JPH03503601A - 遺伝子発現の調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、蛋白質結合部位上に結合した上記へテロダイマーの存在が機能的蛋白質の生 産を促進することによって遺伝子の調節を行なう請求の範囲ｌによる細胞。

４、細胞、即ち 機能的蛋白質を表現し得る遺伝子： 上記遺伝子と有効に会合した調節領域；および相補ストランド上の隣接する異な るＤＮＡによって限定される上記調節領域内の蛋白質結合部位を有し； それぞれ第一および第二の異なるＤＮＡ結合ドメインを各々が有する第一および 第二の異なる蛋白買上ツマ−を細胞中に供給し、上記モノマーが会合して、上記 蛋白質結合部位に対して結合できそして機能的蛋白質の表現を調節できるヘテロ ダイマーを、形成することができる、ことから成る細胞、中で遺伝子表現を調節 する方法。

５、機械的蛋白質を表現するための遺伝子：上記遺伝子と有効に会合した調節領 域：および上記調節領域内の蛋白、質結合部位を有し；結合した時、機械的蛋白 質の表現を調節する第一および第二の異なる蛋白買上ツマ−の会合から形成され るヘテロダイマーに対して結合するための相補ストランド上の隣接する異なる第 一および第二ＤＮＡ配列によって蛋白質結合部位が限定される、 ことから成る組み換え遺伝子系。

６、機能的蛋白質を表現するための第一遺伝子：上記遺伝子と有効に会合した第 一調節領域：および上記第一調節領域内の蛋白質結合部位を有し；該蛋白質結合 部位が相補ストランド上の隣接する異なる第一および第二ＤＮＡ配列によって限 定されており：第−蛋白買上ノマーを表現するための第二遺伝子で上記蛋白質が 上記第−ＤＮＡ配列に対して同系の第−ＤＮＡ結合ドメインから成っており；そ して 第二蛋白質上ツマ−を表現するＩ；めの第三遺伝子で、上記第二ＤＮＡ配列に対 して同系の第二ＤＮＡ結合ドメインから成っており：これによつて上記第二およ び第三遺伝子の表現が上記第一遺伝子の表現を調節する働きをしてもよい、 ことから成る原核生物もしくは真核生物の有機体のゲノム。

７、第二調節領域が上記第二遺伝子のために与えられており、上記第二領域が、 −個以上の調節子の存在または不在に応答して上記第一蛋白質モツマ−の生産を 調節する働きをする請求の範囲６によるゲノム。

８、第三調節領域が、上記第三遺伝子のために与えられており、上記第三調節領 域が、請求の範囲７の調節子と同じか異っていてもよい一個以上の調節子の存在 または不在に応答して上記第二蛋白質上ツマ−の生産を調節する働きする請求の 範囲６まなは７によるゲノム。

９、上記調節子（類）の少なくとも一個が、請求の範囲５に従う遺伝子系によっ て生産される機能的蛋白質である請求の範囲第７または８によるゲノム。

１０、隣接する異なる第一および第二ＤＮＡ配列によって限定される蛋白質結合 部位に関して、第一および第二ＤＮＡ結合ドメインに対して同系のそれぞれ異な る第一および第二ＤＮＡ結合ドメインから成る異なる第一および第二蛋白質上ツ マ−の会合によって形成されるヘテロダイマー調節子蛋白質。

１１、第−ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５’ＡＸＴＸＡＡＧＸＸ３’ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５’ＡＣＡ ＡＸＸＸ３’ ［式中、Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ％ＴＳＣまたはＧである］に対して同系であ る請求の範囲１０によるヘテロダイマー。

１２、第−ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５’ＡＴＴＴＡＡＧＴＴ３’ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合部位がＤＮＡ配列：５’ＡＣＡＡＴ ＡＡ３’ に対して同系である請求の範囲１１によるヘテロダイマー。

１：Ｌ　ＤＮＡ配列： ５’ＡＸＴＸＡＡＧＸＸＸＸＸＴＴＧＴ３’［式中、Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ 、Ｔ％ＣまたはＧ１或いはその補体から成る蛋白質結合部位。

１４、ＤＮＡ配列： ５”ＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴ３’。

或いはその補体から成る蛋白質結合部位。

１５．１求の範囲１〜３のいずれかの中で請求する細胞を有する有機体。

１６、！Ｉｆ求の範囲６〜９のいずれかの中で請求するゲノムから成る有機体。

明　　　　細　　　　書 遺伝子表現の調節 発明の背景 本発明は遺伝子表現の調節に関する。

生体系中では、細胞の働きの多くは、細胞のゲノム中で明確化された青写真に従 う蛋白質によって、実行されている。遺伝子工学では、二つの主要な方法での組 み換えＤＮＡ技術を用いて、細胞の働きが変えられる。一番目として、そこでは 、特別な蛋白質生産のためのＤＮＡコードを修飾するか、またはコードを変更す るか、または欠失させる（そのため、その蛋白質はもはや生産されなくなる）こ とによるか、または全く新しいコード部分を挿入する（それによって、通常細胞 中では全く見られない蛋白質が生産される）ことによって、細胞が生産する蛋白 質の種類が修飾される。二番目として、ある場合には、コードによって生産され る蛋白質の量を増大させるか減少させること、或いは細胞が蛋白質を生産する環 境を変化させることが、蛋白質のためのコード化を行なうＤＮＡに隣接するＤＮ Ａを変化させることによって、可能となる。

本発明は主に二番目の種類の技術に関するものであり、細胞により蛋白質の生産 を所望されるようにより容易に調節し得る手段を提供するものである。

遺伝子がそれらの表現を調節する調節領域を有していることはよく知られている 。模式的には、調節は、細胞中に存在する蛋白質を転写の開始の上流にある短い ＤＮＡ配列（結合部位）上に結合させる手段を用いて行なわれている。結合部位 上への蛋白質の結合は、下流にある遺伝子の表現を抑制もしくは促進し得る。こ の機構は多様であり、ある場合にはメツセンジャーＲＮＡの生産を開始させるＲ ＮＡポリメラーゼが必要とする部位に、結合した分子が重なるかそれを占領する かして、それによって表現を阻止し、他方では、結合した蛋白質が抑止効果を有 する別の蛋白質の結合を阻止し得る。二者択一的に、蛋白質の結合はＲＮＡポリ メラーゼの結合を容易にし、それによって遺伝子表現を誘発する。古典的な遺伝 子調節は、ラムダゲノム上の特定のＤＮＡ配列に結合しそして適当な生理学上の 条件下では遺伝子表現を抑制するか活性化することのできる、バクテリオファー ジのラムダブレッサのそれである。文献（例えばＢｒｅｎｔ、　Ｒ，８よびＰｔ ａｓｈｎｅ％Ｍ、　　（１９８５）　、　Ｃｅ１ｌ　　互１１７２９−７３６） 中には、数多くの例があり、これらは、ＤＮＡ結合、蛋白質の二量化および遺伝 子拡形が別々の機能であることを示している。

一つの種類の蛋白質調節子は、ダイマーとして二本鎖ＤＮＡに対して結合する調 節子から成っている。それらは孤立性のドメインから成っている。一つの上述ド メインの部分は、特定のＤＮＡ部位（塩基の特定の配列によって限定され、それ らのいくつかの正確な性質は本質的なものでありそしていくつかは任意のもので ある）に対して同系であり、それを認識するかまたはそれと相互作用を生じる。

どちらかのストランド中の塩基は、蛋白質のＤＮＡと結合するドメインとの接触 に関与し得るが、蛋白質の結合部位は、その蛋白質の結合部位内のどちらかのＤ ＮＡストランドの塩基配列によって、明瞭に限定されている。ダイマーの形の二 つの上記蛋白質上ツマ−は、二つの上記部位から成る座に対して結合する。単一 の上記部位は、ダイマーもしくは七ツマ−のどちらかの結合には不充分である。

これらの部位は隣接しており、そして同一もしくは類似の限定する配列を一般に 有しているが、しかしそれはＤＮＡの相補ストランド上である。従って、相補ス トランド上のこの二つの類似したＤＮＡ＠定配列は、間隙において反対の配向を 有している。それ故、隣接するＤＮＡ配列によって限定される結合部もしくは部 位は、２回回転対称を有している。

に行なうことは可能であるが、しかしこれは欠点を有している。

上記対称ＤＮＡ配列（例えば、これは２０〜３０の塩基対の長さであってもよい ）は、自然界では比較的まれである。このような配列を有機体のゲノム中に挿入 するのは、使いづらく不便である。その上、遺伝子表現の制御には限界がある。

それは一つの因子、即ち蛋白買上ツマ−の細胞濃度：のみに依存している。酵母 、哺乳動物および無を椎動物の細胞中に人工工学的に導入された遺伝子の表現を 調節するための細菌性レプレッサのホモダイマーの使用はすでに示されている、 Ｂｒｅｎｔｓ　Ｒ，およびＰｈａｓｈｎｅ、　Ｍ、　　（１９８４）　Ｎａｔｕ ｒｅ、　３１２．６１２−６１５．５Ｉｌｌｉｔｈ、　Ｇ、　Ｍ、他、（１９８ ｇ）、ＥＭＢＯＪ、、７．３９７５−３９８２　；Ｈｕ、Ｍ、Ｃ，−Ｔ、および Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　Ｎ、　　（１９８７）　、Ｃｅ１１１４８．５５５　５５ ６；Ｂｒｏｗｎ、Ｍ、他、（１９８７）　、Ｃｅ１ｌ、４９．６０３−６１２； Ｈｕ、Ｍ、Ｃ，−ＴおよびＤａｖｉｄｓｏｎｘ　Ｎ、　　（１９８８）　、Ｇｅ ｎｅ、　６２．３０１−３１３゜これらの状況において、どちらかの蛋白質モノ マーの生産の水準を変化させることによって成される制御であることを考慮する と、制御にヘテロダイマーを使用することは有利である（以下を参照）。この場 合、ホモダイマーもしくはヘテロダイマーによる遺伝子表現の抑制は、標的とな る遺伝子の上流への適当な結合部位の導入に依存している。技術的な理由（例え ば、同−細胞中で６個の遺伝子のコピーを変える必要がある６倍体植物中）、或 いは倫理的な理由（例えば、人間のゲノム中）のため、これは現在不可能である という状況にあり、そしてこのような状況下では、ヘテロダイマーによる制御は より魅力的であり表現的な選択である。ヘテロダイマーは二分子対称を必要とし ないため、二本鎖ＤＮＡの塩基の適当数を伸長したいかなる部位も、隣接しそし て二本鎖ＤＮＡの相補ストランド上にある個々の七ツマ−のための部位を有する ヘテロダイマーのための結合部位と見なすことができる。従って、結合の特異性 を適切に選択することによって、原則的に、遺伝子そのものを修飾することなく 標的遺伝子の抑制部分中のいかなる特定のＤＮＡ配列に対しても、適切なヘテロ ダイマーを向けさせることができる。例えば、遺伝子因子を遊離する、人のコル チコトロピンの配列は、本明細書に詳しく記載するヘテロダイマーのための結合 部位である４９位にあるＤＮＡ配列５’ＡＴＴＣＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＴ３’　 （発表された配列中；ＧｅｎｂｇｌｋＤａｔａｂａｓｅにおけるＨＵＭＣＲＦを 参照）を有している。

発明の要約 本発明はそれ自身、似ていないＤＮＡ結合ドメインを有する似ていない蛋白質の 対が得られるという我々の考えを基とするものであるが、それにもかかわらず、 これらは会合してヘテロダイマーを形成し、適当な非対称ＤＮＡ結合部位に対し て結合し、それによって、隣接する遺伝子の表現を調節するために用いられ得る 。

それ故本発明に従って、我々は、機能的蛋白質を表現し得る遺伝子：それと有効 に会合した上記遺伝子のための調節領域；°相補助ストランド上の隣接する異な る第一および第二ＤＮＡ配列によって限定される上記調節領域内の蛋白質結合部 位：上記第−ＤＮＡ配列に対して同系の第−ＤＮＡ結合ドメインを有する第−蛋 白質モノマー：および上記第二ＤＮＡ配列に対して同系の第二ＤＮＡ結合ドメイ ンを有する第二蛋白質モノマー；会合してヘテロダイマーを形成し得る上記第一 および第二蛋白質モノマーを有し：それによって上記へテロダイマーが上記蛋白 質結合部位に対して結合でき、従って上記遺伝子の表現を調節し二上記蛋白質結 合部位の回転対称性を有さないように上記第一および第二ＤＮＡ結合領域、並び に上記第一および第二ＤＮＡ配列が本質的に異なっている、ことから成る細胞を 提供する。

定義 本特許の目的のため： 金倉　　　非共有相互作用を通して適合するモノマーから蛋白質ダイマーを形成 する能カニ例えば静電的相互作用、ファンデルワールス力。

４２６　　ＤＮＡ結合部位内の相補ストランド上に存在するＤＮＡ配列に関して 、回転対称がないことを意味している。

ＭｉΩ　蛋白買上ツマー中の特別なりＮＡ結合ドメインが、特別なりＮＡ部位（ 一本のストランド上のＤＮＡ配列によって限定されている）を認識するために必 要な特異性（そのアミノ酸配列内）を有しており、そのためその部位に対して皿 玉である。同系ではあるが、ＤＮＡ結合ドメインが、相補ストランド上の反対配 向にある相当するＤＮＡ配列を有する部位に対し同時に結合するため正確な配置 の中で、ダイマーとして存在していない場合、該蛋白質モノマーは実際上特定の 結合を行うことができない。

更に我々は、細胞中の遺伝子表現を調節する方法を提供するものであり、この細 胞は二機能的蛋白質を表現し得る遺伝十三上記遺伝子と有効に会合した調節領域 ；および相補ストランド上の隣接する異なるＤＮＡ配列によって限定される上記 調節領域内の蛋白質結合部位を有し；それぞれ第一および第二の異なるＤＮＡド メインを各々が有する第一および第二の異なる蛋白買上ツマ−を細胞中に供給し 、上記蛋白質結合部位に対して結合できそして機能的蛋白質の表現を調節できる ヘテロダイマーを、上記七ツマ−が形成することができることから成る方法、か ら成っている。

本発明はまた、機能的蛋白質を表現するための遺伝子：上記遺伝子と有効に会合 した調節領域；および上記調節領域内の蛋白質結合部位を有し；結合した時、機 能的蛋白質の表現を調節する第一および第二の異なる調節蛋白質に対して結合の ための相補ストランド上の隣接する異なる第一および第二のＤＮＡ配列によって 蛋白質結合部位が限定されること、から成る組み換え遺伝子系も含むものである 。

各場合共、遺伝子表現の調節は、機能的蛋白質生産の促進もしくは抑制の両方を 意味している。一般に、調節領域は遺伝子の上流にあるが、場合によっては下流 もしくは遺伝子そのものの中に存在する。

我々の発明に従って、他のモノマーが存在していない時、ヘテロダイマーの結合 部位中にある同系の蛋白質結合部位に対してどちらの蛋白買上ツマ−も結合しな い；即ち両方の蛋白質が存在していない場合いかなる遺伝子調節も存在しない。

発明の詳細な説明 我々の発明は二つの重要な利点を有している。第１に、調節子領域中に対称ＤＮ Ａ結合部位を必要としないため、存在する遺伝子の調節領域において相当に広い 適用のための可能性を開くものである（上記調節子領域中にＤＮＡ配列を挿入す るかまｔ；はそれを変化させるよりもむしろ、修飾した結合蛋白質を用いて）。

第２に、２つの異なる因子に直接応答して、そして示されるように、因子のいか なる所望される組み合せにも間接的に応答して、調節される表現を提供するもの である。

ヘテロダイマーの各々の成分は、遺伝子によってそれ自身が生産された蛋白質で ある。各々の上記遺伝子は外因子（例えばエチレンのような小分子の存在、また は温度）に応答するか、或いは調節子蛋白質に応答して、それ自身調節されても よい。この調節子蛋白質は、異なるホモダイマー、第二へテロダイマーまたは同 じヘテロダイマー（自己調節）であってもよい。第二ヘテロダイマーは同様に調 節されてもよい。このように原則として、標的遺伝子の表現を調節するために望 まれるいかに多くの制御因子が使用され得るかがわかる。自ずと、各々の制御因 子用として、それを認識する適切な調節ＤＮＡ配列が利用できるに違いない。

表現を促進するか抑制するために調節が用いられ得るが、２つ以上の制御因子、 或いはいかなるそれらの組み合せの存在もしくは不在に応じて、標的遺伝子の表 現が行なわれる。これは、ホモダイマーによる制御に比べて顕著な利点である、 何故ならばこれは単一遺伝子の生産物であるからである。

従って、本発明は更に、機能的蛋白質を表現するための第一遺伝子；上記遺伝子 と有効に会合した第一調節領域：および上記第一調節領域内の蛋白質結合部位を 有し；該蛋白質結合部位が相補ストランドの上の隣接する異なる第一および第二 ＤＮＡ配列によって限定されており；第−蛋白質七ノマーを表現するための第二 遺伝子で、上記蛋白質が上記第−ＤＮＡ配列に対して同系の第−ＤＮＡ結合ドメ インから成っており；そして、第二蛋白買上ツマ−を表現するための第三遺伝子 で、上記蛋白質が上記第二ＤＮＡ配列に対して同系の第二ＤＮＡ結合ドメインか ら成っており；これによって上記第二および第三遺伝子の表現が上記第一遺伝子 の表現を調節する働きをしてもよいこと、から成る原核生物もしくは真核生物の 有機体のゲノムを提供することにある。

上記ゲノムは、上記第二遺伝子の上流に通常与えられている第二調節領域を有し ていてもよく、上記第二調節領域は、１個以上の調節子の存在まｊ：は不在に応 答して、上記第一蛋白質モノマーの生産を調節する働きを有する。

更に、上記ゲノムは上記第三遺伝子の上流に通常与えられている第三調節領域に 有していてもよく、上記第三調節領域は、第二調節領域に鮎響を与える調節子と 同じか異なっていてもよい１個以上の調節子の存在または不在に応答して、上記 第二蛋白質モノマーの生産を調節する働きを有する。

その上、上記調節子分子の少なくとも１個は、本発明に従う組み換え遺伝子系に よって生産される蛋白質分子であってもよい。

更に本発明は、各々異なる第一および第二ＤＮＡ結合ドメインを含む異なった第 一および第二蛋白買上ツマ−を会合させることによって形成された新規なヘテロ ダイマー調節蛋白質へテロダイマーから成っており：これは、隣接する異なる第 一および第二ＤＮＡ配列によって限定される蛋白質結合部位に結合することがで き、上記第一および第二ＤＮＡ結合ドメインと同系である。興味が持たれている 特定のへテロダイマーは、第−ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５′ＡＸＴＸ ＡＡＧＸＸ３’ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列＝５’ＡＣＡ ＡＸＸＸ３’ ［式中、 Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである］に対して同系であり、そし て更に詳細には、第−ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列： ５’ＡＴＴＴＡＡＧＴＴ３’ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列＝５’ＡＣＡ ＡＴＡＡ３’ に対して同系である、ところのへテロダイマー類である。

該複合体は好適には、回転対称を有していない特定の蛋白質結合部位として、Ｄ ＮＡ配列： ５’ＡＸＴＸＡＡＧＸＸＸＸＸＴＴＧＴ３’［式中、 Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ％Ｔ、ＣまたはＧである］またはその補体を有してお り、更に特別には、ＤＮＡ配列５’ＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴ３’また はその補体を有している。回転対称を有していない上記蛋白質結合部位は、調節 子領域の影響下表現される遺伝子を含むＤＮＡ配列中に天然に存在し得るが、し かし原則的には、上記蛋白質結合部位はまた、調節子領域の影響下表現される遺 伝子を含むＤＮＡ配列中に、異質のＤＮＡとして合成的に導入することもできる 。このようにして、適切な結合ヘテロダイマーが結合し得る、回転対称を有して いない公知の蛋白質結合部位を、該修飾した遺伝子は有している。

図の説明 図１は、本発明に従うヘテロダイマーと結合部位を図式的に示しており、そして 公知のダイマー／結合部位複合体に対するその関係を示している。

図２は、２個の２分子対称オペレーター（４３４およびＰ２２）のＤＮＡ配列お よび３個の非対称ハイブリッド配列を表わしている。

図３は、放射能標識した１５．１６および１７の塩基対７％イブリッドオペレー ターおよび種々の蛋白質を用いたフィルター結合試験の結果を図表を用いて示し たものである。

図４は、ＤＮアーゼＩを用いて部分的に開裂させ、そして電気泳動を行なった後 の放射能標識したハイブリッドオペレーターＤＮＡのオートラジオグラフである 。

図５は、本発明において使用できる範囲のへテロダイマー類を生じさせるために 用いられる方法を要約したものである。

我々の発明は、全く一般的に応用できるものであるが、しかし更に、バクテリオ ファージ４３４のレプレッサ蛋白質を特に参考にして説明を行なう。

バクテリオファージ４３４蛋白質は、アルファらセん（認識らせん）をＢ−型Ｄ ＮＡの主要な溝に挿入することによりで、特定のＤＮＡ配列（４３４オペｌ／− ター）に対して結合する（　Ａ　ｎｄｅｒｓｏｎ他、１９８７）。

この認識らせんは、多くの原核生物およびいくつかの真核生物のＤＮＡ結合蛋白 質中に見られる保護された“らせん−反転一らせん”構造の部分である（　Ｓ　 ａｕｅｒ他、１９８２；Ｐａｂｏ　　ａｎｄ　　５ａｕｅｒ、　　１９８４）、 　ＤＮＡ結合の配列特異性が、レプレッサ蛋白質の認識らせんの最外（溶媒にさ らされた）面のアミノ酸配列中に存在することが、数多くの実験によって示され た。ＷｈａｒｔｏｎおよびＰｔａｓｈｎｅ　（１９８５）は、４３４認識らせん のさらされた残渣をＰ２２レプレッサのそれで置換することによって、バクテリ オファージ４３４のレプレッサの特異性をＰ２２レグレッサのそれに変化させる ことができた。４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ　２２　Ｒ）］と名付けられた新しい 蛋白質は、認識らせんの溶媒にさらされた側の４個のアミノ酸を除いて４３４の レプレッサと同じである。この新規な蛋白質のＤＮＡ結合特異性は、Ｐ２２のオ ペレーターのみを認識し４３４のオペレーターを認識しないようになる。これは 図１に図式的に示されている。

図１において、４３４レプレツサ蛋白質は、らせん３を用いてオペレーターＤＮ Ａに対してホモダイマーとして結合する。４３４レプレツサらせんアルファ３の 溶媒にさらされＩ；残渣を、Ｐ２２レプレッサ（黒で示されている）のそれで置 換すると、得られるレプレッサはＰ２２オペレーターに対してのみ結合する（Ｗ ｈａｒｔｏｎ　　ａｎｄ　　Ｐｈａｓｈｎｅｓ　　ｌ　９８５）。

４３４レグレツサと４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ２２Ｒ）］　レプレッサとは、ダ イマーの接触に関しては同一であるため、それらは、各々の蛋白質の一つのモノ マーを有する混合ダイマー（ヘテロダイマー）を形成することができる。このよ うなヘテロダイマーは、４３４オペレーターの半分とＰ２２オペレーターの半分 とを有するハイブリッドオペレーターを特異的に認識することができる。これは 図１に図式的に示されている。

図１で示されるように、４３４および４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ２２Ｒ）］のレ プレッサは、それぞれ４３４およびＰ２２オペレーターに対して結合する。これ らの二つの蛋白質の間の相違は、認識らせんのＤＮＡ結合表面にのみあるため、 これらの蛋白質は、示されるように、ハイブリッドオペレーターを認識すること ができるヘテロダイマーを形成することができる。このようなハイブリッドオペ レーターは、二分子対称、即ちレプレッサホモダイマーの結合のＩ；めに必要と される特徴、を全く有していない。二つのホモダイマー認識部分は異なる長さく ４３４に関しては１４個の塩基対（ｂｐ）およびＰ２２に関しては１８ｂｐ）を 有しているため、そして単に二個の半分のオペレーターを結合させるだけで、　 　′機能を有するヘテロダイマー結合部位が得られるかどうかが明確でないため 、我々は三つの可能な結合部位を作り上げた。これらの部位の一つ（１６ｂｐハ イブリツドオペレーター）を、４３４の半分にした部位を直接Ｐ２２の半分にし た部位に融合させることによって作り出した。他の二つの部位は、１６ｂｐハイ ブリッド部位の中心に一つの塩基を挿入（１７ｂｐ部位）するか欠失（１５ｂｐ 部）させること以外は上記の融合と同じにした。これらの部位を、これらが派生 した４３４とＰ２２の部位と一緒に図２に示す。Ｐ２２および４３４オペレータ ーに関する配列を示した図２においては、結合の機能に対して必須であると考え られる塩基のみが示されている。他の塩基は“ｘ″で示されている。

図２に、ｌ　５ｂｐ、　　１６ｂｐおよび１７ｂｐのハイブリッドオペレーター のＤＮＡ配列を示す。１６ｂｐオペレーターは、４３４の半分にした部位に対し て直接融合させた一つのＰ２２の半分にした部位を有している。他の二つの部位 は、該部位の中心に一つの塩基を加えるかそこから取り除くかすることによって 作られた。

ヘテロダイマー類は、試験管内で４３４および４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ２２Ｒ ）］　レプレッサを混合することによって作られた。該混合物は、標準フィルタ ー結合技術を用いてオペレーターの結合を分析した。

詳細については以下の実験操作で示す。簡単に言えば、興味が持たれているオペ レーターを含有する短いＤＮＡ配列に放射能標識を行ない、蛋白質の調合量を増 大させるなから混合し、これのオペレーター結合に関する評価を行なう。短時間 培養した後、ＤＮＡと蛋白質の混合物を、ニトロセルロースフィルターを通して 、蛋白質はフィルター上に保持されるが、ＤＮＡはそれを通過する条件下で、濾 過を行う。特に蛋白質と結合した放射能を有するいかなるＤＮＡもまたフィルタ ー上に保持され、シンチレーション算出によって分析できる。保持された放射能 を有するＤＮＡの百分率は、従って、蛋白質／ＤＮＡ結合のｔ；めの敏感な分析 法として用いることができる。

フィルター−結合分析法を用いて、我々はまず最初に、１６ｂｐハイブリツドオ ペレ一タ一部位（正確に融合した４３４とＰ２２の半分にした部位を有する）の みが特に、４３４および４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ２２Ｒ）］レプレッサの混合 物によって保持されることを認識した。我々は更に、ホモダイマー（４３４また は４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ２２Ｒ）］）のどちらも１６ｂｐハイブリッド部位 と結合しないことを認識した。

レプレッサのヘテロダイマーは特に、強い親和力でハイブリッド部位に対して結 合している。フィルター結合の結果に関しては図３を参照。

図３は、放射能標識した１５，１６８よび１７ｂｐハイブリツドオペレーターお よび種々の蛋白質調合を用いたフィルター結合実験の結果を示している。ヘテロ ダイマーに関する結果が、ＤＮＡ添加以前にヘテロダイマーの形成を許す予備培 養を行ったものまたは行なわないものの、４３４および４３４Ｒ［アルファ３（ Ｐ２２Ｒ）］　レプレッサのｌ：ｌの混合物を用いて、得られた。この結果は、 まず最初に、異なったＤＮＡ結合特性を有する二つの同族の七ツマ−から作られ るヘテロダイマーがハイブリッドオペレータ一部位に対して結合できることを示 している。

ヘテロダイマーが形成すると、混合物中の両方のレプレッサホモダイマーのそれ とは異なる新規なりＮＡ結合特性が生じる。ハイブリッド認識部位に対するヘテ ロダイマーの結合に関する追加的証拠が、ＤＮアーゼＩ保護実験から得られ：こ れは実験操作中に記載したように行なった。

ハイブリッドオペレーターを有するプラスミドｐＡＤ１６のＥｃｏＲＩ　−Ｈｌ ｎｄＩ［［は、Ｈ１ｎｄＩ［［部位に５′−末端標識されており、順次希釈した 混合レプレッサ調合剤を用いて培養した。各々の反応中のへテロダイマーの濃度 は、コースｌルプレッサなし；２．１．６＋ａＭ；３．３．ｌｎＭ；４．６．２ ｎＭ；５．１２．５ｍＭ；６．５０ｍＭ；７．１００ｍＭであった。

Ａ＋Ｇの印を付けたコースは、ＭａｎｉａＬｉｓ他（１９８２）に記載されてい るようにプリンで開裂させた同様のＤＮＡ断片である。ハイブリッドオペレータ ーの配列を図２に示したが、断片上の４３４およびＰ２２の半分に部位の位置に 印をつけた。この結果は、特に期待した通り、レプレッサの混合物がオペレータ ーを認識し結合することを示している。保護された領域（２５ｂｐ）の大きさは 、単一結合部位に対する単一の４３４または４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ２２Ｒ） ］　レレプレッサ蛋白質の結合に関して見られる大きさに相当している（Ｗｈａ ｒｔｏｎ他、１９８４：Ｗｈａｒｔｏｎ　　ａｎｄ　　Ｐｔａｓｈｎｅ、　　ｌ 　９８５）　ｏ同様の条件下で、４３４または４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ２２Ｒ ）］　レプレッサ単独に関しては、いかなる足跡も見られなかった（データは示 されていない）。

新規な特異性を有するホモダイマー類（および結果として新規な特異性を有する ヘテロダイマー類）を生じさせ得る数多くの方法がある。これらは図５に要約し である。簡単に言えば、ＤＮＡ結合蛋白質の特異性は、ひどく二量化を変化させ ることになし、ＤＮＡ認識のらせんに対する特定の変化、認識らせんに対する無 作為の変化、或いは二量化ドメインを保持しながらのＤＮＡ認識ドメインの完全 な置換、によって変更させることができる。最も簡単な場合として、本明細書中 に図示的に示しｆ：４３４ｃアルフア３　　［Ｐ２２Ｒ］　）レプレッサを生じ させるために用いたように、一つのレプレッサからのＤＮＡに接触させる残渣を 、二番目のレプレッサのそれらで置換するために用いることができる（Ｗｈａｒ ｔｏｎ　　ａｎｄ　　Ｐｔａｓｈｅｎ、　　ｌ　９８６参照）、新規な特異性を 有するホモダイマー類は、数多くの方法、例えばＷｈａｒｔｏｎ　　ａｎｄ　　 Ｐｔａｓｈｎｅ、　　１９８７；　Ｙｏｕｄｅｒｉａｎ　　ａ、ｌ　９８３参照 、によって作ることができる。ホモダイマーのＤＮＡ結合特異性もまた、ＤＮＡ 結合ドメインを別の蛋白質のそれＩこ変化させることによって変えることができ る。この方法は、Ｌｉｎ旭、１９８８によって、細菌性レプレッサ蛋白質（ラム ダレプレッサ）の二量化接触を保持しているが酵母ＧＡＬ４蛋白質のＤＮＡ結合 特異性を有している蛋白質（ＧＡＬ４　（１−７４）＋ラムダＲ（１１２−２３ ６））を生じさせるために用いられた。

ＤＮＡ結合特異性を変化させてもレプレッサ蛋白質の二量化ドメインをひどく変 化させないため、それ故、新規な特異性を有する範囲のへテロダイマー類を生じ させる目的で、これらの変化させた特異性を有するホモダイマー類をそれぞれ互 いに組み合わせて、または親のホモダイマーと組み合わせて、用いることができ る（図５の下半分を参照）。

寅験操作 蛋白質精製 ４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ２２Ｒ）］　レプレッサを、先に示されたように、プ ラスミドＩ）ＲＷ２１９を有する細胞から精製した（Ｗｈａｒｔｏｎ　　ａｎｄ 　　Ｐｔａｓｈｎｅ、　　ｌ　９８５）　、　４３４レプレツサを、Ａ　ｎｄｅ ｒｓｏｎ他（１９８４）の方法によって精製した。両方の蛋白質の活性を分析し たところ〉８５％の活性を有していた。

ハイブリッドオペレーターのクローン化Ｓａｌ　　Ｉに適合性を有する末端に側 面を接したノ１イブリッドオペレーターを有する二本鎖合成オリゴノヌクレオチ ドを、プラスミドｐｕＣｌ　８のＳａｌ　　Ｉの部位中にクローン化させて、プ ラスミドｐＡＤｌ　５、ｐＡＤ１６およびｐＡＤ１７を生じさせた。プラスミド ｐＡＤ１６のポリリンカー領域を、プラスミドｐＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　８　”　（Ｄ ｅｎｔｅｆｌｌｌＬ、１９８５）中に再クローン化させて、ｐＤＶ５０を得た。

木！！株ＲＺ　Ｉ　Ｏ３２（ＡＴＣＣ３９７３７；Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５）か らの−木調ｐＤＶ５０　　ＤＮＡの調製および引き続く変異誘発を、Ｚ　ｏｌ　 ｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ　（１９Ｂ　２）が記載したように行なった。Ｃｈｅｎ およびＳ　ｅｅｂｕｒｇの方法（１９８５）を用いｔ；プラスミド配列を行なう ことによって、全てのオペレーター配列の立証を行なった。

フィルター結合 ハイブリッドオペレーターを、約８０−ｂｐ　　ＥｃｏＲＩ　−Ｈｌｎｄｌ［［ 断片として、相当するプラスミドから切り取り、そして記述（Ｍａｎｉａｔｉｓ 他、１９８２）されるように、ポリヌクレオチドキナーゼおよび３２ｐ−ｄＡＴ Ｐを用いて、ＥｃｏＲＩもしくはＨｉｎｄＩ［［の端のどちらかに、高い特定活 性になるように、５′−末端標識を行なった。ニトロセルロースフィルター結合 分析法（Ｒ１ｇｇ５ａ、ｌ　９６８）を以下に示す。標識したオペレーターの断 片を、４００Ｊの５Ｃ１ｍＭカコジル酸二ナトリウム（ｐＨ８）、ｌＱｍＭ塩化 マグネシウム、０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡ＝ナトリウム、音波処理したにわとりの 血液ＤＮＡ５ｕｇ／ｍｆ２を含有する塩化カリウム（ＣＢ緩衝液）５０ｍＭ、お よび５０　ｕｇ／　ｍ１２のＢＳＡ中で、最終濃度が＜２０ｐＭになるように、 １／プレツサと一緒に培養した。４３４および４３４Ｒ［アルファ３（Ｐ２２Ｒ ）］　レプレッサを氷上で希釈して、ＣＢ緩衝液（十ＢＳＡ）中１ｕＭの濃度と し、そしてこの希釈した蛋白質の一定分量を同比率で混合して“ヘテロダイマー サンプル“を得た。希釈した三つの蛋白質のサンプルを、対応する結合反応物に 直ちに加え、１．５ｍＭ−１００ｍＭの最終的範囲のレプレッサ濃度を得た。結 合を生じさせるため室温で１５分間培養した後、このサンプルを、ＣＢ緩衝液に 予め浸けておいた２４ｍｌ１１ニトロセルロースフイルター（Ｍ　ｉ　ｌ　ｌ　 １ｐｏｒｅ、タイプＨＡ０゜４５ｕｍ）を通して濾過した。標識したオペし・− ターＤＮＡの保持を、フィルターのＣｅｒｅｎｋｏｖ算出を行なうことによって 測定した。レプレッサを含有していないサンプルを勘定に入れて、背景レベルの 保持（常に６％以下）を得て、これを測定値から差し引いＩ；。

ＤＮアーゼ■保護実験 音波処理した５　ｕｇ／　ｍＱのにわとりの血液ＤＮＡ８よび５０ｕｇ／ｍ１２ のＢＳＡを含有するＣＢ緩衝液をレグレッサ結合およびＮＤアーゼＩ開裂反応用 として用いる以外はＪ　ｏｈｎｓｏｎ伸、（１９７９）によって示されるのと同 様に、ＤＮアーゼＩ保護実験を実質上行なった。ハイブリッドオペレーターを含 有するＤＮＡの断片を調製し、そしてフィルター結合のために上述したように標 識をつけた。

艶煮遭 Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｊ　、　Ｅ、、　Ｐｔａｓｈｎｅ、　Ｍ、、およびＨａｒ ｒｉｓｏｎｌｌＳ、　Ｃ。

（１９８７）　、Ｎａｔｕｒｅ、３２６．８４６−８５２゜Ｐａｂｏ、　Ｃ，Ｏ ，および５ａｕｅｒ、　Ｒ，Ｔ、　　（１９８４）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　５３．２９３−３２１゜５ａｕｅｒｘ　Ｒ，Ｔ、、　Ｙｏ ｃｕｍｓ　Ｒ，Ｒ，、、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｒ，Ｆ、、　ＬｅｗｉｓｘＭ、 ８よびＰａｂｏ、Ｃ−０，（１９８２）、Ｎａｔｕｒｅ、２９８．４４７−４５ １゜ Ｗ１１ａｒＬＯｎ％Ｒ，Ｐ−８よびＰｔａｓｈｎｅ、　Ｍ、　　（１９８５）　 、Ｎａｔｕｒｅ。

３１６．６０１−６０５゜ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｉ　、　Ｅ、　　（１９８４）　Ｔｈｅ　　７人　Ｓ　ｔ ｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ａ４３４　　Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ−ｏｐｅｒａｔｏｒ　 　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（Ｐｈ、　Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ％ＨａｒｖａｒｄＵｎｉｖｓ ｒｓｉｔｙ）　ｅ Ｄｅｎｔｓ、　Ｌ、　Ｃｅ５ａｒｅｎｉＳＧ、　ａｎｄ　　Ｃｏｒｔｅｓｅｘ　 Ｒ，（１９８３）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　　ｌ　ｌ　、 　　ｌ　６４５−１６５５゜Ｋｕｎｋｅ１％Ｔ、　Ａ、　　（１９８５）　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８２．４８８−４９２゜ Ｗｈａｒｔｏｎ、　Ｒ，Ｐ、、　Ｂｒｏｗｎ、　Ｅ、　Ｌ、およびＰ　ｔａｓｈ ｎｅ、　Ｍ、　（１９８４）Ｃｅｌｌ、３８．３６　］、　−３６９゜Ｃｈｅｎ 、　Ｅ、　Ｙ、およびＳｅｅｂｅｒｇ、　Ｐ、　Ｈ，、（１９８５）　ＤＮＡ％ ４、Ｍ、、（１９６８）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｒｏｌ、３４，３６５−３６８゜Ｚｏｌ ｌｅｒ、　Ｍ、　Ｊ　、、およびＳｍ１ｔｂ％Ｍ、　　（１９８２）　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１旦、６４８７−６５００゜ Ｊｏｈｎｓｏｎ％Ａ、　Ｄ、、　Ｍｅｙｅｒ、Ｂ、Ｊ、、およびＰ　ｔａｓｈｎ ｅ％Ｍ　、（１９７９）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａｓヱ旦、５０６１−５０６５゜Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　　Ｆｒ１ｔｓａ ｎ、　　Ｅ、　Ｆ、　ａｎｄ　　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　Ｊ　、　　（１９Ｂ　 ２）Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇｓ　Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 　Ｍａｎｕａｌ”　　（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ％Ｎｅｗ　 　Ｙｏｒｋ）。

Ｌｉｎ、Ｙ、Ｓ、　厘、（１９８８）Ｃｅｌｌ、５４．６５９−６６４゜Ｗｈａ ｒｔｏｎ、　Ｒ，Ｐ、およびＰｔａｓｈｎｅ％Ｍ、　　（１９８８）　、Ｔｒｅ ｎｄｓ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｓｃｉ、　　ｌ　Ｉ、７１−７３゜Ｗｈａｒｔ ｏｎＳＲ、Ｐ　、およびＰｔａｓｈｎｅ、　Ｍ、　　（１９８７）　、Ｎａｔｕ ｒｅ、　３２６．８８１−８９１゜ ％結合 ・・・−−−−◆ 鴫− 補正口の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）特許庁長官　植　松 　　　敏　殿 ｌ。特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８９１００３３４ ２、発明の名称 遺伝子表現の調節 ３、特許出願人 住　所　イギリス国ロンドンニスダブリュー１ビー　３ジエイエフ・ミルバンク ・インペリアルケミカルハウス（番地なし）名　称　インペリアル・ケミカル・ インダストリース・ピーエルシー（ほか１名） ４、代理人　〒１０７ ７、補正の説明 補正書間訳文の第１頁〜第３頁は明細書翻訳文の第７頁第２２行〜第１０頁第２ 行の差し替えであります。

補正書間訳文の第４頁は請求の範囲第１０項〜第１４項の差し替えであります。

上記遺伝子と有効に会合した第一調節領域；および上記第一調節領域内の蛋白質 結合部位を有し；該蛋白質結合部位が相補ストランドの上の隣接する異なる第一 および第二ＤＮＡ配列によって限定されており：第二蛋白質モノマーを表現する ための第二遺伝子で、上記蛋白質が上記第−ＤＮＡ配列に対して同系の第−ＤＮ Ａ結合ドメインから成っており；そして、第二蛋白質モノマーを表現するための 第三遺伝子で、上記蛋白質が上記第二ＤＮＡ配列に対して同系の第二ＤＮＡ結合 ドメインから戊っており：これによって上記第二および第三遺伝子の表現が上記 第一遺伝子の表現を調節する働きをしてもよいこと、から成る原核生物もしくは 真核生物の有機体のゲノムを提供することにある。

上記ゲノムは、上記第二遺伝子の上流に通常与えられている第二調節領域を有し ていてもよく、上記第二調節領域は、１個以上の調節子の存在または不在に応答 し、て、上記第−蛋白質上ノマーの生産を調節する働きを有する。

更に、上記ゲノムは上記第三遺伝子の上流に通常与えられている第三調節領域に 有していでもよく、上記第三調節領域は、第二調節領域に影響を与える調節子と 同じか異なっていてもよい１個以上の調節子の存在または不在に応答して、上記 第二蛋白質上ツマ−の生産を調節する働きを有する。

その上、上記調節子分子の少なくとも１個は、本発明に従う組み換え遺伝子系に よって生産される蛋白質分子であってもよい。

更に本発明は、各々異なる第一および第二ＤＮＡ結合ドメインを含む異なった第 一および第二蛋白質上ツマ−を会合させることによって形成された新規なヘテロ ダイマー調節蛋白質へテロダイマーから成っており：これは、隣接する異なる第 一および第二ＤＮＡ配列によって限定される蛋白質結合部位と会合して、上記第 一および第二ＤＮＡ結合ドメインと同系である。興味が持たれている特定のヘテ ロダイマーは、第−ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列： ５’ＡＸＴＸＡＡＧＸＸ３’ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５’ＡＣＡ ＡＸＸＸ３’ ［式中、 Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである１に対して同系であり、そし て更に詳細には、第−ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列： ５’ＡＴＴＴＡＡＧＴＴ３’ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５’ＡＣＡ ＡＴＡＡ３’ に対して同系である、ところのへテロダイマー類である。

該複合体は好適には、回転対称を有していない特定の蛋白質結合部位として、Ｄ ＮＡ配列： ５’ＡＸＴＸＡＡＧＸＸＸＸＸＴＴＧＴ３’［式中、 Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ％Ｔ％ＣまたはＧｆある］またはその補体を有してお り、更に特別には、ＤＮＡ配列５’ＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴ３’また はその補体を有している。回転対称を有していない上記蛋白質結合部位は、調節 子領域の影響下表現される遺伝子を含むＤＮＡ配列中に天然に存在し得るが、し カル原則的には、上記蛋白質結合部位はまた、調節子領域の影響下表現される遺 伝子を含むＤＮＡ配列中に、異質のＤＮＡとして合成的に導入することもできる 。このようにして、適切な結合へテロダイマーが結合し得る、回転対称を有して いない公知の蛋白質結合部位を、該修飾した遺伝子は有している。

１０、隣接する異なる第一および第二ＤＮＡ配列によって限定される蛋白質結合 部位に関して、第一および第二ＤＮＡ結合ドメインに対して同系のそれぞれ異な る第一および第二ＤＮＡ結合ドメインから成る異なる第一および第二蛋白質上ツ マ−の会合によって形成されるヘテロダイマー調節子蛋白質の複合体。

１１、第−ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５’ＡＸＴＸＡＡＧＸＸ３’ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５’ＡＣＡ ＡＸＸＸ３’ ［式中、Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ％Ｔ％ＣまたはＧである］に対して同系であ る請求の範囲ｌＯによる複合体。

１２、第−ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５’ＡＴＴＴＡＡＧＴＴ３’ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合部位がＤＮＡ配列：５’ＡＣＡＡＴ ＡＡ３’ に対して同系である請求の範囲１１による複合体。

１３．１Ｆ白白質台部位がＤＮＡ配列：５’ＡＸＴＸＡＡＧＸＸＸＸＸＴＴＧＴ ３’Ｅ式中、Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ１Ｔ、ＣまたはＧ］或いはその補体から 成る請求の範囲ｌＯ〜１２のいずれか１つによる複合体。

１４、蛋白質結合部位がＤＮＡ配列： ５’ＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴ３’。

或いはその補体から成る請求の範囲１３による複合体。

補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）特許庁長官　植　松 　　　敏　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８９１００３３４ ２、発明の名称 遺伝子表現の調節 ３、特許出願人 ４、代理人　〒１０７ ７、補正の説明 補正書翻訳文の第」頁〜第２頁は６月１４日提出の補正書翻訳文の第１頁第１行 〜第２頁第３行前半の差し替えであります。

補正書翻訳文の第３頁〜第４頁は請求の範囲第６項〜第９項の差し替えでありま す。

上記遺伝子と有効に会合した第一調節領域；および上記第一調節領域内の蛋白質 結合部位を有し；該蛋白質結合部位が相補ストランドの上の隣接する異なる第一 および第二ＤＮＡ配列によって限定されており；第一蛋白質モノマーを表現する ための第二遺伝子で、上記蛋白質が上記第−ＤＮＡ配列に対して同系の第−ＤＮ Ａ結合ドメインから成っており；そして、第二蛋白質モノマーを表現するだめの 第三遺伝子で、上記蛋白質が上記第二ＤＮＡ配列に対して同系の第二ＤＮＡ結合 ドメインから成っており；上記第−蛋白質上ノマーと上記第二蛋白質モノマーが 会合してヘテロダイマーを形成することができ：これによって上記第二および第 三遺伝子の表現が上記第一遺伝子の表現を調節する働きをしてもよいこと、から 成る原核生物もしくは真核生物の有機体のゲノムを提供することにある。

上記ゲノムは、上記第二遺伝子の上流に通常与えられている第二調節領域を有し ていてもよく、上記第二調節領域は、１個以上の調節子の存在または不在に応答 して、上記第−蛋白質上ノマーの生産を調節する働きを有する。

更Ｉこ、上記ゲノムは上記第三遺伝子の上流に通常与えられている第三調節領域 に有していてもよく、上記第三調節領域は、第二調節領域に影響を与える調節子 と同じか異なっていてもよい１個以上の調節子の存在または不在に応答して、上 記第二蛋白質上ツマ−の生産を調節する働きを有する。

その上、上記調節子分子の少なくとも１個は、本発明に従う組み換え遺伝子系に よって生産される蛋白質分子であってもよい。

更に本発明は、各々異なる第一および第二ＤＮＡ結合ドメインを含む異なった第 一および第二蛋白質上ツマ−を会合させることによって形成されｔ；へテロダイ マーｙ４節蛋白質の新規な複合体から成っており：これは、隣接する異なる第一 および第二ＤＮＡ配列によって限定される蛋白質結合部位と会合して、上記第一 および第二ＤＮＡ結合ドメインと同系である。

６、機能的蛋白質を表現するだめの第一遺伝子；上記遺伝子と有効に会合した第 一調節領域：および上記第一調節領域内の蛋白質結合部位を有し；該蛋白質結合 部位が相補ストランド上の隣接する異なる第一および第二ＤＮＡ配列によって限 定されており：第−蛋白買上ノマーを表現するための第二遺伝子で上記蛋白質が 上記第−ＤＮＡ配列に対して同系の第−ＤＮＡ結合ドメインから成っており：そ して 第二蛋白質上ツマ−を表現するための第三遺伝子で、上記蛋白質が上記第二ＤＮ Ａ配列に対して同系の第二ＤＮＡ結合ドメインから成っており；上記第−蛋白質 上ノマーと上記第二蛋白質上ツマ−が会合してヘテロダイマーを形成することが でき； これによって上記第二および第三遺伝子の表現が上記第一遺伝子の表現を調節す る働きをしてもよい、 ことから成る原核生物もしくは真核生物の有機体のゲノム。

７、第二調節領域が上記第二遺伝子のために与えられており、上記第二領域が、 −個以上の調節子の存在または不在に応答して上記第−蛋白質上ノマーの生産を 調節する働きをする請求の範囲６によるゲノム。

８、第三調節領域が、上記第三遺伝子のために与えられており、上記第三調節領 域が、請求の範囲７の調節子と同じか異っていてもよい一個以上の調節子の存在 または不在に応答して上記第二蛋白質上ツマ−の生産を調節する働きする請求の 範囲６または７によるゲノム。

９、上記調節子（類）の少なくとも一個が、請求の範囲５に従う遺伝子系によっ て生産される機能的蛋白質である請求の範囲第７または８によるゲノム。

国際調査報告 −一一喝ＩＡ帥−−−Ｎ４．　　　　ＰＣＢ／ＧＢ８９１００３３４

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．機能的蛋白質を表現し得る遺伝子：それと有効に会合した上記遺伝子のため の調節領域；相補ストランド上の隣接する第一および第二ＤＮＡ配列によって限 定される上記調節領域内の蛋白質結合部位；上記第一ＤＮＡ配列に対して同系の 第一ＤＮＡ結合ドメインを有する第一蛋白質モノマー； および上記第二ＤＮＡ配列に対して同系の第二結合ドメインを有する第二蛋白質 モノマー； 会合してヘテロダイマーを形成し得る上記第一および第二蛋白質モノマーを有し ： それによって上記ヘテロダイマーが上記蛋白質結合部位に対して結合でき、従っ て上記遺伝子の表現を調節し：上記蛋白質結合部位が回転対称性を有さないよう に上記第一および第二ＤＮＡ結合領域および上記第一および第二ＤＮＡ配列が本 質的に異なっている、 ことから成る細胞。
2. ２．蛋白質結合部位上に結合した上記ヘテロダイマーの存在が機能的蛋白質の生 産を阻害することによって遺伝子の調節を行なう請求の範囲１による細胞。
3. ３．蛋白質結合部位上に結合した上記ヘテロダイマーの存在が機能的蛋白質の生 産を促進することによって遺伝子の調節を行なう請求の範囲１による細胞。
4. ４．細胞、即ち 機能的蛋白質を表現し得る遺伝子： 上記遺伝子と有効に会合した調節領域；および相補ストランド上の隣接する異な るＤＮＡによって限定される上記調節領域内の蛋白質結合部位を有し； それぞれ第一および第二の異なるＤＮＡ結合ドメインを各々が有する第一および 第二の異なる蛋白質モノマーを細胞中に供給し、上記モノマーが会合して、上記 蛋白質結合部位に対して結合でさそして機能的蛋白質の表現を調節できるヘテロ ダイマーを、形成することができる、ことから成る細胞、中で遺伝子表現を調節 する方法。
5. ５．機械的蛋白質を表現するための遺伝子；上記遺伝子と有効に会合した調節領 域；および上記調節領域内の蛋白質結合部位を有し；結合した時、機械的蛋白質 の表現を調節する第一および第二の異なる蛋白質モノマーの会合から形成される ヘテロダイマーに対して結合するための相補ストランド上の隣接ずる異なる第一 および第二ＤＮＡ配列によって蛋白質結合部位が限定される、 ことから成る組み換え遺伝子系。
6. ６．機能的蛋白質を表現するための第一遺伝子；上記遺伝子と有効に会合した第 一調節領域；および上記第一調節領域内の蛋白質結合部位を有し；該蛋白質結合 部位が相補ストランド上の隣接する異なる第一および第二ＤＮＡ配列によって限 定されており：第一蛋白質モノマーを表現するための第二遺伝子で上記蛋白質が 上記第一ＤＮＡ配列に対して同系の第一ＤＮＡ結合ドメインから成っており；そ して 第二蛋白質モノマーを表現するための第三遺伝子で、上記第二ＤＮＡ配列に対し て同系の第二ＤＮＡ結合ドメインから成っており；これによって上記第二および 第三遺伝子の表現が上記第一遺伝子の表現を調節する働きをしてもよい、 ことから成る原核生物もしくは真核生物の有機体のゲノム。
7. ７．第二調節領域が上記第二遺伝子のために与えられており、上記第二領域が、 一個以上の調節子の存在または不在に応答して上記第一蛋白質モノマーの生産を 調節する働きをする請求の範囲６によるゲノム。
8. ８．第三調節領域が、上記第三遺伝子のために与えられており、上記第三調節領 域が、請求の範囲７の調節子と同じか異っていてもよい一個以上の調節子の存在 または不在に応答して上記第二蛋白質モノマーの生産を調節する働きする請求の 範囲６または７によるゲノム。
9. ９．上記調節子（類）の少なくとも一個が、請求の範囲５に従う遺伝子系によっ て生産される機能的蛋白質である請求の範囲第７または８によるゲノム。
10. １０．隣接する異なる第一および第二ＤＮＡ配列によって限定される蛋白質結合 部位に関して、第一および第二ＤＮＡ結合ドメインに対して同系のそれぞれ異な る第一および第二ＤＮＡ結合ドメインから成る異なる第一および第二蛋白質モノ マーの会合によって形成されるヘテロダイマー調節子蛋白質。
11. １１．第一ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５′ＡＸＴＸＡＡＧＸＸ３′ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５′ＡＣＡ ＡＸＸＸ３′ ［式中、Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである］に対して同系であ る請求の範囲１０によるヘテロダイマー。
12. １２．第一ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ配列：５′ＡＴＴＴＡＡＧＴＴ３′ に対して同系であり、そして第二ＤＮＡ結合部位がＤＮＡ配列：５′ＡＣＡＡＴ ＡＡ３′ に対して同系である請求の範囲１１によるヘテロダイマー。
13. １３．ＤＮＡ配列： ５′ＡＸＴＸＡＡＧＸＸＸＸＸＴＴＧＴ３′〔式中、Ｘは、ヌクレオチド塩基Ａ 、Ｔ、ＣまたはＧ］或いはその補体から成る蛋白質結合部位。
14. １４．ＤＮＡ配列： ５′ＡＴＴＴＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴ３′，或いはその補体から成る蛋白質結 合部位。
15. １５．請求の範囲１〜３のいずれかの中で請求する細胞を有する有機体。
16. １６．請求の範囲６〜９のいずれかの中で請求するゲノムから成る有機体。