ブランク」値および試料値を評価して、較正ステップに関して前記試料を 分析することを含む方法が提供される。

有利なことには、基準発蛍光団は、試料を保有するキュベツトの構造内に、ある いは別の試料支持形態内に包含される。

このキュベツトは光学的構造性のものでよい。

分析用の試料は、前記の特定の放射を生じるため蛍光を発し得るべく反応するサ ンプルおよび試薬でよい。

このサンプルおよび試薬の一方は「ブランク」分析中存在し、他方は「ブランク 」分析後に添加される。基準発蛍光団は、このサンプルおよび試薬の一方に含む ことができる。

本方法は、安定した基準蛍光放射を確保するため基準分析と試料分析間の時間を 制限することを含むことができる。

試料の蛍光分析のための計器はバッテリ駆動され、かつ制御回路と、閃光管と、 この閃光管から試料位置を経て光検出器に至る光経路とを含むことが望ましく、 前記制御回路は、この制御回路により処理して較正ステップに関し前記試料位置 における試料から特定の放射レベルを比率計的（レシオメトリック）比較法によ り決定するため、作動時に基準蛍光を含む放射を前記検出器に対して与えるため 、試料位置を通る適当な放射を生じるように閃光管を充電させて発光させるよう 作用する。

本発明によれば、画成された構成内に光学素子を収受して保持する開口が設けら れた材料体に形成された光学的構造が蛍光内に設けられ、この材料体は、試料を 収受して試料を特定の位置に保持する試料開口と、放射源を受取りこの源を前記 試料開口に対して特定の位置関係に保持する放射源開口と、この放射源開口と試 料開口間に特定の経路を提供する入射放射経路開口と、出力放射経路開口を画成 して前記試料開口から放射検出器に至る出力放射経路を提供する検出器開口とを 提供する。

前記材料体は、全てが一つとなった一体のものでよい。この材料体は、ビーム・ スプリッタを前記出力経路内の特定の位置に収受して保持する出力放射経路開口 内にビーム・スプリッタ開口と、このビーム・スプリンタ開口からの出力放射成 分経路を画成する出力放射成分開口とを、前記放射成分経路内の各検出器開口と 共に提供することができ、これにより前記材料体が前記開口の周囲に前記試料開 口に対して光学素子の画成された構成を保持する。前記ビーム・スプリッタは、 部分反射タイプまたは光ファイバ・タイプのいずれでもよい。

本発明によれば、蛍光測定器には光経路構成を保持する材料体が設けられ、この 材料体は不透明材料製であり、前記光経路構成内に光学系要素を収受して保持す る開口を内部に画成し、前記材料体により画成されるこれらの開口は、使用に際 して試料を収受して試料を特定の位置に保持する試料開口と、放射源を収受して この源を試料開口に対し特定位置に保持する放射源開口と、放射源と試料開口間 に特定の放射経路を提供する入力放射経路開口と、試料開口から放射検出器開口 に至る特定出力放射経路を画成する出力放射経路開口とを含み、これにより材料 体は前記開口の周囲に前記試料開口に対して光学素子の画成された構成を保持す る。

前記開口は、その内部に放射強度および放射周波数範囲の少なくとも１つを制御 する光制御要素を組み込むことができる。

本発明によれば、放射源に対する開口を画成する一体の熱伝導性の不透明材料の 蛍光測定器の光コア構造と、試料入力放射経路と、検査のための試料と、試料出 力放射経路とが設けられ、材料体は前記開口の周囲に前記開口と、試料開口の周 囲に画成された構成で光学素子を保持する。

本発明の実施例については、添付図面に関して以下に述べることにする。図にお いては、 第１図は、光学素子を略図的に示した本発明による蛍光測定器の光学系部分の部 分断面を示し、 第２図は、第１図の蛍光測定器と関連する電子回路のブロック図、および 第３図および第４図は、本発明による更に別の蛍光測定器の光学系部分を部分断 面で示す。

診断的化学分析、飲用水供給試験および環境監視においては、「現地」試験なら びに確立された中央集中研究作業に対する漸増する需要がある。上記３つの分析 領域の全てにおいて、蛍光光度測定は充分に確立された研究手法であるが、蛍光 分析法を用いてなされるべき「現場」または「本撚」の測定を可能にする計器は 使用できない。上記の如く、燐光、遅延蛍光およびルミネセンス測定は、本文の 記述のための蛍光なる用語に含まれるべき蛍光に非常に類似する。

現在の蛍光測定器設計においては、高い感度は、光電圧の光電増倍管検出器と関 連して高出力の励起光源（例えば、１５０ワツトのキセノン・ランプ）を用いる ことにより達成され、試料は高精度石英発振セル内に保有される。このような試 みは研究所内の計器においては受は入れられるが、バッテリ駆動の蛍光測定器に は不適当である。

次に、レシオメトリック２連蛍光測定器および関連する検定システムについて述 べる。この蛍光測定器は、強いＵＶ−Ｖ　ＴＳ放射の同じパルスからの２つの波 長における蛍光を測定する。

携帯可能なバッテリ駆動蛍光測定器および低コストの研究室の蛍光測定器の双方 の構造が可能となる。

本発明を実施する装置は、サンプルを透過した復興なる波長で測定された連続す る放射パルスを用いるレシオメトリック法による測定を行う。これらの連続する パルス間には問題となる反応が生じ、連続的な測定がこの反応についての情報を 提供する。本方法は、較正がこれに取り込まれている。このため装置を簡単にし て、現場使用を可能にする。研究室での使用は含まれず、実際には本装置よりも コスト安くかつオペレータの習熟度をそれほど必要としないためより広い可能性 を持つ。

第１図は、本発明による蛍光測定器の部分的断面による概要を示している。この 蛍光測定器においては、適当なフレーム構造（詳細には示さない）が種々の要素 を支持するよう構成されている。構造の詳細は当業者には明らかであろうが、重 要な点について述べることにする。以下に述へる１つの形態においては、フレー ム構造は金属ブロックである。

ザツブルあるいは他の材料を保有するキュベツト５に対するホルダー５１は、放 射源１から特定の放射検出器１０および基準放射検出器１２を含む検出器組立体 に至る光経路あるいは曲の放射経路内にキュベツトを正確に定置する。作動にお いては、基準蛍光放射源は、以下に述べるようにキュヘットの位置に設けられる 。

源１とキュベツト５間において、放射経路は開口２．３および石英ウィンドウ４ を有する。源１は、強さの大きなキセノンを充填した閃光管であることが望まし く、必要に応じて遮光フィルタ６が図示の如く開口２と３の間あるいは他の場所 に設けられて、キュベント内の材料の閃光エネルギによる分解を阻止する。フィ ルタ６は、キュベツトに達する放射の強さおよび（または）波長を制御するよう に配置することができる。

キュベツト５は、高精度石英セルでよく、あるいは例えばアクリル、ポリスチレ ンあるいは曲の光学用品質のプラスチック材料から射出成型により作られる使い 捨て構造のものでよい。

このキュベツトおよびホルダーは、取外した状態でも同じ相対的位置関係にキュ ベツトの再挿入を保証するようマークを付すべきである。

キュベツト５と検出器組立体間において、前記経路は石英ウィンドウ７およびビ ーム・スプリッタ８を含む。ビーム・スプリッタ８は放射を均等に分割し、ある いは一方のチャンネルにおける強さを増加するよう重み（例えば、８０対２０） を付すことができる。ビーム・スプリッタにより偏向されないエネルギは、特定 の放射に対する狭い帯域通過フィルタ９を経て特定の放射に対する検出器１０に 達する。ビーム・スプリッタにより偏向されたエネルギは、狭い帯域通過フィル タ１１を経て基準放射に対する基準放射検出器１２に達する。これらフィルタは 、予期される放射に対して適当な波長即ち周波数を有する。もし本計器がある特 定の用途のものであるならば、光学特性を最大にしかつ個別の特定のフィルタお よび放射フィルタの必要を排除するため、二色性のフィルタを用いることもでき る。石英ウィンドウは、キュベント・ホルダー内のキュベツトからこぼれた液体 を保持する。

光導管の如き光リンク１３が、基準放射検出器１２と特定放射検出器１０間に設 けられている。これは、特定放射検出器が常に基準放射の一定成分を受取ること を保証するためである。基準放射は、フィルタ１１の出力側から集められ、検出 器１０へ与えられる。

第１図の構造は、非常にコンパクトな形態に作ることができる。一実施例におけ る全体構成５３は、色々な要素が平削りおよび穿孔により形成された腔部内に収 容される４０ｍ＋のアルミニウムの立体の４０１ｒＩ＋四方の平面図を画成する 。キュベツトは、基本的には標準的な１０■四方（内のり寸法）の形態であり、 典型的には外側で１２ｍｍ四方である。ホルダー５１は、キュベツトが要求され た位置にのみ進入することを可能にするよう刻まれた溝を有するキュベツト面の 外接円より僅かに小さな直径の穴でよい。閃光管は、ポケット・カメラに使用さ れるタイプのものでよく、長さが略々３５ｏｍである。ビーム・スプリッタは１ ｉｅｌ　１ｅｓ−Ｇｒｉｏｔの如き構成部品サブライヤから容易に入手可能であ り、フィルタは入手可能な要素を研磨することにより形成できる。光リンクは、 ある長さの光ファイバでよい。

本装置を固体の熱伝導性ブロックに構成することにより、機械的な安定性が得ら れ、また携帯可能な使用が可能となるように熱安定性が助成され、固体のブロッ クは全ての重要な構成要素が衝撃抵抗構造になった強い「コア」即ち「心臓部」 を形成する。このコア即ち心臓部は、研究室計器にも等しく適している。

電力を供給しかつ蛍光測定器を制御するこの電子回路については、次に第２図に 関して概要を述べることにする。特定の要求のための適当な構成要素は当業者に は明らかであろうが、特別な特徴について述べることにする。

主要スイッチは、装置をオンにしかつ装置を自動的にゼロに設定する２系列の要 素１４Ａおよび１４１３を有する。スイッチ要素１４Ａは、電圧調整器１６がス イッチ１４Ａの閉路からある設定期間他の回路へ電力を供給することを許すタイ マー１５の作動を制御し、これによりこの設定期間の終りにオフ動作を生じる。

スイッチ要素１４Ｂは、閉路されると、閃光管駆動回路１８が電圧調整器１６を 介して充電するに充分な期間を調時するように構成された単安定マルチバイブレ ータ１７を使用可能状態にする。

単安定マルチバイブレーク１７の出力は、更に別の単安定マルチバイブレータ３ ０の「使用可能」　（イネイブル）端子へ直接接続され、また絶縁ダイオードを 介して閃光管駆動回路１８および単安定マルチバイブレータ２０の「使用可能」 端子に接続されている。上記の構成により、閃光管１が発光され、関連したタイ ミング信号が単安定マルチバイブレータ１７．２０．３０から得られる。

特定放射検出器■０および基準放射検出器１２は、フォトダイオードであること が望ましく、各演算増幅器２４．２５と接続されている。ゲート２２．２３はそ れぞれゲート演算増幅器２４．２５および各蓄電コンデンサ２６．２７間にある 。アナログ分割器２８は、コンデンサ２６．２７における電圧を受取りこれら電 圧の比率を表わす出力を生じるように構成されている。

この目的のため、単安定マルチバイブレーク２０は単安定マルチバイブレータ２ １と接続され、ゲート２２．２３が単安定マルチバイブレータ１７の作動に応答 して開く期間タイミング信号を生じる。この期間は、閃光管が最初に発光された 僅か後に単安定マルチバイブレータ１７によって生じ、その間フォトダイオード に入射する放射から生じる演算増幅器２４．２５の電圧出力がそれぞれサンプル されてコンデンサ２６．２７に蓄えられる。

光リンク１３（第１図）は、特定放射検出器が常に反射放射の一定の部分を受取 ることを保証する。これは、特定放射が存在しない時検出器の挙動を安定化する こと、および特定放射が生じる時その一貫した読みを保証することの２つの目的 を有する。単安定マルチバイブレータ３０は、分割器２８の出力側のゲート３１ を作動させるよう接続される。分割器２８の出力は、ゲート３１および差の演算 増幅器３６の第１の入力の双方に与えられる。ゲート３１の出力は、バッファ演 算増幅器３３の一方の入力におけるコンデンサ３２に接続されている。ゲート３ １が単安定マルチバイブレータ３０の作動によ、り開かれると、検出器に入射す る放射の比率を表わす分割器２８の出力はコンデンサ３２へ与えられ、演算増幅 器３３の作動により、この出力の値は、例えゲート３１が再び単安定マルチバイ ブレータ３０の作動により閉路された時でも保持される。演算増幅器３３の出力 は、差の演算増幅器３６の第２の入力に接続される。演算増幅器３６の出力は、 電位分割器４０へ与えられ、この出力のタップ・オフ部分が表示器３７に表示さ れる。表示器３７における表示は、差の演算増幅器３６の入力間の差を表わす。

スイッチ３８は、閉路されるとｔｌｉ安定マルチバイブレータ３９を使用可能状 態にし、これが閃光管駆動回路１８の充電を調時し、次いで閃光管を単安定マル チバイブレータ１７と同様に発光させる。単安定マルチバイブレータ２０および ２１は、上記の如く単安定マルチバイブレータ１７に対する単安定マルチバイブ レータ３９に応答して出力をサンプリングしてコンデンサ２６．２７にこれを蓄 える。特定放射検出器１０および基準放射検出器１２は放射に応答して、受取っ た特定および基準放射の比率の値が分圧器２８の出力により差の演算増幅器３６ の「第１の」入力のみに与えられる。差の演算増幅器３６に対するこれら入力の 値開の差は表示器に示される。

タイマー１５は、スイッチ３８の作動のための時間を制限するよう働く。もしス １イッチ３８が充分に早く作動されなければ、このサイクルはスイッチ＋４Ａ、 １４Ｂにより再始動されねばならない。略々５分が、閃光管が最初に発光される 時に得られる値をバッファ演算増幅器３３が保持するための適当な時間的限度で ある。

典型的な測定に対する蛍光測定器の作動については、キュベツトの論議の後に述 べることにする。

上記の如く、キュベツト５は適当なプラスチック材料から使い捨て可能な構成要 素としてモジュール化することができる。

本発明による蛍光測定器に対するモジュール化されたキュベツトの光学的要件は 、今日使用される使い捨てキュベツトにおける程厳格ではない。僅かに２つの透 明な面が必要とされ、これらの面は通常は隣接している。もしキュベツトが取外 されるならば、これを元に戻す際裏返さないことが重要である。

従って、これに抵触しないようにマークを付しあるいは形状を与えるべきである 。例えば、ホルダー５１は、面取りされたキュベツトの隅部と一致するように１ つの隔分に突起を持たせることができる。

例えば発蛍光団をキュベツトがモジュール化される材料中に含めることにより、 基準となる発蛍光団がキュベツト自体に内蔵できることが重要な特徴である。

発蛍光団をキュベツト中に含めることは非常に便利な措置であるが、他の手法を 用いることもできる。例えば、基準発蛍光団をキュベツト中に置かれた試薬に含 めることもできる。

重要な点は、安定な発蛍光団材料が蛍光測定器の光経路内に存在することである 。この材料は、就中、閃光の強さ、閃光の位置およびキュベツトの品質を含む全 ての蛍光測定器の可変要因を正規化し得る動的な光学的「基準」を提供する。

発蛍光団を含むキュベツトを用いる蛍光測定器を作動させるため、純水を保有す る如きキュベツトを１ブランク」材としてホルダー５１内に置き、スイッチ１４ Ａ、１４Ｂが作動される。この回路の自動的な作動により、上記の如き「ブラン ク」分析が最初に行われて「ゼロ」値を生じる。単安定マルチバイブレータ１７ が閃光管回路の充電を調時するよう作動し、次いでその出力が「ロー」となり、 閃光管駆動回路１８をトリガーして単安定マルチバイブレータ３０と共に単安定 マルチバイブレータ２０を始動する。閃光管からの放射が開口２．３および石英 ウィンドウ４を経てキュベツトに至り、キュベツトからの蛍光がビーム・スプリ ッタ８に達する。このビーム・スプリッタからの基準蛍光放射の一部が、検出器 １２による測定のため発蛍光団からの基準周波数に適する帯域通過フィルタ１１ へ与えられ、同時に池の部分が、特定周波数に適する帯域通過フィルタ９へ与え られ、従ってこれが検出器１０による測定のため発蛍光団からの基準周波数の放 射を阻止する。単安定マルチバイブレータ２０により設定される数マイクロ秒の 遅れの後、単安定マルチバイブレータ２１が作動して数ミリ秒のサンプリング期 間ゲート２２．２３を開き、演算増幅器２４．２５の出力を各コンデンサ２６． ２７に蓄える。上記の如く、帯域通過フィルタ９は基準放射が特定放射検出器１ ０に達することを妨げるが、先に述べたように光リンクがある放射を与える。こ の遅れは、行われる測定の種類に従って選択することができる。このように、い わゆる「短い周期」の蛍光が閃光後最初の２００マイクロ秒内で測定されるが、 当業者が理解するように、「時間的に分解した」蛍光が略々２００マイクロ秒以 降測定され、燐光は閃光後略々１０００マイクロ秒以上遅れて測定される。必要 に応じて、これらの測定を行うため適当な制御を回路に加えることが可能である 。

コンデンサに蓄えられた電圧は、分割器２８により用いられて特定および基準周 波数で検出された蛍光放射の比率を表わす出力値を生じる。単安定マルチバイブ レータ１７の出力がローとなり単安定マルチバイブレータ３０を始動すると、単 安定マルチバイブレータ３０はゲート３１を短期間開いて放射の比率を表わす分 割器２８の出力をコンデンサ３２に与える。ブランク・キュベツトによるこの放 射の比率を表わす値は、このように演算増幅器３３によりコンデンサ３２に保持 され、差の演算増幅器３６の第２の入力へ与えられる。放射比率の値を表わす分 割器２８の出力は、コンデンサ２６．２７が再びゲート２２．２３を介して荷電 されるまで、差の演算増幅器３６の第１の入力へ直接加えられる。キュベツトが 「ブランク」である時、基準蛍光のみが生じて、その結果差の演算増幅器３６に 対する入力が均衡するように構成され、ゼロ出力が表示器３７のディスプレイ上 に得られる。適当なリセット回路が表示器３７のため必要となることもある。

次に、キュベツトにおける「ブランク」は、試料分析を行うことができるように 分析のための試料で置換される。スイッチ３８が開かれ、タイマー１５がタイム アウトにならなければ、閃光管が回路の継続する自動動作の一部として発光する 。

この時、キュベツト内を通過する励起放射が、分析物が存在する時少なくとも２ つの蛍光、即ち試料が生じた蛍光と基準物質が生じた蛍光を生じる。これらの発 光の一部は石英ウィンドウ７を通り、次いでビーム・スプリッタ８へ進む。

試料からの蛍光は検出器１０．１２により集められ、その比率が差の演算増幅器 ３６の１第１のｊ人カへ加えられる。光リンクが再び放射の一部を検出器１０へ 与える。

ブランク・キュベツトに対する比率の値は既に差の演算増幅器３６の第２の入力 に維持され、そのため表示器３７はキュベツトにおける試料に対する比率の値と １ブランク」分析中の「ブランク」キュベントに対する比率の値との間の差を表 示することになる。計器の較正値を知ることにより、試料における蛍光を生じる 材料の量を決定することができる。

表示器３７のディスプレイの目盛り長さを電位分割器４０により設定することが できる。

タイマー１５は、計器あるいは基準となる発蛍光団の不安定により前記「ゼロ」 がもはや真でないように、ブランク・キュベツトにおける「ゼロ」の読みが試料 のテスト以前の遅れにより無効化されないことを保証する。

装置の較正のため既知の濃度の蛍光物質でドープされたブロックの如き蛍光分析 基準値を使用することは当技術において周知であり、このステップは必要な際に 行われるものとし、特に付言しない。

閃光は非常に短時間（１乃至５ミリ秒）である故に、サンプルの光分解は生じる 可能性は少ないが、励起波長を特定放射および基準放射の波長より短い波長に制 限するため遮光フィルタ６を内蔵してもよい。

非常に重要な特徴は、＋ユベットがモジュール化される熱可塑性材料中に蛍光マ ーカを含むことである。このようなキュベツトを用いて、２種類の波長の発蛍光 団を、先に述べたようにテストと同期して基準化（即ち正規化）することができ る。

このようなキュベツトを作るためには、従来周知の射出成型具を変更なしに使用 することができ、装入原料粒子を基準蛍光マーカで被覆するだけでよい。

このマーカは、フェノールまたはインドール、フルオレセイン、キニーネ（キニ ン）、アントラセン（ａｎｔｈｒａｃｉｎｅ）、ナフサＤ　７　（ｎａｐｔｈａ ｌｏｎｅ）　、オバレン（ｏｖａｌｅｎｅ）　、ｐ−ターフェニール（ｐ−ｔｅ ｒｐｈｅｎｙｌ）　、ターフェニールブタジェン（ｔｅｒｐｈｅｎｙｌ−ｂｕｔ ｏｄｉｅｎｅ）　、ｏ−ダミンＢ　（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　Ｂ）、コンパウンド ６１０、または他の類似のコンパウンドでよい。

マーカが微細な粉材として得られる場合は、このマーカを天然の粒材、ポリスチ レン、ポリメチルメタクリレート（ポリメタクリル酸メチル）、ＰＴＸあるいは 池の光学材料品質の熱可塑性材に対して「粉末散布」　（ダスチング）すること もできる。あるいはまた、このマーカは、熱可塑性材と混合しない溶剤中に溶解 させた後粒材をドープした溶剤中で洗浄すると、各粒材が微量の蛍光マーカで被 覆された状態にする。

次いで、この変成装入原料を用いてキュベツトを射出成型する。

蛍光の完全な均一性は必要でなく、他にも記載される如く方法論としては、１０ ％のパッチ当たりのばらつきは容認でき、各キュベツトが「ゼロ点化コされるこ とを必要とし、あるいはゼロ点化されたキュベツトに対し少なくとも見出される 。

これは、標準的な蛍光性粒子であるが、この基準蛍光が全システムの可変要因が 正規化される水準であるため、分析期間（１乃至１０分）において光学的に安定 でなければならない。

少量生産の場合は、簡単なモールドでよく、キュベツトはアクリルその他のポリ マーから形造され、この場合モノマーが少量の蛍光性マーカでドープされている 。この手法は、マーカの最適化および試験において有効である。キュベツト５が 例えば溶剤に対抗性のある高精度ケイ素セルである時、基準発蛍光団は試薬の１ つに包含するかあるいはシリカあるいはホウケイ酸塩材中にドープすることがで きる。キニーネ硫酸塩は、ある試薬中で使用するのに適する発蛍光団である。

ビーム・スプリッタの表面まで特定および基準波長が共通の経路を共有し、短期 間の励起閃光（１乃至５ミリ秒）中、特定および基準放射の検出器が同じ放射源 に同期的に応答することが判る。二次フィルタ９および１１を設けることは全く 変化を生じることがな（、また特定および基準放射検出器（同量のヒートシンク に取付けられる）間にドリフト差も存在せず、従って、比率 （特定放射）蛍光／（基準放射）蛍光 は、励起源の以降の閃光における変化の如何に拘わらず一定となる。このため、 蛍光分析においては、テストに対する特定の放射が測定されるチャンネルは基準 となるチャンネルに対して同期的に正規化（即ち標準化）される。燐光分析にお いては、光学的レイアウトは同じものであるが、特定放射チャンネルからの信号 取得は、燐光測定値を得る際数ミリ秒だけ遅れる。

ルミネセンス分析（ｌｕｍｉｎｏＩＩｅｔｒｙ）においては、高電力の励起ある いは軸線外光度のいずれも不要であるが、低電力の軸線上発光ダイオード（Ｌ　 Ｅ　Ｄ　）はこのような測定群に対して内部的な基準として役立ち得る。

上記の装置は、パッ゛テリ駆動による現場使用に特に適している。この装置は自 蔵バッテリを有するコンパクトな堅牢な構造とすることができる。電力消費は比 較的低い。閃光管発光回路を充電する電力が短時間のみ必要であり、残りの期間 は、半導体制御回路および表示器３７の作動させる小さな電力しか必要としない 。

本装置は、米国試験材料協会（ＡＳＴＭ）が改定した協定における使用に特に適 している。

第３図においては、このことは、ソリッド材料ブロックの内孔に光学要素を設置 することによりこのプロ、りに取付ケられた別の蛍光測定器の光学系の断面平面 図を第３ａ図に、またその断面立面図を第３ｂ図に示している。第３ｂ図におい ては、いくつかの要素が明瞭にするため省略されている。

３５３で示されるブロックは、便宜上平面において５０　Ｘ　５５ｍｍ、厚さが ３５ｍｍのアルミニウムの如き加工が容易な材料のブロックである。例示された 構成においては、内孔はソリッド・ブロックに切削されるが、他の方法、例えば 高精度グイキャストを用いることもでき、また材料も安定性および精度が維持さ れる限り特定目的に対して選定することができる。

前例のように、ボルダ−は、本例においては１６ｍｍ正方のキュベツトあるいは 他の試験片または試料保持具３０５を収受する溝を削った略々円形の内孔３５１ によりブロックの中心に向けて形成される。更に別の内孔３５２が内孔３５１と 平行に形成されて、本例ではキセノン閃光管（特に、Ｍａｐｌ　ｉｎタイプＦＳ ７７Ｊ）である放射源３０１を収受する。この閃光管は、閃光毎に０３ワット秒 のエネルギ入力で典型的に毎分６０回の速い閃光速度で閃光する。この閃光管は 、絶縁ブツシュ（図示せず）により内孔３５２に嵌合され、適当な電気接続が設 けられる。

内孔３５４．３５５．３５６が内孔３５１．３５２と交差する面内に設けられる 。これらの内孔は、種々の光学要素が嵌合された管を収受し、次いでこの管は所 要の光学的配置で、例えばブロック内の穴に螺合された３５８．３５９の如き止 めねじにより所定位置に固定的に保持される。これら内孔は直径が１４ｍｍであ ることが望ましい。

最初に内孔３５４について考察すれば、これはこの内孔に良好な滑り嵌めとなる 管の形態のフィルタおよびコリメータ組立体が設けられ、この内孔には各端部に 開口ディスク（３０２，３０３）が嵌合されるが、紫外線透過フィルタ３０６が 管の内側でホルダー３５１に最も近い端部に保持されている。開口ディスク３０ ２．３０３は、円形孔あるいはスリットまたは他の形状の開口を持ち、放射源３ 旧からの光の所要の規準化および強さの制御を行う。本実施例の紫外線フィルタ ３０６は、３００乃至３９０ナノメータの通過帯域を有する。このフィルタは、 ＴＥＣＩＩＮＩＣＯＮ（登録商標）分析器に嵌合される如き診断計器において使 用されるタイプのものであり、約３５６ナノメータをピークとし、３９６および ２９６ナノメータにおいて約１０％の透過率まで低減され、４２８．２６０ナノ メータにおいて最小透過率を有する非常に良好に規定された通過帯域を有する。

この組立体は、ホルダー３５１におけるキュベツトの０．５＋ｎ＋ｎ以内となる ように内孔３５４に定置される。

次に内孔３５５．３５６について考察する。内孔３５５は内孔３５４に対して直 角をなし、ホルダー３５１領域から出る放射を受取る。

４００ナノメ一タ以上の紫外線を遮断するフィルタ３７１は、内孔３５５がホル ダー３５１と出会う位置に嵌合されている。このフィルタは、ＢＡＬＺＥＲ８（ 登録商標）ＵＶ遮断フィルタであることが望ましい。ＵＶレンジまで拡がる石英 ビーム・スプリッタ３０８は一端部で１０００１１１１穴を、また内孔３５６と 一致する位置に置かれた側方でｉｏａｍの穴を有する１４ｗｍの外径の管３６０ に取付けられている。このビーム・スプリッタは、１０画の側方穴の軸心の中心 にありかつこれと直角をなす反射出力面を持つよう管内に配置される。管３６０ は、ｌ（ｂｎｍの側方穴の軸心が内孔３５６の軸心と整合した状態で内孔３５５ 内に嵌合されている。

２個の検出器組立体が、内孔３５５．３５６の各々に１つずつブロック３５３に 嵌合されている。各検出器組立体は、内孔と嵌合する管であり、スリーブにより 支持された各フォトダイオード３１０．３１２を収受する内径を有する。このフ ォトダイオードは、３２０乃至１０００ナノメータの応答レンジを持つｌｌａｍ ｆｆｌａｍａｔｓｕ（登録商標）タイプＳ　Ｌ　２２６−４４８　Ｋであること が望ましい。各インターフェース・フィルタ３０９．３１１（第１図に関して記 載した如き）は、各ダイオードの前方に、例えば図示の如くビーム・スプリッタ の立体面上あるいはダイオード自体に嵌合され、検出器組立体はビーム・スプリ ッタ組立体に丁度接触するよう各内孔内に組付けられる。電気結線がフォトダイ オードに対して設けられている。

第４図は、第３ａ図および第３ｂ図と類似する第４ａ図および第４ｂ図において 、ビーム・スプリッタの代わりに光ファイバを用いてホルダー領域からの放射を 分岐させる光学系を示している。第４図においては、第３図のものと類似する要 素は、先頭数字「３」を「４」に置換することにより示される。

全体的に４６０により示されるビーム・スプリッタは、内孔４５４の面内にある が内孔４５４に対し直角をなしホルダー４５１と交差する内孔４５７に取付けら れる。フィルタ４７１は、フィルタ３７１（前記）と同じ機能を有する。このビ ーム・スプリッタは、全て一端部がホルダー領域に露呈された整然とした光フア イバ列である。このファイバは、通常の方法で２つ以上の分束間に分散され、個 々の光検出器および各フィルタが光ファイバの他端の各分束毎に配置されている 。一実施例においては、０．２５■径の５　ｔｔｖａ　Ｘ　３　ｍの整然とした 矩形状列のファイバは、各分束に割付けられた交互の柱体（寸法６ｍ）を有する （　５０１５０分岐）。

これにより、各々が直径約４ｍである２つの分束４０８．４１８を生じる。光フ ァイバを所要の配置に保持するため、一方の端部および他端部の周囲に適当な日 輪（フェルール）およびエポキシ基材の不透明なポツティング・コンパウンドが 置かれる。一端部における光ファイバおよびフィルタ４７１が管４６０内に接着 されることが望ましく、この管は内孔４５７内でホルダー領域のキュベツトの０ ．５ｍ＋ｎ以内に嵌合して保持することができる。他端部の日輪は管内に嵌合す ることができ、これら管は各干渉フィルタおよび光検出器（上記の如きタイプ） を光フアイバ端部に当てて保持する。

図示しない更に別の構成においては、内孔４５４（または３５４）の反対側に１ つの内孔が設けられて、ホルダー領域を経て送られる放射を調べることができる 検出器を収受する。

第２図に示した放射源の電子的制御および測定、および結果として生じる光検出 器の信号に体する別の構成は、マイクロプロセッサを用いて閃光管の発光および 検出器信号の処理を制御する。上記の一般的な手順は依然として妥当するが、更 に優れた制御および性能が信号／ノイズ比を改善する技術を使用することにより 可能である。

検出器からの信号はディジタル的に処理することができるため、マイクロプロセ ッサは前記「信号／ノイズ比」出力を迅速に調べることができる。もしこれが満 足し得る信号／ノイズ比を表示するに充分な大きさでなければ、閃光管を（例え ば、３００ミリ秒以内に）再び発光させて、信号／ノイズ比を改善するためこれ ら信号を統計的に集計することができる。

これは、充分な信号が得られるまで、例えば３Ｈｚの閃光速度で継続することが できる。

先に述べた詳細から当業者には適当なマイクロプロセッサ構成が容易に判るであ ろう。

放射の強さの比較によっては、閃光のばらつきおよび他の光学的再現性の欠如の 影響が排除され、本装置の応答が１正規化」される。１つの光パルスからの２つ の異なる波長における測定は、測定システムにおける光学的および電子的なドリ フトおよびノイズを補償する。このように、波長の１つが分析されるべき試料か ら予期されるものであるテスト即ちアクティブな特定の波長であるが、他の波長 は、特定の波長における蛍光の強さにおける変化により影響を受けないように選 定された光経路における発蛍光団により生しる基準波長である。小さな閃光管に よる励起は、良好な検出器であるがやや高い発光レベルを必要とするシリコンＰ ＴＮフォトダイオードに対して充分な強さを提供する。特に発蛍光団を内蔵する ならば、使い捨てキュベ・ントは、本装置の使用を著しく容易にする。電子的、 光学的あるいは化学的な特性の前記「ドリフト」が大きくないすることにより可 能である。

検出器からの信号はディジタル的に処理することができるため、マイクロプロセ ッサは前記「信号／ノイズ比」出力を迅速に調べることができる。もしこれが満 足し得る信号／ノイズ比を表示するに充分な大きさでなければ、閃光管を（例え ば、３００ミリ秒以内に）再び発光させて、信号／ノイズ比を改善するためこれ ら信号を統計的に集計することができる。

これは、充分な信号が得られるまで、例えば３　ｆ（ｚの閃光速度で継続するこ とができる。

先に述べた詳細から当業者には適当なマイクロプロセッサ構成が容易に判るであ ろう。

放射の強さの比較によっては、閃光のばらつきおよび他の光学的再現性の欠如の 影響が排除され、本装置の応答が「正規化」される。１つの光パルスからの２つ の異なる波長における測定は、測定システムにおける光学的および電子的なドリ フトおよびノイズを補償する。このように、波長の１つが分析されるべき試料か ら予期されるものであるテスト即ちアクティブな特定の波長であるが、他の波長 は、特定の波長における蛍光の強さにおける変化により影響を受けないように選 定された光経路にお°ける発蛍光団により生じる基準波長である。小さな閃光管 による励起は、良好な検出器であるがやや高い発光レベルを必要とするシリコン ＰＩＮフォトダイオードに対して充分な強さを提供する。特に発蛍光団を内蔵す るならば、使い捨てキュベツトは、本装置の使用を著しく容易にする。電子的、 光学的あるいは化学的な特性の前記「ドリフト」が大きくないことを保証するた め、一旦本装置が正規化されると、試料は設定時間内に分析されねばならない。

据え付は使用の装置は明らかに、主要電源および他の関連した変更によるも依然 として上記の使用上の利点を以て、「現場用」装置と同じ一般形態で構成するこ とができる。

２波長の蛍光光度測定（ＤＷＦ）は、検出器が最適な状態で作動しさえすれば、 満足し得る性能をもたらそう。発光が少なすぎると信号／ノイズ比が低下し、こ のため、再現性も低下することになる。過大な励起エネルギは飽和状態および非 直線性を生じることになる。

光ファイバ・ビーム・スプリッタの使用は更に拡張が可能となる。ビーム・スプ リッタを用いることにより、光を閃光管から分けて異なる光ファイバを通し、次 いで同様な光フアイバ装置を通してキュベツトに加えるため光を結果として生じ る選択された周波数で組合わせ、どんな内容でも周知の方法で検出するため別の 周波数で同時に励起することができる。このように、３００ナノメータより低い ＵＶレンジにおける励起が可能である。適当な光ファイバおよびＵＶ強化光検出 器を使用することができる。

光ファイバの別の構成においては、３つの全ての分束カキュベット面で組合わさ れる一方の分束はキュベツトの面に光を運び、他の２つの分束は」二記の如く同 じ面から各検出器に向けて光を運ぶことができる。特に、この構成は、試薬保持 具を適当な形態のキュベツト・ホルダーあるいはアダプタに挿入して１つの面上 で測定を行うことができる乾式試薬において有効である。このような試薬は、就 中、Ｋｏｄａｋ　Ｅｋｔａｃｈｅｍ。

Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（＾ｍｅｓ　Ｄｖｉｓｉｏｎ）　、Ｂ ｏｅｌｗｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ。

Ｆｕｊｉ　Ｆｉｌｍ　（全て、登録商標）により提供されている。

あるシステムにおいては、光学の測定は、支持層あるいは分散反射層（ＴｉＯ□ 、Ｂａ５Ｏ，、等）のいずれかが基準蛍光を包含し得る透明な支持層を介して行 われる。前記支持が反射層であるシステムにおいては、測定は上方から行われ、 分散反射支持あるいは試薬領域のいずれか一方が基準発蛍光団を内蔵し得る。

このような手法は、蛍光測定器における液体の使用と関連する諸問題を回避し、 「乾式」サンプルの使用が可能である。

このため、ある形態の「液面測定棒」が使用可能である。透明なプラスチック基 板がおそらくはキュベツトに関して先に述べた如く発蛍光団を内蔵し、また基板 片を当技術において周知の如くマトリックス状に支持された試薬で被覆される。

テストを実施するため、この被覆された基板片は、サンプル剤を浸漬あるいは払 拭の如き周知の方法で塗布され、次いで蛍光測定器におけるホルダーに配置され る。基板片が正しい位置にあり、汚染を避けるためホルダーに接触しないことを 保証するためアダプタあるいは離間装置を使用することができる。

本装置により実施されるテストの形態に関するいくつかの一般的なガイダンスを 次に述べる。有効な分析範囲は、光検出器の最適の性能範囲と合致しなければな らず、理想的には、厳密な分析材のレベル（例えば、臨床作用レベル、あるいは 飽和汚染限度）が計器のピーク性能レベルにおいて生じるべきである。励起パル ス・エネルギを低減するかあるいは検出器に達する放射を光学的に減衰させるこ とにより、高い固有感度を有する方法が可能である。

２つの主な蛍光分析検定法のタイプは、１　分析ｔｌｆｌ１度と共に蛍光が増加 する２、分析材濃度と共に蛍光が減少する（消光時）消光法は、低い分析材濃度 で高い精度が要求される時、ＤＷＦに充分に適する。本方法は、テスト蛍光ある いは特定の蛍光が計器の性能が低下し始める点まで急冷される前に厳密な作用レ ベルが起生ずるように調整しなければならない。消光法においては、特定の放射 検出器に対して基準放射を与える光リンクは不要となろう。

高レベルの分析材濃度が予期されあるいは要求される検定法においては、蛍光増 加法が選好される。低レベルにおける精度が要求されるが消光法は実施不能であ る検定法においては、初期化段階において固定量の分析材を少量の特定の放射を 生じる試薬に内在させることにより、蛍光増加法を用いることができる。この方 法は、例え１分析材のゼロ濃度」においても特定放射検出器が依然として充分に 発光を受けることを保証する。

このように、消光法および比例増加法の両者において、ブランク値が読出される 時確立される比率（特定放射）蛍光／（基準放射）蛍光 は、分析濃度における実際の変化によってのみ以後に変化し得る。

国際調査報告 −Ｍ−・榊峙＾−＊ｍｍｓ＋＋、ＰＣＴ／ＧＢ　８９１０ＯＬ４２　　２＋ｎ申 −ｍｓ酊ａ−ｕｌｔｃＮｂ−＋ｎ、ＰＣＴ／ＧＢ　　８９１００１４２Ｐａｇｅ 　　　　２ 国際調査報告 ＧＢ　８９００１４２ ＳＡ　　　　２６９３０

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．第１の特定の蛍光放射をテスト位置の励起時に生じることが予期される試料 の閃光蛍光分析法であって、「ブランク」分析の実施に際して、 第２の特徴的な基準放射を励起時に生じることが予期される基準発蛍光団を前記 テスト位置に支持し、前記テスト位置に対して励起放射のパルスを加え、前記テ スト位置からの放射を、前記第１の放射に対する各検出器および前記第２の放射 に対する各検出器により調べ、 前記検出器の相対的な応答から、試料が存在しない時のテスト位置からの放射の 強さの比率に対する「ブランク」値を決定し、かつ 試料分析の類似した実施に際して、 前記基準発蛍光団の維持された存在時に、前記テスト位置に励起時に入射放射に より前記第１の特定の放射を生じることが予期される試料を支持し、 前記各検出器により、前記テスト位置からの放射を調べ、 前記検出器の相対的な応答から、試料が存在する時のテスト位置からの放射の強 さの比率に対する試料の値を決定し、 前記「ブランク」値と試料値を評価して較正ステップに関して前記試料を分析す る、 ステップを含む方法。
2. ２．前記テスト位置において前記試料を支持するキュベットを提供するステップ を含む請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記キュベット内に基準発蛍光団を内在させるステップを含む請求の範囲第 ２項記載の方法。
4. ４．サンプルとして分析のための試料と、前記特定の放射を生じるため蛍光を発 し得るように反応する試薬とを供給するステップを含む請求の範囲第１項記載の 方法。
5. ５．前記「ブランク」分析中、前記サンプルおよび前記試薬の一方を供給するス テップを含む請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．前記サンプルおよび前記試薬の一方に基準発蛍光団を提供し、前記「ブラン ク」分析の後に前記サンプルおよび前記試薬の他方を添加するステップを含む請 求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．前記基準分析および試料分析間の時間を制限して安定した基準蛍光放射を保 証するステップを含む請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記「ブランク」値を前記試料値から差し引いて該試料を分析するステップ を含む請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．前記「ブランク」分析の実施中、前記第１の放射の一部が両方の検出器に達 することを保証するステップを含む非消光蛍光分析のための請求の範囲第１項記 載の方法。
10. １０．２つの波長によるレシオメトリック蛍光分析法。
11. １１．２つの波長によるレシオメトリック分析法。
12. １２．試料の蛍光分析のためのバッテリ駆動される計器において、制御回路と、 閃光管と、該閃光管から試料位置を経て光検出器に至る光経路とを含み、前記制 御回路は、前記試料位置を通る適当な放射を生じように前記閃光管を充電して発 光させるよう作動し、作動中基準蛍光を含む放射を検出器に対して提供して、較 正ステップに関して試料位置における試料からの特定の放射レベルをレシオメト リック比較により決定するため前記制御回路により処理するための出力を検出器 に起生させることを特徴とする計器。
13. １３．作動中、試料位置に基準発蛍光団を含む請求の範囲第１２項記載の計器。
14. １４．基準発蛍光団が試料キュベット内に存在する請求の範囲第１３項記載の計 器。
15. １５．レシオメトリック蛍光分析のための基準発蛍光団を内在する試料支持部。
16. １６．キュベットの形態である請求の範囲第１５項記載の試料支持部。
17. １７．乾式化学形態の少なくとも１つの試薬を有する請求の範囲第１５項記載の 試料支持部。
18. １８．規定された構成において光学要素を収受して保持する開口を設けた材料体 で形成された蛍光測定器用の光学的構造において、該材料体が、試料を収受して 該試料を特定の位置に保持する試料開口と、放射源を収受して該源を開口に対し て特定の位置関係に保持する放射源開口と、前記放射源開口と前記試料開口との 間に特定の経路を提供する入力放射経路開口と、出力放射経路開口を画成して前 記試料開口から放射検出器に至る出力放射経路を提供する出力放射経路開口とを 提供する構造。
19. １９．前記材料体が全て１つのものからなる一体である請求の範囲第１８記載の 構造。
20. ２０．前記材料体が、放射成分経路における各検出器開口と共に、前記出力経路 における特定の位置にビーム・スプリッタを収受して保持する出力放射経路開口 におけるビーム・スプリッタ開口と、該ビーム・スプリッタ開口からの出力放射 成分経路を画成する出力放射成分開口とを提供し、これにより前記各開口周囲の 前記材料体が、前記試料開口に対する光学要素の規定された構成を維持する請求 の範囲第１８項記載の構造。
21. ２１．光経路構成を含む蛍光測定器用の材料体において、該材料体は不透明な材 料であり、前記光経路構成内に光学要素を収受して保持する開口を画成し、該開 口は、使用に際して試料を収受して特定の位置に試料を保持する試料開口と、該 試料開口に対して特定の位置関係において放射源を保持する放射源開口と、前記 放射源と試料開口との間に特定の放射経路を提供する入力放射経路開口と、前記 試料開口から放射検出器開口に至る特定の出力放射経路を画成する出力放射経路 開口とを含み、これにより前記開口の周囲の前記材料体が、前記試料開口に対し て光学要素の規定された構成を維持する構造。
22. ２２．前記開口が、放射の強さおよび周波数の少なくとも一方を制御する光学的 制御要素を内蔵する請求の範囲第２１項記載の構造。
23. ２３．放射源に対する開口を画成する一体の熱伝導性の不透明な材料と、試料入 力放射経路と、検査のための試料と、試料出力放射経路とを含み、前記開口の周 囲の材料体が、試料開口周囲の規定された構成において前記開口と光学要素を維 持する蛍光測定器の光学心部構造。