JPH03503360A

JPH03503360A - リボソーム結合部位

Info

Publication number: JPH03503360A
Application number: JP1503659A
Authority: JP
Inventors: トミッチ，チェ‐シェン・シイ; オルセン，メアリー・ケイ
Original assignee: ジ・アップジョン・カンパニー
Priority date: 1988-03-11
Filing date: 1989-02-23
Publication date: 1991-08-01
Also published as: WO1989008708A1; AU3341089A; DK201090D0; EP0404824A1; DK201090A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】リポソーム結合部位発明の技術分野本発明は、異種ポリペプチドの発現を増強する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、そこに有効に結合したリポソーム結合部位を変えることによる異種ポリペプチドの発現の増強に関する。

発明の背景ウシソマトトロピン（ＢＳｔ）を含むある種の異種ポリペプチドは、はとんどのイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）発現系中で発現するのが困難である。ＢＳｔ構造遺伝子をコードしているｃＤＮＡの最初の４つのコドン内での修飾によって、これらの修飾されたｃＤＮＡをｐＢＲ３２２−関連ベクター中で発現すると、ＢＳＬ発現のレベルが増大する。

これらの修飾されたｃＤＮＡは、ランナウェイ発現ベクター中におかれる場合にはさらに高いレベルで発現される（米国特許出願Ｓ、Ｎ。

０１６．２９４．１９８７年２月１９日出願一本明細書に資料として引用する）。

本発明の修飾されたリポソーム結合部位は、ランチウェイ・ベクターによって達成されるものに相当する、非ランナウェイ・ベクター、例えば、ｐＢＲ３２２の誘導体による異種ポリペプチドの発現を生じる。

一般的に、形質転換された宿主において異種ポリペプチドをクローニングおよび発現する方法は、当業者には周知である。このような異種ポリペプチドとしては、例えば、ヒトインシュリン、成長ホルモン、インターフェロンおよび因子■、ウィルス抗体、および他の動物ホルモンが挙げられる。

リポソーム結合部位は、このような発現において含まれる素子の１つである。これは、開始コドンの両側に領域約２０ずつのヌクレオチドを包含し、開始コドンから上流にシャインーダルガーノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）通常６−１’　Ｏのヌクレオチドを含む。

開始コドンの後方の２０ヌクレオチドは、発現用の挿入された遺伝子配列の始めの部分を含んでおり、該遺伝子のアミノ酸配列を変えずに修飾させることができない。したがって、実質的な意味において、リポソーム結合部位の操作は、開始コドンから上流の領域のみで行うことができる。リポソーム結合部位は、ある塩基を含有する場合に最も良く機能することが知られているが、シャインーダルガーノ配列が一般的にプリンリッチであること以外は、特定の部位における特定の塩基に関して公知の条件はない。種々の公知のリポソーム結合部位配列の間の微妙な差は、それが関連する場合に遺伝子が非常に発現するかあまり発現しないかを予想するための明確な比較を与えない。本発明の好ましい態様は、ＡおよびＴヌクレオチドが豊富である配列を用いて、シャインーダルガーノ配列を７ランクし、これによって、天然のリポソーム結合部位と比較して増加したアデニンおよびチミジン残基を有する該天然リポソーム部位から誘導されるリポソーム結合部位を作製することである。

天然のＢＳｔは、異種タンパクの混合物であり、そのアミノ酸配列は公知である［バラディニ（Ｐａｌａｄｉｎｉ、Ａ、Ｃ，）ら、モレキュラー・バイオロジイ・オブ・グロウス・ホルモン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆＧｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ）、シーアールシー・リビューズ・イン・バイオケミストリ４　（ＣＲＣＲｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１５（１）：２５−５６　（１９８３）］。天然の混合物は、ウシの下垂体から精製されている。成長および乳汁分泌を促進するためにＢＳｔを用いることについての商業的な可能性は、よく認識されており、乳牛および肉牛の両方の生物学的研究によって立証されている［エラバード（Ｅｐｐａｒｄ、Ｐ、Ｊ）およびバウマン（Ｂａｕｍａｎ、Ｄ、Ｅ、）、ジ・エフェクト・オン・ロングーターム・アトミニストレージ１ン・オン・グロウス・ホルモン・オン・パフォーマンス、オン・ラフチーティング・デアリー・カウズ（Ｔｈｅ　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆＬｏｎｇ−Ｔｅｒｍ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ｏｎ　Ｐｓｒｆｏｒｍａｎｃｓ　ｏｆＬａｃＬａｔｉｎｇ　Ｄａｉｒｙ　Ｃｏｗｓ）　；およびノ３ウマン（Ｂａｕｍａｎ、Ｄ、Ｅ、）、エフェクト・オン・グロウス・ホルモン・オン・グロウス・レイン・アンド・マンマリイ・ディベロープメント・オン・ルミナンツ（Ｅｆｆｅｃｔｏｆ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｒａｔｅｓ　ａｎｄ　ＩＪａｍｍａｒｙ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆＲｕｍｉｎａｎｔｓ）、　Ｐｒｏｃ、　１９８４コーネル・ニュートリジョン・フン７アレンス・フォー・フィード・マニュファクチャラース（ＣｏｒｎｅｌｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｆｅｅｄ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ）＋　ｐｐ、　５−１７．　＝　ニーヨーク、イタ力のコー不ル・ユニバーシティ（Ｃｏｒｎｅｌｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって発行］。

組換えウシソマトトロピン（ｒＢｓｔ）は、種々の組換え遺伝的プラスミドを用いて、形質転換された微生物中で産生ずることができる［シーバーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、Ｈ，）ら、“エフィシャント・バクチリアル・イクスプレッション・オン・ボビン・アンド・ボーシン・グロウス・ホルモンズ（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｂａｃｉｅｒｉａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　ａｎｄＦｏｒｃｉｎｅＧｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）”、　ＤＮＡ、　２：３７− ４５　（１９８３）　；欧州特許出顯第４７６００号；英国特許出願ＣＢ　２０７３２４ＳＡ号；ショナー（Ｓｃｈｏｎｅｒ、Ｂ、Ｅ、）ら、ロール・オン・ｍＲＮＡ・トランスレージ貯ナル・エフィシャンシー・イン・ボビン・グロウス拳ホルモン・イクスプレッシ璽ン愉イン・エシェリキア・コリ（Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｍＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｉｎ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）。

ＰＮＡＳ　ＵＳ＾、　８１：５４０３−５４０７　（１９８４）　；欧州特許出順算１０３３９５号；および欧州特許出順算１１１，８１４号参照］、これらの文献は、天然のポリペプチドとは異なるタンパクを産生ずるＢＳＬ遺伝子の５″ 末端の塩基の挿入もしくは欠失、または好ましいコドンを最大にしかつｍＲＮＡにおいて第２構築を減少するためのＢＳｔｃＤＮＡにおける変化、あるいは発現を増強するためのランナウェイ・プラスミドの使用に関するものである。他方、本発明は、異種ポリペプチド、特に高いレベルのＢＳｔを産生ずるためのＡＴ− リッチリポソーム結合部位の使用を教示するものである。

ＢＳｔを発現する形質転換された微生物を培養および発酵する方法は、前記文献にも引用されている。

形質転換された細胞から生物学的に活性なｒＢｓｔの精製も、既に開示されている［米国特許第４，５１１．５０２号、第４，５１１．５０３号、第４，５１２゜９２２号および第４．５１８．５２６号；欧州特許出順算１３１８４３号；ならびにンヨナー（Ｓｃｈｏｎｅｒ、Ｒ，Ｇ、）ら、′アイソレーション・アンド・ピューリフィケーシコン・オン・プロティン・グラニュールス・７０ム・イー・コリ・セルズ・オーバープロデューシング・Ｂ　Ｓ　ｔ（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇｒａｎｕｌｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＣｅｌｌｓＯｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ＢＳｔ） ”、バイオ−テクノロジー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ、）、　３：１５１−１５４　（１９８５）参照］。

発明の概要本発明は、アデニンおよびチミジンが豊富なリポソーム結合部位に関する。

さらに詳細には、本発明は、異種ポリペプチドをコードしているデオキシリボヌクレオチドの配列およびそれに有効に結合したリポソーム結合部位からなる組換えＤＮＡ分子であって、該リポソーム結合部位が、これを誘導するかまｔ；はこれが関係している天然のリポソーム結合部位と比較して増加したアデニン（Ａ）およびチミジン（Ｔ）残基を有することを特徴とする組換えＤＮＡ分子を提供するものである。

さらに詳細には、異種ポリペプチドは、好ましくはブタ、ヒツジさらに詳細には、該組換えＤＮＡ分子リポソーム結合部位デオキシリボヌクレオチド配列は、Ａ　ＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡ　ＡＡ　ＡＴＴＡ　Ａ　ＡＧＡＧＧＴＡ　ＴＡＴＡＴＴＡＡＴＧまたはＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧであり、好ましくはウシソマトト口ピンに関するＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＣＣＴまプこはＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴである。

まｔ；、本発明は、ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴ％ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡ　ＴＴＡ　ＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴ１ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴＧおよびＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧから選択されるデオキシリポヌクレオチドの配列からなるＤＮＡ分子を提供するものである。

また、本発明は、天然のリポソーム結合部位と比較して増加したＡおよびＴ残基を有しかつ該天然のリポソーム結合部位から誘導されるかまたはこれと関係しているリポソーム結合部位を提供するものでもある。

発明の詳細な記載一般に、本発明において用いられる一般的な研究室方法の学術用語および説明の定義は、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ）らのモレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）［コールド・スプリング＋／一一バー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ｛ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）．コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク．　１９８２］において見られるものである。該マニュアルを本明細書では“マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）”と記し、本明細書中に資料として引用する。

全てのイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌ　ｉ）菌株を、ルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス（ＬＢ）、０．２％グルコースを含有するＬＢ，ディフコ抗生物質培地（Ｄｉｒｃｏ ’ｓ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｍｅｄｉｕ＋ｎ）　＃　２、または０．２％グルコースおよび０．０５〜０．１％酸一加水分解カゼインアミノ酸を補足したＭ９培地上で増殖する。抗生物質に対して耐性の菌株を、マニアティスニ記載の薬物濃度に維持する。モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ａ．）［（１９７７），ジャーナル・オプ・バクテリオロジ−（Ｊ．　ｏｆ　Ｂａｃｔ．）．　１３２：３４９−３５１１によって開示された方法に従って、形質転換を行った。

全ての制限エンドヌクレアーゼおよび他のＤＮＡ修飾酵素は、市販品として入手可能であり、製造者の指示に従って使用する。

制＠７ラグメントは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離され、電気溶離（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によって単離される（マニアティス）。

大規模で迅速なプラスミド単離は、マニアティスの記載に従って行われる。

タンパク濃度は、クマシーブルー染色（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）に基づいて、バイオランド（ＢｉｏＲａｄ）タンパク検査キットを用いて測定する。

タンパク分析に関するＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は、モース（Ｍｏｒｓｅ，Ｌ．）らの１９７８．ジャーナル・オブ・パイ口ロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）．　２６：３８９−４１０の記載に従って行う。

ウエスタン・イムノブロツティング分析は、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ．Ｈ．）らの１９７９，プロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）．　ＵＳＡ，　７６：４３５０−４３５４の記載に従って行う。

コロニーハイブリッド法は、グルンスタイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ，Ｍ）らのプロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．），　７２：３９６１−５（１９７５）の一般的な記載に従って行う。

オリゴヌクレオチドブローブに関するハイブリダイゼーション条件は、ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ　，Ｄ．Ｖ．）らのネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）．　２９０＝２０−２６（１９８１）によって先に開示されたものである。

形質転換株を分析するための制限エンドヌクレアーゼ消化に関して、プラスミドＤＮＡのミニリゼイトは、ホームズ（Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．）ら［アナリティカルーバイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ−），　１１４：１９３　（１９８１）］の方法またはマニアティスに記載のアルカリ細胞溶解法に従って調製される。大規模なプラスミド調製は、マニアティスに記載の方法に従って、ＣｓＣＱ沈降法によって行う。

プラスミド配列決定は、ワレイス（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．Ｂ．）ら［ジーン（Ｇｅｎｅ）．　１６：２１−２６　（１９８１）］のジデオキシ鎖成長停止及応法、またはマキサム（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．）およびギルパート（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．）［メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）．　６５：４９９−５６０（１９８０）］の化学分解法に従って行う。

オリゴヌクレオチドは、ニーダム−ファンデフアンター（Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ、Ｄ、Ｒ，）らのヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）、　１２：６１５９−６１６８　（１９８４）に記載の自動合成器を用いて、同相ホスホルアミダイトトリエステル法［ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ。

Ｌ、）およびカルーザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ，）、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｓ、）、　２２（２０）：１８５９−１８６２　（１９８１）］に従って、化学的に合成する。オリゴヌクレオチドは、７Ｍ尿素を含有する１２〜２０％ポリアクリルアミドを用いて、調製用ゲル電気泳動によって精製される。３７″で０．５４Ｍ酢酸アンモニウム中、ゲル薄片をインキュベートすることによって、該ゲルから適当なバンドを溶離する。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）　５ｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ１８カラム上でオリゴヌクレオチドを吸収し、アセトニトリル：ＨｚＯ（４０：６０Ｖ：Ｖ）で溶離することによって、該塩を除去する。

原核生物系における所望のクローン遺伝子の高レベルの発現に関して、最小限度の、ｍＲＮＡ転写を方向付けるための強いプロモーター、翻訳開始に関するリポソーム結合部位、および全てが所望の遺伝子と有効に結合する転写終了暗号（総体的に、「発現調節配列」）を含む発現ベクターを構築することが必須である。

「有効に結合する」という用語は、所望の生成物をコードしている遺伝子の前に適当な出発シグナルを有していること、ならびに発現調節配列の調節下での挿入された遺伝子の発現および遺伝子によってコードされた所望の生成物の合成を可能にするｔ；めに正しい読取り枠を維持することを含んでいる。大量の遺伝子生成物の堆積が細胞増殖を抑制し、しばしば細胞死を引き起こすので、生成物の合成を方向付けるために選択されたプロモーターを、プロモーターが導入される前に、細胞増殖が高濃度に達し得る方法で調節するべきである。このために適切な調節領域の例は、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ　ｔ）　トリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター領域Ｑｒｐプロモーター）ならびにファージラムダの左手プロモーター（ＰＬ）である。ｔｒｐプロモーターは、トリプトファンの存在下で抑制され、トリプトファン飢餓（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）または誘発物買インドールアクリル酸の添加によって誘発され得る［ヤノフスキー（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、Ｃ，）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）、　１５８：１０１８−１０２４　（１９８４）］。プロモーターＰ、は、リプレッサーｃｌによって調節される。ｅｌ遺伝子、例えば、ｃ１８５７における温度感受性突然変異について、Ｐｔは、３８℃以上の温度で誘発され得る［）＼−スコヴイ・ノツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　Ｉ）およびハーゲン（）ｌａｇａｎ、Ｄ、）、　１９８０．　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｃ＋ｅｎｅｔ、＋　１４：３９９−４４５］。

最も好ましくは、遺伝子の挿入のための制限酵素部位を有する発現ベクターがシャインーダルガーノ配列から適当な距離で発現されることである。

゛　イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）において、開始コドン、通常ＡＴＧは、遺伝子の効果的な発現のために適当なリポソーム結合部位配列と結合し１て配置されるべきである［ゴールド（Ｇｏｌｄ、Ｌ、）ら、　１９８１．　Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　３５：３６５−４０３　；シャーシ−（Ｓｃｈｅｒｅｒ、’Ｇ、Ｆ、Ｅ、）ら、　１９８０゜ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、　１７：３８９５−３９０６１゜イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）および他の原核生物においてｃＤＮＡ配列由米の原核生物遺伝子によってコードされたタンパクを細胞内で合成するために、５′未翻訳領域およびシグナルペプチドをコードしている配列を除去し、成熟タンパクをコードしている配列の翻訳開始のｔ；めに開始コドンを供給するのが好都合である。成熟タンパクに関する暗号配列のいくつかを化学的に合成されたオリゴヌクレオチドと交換して、翻訳効力を最大にすることも必要である。本発明の好ましいＤＮＡ暗号配列は、ＧＣＣをＧＣＴに変えることによって４番目のコドンで修飾されたＢＳｔｃＤＮＡ配列である。本発明の好ましいベクターは、非常に高レベルの修飾されたウシソマトトロピンを発現するｐＢＲ３２’２　　レプリコンからなる。ｐＢＲ３２２誘導されたプラスミド以外のベクターを用いることもできる。ｐＢＲ３２２は、Ｃｏ１Ｅｌ　　レプリコンを有する。Ｃｏ１Ｅｌ　　レプリコンを含有する他の有用なプラスミドとしては、ｐＫＣ７１，）ＡＴ１５３およびｐＢＲ３２５が挙げられる。これらは、その薬物耐性メーカーｐＡＣＹＣ１８４（ｐｌ　５Ａ　レプリコン）、ｐＮｏ　１５２３（ｐＭＢ　１レプリコン）、Ｉ）ＬＧ３３８（＋）ＳＣＩＯＩ　　Ｌ、プリコン）、オヨヒｐＢＥＵ５０（Ｒ１レプリコン）が挙げられる［マニアティス；ボウベルズ（Ｐｏｕｖｅｌｓ、Ｐ、Ｈ，）ら、クローニング・ベクターズ（ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ）、エルスバイヤー、ニューヨーク１９８５コ。また、ｐＵＲＡ（Ｒ１およびＣｏＩＥｌ　レプリコン；米国特許出１ｉ１Ｓ、Ｎ、０１６．２９４号）、ｐＵｃ１９［ヤニシューバーロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、　３３：１０３−１１９１９８５１およびｐＨｃ３１４［ポロズ（Ｂｏｒｏｓ　、　Ｉ　、　）ら。

ジーン（Ｇｅｎｅ）　３０：２５７−２６０１９８４コも有用である。

前記のとおり、組換え微生物から哺乳動物のソマトトロピンの単離および精製は、公知である［例えば、米国特許第４，５１１．５０２号、第４．５１２．９２２号および第４．５１８．５２６号：欧州特許出願第１３１．８４３号；ならびにショナー（Ｓｃｈｏｎｅｒ、Ｒ，Ｇ、）ら、アイソレーション・アンド・ピューリフィヶーション・オプ・プロティン・グラニュールズ・７０ム・イー・フリ・セルズ・オーバープロデューシング・Ｂ　Ｇ　Ｈ（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｒａｎｕｌｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ｃｅｌｌｓｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ＢＧＦＩ）、バイオ−テクノロジー（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、　３：１５１−１５４参照］。概して、該方法は、組換え微生物を溶解すること、選択的な遠心分離、非天然ジスルフィド結合から天然構造への転換（ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）およびカラムクロマトグラフィーを含む。

チャート１〜４においてプラスミドおよび７ラグメントを表すのに用いられる慣例は以下のとおりである。単一線は、円形および線形の二重鎖ＤＮＡを表し、翻訳開始または転写は、プロモーターまたは構造遺伝子の下に示された矢印の方向に生じる。星印（”）は、プラスミドの円形を完成するだめのヌクレオチドの架橋を表す。フラグメントは、二重鎖ＤＮＡの線形片であるので、星印を有していない。エンドヌクレアーゼ制限部位は、線の上に示す。遺伝子は、線の下に示す。これらの成分間の位置関係は、実際の距離ではないが、記載されたＤＮＡ配列上での相対位置を示すことだけを意味しからＣ，ＣＴに修飾したｃＤＮＡを含んでいるプラスミドｐＴｒｐ−ＢＳｔ１０２およびｐＴｒｐ　−Ｂ　Ｓ　ｔｍ４の構築は、米国特許出願Ｓ、Ｎ、０１６．２９４号に詳しく開示されている。概して、発現ベクターｐＴｒｐｌは、ｐＳＫ４から誘導される［カイテス（Ｋａｙｔｅｓ、Ｐ、Ｓ、）ら、　１９８６．ジャーナル−オプ・バイオテクノロジー（Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、　４：２０５−２１８）。ｐＴｒｐｌは、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター配列（ｔｒｐプロモーター）、ｔｒｐＬ遺伝子のシャインーダルカーノ配列、ｐＢＲ３２２由来複製起源、およびアンピシリン耐性に関する遺伝子を含んでいる。ｐＴｒｐｌは、ｔｒｐＬシャインーダル力−ノ配列の後に唯一のＣｌａＩ部位、および開始コドンＡＴＧの直後に唯一のＫｐｎ　Ｉ　／　Ａｓｐ７１８部位を有している。ｐＴ　ｒｐ　ｌのＣｌａｌ部位で挿入される開始コドンを有している遺伝子は、外米アミノ酸では発現されない。

ＢＳｔのアミノ酸残基２４〜１８８をコードしているｃＤＮＡ配列を含有する４　９４ｂｐ　Ｐｖｕｎフラグメントは、ｐＬＧ２３［アメリカ合衆国イリノイ、ペオリアのノーザン・サージ１ナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ１２４３６の下、寄託されている１から単離され、ｐＴ　ｒｐ　ｌの平滑末端ＫｐｎＩ部位に挿入して、最初の２２アミノ酸残基に対するコドンを欠失しているＢＳｔｃＤＮＡ配列を作成する。

得られたプラスミドは、ｐＴｒｐ　−Ｂ　Ｓ　Ｌｌｌ　１と記す。不完全なりＳｔ配列の各操作について、アミノ酸残基１８８に対するコドンのＰｖｕＩ［部位は、ＭｓｔＩＩおよびＢａｍＨ１部位間のＢＳｔ３″末端を適当なオリゴヌクレオチドと交換することによって除去される。得られたプラスミドは、ｐＴｒｐ− Ｂ　Ｓｔｍｌ　ｂと記す。５°末端でＢＳｔ配列を消失させるために、Ｃ１ａｌからＰｖｕｎまでの小さい領域を適当なオリゴヌクレオチドと交換する。得られたプラスミド、すなわち、ｐＴｒｐ−ＢＳｔｌ　Ｏ２およびｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４は、ｔｒｐプロモーターから下流にＢＳｔ配列およびｔｒｐＬリポソーム結合部位を有している。プラスミドｐＴｒｐ−ＢＳｔｌ　Ｏ２は、ＢＳｔ暗号配列の始めの部分において変化を有しないが、ｐＴｒｐ　−Ｂ　Ｓ　ｔｍ４は、ＧＣＣからＧＣＴに変化したアラニンに対する４番目のコドンを有する。これらのプラスミドをチャート１に示す。

寅施例１：ＡＴ−リッチリポソーム結合部位を有するＢＳｔ発現用プラスミドの構築出発リポソーム結合部位と比較して増加したＡおよびＴ残基を有するリポソーム結合部位を有するＢＳｔを発現するためのにプラスミドを構築するために、２つのオリゴヌクレオチドを用いて、ｐＴｒｐ　−Ｂ　Ｓ　ｔｍ４中のＨｐａｌからＣ１ａＩの領域を置き換える。

チャート２に関して、ｐＴｒｐ　−Ｂ　Ｓ　ｔｍ４をＨｐａＩおよびＣ１ａｌで処理する。ＨｐａＴ開裂部゛位をｔｒｐプロモーター配列中に配置し、Ｃ１ａｌ開裂部位を開始コドンＡＴＧのすぐ上流に配置する。シャインーダルガーノ配列以外においてリポソーム結合部位におけるグアニジン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）の全てを除去するために、Ｃ１ａｌ消化によって生成されたＣＧオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を、マングービーン（ｍｕｎｇ−ｂｅａｎ）ヌクレアーゼによって除去する。次いで、このようにして生成された７ラグメント（フラグメント１）を、上記のように化学的に合成された２つの相補的オリゴヌクレオチドからなるフラグメント２にライゲートする（チャート２）。フラグメント２は、２つの方向でフラグメントｌにライゲートすることができるので、開始コドンＡＴＧに近いシャインーダルガーノ配列（ＧＡＧＧ）に関連する所望の方向は、配列決定によって同定される。得られｌ；プラスミドは、ｐＡＴ−８３１ｍ４と記す。同様の方法で、ｐＴｒｐ−ＢＳｔ１０２は、Ｈｐａｌ、Ｃｌａ　Ｉおよびマングービーンヌクレアーゼで処理し、７ラグメント２にライゲートして、ｐＡＴ−１０２を生じる。

ｐＴｒｐ−ＢＳｔｌ　Ｏ２、ｐＡＴ−ＢＳｔｌ　０２、ｐ７　ｒｐ　−Ｂ　Ｓ　ｔｍ４およびｐＡＴ−８３１ｍ４にお）するＢＳｔの４番目のコドンとｍＲＮＡの＋１塩基との間の出発配列および得られた配列をチャート３に示す。

実施例２：　Ａ　Ｔ−リッチリポソーム結合部位を有するプラスミドを用いるＢＳｔ発現実施例１の発現プラスミドを用いるＢＳｔ発現について試験するために、プラスミドをコンピテントなイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）菌株、Ｋ　１２（ＡＴＣＣ＃ｅ２３７１６）およびＤ１１２（米国特許出願Ｓ、Ｎ。

０１６．２９４号）に転換した。培養物を、０．２％グルコース、１００μ９／罰アンピシリンおよび１００μｇ／ｍＱトリプトファンを含有するＬＢ培地中で一晩増殖させた。−晩培養物を、０．２％グルコース、０．０５％酸加水分解オートクレーブカゼインアミノ酸および１００μｇ／ｍＱアンピシリンを含有するＭ９培地中で５０〜１００倍に希釈し、５５０ｎｍでのＯＤが０．３〜０．４になるまで曝気しながら３０″または３７″で増殖させた。

誘発培養物から試料を取り、この試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。該ゲルはクマシーブルーで染色され、スキャンして、目視できるＢＳｔの量を測定した。該ゲルはウェスタンイムノブロッティング分析のためにも用いた。結果を第１表に示す。低いレベルの発現の値は、イムノブロッティング分析によるものであり、高いレベルの発現は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによるものである。

ブタおよびヒツジのソマトトロピンは、同様の方法で行うことができる。

実施ｆｉ３：ＡＴ−’Ｊッチリポソーム結合部位を有するＢＳｔ発現のための第２プラスミドの構築用いた２つの相補的オリゴヌクレオチドがＣ１ａｌの粘着末端を有しており、したがって、これらがＨｐａｌおよびＣ１ａｌで処理されたｐＴｒｐ　−Ｂ　Ｓ　ｔｍ４にクローンされること以外は、ｐＡ、Ｔ−８３１ｍ４（＊施例１）と同様に、プラスミドｐＴｒｐ２−Ｂ　Ｓ　ｔｍ４を構築する。ｐＴｒｐ２−８３１ｍ４とｐ、ＡＴ−８３１ｍ４との差は、ｐＴｒｐ２−　Ｂ　Ｓ　ｔｍ４におけるリポソーム結合部位がｐＡＴ−８３１ｍ４におけるリポソーム結合部位よりもＡ− Ｔリッチではない点である（チャート５参照）。

実施例４：ＡＴ−リッチリポソーム結合部位を有する第２プラスミドを用いるＢＳｔ発現実施例２の記載に本質的に従って、プラスミドｐＴ　ｒｐ２−Ｂ　Ｓ　ｔｍ４をイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）菌株に１２およびＤ１１２に形質転換し、誘発し、発現について分析した。結果を第１表に示す。

第１表ｐＴｒｐ−ＢＳＬ１０２、ｔｒｐＬリポソーム結合部位、　　　　＜０．０１　　　（０，０１３Ｓｔの始めの部分で変化なしｐＡＴ−ＢＳｔ１０２、ＡＴ−リッチリポソーム結合部位、　＜０．０１　　１ＢＳｔの始めの部分で変化なしｐＴｒｐ−ＢＳｔｍ４、ｔｒｐＬリポソーム結合部位、　　　　＜１　　　１ＧＣＣからＧＣＴに変化しｔ：ａｌａ４ｐＡＴ−ＢＳｔ＋ｎ４、Ａ−Ｔリッチリポソーム結合部位、　　＞１０　　　　＞２０ＧＣＣからＯＣＴに変化しＩ：ａｌａ４ｐＴｒｐ２−ＢＳＬｍ４、ＡＴ−リッチリポソーム結合部位、２５ＧＣＣからＯＣＴに変化したａｌａ４第１表の結果は、特にＤ１１２宿主において、ＢＳｔｃＤＮＡ配列の非常に低いレベルの発現がＡＴ−リッチリポソーム結合部位によって増大し得ることを示している。ａｌａ４コドンで修飾されたｃＤＮＡ配列の低いレベルの発現はＡＴ− リッチリポソーム結合部位によって全細胞タンパクの２０％以上まで増強され得る。

実施例５：　Ａ　Ｔ−リッチリポソーム結合部位を有するヒト腫瘍壊死ファクターσ（ＴＮＦ　　σ）の発現の増強Ａ）ＡＴ−リッチリポソーム結合部位を含有する発現ベクターの構築ＡＴ−リッチリポソーム結合部位の後ろにクローン遺伝子を挿入するために、発現ベクターｐＴｒｐ２を構築する。ｐＴ　ｒｐ　−ｃｏｎ　Ｓ　Ｄ［カーリ−（Ｋ　、Ａ、Ｃｕｒｒｙ）およびトミッチ（Ｃ−Ｓ、Ｃ，Ｔｏｍｉｃｈ）、“エフェクト・オン・リポソーム・パインディング・サイト・オン・ジーン・イクスプレッション・イン・イー・コリ（Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｒｉｂｏｓｏ＋ｎｅ　ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ　ｏｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　：ｎ　Ｅ、ｃｏｌｉ）、　ＤＮＡ、　３９８８印刷］におけるリポソーム結合部位領域を、ＡＴ−リッチ配列を含むオリゴヌクレオチドと交換する。チャート３に示すように、ｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤにおけるリポソーム結合部位領域を、ＨｐａＩおよびＣ１ａｌによる処理によって除去する。得られたフラグメント３をＨｐａｌおよびＣ１ａｒ末端を有する２つの相補的オリゴヌクレオチドにライゲートして、ｐＴｒｐ２を得る。ｐＴｒｐ−ｃｏｎｓ　ＤおよびｐＴ　ｒｐ　２は、共に、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のトリプトファン生合成経路のプロモーターおよびオペレーター配列Ｑｒｐプロモーター）、シャインーダルガーノ配列としてＧＧＡＧＧを有するリポソーム結合部位、シャインーダルガーノ配列の後の唯一のＣｌａｌ部位、ｐＢ　Ｒ３２２由来の複製起源ならびにアンピシリン耐性に関する遺伝子を含有する。リポソーム結合部位配列は、ｐＴｒｐ−ｃｏｎｓＤにおけるＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧおよびｐＴｒｐ２におけるＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＣＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧである。これら２つの配列の差は、ｐＴｒｐ２におけるリポソーム結合部位が、それを誘導するｐＴｒｐ−ｃｏｎｓＤにおけるリポソーム結合部位よりもＡＴ−リッチであるという点である。

Ｂ）ＴＮＦａの発現に関するプラスミドの構築ＴＮＦａをコードしている遺伝子を、ブリティッシュ・バイオ−テクノロジー・リミテッド（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ　；Ｂｒｏｏｋ　Ｈｏｕｓｅ、　Ｗａｔｌｉｎｇｔｏｎ　Ｒｏａｄ、　Ｃｏｗｌｅｙ、　０ｘｆｏｒｄ、　０Ｘ４５ＬＹ、　ＵＫ）から購入する。この遺伝子はいくつかの固有の制限エンドヌクレオチド部位を有している。この遺伝子から５９０ｂｐ　５ｎａＢ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ７ラグメントを単離することができ、これは、最初の２つのコドンについて平滑にされｔ；成熟ＴＮＦσ配列を含んでいる。この７ラグメントは、最初の２つのコドンを供給するｔ；めの２つの相補的オリゴヌクレオチドと一緒に、発現ベクターｐＴ　ｒｐ　−ｃｏｎ　Ｓ　ＤおよびｐＴｒｐ２にクローンする。チャート４に示すように、ｐＴ　ｒｐ−ｃｏｎ　Ｓ　ＤおよびｐＴｒｐ２をＣ１ａｌおよびＢａｍＨＩで処理して、各々、７ラグメント５および６を得る。７ラグメント５は、フラグメント７（平滑されたＴＮＦσ遺伝子を含有する５ｎａＢ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ　７ラグメント）およびフラグメント８　（Ｔ　Ｎ　Ｆα配列の始めの部分を供給し、ＣＪａｌ＃よび５ｎａＢＩ末端を有するオリゴヌクレオチド）とライゲートして、ｐＴｒｐ−ｃａｎｓ　Ｄ−ＴＮ　Ｆ　ａを得る。同様に、フラグメント６と７ラグメント７８よび８をライゲートして、ｐＴｒｐ２− ＴＮＦａを得る。

Ｃ）ＴＮＦｅの発現実施例２の記載に木質的に従って、プラスミドｐＴｒｐ−ｃｏｎＳＤ−ＴＮＦａおよびｐＴｒｐ２−　Ｔ　Ｎ　Ｆ　ａをイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）菌株ＪＭ１０３に形質転換し、発現を誘発し、発現について分析する。

ｐＴｒｐ−ｃｏｎｓＤ−ＴＮＦａおよびｐＴｒｐ２−ＴＮＦａ由来のＴＮＦａ発現のレベルは、各々、全細胞タンパクの約５％および３０％である。したがって、ＡＴ−リッチリポソーム結合部位は、ＴＮＦα発現を増加させる。

チャート１．プラスミドのリストｐＴｒｐｌｐＴｒｐ−ＢＳｔｎｌｐＴｒｐ−ＢＳｔｍｌｂｐＴｒｐ−ＢＳｅ１０２．　ｐＴｒｐ−ＢＳｅｍ４　（４，１１ｋｂ）Ａ＋ａｐＲ繻アンピシアンピシリン耐性”ｔｒｐプロモーター／オペレーターＥ　　−リポソーム結合部位Ｃ−合成配列Ｂ　　　−ＢＳｔ配列チャート２　：ＰＡＴ−ＢＳｔｍ４の構築ａ　）　ｐＴｒｐ　−Ｂ　Ｓ　ｔｍ４をＨｐａｌ、Ｃ１ａｌおよびマングービーンヌクレアーゼで処理して、フラグメントｌを得る。

ｂ）２つのオリゴヌクレオチドをアニールして、フラグメント２を得る。

５’　　ＡＡＣＴＡにＴＡＣＣＣＡＡＧＴｒＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡｌｌ；ＣＴＡＴＡ、ＴＡτｒｒｃＡＴｃＡＴｃｃｃＴＴｃＡＡｃ’ｒｃＣＡＡ？ＡＡＴＴｒＴＴＡＡＴｒＴＣＴＣＣＡＴＡＴＡＴＡＣ）フラグメントｌおよび２をライゲートして、ｐＡＴ−ＢＳｔｍ４（４，８Ｋｂ）を得る。

ｐＡＴ−ＢＳ国４チャート４：　１）Ｔｒｐ−ｃｏｎＳＤ−ＴＮＦａおよびｐＴｒｐ２　　Ｔ　Ｎ　Ｆ　ａの構築ａ　）　ｐＴｒｐ−ｃｏｎｓ　ＤをＣ１ａｌおよびＢａｍＨＩ　″Ｆ処理して、フラグメント５を得る。ｐＴｒｐ２をＣ１ａｌおよびＢａｍＨＩで処理して、７ラグメント６を得る。

フラグメント５および６（４，６Ｋｂ）ｂ）ＴＮＦｉｒ遺伝子を５ｎａＢｌおよびＢａｍＨｌで処理して、７ラグメント７（４６０ｂｐ）を巣離する。

ｃ）２つの相補的なオリゴヌクレオチドをアニールして、フラグメント８を得る。

フラグメント８ＣＧＡＴＡＡＴにＧτ八ＣへＡＴＴＡＣＣＡＴＣｄ）フラグメント５．７および８をライゲートしてｐＴｒｐ−ｃｏｎｓＤＴ　Ｎ　Ｆ　ａを得、フラグメント６．７および８をライゲートしてｐＴｒｐ２　　ＴＮＦａを得る。

ｐＴｒｐ−ｃｏｎｓＤ−ＴＮＦａおよびｐＴｒｐ２　　ＴＮＦａ（５，ＩＫｂ）Ａｏ＋ｐＲ−アンピシリン耐性Ｄ　　　−ｔｒｐプロモーター／オペレーターＥ　　−シャインーダルガーノ配列Ｃ−合成配列Ｔ　　　＝ＴＮＦａ配列チャート５：　ＢＳｔ発現用プラスミドにおけるリポソーム結合部位配列ＸｐＴｒｐ−ＢＳｔ１０２ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡＭＧＧＯＴＡＴＣＣＡＴＡＡＴＧ　Ｉ　ＧＣＣＴＴ　ＣＣＣＡＧＣＣｐＡＴ−ＢＳｔ１０２ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＭＡＡＴＴＡＡＡにＡＧＧＴ＾ＴＡＴＡπ緑τ ｃｌｃｃｃ買ＣＣＣ＾ｃｃｃｐＴｒｐ−ＢＳｃ＋＋＋４ＭｃｉｃＡｃｃｒＡＡＡＡＩＩＩｃｃｃＴＡＴｃｃＡＴＡＡｌｒｃ　ｌ　ｃｃｃｒｒｃｃｃｈｃｃｘｐＡτ−ＢＳｔ！＋１４ＩＩＩＡｃｒｒｃｐ、ｃｃＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＩＩ：ＡＧｃｉＡＴＡｒＡｍｍｒｃ　ｌ　ｃｃｃｒｒｃＣＣＡＧＣＴｐＴｒｐ２−１５ｃｍ４ＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＭＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＣＣＡＴＡＡＴに　ｌ　ｃｃｃｒｒｃｃｃＡｃｃＴ本縦線の左側に、異種ポリペプチドを発現するために有用なリポソーム結合部位を示す。縦線の右側の配列は、ＢＳｔ遺伝子の部分からなる。

国醇Ｉ審輻牛国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）異種ポリペプチドをコードしているデオキシリボヌクレオチドの配列および有効に結合したリボソーム結合部位からなる組換えＤＮＡ分子であって、該リボソーム結合部位が、これを誘導するかまたはこれと関係する天然のリボソーム結合部位と比較して、増加したアデニン（Ａ）およびチミジン（Ｔ）残基を有することを特徴とする組換えＤＮＡ分子。
（２）異種ポリペプチドがソマトトロピンである請求項（１）記載の組換えＤＮＡ分子。
（３）ソマトトロピンがブタ、ヒツジおよびウシのソマトトロピンから選択される請求項（２）記載の組供えＤＮＡ分子。
（４）ソマトトロピンがウシソマトトロピンである請求項（３）記載の組換えＤＮＡ分子。
（５）リボソーム結合部位デオキシリボヌクレオチド配列が【配列があります】または【配列があります】である請求項（１）記載の組換えＤＮＡ分子。
（６）リボソーム結合部位デオキシリボヌクレオチド配列が【配列があります】または【配列があります】である請求項（４）記載の組換えＤＮＡ分子。
（７）【配列があります】および【配列があります】から選択されるデオキシリボヌクレオチドの配列からなるＤＮＡ分子。
（８）請求項（６）記載の組換えＤＮＡ分子、ｐＡＴ−ＢＳｔｍ４またはｐＴｒｐ２−ＢＳｔｍ４。
（９）それを誘導するかまたはそれを関連させる自然に生じるリボソーム結合部位と比較して増加しているＡおよびＴ残基を有するリボソーム結合部位。
（１０）デオキシリボヌクレオチド配列が【配列があります】および【配列があります】から選択される請求項（９）記載のリボソーム結合部位。