JPH03503644A - ヘパリン含有製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘパリン含有製剤 本発明は、ヘパリンを含有する製剤、およびヒアルロニダーゼの使用に関する。

ヘパリンおよびその誘導体は、長年にわたって、薬理学的活性製剤ならびに血液 と接触する装置、義肢および移植組織の処理の両者に、抗凝固剤として広く使用 されてきた。ヘパリンの抗凝固剤としての使用は、たとえばＣｒａｗｆｏｒｄ、 　Ｇ、Ｐ、Ｈ，＆ロＯｕｇｌａｓ、＾、Ｓ、により、“ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎ ｃｅｓ　　ｉｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ（Ｐｏｌｌｅｒ、　Ｌ、 ＩＩＡ；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ　、　１９７７年刊）に まとめられている。

ヒアルロン酸またはその場もしくは誘導体を分解する酵素はヒアルロニダーゼと して知られている。ヒアルロニダーゼはｉｎ　　ｖｉｖｏにおいて組織の透過性 の修飾能を示し、したがって薬理学的活性物質の送達または浸透を増大させる「 拡散Ｊ剤として作用することから、薬理学的活性成分を含有する多くの製剤への 使用が、以前に提案されている。

ヒアルロニダーゼはまた、心筋虚血（この語は、心筋の血流低下の結果生じる心 臓の細胞の不可逆的障害、ならびに壊死を意味する）の緩和への使用が提案され ている。しかしながら、この目的でヒアルロニダーゼが使用されることがあった としても、それが、心脈管系外科において広く用いられるヘパリンと接触するこ とはほとんど確実であろうと思われる。この場合、ある種のヒアルロニダーゼ、 とくに哺乳類動物の精巣ヒアルロニダーゼ（以下、ＭＴＨと略す）はきわめて低 濃度のヘパリンによっても阻害されることから、治療の有効性は消失してしまう ことが考えられる。

ヒアルロニダーゼとヘパリンの両者を含有する製剤は以前に提案されている。た とえばフランス特許明１書２１０１　３９３＠は、乾穿および他の類似の皮膚疾 患の処置（または静脈瘤、腫瘍、局所的火傷、痔疾、もしくは静脈炎後遺症の処 Ｗ）のための外用組成物を提案するもので、これは表面酵素（たとえばヒアルロ ニダーゼ）、゛抗凝固剤（たとえばヘパリン、ジクマリンまたはヒルジン）と、 ざらに末梢血管拡張剤（たとえば塩化アセチルコリンまたはニコチンアミド）を 含有する。この製剤は、軟膏、クリーム、ゼリー、エアゾルまたはフオーム剤と して記載されている。ヒアルロン酸−ぜの種類は特定されていない。

本発明者らが以前の欧州特許明細書８２９　７８５号に記載しているように、ヒ アルロニダーゼには基本的に２つの種類があり、比較的非特異性で、ヒアルロン 酸、コンドロイチンおよび関連多糖を分解するものと、特異的にヒアルロン酸の みを分解するものである。前者は天然にはるかに広く分布し、哺乳類動物の精巣 、肝臓および肺臓ならびにある種の微生物に見出される。一方、後者はある種の 他の微生物（たとえばストレプトミセス細菌）および旧ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉ ｎａｌｉｓのようなヒル類または１（ｉｒｕｄｉｎａｒｉｉｎａｅ亜科のヒル類 に由来するものである。これらの後者の種類はヒアルロン酸を特定の部位で切断 し、エンド−β−グルクロニダーゼと呼ばれる。

ヘパリンをヒアルロニダーゼと混合して使用することは以前に提案されているが 、ある種のヒアルロニダーゼ（とくに哺乳１ＩＩａ物精巣ヒアルロニダーゼ）は ヘパリンによって競合的に阻害されることが明らかにされている（Ｈａｔｈｅｗ ｓ　　＆　　Ｄｏｒｆｍａｎ　　：　　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｒｅｖ ｉｅｗ３　５　　：　　３８１〜４０２参照）。

薬物送達ビヒクルとして使用するためには、とアル［にダーぜ酵素が血液または 血漿と接触して中和または阻害されないことが前提条件である。本発明者らは、 驚くべきことに、エンド−β−グルクロニダーゼはヘパリン抗凝固剤に阻害され ないことから他のヒアルロニダーゼとは異なること、すなわち、本発明により、 エンド−β−グルクロニダーゼの活性を損うことなく、ヘパリンとエンド−β− グルクロニダーゼを患者に共投与できることを見出したのである。

したがって、本発明は、ヘパリンをエンド−β−グルクロニダーゼと配合してな る医薬製剤を提供する。本発明の製剤はさらに、薬理学的に許容される希釈剤、 担体本発明の製剤は、様々な形態とすることができる。たとえば、局所的に適用 可能な形態、たとえばクリーム、ゲル、軟膏またはエアゾルとすることができる 。この場合、たとえば、それは血液の凝固の防止が望ましい開放創傷等に適用さ れる。また、本発明の製剤は徐放性製剤、たとえば坐剤もしくはデボ剤、または （好ましくは）静脈内投与製剤であってもよい。静脈内投与製剤といった場合、 皮下用シリンジ等により１回または反復単位用量として注射できる製剤、または 点滴等により長時間連続的に血流中に投与できる製剤を意味する。このような注 　。

射可能な静脈投与用単位用量は密封滅菌アンプルに入れて提供されるのが好まし く、この場合、本発明の製剤は液体、凍結または凍結乾燥形態とされる。

後者の場合、担体は通常緩衝食塩水媒質であり（通常、Ｅ）Ｈ３〜５．５の範囲 に緩衝される）、この場合の水性担体は滅菌蒸留（または他の方法で高度に精製 した）水（たとえば少なくとも９９．９１！１％純度の）である。

本発明の製剤が１回または反復用量の注射用である場合、各単位用量はエンド− β−グルクロニダーゼ２０．０００〜５０，０００単位を含有させることが好ま しい。１単位は、至適ｐＨにおいてヒアルロン酸から、１時間に１μグのグルコ ースを遊離ぎせる当量と定義される。この約２０単位が、［ヒアルロニダーゼ国 際標準Ｊ　　（Ｊ、Ｈ。

Ｈｕｉｐｈｒｅｙ：　Ｂｕｌｌ、　ＷＨＯ、±６：２９１〜２９４．１９５７） に記載された１国際軍位（１，Ｕ、　）に相当する。

本発明の製剤を静脈内点滴として投与する場合には、エンド−β−グルクロニダ ーゼの濃度は、個別単位用聞（たとえば、丸薬形態）で投与する剤型の場合より も濃度を実質的に低くする。たとえば、本発明の静脈内投与用組成物中のエンド −β−グルクロニダーゼの濃度は、２４　ｆｍｍｍｍ型”ＩＫＩａｔ：＃：）　 １０〜１　、０００１．ｔｌ、カＮ与されるようにする。

本発明の製剤中のヘパリン濃度は通常、２４時間に５００〜４，０００１１．が 皮下、静脈内または注入投与されるようにする。エンド−β−グルクロニダーゼ とヘパリンは、エンド−β−グルクロニダーゼ１１．υ、にヘパリン２〜６１． ｔｌ、の比で含まれるのが好ましい。

本発明の製剤に使用されるエンド−β−グルクロニダーゼは、上述の欧州特許明 細書に詳細に記載されているように、Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉｉｎａｅ亜科のヒル に由来するものである。また、ヒルの他の種、たとえば旧ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃ ｉｎａｌｉｓ。

または他の適当な起源に由来するエンド−β−グルクロニダーゼでもよい。上述 の欧州特許明細書の場合と同様、遺伝子操作または合成によるエンド−β−グル クロニダーゼの均等体もヒルに「由来する」の詔に包含されるものである。

ヘパリンは、そのトロンピンおよび他のブＯＭ囚因子に対する作用により、抗凝 固剤である。一方、抗凝固作用は、プラスミノーゲンアクティベーターに仲介さ れるフィブリンおよび／またはフィブリノーゲンの分解による凝血形成の防止に よっても達成できる。このような凝血分解剤の例には、組織型プラスミノーゲン アクティベーターおよびヘメンチン（米国特許４　３９０　６３０号に記載され ているようにＨａｅｌｌｅｎｔｅｒｉａ　　ｈｉｌｉａｎｉｉに由来する１ａＩ 素溶解または纏維素原溶解物質）がある。

本発明の製剤には１種または２種以上の他の薬理学的活性成分を含有させること ができる。とくに好ましい態様においては、本発明の製剤にはさらに、１種また は２種以上の凝血溶解剤、たとえばプロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、ヘメンチ ン、ストレプトキナーゼまたは組織プラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ ＞および／またはその誘導体を含有する。凝血溶解剤は通常、体重１腹あたり５ ００〜３．０ＯＯ１，Ｕ、の履を含有させる。

以上、本発明は、ヘパリンおよびエンド−β−グルクロニダーゼの両者を含有す る医薬製剤として記述したが、本発明はさらに、ヘパリンとエンド−β−グルク ロニダーゼを同時にまたは連続して、所望により上述の凝血分解剤とともに、患 者に投与する。血栓状態の治療的処置（たとえば心筋梗塞の処置）方法をも提供 するａ凝血分解剤は、ヘパリンおよび／またはエンド−β−グルクロニダーゼと ともに、あるいは別個の投与様式で投与される。　他の観点からみれば、本発明 は、ヘパリン投与患者の治療に、所望によりヘメンチンおよび／または組織プラ スミノーゲンアクティベーターとともに、使用するためのエンド−β−グルクロ ニダーゼを包含するものである。

本発明を以下の例により、説明する。

５、０１１１１Ｆ＆中、様々な濃度ノヘバリン（０〜２５００ＵＳＰ／１ｍ）の 存在下２５℃で１時間ブレインキュベートし、ついでヒアルロン酸（５ｊｌＦ／ ｍ）に添加し、インキュベーションを３７℃で１時間継続した。還元糖の生成を 、１：１　３．５−ジニトロサリチル酸試薬（１００ａｙ：２Ｍ　　ＮａＯＨ中 ５％Ｗ／Ｖジニトロサリ７／Ｌ。

酸プラス２５０ｍ：水中６０％Ｗ／Ｖ酒石酸ナトリウムカリウム、水で５００− にする）を加えて、激しく沸騰した水中で５分間加熱して反応を停止させること により定には適当なブランクと非酵素対照を包含させた。結果は、ヘパリンを含 まない対照インキュベーションで得られた吸光度の百分率として示す。２５００ 　Ｕ　Ｓ　Ｐ／ｄまでの濃度のヘパリンは、添付の第１図に示すように、ヒルヒ アルロニダーゼの活性に有為な影響を与えなかった。

ヒアルロニダーゼとは著しく対照的に、哺乳類動物精巣ヒアルロニダーゼ（ＭＴ Ｈ）はヘパリン濃度３ＵＳＰ／−以上で（これは、ｉｎ　　ｖｉｖｏにおいて非 凝固状態を誘導するのに必要な血漿／血清レベルである）完全に阻害された。Ｍ ＴＨ（７５Ｔ　Ｕ／ｍｅ）　ヲ２０ｅｉＨＭＥＳ、０．ＩＭ　　ＮａＣｊ　　ｐ Ｈ５，０１衝液中ヘハリン（０〜２５０ＵＳＰ／ｄ＞と２５℃で１時間ブレイン キュベートし、ついでヒアルロン酸塩に加え（１：１０最終希釈）、ざらに３７ ℃で１時間インキュベートした。

活性は還元糖検定（上述）を用いて測定し、ヘパリン非添加対照の百分率として 表す。同一条件下でヒルヒアルロニダーゼについて得られた結果を添付の第２図 に示す。

ロニダーゼ（５０１ＬＩ／ｄ）の存在下または非存在下、３７℃で１時間インキ ュベートし、ついで全血を加えて能に全く影響を与えないことを示している。

匙１羞 ヘパリン　　　　　　　全血凝固時間（分）ＮＣ：３７℃、２０分までに凝血を 生じないし ヒルヒアルロニダーゼ（１００ＩＵ／４）をヘパリン（２５０〜２５００ｔＪＳ Ｐ／ｄ）の存在ドまたは非存在下に２０ｍＨＭＥＳ、０．１Ｍ　　ＮａＣＪ　　 ｐＨ５，０緩衝液中インデイアンインクと１：１に混合した。ラットにこの混合 物５０μｌを皮）注射し、１〜３時間にわたって拡散させた。ラットを層殺し、 拡散領域を１２寮するために皮膚を除去した。

第２表にまとめた結果は、酵素の存在下にインクの拡散領域は対照に比較して約 １０倍に増大し、これは比較的高用量のヘパリンによって有意に影響されないこ とを示している。

１＋ ヘハ＋）　ン（ＵＳＰ／ｌ１１）　　　　拡ｌ！領域Ｏ） 酵素なし　　　　２５０＞０．３〜０．６（：ｌ１２の範囲酵素あり　　　　２ ５０）２．０〜４．０１２の範囲鉄Ａ Ａ）　ヒルヒアルロニダーゼ（２００１Ｕ／ｄ）を、正常保存クエン酸塩用血漿 の２０ｍＨＭＥＳ、０．１ＭＮａＣ１１）Ｈ５，Ｏ緩衝液中希釈液と１１間ブレ インキュベートし、ついでヒアルロン！　（５ａｅｙ／ｄ）に加えてさらに１時 園３７℃でインキュベートし、還元糖活性を測定した（方法については例１参照 ）。結果は、ブランクを差し引いたのち白票不存在下での百分率活性として表し 、添付の第３図に示す。ヒルヒアルロニダーゼの活性は血漿の存在によって刺激 されることを示している。

Ｂ）　ヒルとフルロニダーゼ（２００１Ｕ／ｄ）を血漿およびヘパリン処理血漿 の存在下および非存右手、２０ｍＨＭＥｓ、０．ＩＭ　　ＮａＣｊ！、Ｉ）８５ ．０１１１液中、２５℃で１時間ブレインキュベートした。３０．０００ＬＩＳ Ｐ／２４時間のヘパリン処理前後に患者から採取した血漿では、凝血時間は４０ 秒から８０秒に増大した。

ヒアルロン酸を添加してインキュベーションを続け（上記Ａ参照）、還元糖を上 述（例１）のようにして測定した。

結果は、第４図に示すように、同一患者からの非ヘパリン処理血漿に比べてヘパ リン処理血漿におけるヒルヒアルロニダーゼ活性の有意な阻害はみられないこと を示している（図中、カラムＡはヘパリン非添加、カラムＢはヘパリン添加での 結果を示す）。

匠支 ＾）ヒルヒアルロニダーゼ（６８ｒ　ＬＪ／ｄ）を、ヘパリン（２００ＬＩＳＰ ／ｄ）の存在下および非存在下に、ある濃度範囲（０，５０００１ＬＩ／ｌｌ１ ）の組織プラスミノーゲン７タテイベーター（ｔＰＡ）およびヒアルロン酸（５ ｑ／ａｄ　）とともに混合し、３７℃で１時間インキュベートした。還元糖を測 定しく例１）、結果は、ｔＰＡを含まない対照の百分率として表す。

結果は、第５図に示すように、比較的高用量のヘパリンの存在下にも不存在下に も、ヒルヒアルロニダーゼ活性に対してｔＰＡは影響を与えなかった（図中、カ ラムＡはヘパリン非存在下、カラムＢはヘパリン存在下での結果を示す）。

Ｂ）ヒルヒアルロニダーゼ（７５１Ｕ／ｄ）をヘメンチン（１８０ＩＵ／ｍｅ） （１１Ｕは３７℃で１分間にフィブリノーゲン１μグを凝固させない量である） と混合し、またはその非存在下に、ヘパリン（１，５〜１５００ＵＳＰ／ｄ＞と ともに２５℃で１時間インキュベートし、ついでヒアルロン酸（２■／ｄ）を加 えてさらに３７℃で１時間インキュベートした。還元糖のレベルを測定しく例１ 参照）、結果はヘパリンを含まない対照の百分率として表す（第３表）。

匙旦羞 非添加　　　　　　１５　　　　　　　１００ヘメンチン　　　　　　１．５　 　　　　１０３添加　　　　　　１５　　　　　　　　９３．８結果はヘパリン の存在下にも不存在下にも、ヘメンチンＪネ′アルロニダーゼ活性に対し、実質 的に影響を与えないことを示している。

るミ ヘム０リン（ｕｓＰ／ｍｌ） ト 皮 に 国際調査報告 １噂ｒ＋１１４醪＾”１１ｐ’＠””　　　ＰＣＴ／ＧＢ　　８９１００３９Ｌ 国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘパリンをエンド−β−グルクロニダーゼと配合してなる医薬製剤。
2. ２．さらに薬理学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する請求項１ 記載の製剤。
3. ３．エンド−β−グルクロニダーゼはヒル由来のものである請求項１または２記 載の製剤。
4. ４．さらに少なくとも１種の凝血溶解剤を含有する請求項１〜３のいずれかに記 載の製剤。
5. ５．該凝血溶解剤は組織プラスミノーゲンアクティベーターおよび／またはへメ ンチンを含む請求項４記載の製剤。
6. ６．静脈内投与に適用される請求項１〜５のいずれかに記載の製剤。
7. ７．請求項６記載の製剤を含有する密閉滅菌アンプルを含む注射用単位用量剤形 。
8. ８．ヘパリン処置患者の治療に使用するためのエンド−β−グルクロニダーゼ製 品。
9. ９．ヘパリン処置患者に投与するためのエンド−β−グルクロニダーゼとへメン チンおよび／または組織プラスミノーゲンアクティベーターの配合物。
10. １０．ヒトまたはヒト以外の動物に、ヒル由来エンド−β−グルクロニダーゼの ようなエンド−β−グルクロニダーゼとヘパリンを同時にまたは連続的に、また 所望により少なくとも１種の凝血溶解剤を該エンド−β−グルクロニダーゼおよ び該ヘパリンの少なくとも一方と一緒に、または別個に、投与（好ましくは静脈 内に）することを含む血栓状態の治療的処置方法。