JPH03503716A - バチルス・スリンギエンシス亜種イスラエレンシスからの新しい毒素をエンコードするｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バチルス・スリンギエンシス亜種イスラエレンシスからの新しい毒素をエンコー ドするＤＮＡ断片発明の背景 及鼠０旦！ 本発明は、殺虫性タンパク質の遺伝情報を指定する新規なりＮＡ断片および昆虫 、とくに力の防除におけるこのようなタンパク質の使用に関する。さらに詳しく は、（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｔｈｕｒｉｅｎｇｉｅｎｓｉｓ　　５ｕｂｓ、　　 　１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）により産生される１３０ｋＤの殺虫性タンパク質の 遺伝情報を指定する断片に関する。新規なりＮＡ断片を含有するキメラ遺伝子お よび前記断片を組み込んだバクテリア、組織、種子および植物を、また、論じる 。

１党 バチルス・スリンギエンシス亜種イスラエレンシス、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　　ｅｔ 　　ａｌ、、Ｍｓｏｑｕｉｔｏ　　Ｎｅｗｓ、３ヱ：　３５５−３５８（１９７ ７）は、胞子形成とともにパラ胞子の８−エンドトキシンの結晶を産生ずるグラ ム陽性胞子形成有機体である。Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｔｒｅｎｄｓ　　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、、３：１０８−１１０（１９８７）；Ｂｕｌｌａ　　ｅｔ　 　ａｌ、、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ｓ８　：１４７−２０４　（１９８０ ）。δ−エンドトキシンは力およびブユの幼虫に対して極めて毒性である、ｄｅ 　　Ｂａｒｊａｃ、ＣＲＡｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｐａｒｉｓ、ｓｅｒ　　Ｄ２８６： ７９８−８００　（１９７８）ＪＴ’ｈｏｍａｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ １ｌ　　５ｃｉ−１６０：１８１−１９７　（１９８３）と同時に赤血球に対し て細胞溶解活性を示す、Ｔｈｏｍａｓ　　ｅｔ　　ａｌｏ、Ｊ−Ｃｅｌｌ　　Ｓ ｃｉ、：５Ｑ：１８１−１９７　（１９８３）、精製した亜種イスラエレンシス （ｓｕｂｓ。

１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）の結晶質封入体は、分子量１３０ｋＤの（すなわち、 各々が分子量１３０ｋＤの２つのタンパク質）二重のもの、分子量６５ｋｂおよ び分子量２７ｋＤ、ならびに他の小さいタンパク質を包含する、種々の分子量の いくつかの主要なポリペプチド種から成る。

参照、Ｈｕｂｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、「微生物の病気の病原性（Ｐａｔｈｏｇ ｅｎａｓｉｓ　　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）Ｊ、Ｄａ ｖｉｓａｏｎ、Ｅ＋Ｗ＋編、ＡＩ　）ａｎｈｅ　Ｉｄ　　Ｏｓｍｕｎ％Ｎｅｗ　 　Ｊｅｒｓｅｙ、２０９２３４　（１９８１）；Ｔｈｏｍａｓ　　ｅｔ　　ａｌ 、、Ｊ、Ｃａ１ｌ　　Ｓｃｉ、、８０：１８１−１９７（１９８３）；ヤマモト ら、Ｃｕｒｒ、Ｍｉｃｒｏｂｉｆ−１９：２７９−２８４（１９８３）。亜種イ スラエレンシスの結晶の全体の毒性に対するこれらのポリペプチドの相対的濃度 はかなり興味があることである。

最近、亜種イスラエレンシスの結晶を構成する、個々のポリペプチド成分の活性 を明らかにすることについて２つのアプローチが存在する。

いくつかのグループは、結晶または結晶／胞子混合物からの亜種イスラエレンシ スタンパク質の生化学的技術による分離を報告した。参照、Ｄａｖｉｄｓｏｎ　 　ｅｔ　　ａｌ、、Ｃｕｒｒ、Ｍｉｃｒｏｂｉｌ、、１１：　１７１１７４　（ １９８４）；Ｔｈｏｍａｓ、ＰｈＤ、Ｔｈｅｓ　ｉｓ。

ケンブリッジ大学（１９８５）；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１６土、３９　４６　（１９８５）；Ｗｕｅｔ　’ａ’ １．、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｓ、、１９０：２３２　２３６　（１９８５）；Ｌ ｅｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅ　ｓ、Ｃｏｍｍ、　、上２６：９５３　９６０　（１９８５）；Ｃｈｅｕ１ ２６　（１９８５）；Ｖｉｓｓｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔこ のアプローチを使用して、１３０ｋＤの二重のもの、６５ｋＤおよび２７ｋＤの ポリペプチドが他のポリペプチド種の不存在下に研究された。

あるいは、一般の方法による分離は現在いくつかの場合において報告５ｌ−１５ ８（１９８５）；Ｗａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂ２７ｋＤのタン パク質をエンコードする構造遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ ｏｌｉ）中でクローニングおよび発現され、Ｗａｌ　（１９８４）：Ｗａａｌｗ ｉｊｋ　　ｅｔ　　ａｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ％ 　１３：８２０７−８２１６　（１９８５）、そしてバチルス・スブチリス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｉｓ）中でクローニングおよび発現された、Ｗ ａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．−Ｂ’ｉｏ１．１９１：１３−２２　 （１９８６）−さらに、この遺伝子ん磁気撹拌機は発表されｔ：。参照、Ｗａａ ｌｗｉｊｋ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、１３：８２０７　８２］６（１９８５）；Ｗａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、 、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

上豆工：　１−１１　（１９ｉ）。分子量７２ｋＤの膜力部分をエンコードする 構造遺伝子は、クローニングされ、そして配列決定され、Ｔｈ。

ｒｎｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙｓ　　１６６：８０１ −８１１　（１９８６）　、モして亜種イスラエレンシスＨＤＩ−Ｄｉｓｐｅｌ から分離されたｒ５．３ｋｂＪの遺伝子と多少の相同性を共有することが示され た、５ｃｈｅｆ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、Ｉ旦升：　６２ ６４−６２７２　（１９８５）。さらに、殺カタンパク質をエンコードする亜種 イスラエレンシス遺伝子は、クローニング宿主のバチリス・メガテリウム（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から分離されｌ二、５ｅｋａｒ　　ｅ ｔ　　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、３ヨじ３：１５１−１５８　（］　９８５）。この遺 伝子のヌクレオチド配列は、最近、ヤマモトら、「無を椎動物の病理学の基礎お よび応用の面（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　　ａｎｄ　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ａｓ ｐｅｃｔｓ　　ｏｆ　　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）Ｊ 、Ｓａｍｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｔ。

編、（Ｆｏｒｔｈ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎｌ　　ＣｏｌＣｏ１１ｏｑｕｉｕ 　　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、オランダ国（１９８６ ）により報告され、そしてオープンリーディングフレームの長さから、それは２ つの分子量１３０ｋＤの二重のもののタンパク質の１つの遺伝情報を指定するよ うにＥわれる。この遺伝子をを収容する組み換え体バチリス・メガテリウムの細 胞は１３０ｋＤのポリペプチドを合成ヒ、このポリペプチドは亜種イスラエレン シス結晶タンパク質に対してレイズされた抗血清と免疫学的に反応する、５ｅｋ ａｒ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　、１３ ７：７４８−７５本発明は、亜種イスラエレンシスの第２の１３０ｋＤタンパク 買の遺伝情報を指定する遺伝子の発見を包含する。この遺伝子によりエンコード されるタンパク質は、殺虫性を有し、そして昆虫の有害生物に対する前進する戦 いにおいて他の有用な因子を提供する。

発明の要約 本発明は、殺虫性タンパク質をエンコードする新規なりＮＡ断片に関する。詳し くは、本発明は、ｂｐｌで開始しｂｐ４４５１で終わる第７図に示す新規なバチ ルス・スリンギエンシス亜種イスラエレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｔｈｕｒ ｉｅｎｇｉｅｎｓｉｓ　　５ｕｂｓ、　　　１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）のヌクレ オチド配列との配列の相同性まＩ；は実質的な配列の相同性を有するヌクレオチ ド配列からなる殺虫性タンパク質、およびその殺虫性部分の遺伝情報を指定する ＤＮＡ断片に関する。その殺虫性部分は、例えば、ｂｐ８９１で開始しｂｐ４４ ３０で終わる第７図に示すヌクレオチド配列との配列の相同性または実質的な配 列の相同性を有するヌクレオチド配列を包含する。主題のＤＮＡ断片は、Ｍ７図 に示すアミノ酸配列に対して相同性であるが、あるいは実質的に相同性であるア ミノ酸配列を有する、殺虫性、とくに殺カ性のタンパク質、およびその殺虫性部 分の遺伝情報を指定し、そして本発明はこれらのタンパク質に、また、関する。

好ましいタンパク質は、約１３０ｋＤの分子量を有するものである。殺虫量のこ のようなタンパク質からなる殺虫性組成物および殺虫量のこのようなタンパク質 を保護すべき場所に適用することからなる昆虫を抑制する方法は、また、本発明 の範囲内である。

本発明は、また、（１）プロモーター領域を含有するＤＮＡ断片および（２）前 述の殺虫性タンパク質をエンコードするＤＮＡ断片からなる、微生物、とくに大 腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）中で発現することができるキメラ 遺伝子に関する。好ましいプロモーター領域は、ＩａｃＺプロモーターを含有す るものである。好ましい実施態様において、キメラ遺伝子はさらに３′逆向き反 復配列からなる。Ｅ、ｃｏｌｉを使用する最も好ましい実施態様において、キメ ラ遺伝子はさらに３′逆向き反復配列からなり、そしてプロモーター領域は］ａ ｃＺプロモーターを含有する。最も好ましい実施態様は第９図に図解されている 。本発明は、また、このようなキメラ遺伝子を含有する微生物、とくにＥ。

ｃ　ｏ　Ｉ　ｉ％および微生物の性質または特性を変更する！こめにこのような キメラ遺伝子を使用することに関する。

さらに、本発明は、（１）プロモーター領域を含有するＤＮＡ断片および（２） 前述の殺虫性タンパク質をエンコードするＤＮＡ断片からなる、植物細胞中で発 現することができるキメラ遺伝子に関する。本発明は、また、このようなキメラ 遺伝子を含有する植物細胞、ｌまたは２以上のそれらの細胞中にこのようなキメ ラ遺伝子を含有する植物組織、植物種子および植物、および植物細胞、植物組織 、植物種子および／まｔ；は植物の性質または特性を変更するためにこのような キメラ遺伝子を使用することに関する。

図面の簡単な説明 第１図は、ｐ　１３０／Ｐ　１−ＤＮＡでプライミングしたＥ、ｃｏｌｉ転写ゴ 翻訳系において合成された、３Ｂ３標識ポリペプチドのＳＤＳ　１３％ポリアク リルアミドゲルのフルオログラフを提供する。レーン１は免没前血清を使用して 生体外反応で沈澱した物質を含有する。レーン２は、亜種イスラエレンシス１３ ０ｋＤの二重のものに対してレイズされｔ；抗血清を使用して生体外反応で沈澱 した物質を含有する。レーン３は、１４Ｃ標識分子量標準を含有する。標準の大 きさくｋＤ）は左のヘリに示されている。

第２図は、５ｅｋａｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｇｅｎｅｓ３３：１５１−１５８　 （１９８５）。この遺伝子のヌクレオチド配列は、最近、ヤマモトら、「無を椎 動物の病理学の基礎および応用の面（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　　ａｎｄ　　Ａ ｐｐｌｉｅｄ　　Ａｓｐｅｃｔｓ　　ｏｆ　　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　　Ｐ ａｔｈｏｌｏｇｙ）Ｊ、Ｓａｍｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ。

編、（Ｆｏｒｔｈ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎｌ　　ＣｏｌＣｏ１１ｏｑｕｉｕ 　　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　　ＰａｔｈＯＩＯｇ７ｓ　オランダ国（１９８ ６）に記載されている、完全な１３０ｋＤのδ−エンドトキシン遺伝子（ｐＰｃ １３０）を構成するために使用する方法を示す。黒くした円形の線は、Ｙａｎｉ ｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、３３：１０３−１１９　 （１９８５）に記載されているｐＵＣ１３ベクターからのＤＮＡを表す。放射線 標識したプローブとして使用した制限断片は、ｐ１３０／ｐｉ−１より下に太い 線により示されている。

第３図は、新規なｐｃｃ１３０　　ＤＮＡでプライミングしかつ３５Ｓ−メチオ ニンを補充したＥ、ｃｏｌｉ転写−翻訳系において合成された、３１Ｓ標識ポリ ペプチドの５ＤＳ１３％ポリアクリルアミドゲルのフルオログラフを提供する。

レーンＩは免疫前血清を使用して生体外反応で沈澱しｔＥ物簀を含有する。レー ン２は、亜種イスラエレンシス１３０ｋＤの二重のものに対してレイズされた抗 血清を使用して生体外反応で沈澱した物質を含有する。レーン３は、１′Ｃ標識 分子量標準を含有する。標準の大きさくｋＤ）は左のヘリに示されている。

第４図は、ｐｃｃ１３０の新規な亜種イスラエレンシスＤＮＡインサートの部分 的制限地図を含有する。Ｎ末端アミノ酸をエンコードするオープンリーディング ７レーム（ＯＲＦ）は、黒い領域により示されたいる。

第５図（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）は、ｐｃｃ１３０の３．９４ｋｂのインサートの 新規なヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド８９１から延びる切頭オープンリ ーディングフレームに相当するアミノ酸配列は、対応する配列より下に示されて いる。ＳＤはシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇｒｎｏ）配列、５ｈ ｉｎｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｒｕｒｅ、２４５：３４　３８　（１９７５） の位置を示す。

第６図は、新規な亜種イスラエレンシス１３０ｋｄのカルボキシ末端のクローニ ングのために使用しｔ；方法を示す。第１に、放射線標識した１、８ｋｂのＨｉ ｎｄｌＩＩ断片を使用して、カルボキシ末端をエンコードする２、３ｋｂのＨｉ ｎｄｌｌｌ断片を分離した。次いで、この断片を使用して、完全なδ−エンドト キシン遺伝子を含むｐＣＨｌ　３０を構成した。

第７図（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、亜種イスラエレンシスから新規な１３０ｋＤ のδ−エンドトキシン遺伝子を構成する、ｐｃＨ１３０の４゜４６ｋｂのインサ ートの新規なヌクレオチド配列を示す。４．４６ｋＤのインサートは、次のよう にしてを提供された：ｐＣＣ１３０から３゜ｇ４ｍｂｉ断片および、放射線標識 したＨ４ｎｄｌＩＩ−Ｃ１ａｌ断片を使用して分離されｔ：Ｈｉｎｄｌｌｌ断片 から誘導された、Ｃ１ａｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片。ヌクレオチド８９１からヌク レオチド４４３０に延びるオープンリーディングフレームに相当するアミノ酸配 列は、対応する配列の下に示されている。制限酵素の切断の部位の数は、適当な 配列の上に示されている。ＳＤはシャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇ ｒｎｏ）配列、５ｈｉｎｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｒｕｒｅ、２４５　：　３ ４−３８　（１９７５）の位置を示す。３つの星印ｒ＊＊＊Ｊは、停止コドン、 ＴＧＡ　（ｍＲＮＡ　　ＬＪＧＡのＤＮＡ同等体）を示す。・第８図は、前に報 告したバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｔｈｕｒｉｅｎｇｉ ｅｎｓｉｓ）δ−エンドトキシン遺伝子をもつｐｃＨ１３００ＲＦの新規な構造 遺伝子の配列の、マトリックス分析を使用する、比較を提供する。比較は次の既 知の遺伝子配列を使用する：　（ａ）ｐｃＨ１３０，これは５ｅｋａｒ　　ｅｔ 　　ａｌ、、Ｇｅｎｅｓユ３：１５１−１５８　（１９８５）およびヤマモトら 、「無を椎動物の病理学の基礎および応用の面（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　　ａ ｎｄ　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ａｓｐｅｃｔｓ　　ｏｆ　　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａ ｔｅ　　Ｐａｔｈｏｌｏｇ３’）Ｊ、Ｓａｍｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｌ、Ｊｉｓ　 　（ＦｏｒｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎｌ　　ＣＣｏ１１ｏｑｕｉｕ　　ｏｆ　 　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　　Ｐａｔｌｂ０１０ｇＦｓオランダ国（１９８６ ）に記載されている、亜種イスラエレンシスの分子量１３０ｋＤのδ−エンドト キシン；　（ｂ）Ｔｈｏｒｎｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ。

ｇｙ、ｌ旦６　：　８０１−８１１　（１９８６）に記載されている亜種イスラ エレンシス遺伝子；（ｃ）Ｗａａｌｗｉｊｋ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎｕｃ］ｅｉ Ｔｃ’Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１３：８２０７−８２１６（１９８５ ）；Ｗａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１旦１　：　ｌ−１ １（１９８６）に記載されている亜種イスラエレンシス亜種イスラエレンシスの 分子量２７ｋＤのδ−エンドトキシンをエンコードする遺伝子；および（ｄ）Ｓ ｃｈｎｅｐｆ　　ｅｔ　　ａｌ、、ジャーナル・Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２ ６０：６２６４−６２７２　（１９８５）に記載されているレピドプレラン特異 的毒素をエンコードするδ−エンドトキシン遺伝子。ヌクレオチドの番号は対応 するヘリ上の各遺伝子について示す。サート要素の長さ−１５；不一致の最大数 −３゜第９図は、ＩａｃＺプロモーターをもつ新規な亜種イスラエレンシスδ− エンドトキシン遺伝子の構成を図解する。オリゴヌクレオチド５′−ＣＴＣＡＡ ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＴＴＴＴ−３’（）を使用する独特ＢａｍＨＩ亜種 イスラエレンシスは、ヌクレオチド位置８６１−８６７においてつくられた。次 いで、１．３ｋｂのＢａｍＨＩ−）Ｉｉｎｄｌｌｌ断片を、ｐｃＨ１３０の２． ３ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ断片と組み合わせて使用して、１ａｃＺプロモーターをも つ完全な毒素の転写融合体を構成した。さらに、外部発生の（ｅｘｔｒａｇｅｎ ｉｃ）３″逆向き反復配列をエンコードする、ｐｃＨ１３０から誘導されたＨｉ ｎｃｌ−Ｃ１ａｌ断片を、ｐＣＨ１３０の構成において使用した。

第１０図は、亜種イスラエレンシス１３０ｋＤ二重のものに対してレイズされた 抗血清を使用するＳＤＳポリアクリルアミドゲルのイムノブロッティングを示す 。レーンｌはｐＢｃ１３０を収容するＥ、ｃｏｌｉのリゼイトから誘導されたタ ンパク質のほぼ２００μｇを含有する。レーン２はレーンｌにおけるのと同一の リゼイトのほぼ１００μｇをを含有すｇ、レーン３はｐＵｃ１８を収容するＥ、 ｃｏｌｉのリゼイトから誘導されたタンパク質のほぼ２００μｇを含有する。レ ーン４は精製した亜種イスラエレンノス結晶タンパク質の５０μｇを含有する。

矢印は亜種イスラエレンシス１３０ｋＤの二重のものの位置を示す。

発明の詳細な説明 この説明および／まｌ−は請求の範囲において、次の略号、用語および句を参照 する。

ここで使用するとき、文字の略号Ｃ，ＧＳＡおよびＴは、ＤＮＡ中に存在する、 それぞれ、ヌクレオチドのントシン、グアニン、アデニンおよびトミンを意味す る。略号Ｕは、ＲＮＡ中に存在する、ヌクレオチドウランルを意味する。

ここで使用するとき、アミノ酸は次のよ−〉に略する：Ａ１ａａ−アラニン　　 　　　　Ａｒｇ−アルギニンＡｓｎ−アスパラギン　　　　Ａｓｐ−アスパラギ ン酸Ｃｙｓ−システィン　　　　　ｃｒｙ−グリシンＧ１ｎ＝グルタミン　　　 　　Ｇｌｕ−グルタミン酸Ｈｉ　ｓ−ヒスチジン　　　　　Ｌｙｓ−リジン１１ ｅ−インロイシン　　　　Ｌｅｕ−ロイシンＭｅｔ−メチオニン　　　　　Ｐｈ ｅ−７エニルアラニンＰｒｏ−プロリン　　　　　　５ｅｒ−セリンＴｙｒ冨ヂ ロシン　　　　　　Ｖａｌエバリン略号ｒｂ　Ｉ）ｊは塩基対を意味し、ｒｋｂ Ｊはキロ塩基対を意味し、「ｋＤ」はキロダルトンを意味し、「ｍＤ」はメガダ ルトンを意味し、そして「ＭＷ」は分子量を意味する。

句ｔＤＮＡ断片または配列」は、ここで使用するとき、−末鎖および二本鎖のデ オキンリポ核酸および一末鎖リボ核酸セグメントを適用可能ならば包含する。

ここで使用するとき、句「配列の相同性」または「相同性」は、文脈に応じて、 （１）他のＤＮＡ断片と同一のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片または（２ ）他のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。

ここで使用するとき、句「実質的な配列の相同性」または「実質的に相同性」は 、文脈に応じて、（１）他のＤＮＡ断片によりエンコードされるタンパク質に類 似する性質または特性をもつタンパク質をエンコードする、他のＤＮＡ断片に十 分に類似するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片まｌ；は（２）他のタンパク 質に類似する性質または特性を示す他のタンパク質に十分に類似するアミノ酸配 列を有するタンパク質を意味する。

用語「殺虫性部分」は、文脈に応じて、（１）殺虫性タンパク質の遺伝情報を指 定するＤＮＡ断片のセグメントまたは（２）それら自体殺虫性である殺虫性タン パク質のセグメントを意味する。

句「キメラ遺伝子」は、ここで使用するとき、他の遺伝子源からの殺虫性タンパ ク質の遺伝情報を指定する少なくとも１つのＤＮＡ断片に融合した１つの遺伝子 からのプロモーター領域からなる、雑種ＤＮＡセグメントを呼ぶ。

用語「３′逆向き反復配列」は、ここにおいて、ｍＲＮＡに転写されたとき、安 定なヘヤピンループ構造を形成する、本発明の新規な殺虫性をエンコードする３ ′末端から下流に位置するＤＮＡ配列を意味する。

用語「プロモーター」は、ここにおいて、一般に解読配列の３′末端から上流に 位置し、酵素ＲＮＡポリメラーゼの結合に含まれる、ＤＮＡ断片を呼ぶ。

用語「微生物」は、ここで使用するとき、単細胞の有機体、例えば、原核生物、 例えば、藍藻植物門（藍藻）、ま！；はバクテリア、例えは、大腸菌（Ｅｓｃｈ ｅｒｉｅｈｉａ）；下等の真核生物、例えば、菌・かび、例えば、酵母およびフ ィラメント軟菌・かび、例えば、不つロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）および アスペルギルス（、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、または藻類、例えば、ロドフィ タ（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、フェオフィタ（ＰｈａｅｏｐｈｙＬａ）およびク ロロフィタ（Ｃｈｌ、：＋ｒｏｐｈｙｔａ）；原生生物、例えば、アメーバ−、 プロトシア：およびウィルス、例えば、バクロウィルスまｌ；は核ポリへドロシ スウィルスを包含する。

用語「植物細胞」は、ここで使用するとき、全植物または培養物中の、多細胞の 高等植物からの細胞を意味する。

用語「植物組織」は、ここで使用するとき、全植物または培養物中の、分化また は未分化の植物細胞を意味し、次のものを包含するが、これらに限定されない： 根、新芽、腫瘍組織、例えば、根頭菌えい病、花粉など。

用語「殺虫性」は、ここにおいて単独であるいは組み合わせて使用するとき、殺 虫に対して毒性（致死的）または闘争的（致死下の）であることを意味する。

本発明の新規な殺虫性をエンコードするＤＮＡ断片は、ここに記載する遺伝子操 作および分子クローニングの技術およびそれらの変法を使用して、−バチルス・ スリンギエンシス亜種イスラエレンシスの７２ｍＤのプラスミドから得ることが できる。このような技術の適当な変法は、当業者とって明らかであろう。操作お よびクローニングの手順は、次の文献を一般に参照することができる：マニアチ ス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）ら、「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）。

コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ ）（１９８１）。７２ｍＤのプラスミドを有するバチルス・スリンギエンシス亜 種イスラエレンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｔｈｕｒｉｅｎｇｉｅｎｓｉｓ　　 ５ｕｂｓ、　　　１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）の菌株は、ナショナル・フレクショ ン・才ブ・インザストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ 　　Ｇｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　ａｎｄ　　Ｍ ａｒｉｎｅ　　Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｏｒｒｙ　　Ｒｅ５ｅａ、ｒｃｈ　　５ｔ ａｔｉｏｎｓスコツトランド、アバーディーン、１３５アベイロード、ＡＢ　９ ８ＤＧ、　Ｐ　、　Ｏ，Ｂ　ｏ　ｘ　３１）に受託され、そして受は入れ番号Ｎ ＣＩＢ　　１２４９２を有する。

本発明のＤＮＡ断片は、ｂｐｌで開始しｂｐ４４５１で終わる第７図に示す新規 なバチルス・スリンギエンシス亜種イスラエレンシスのヌクレオチド配列との配 列の相同性または実質的な配列の相同性を有するヌクレオチド配列、およびその 殺虫性部分、例えば、ｂｐ８９１で開始しｂｐ４４３０で終わるまＩ；はｂｐ８ ９１で開始しｂｐ約２７００終わる部分からなる。好ましくは、ＤＮＡ断片はｂ ｐｌで開始しｂｐ４４５１で終わるか、あるいはｂｐ８９１で開始しｂｐ４４３ ０で終わるか、あるいはｂｐ８９１で開始しｂｐ約２７００終わる、第７図に示 すＤＮＡ断片に対して相同性である。

本発明のＤＮＡ断片によりエンコードされるタンパク質は、殺虫性、とくに殺カ 性である。タンパク質が有効である力の例は、次のものを包含するが、これらに 限定されない：エデス・ニジブチ（Ａｅｄｅｓ　　ａｅｇｙｐｔｉ）、アノ７エ レス・ガンビアエ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ　　ｇａｍｂ　ｉ　ａ　ｅ）およびフレ ックス（Ｃｕｌｅｘ）。エデスおよびアノ７エレスの力は、世界のある区域にお ける、潜在的に生命を脅かす病気、例えば、それぞれ、黄熱病およびマラリャを 有するので、とくに重要である。好ましい標的力は、エデス・ニジブチである。

タンパク質は第７図に示すアミノ酸配列に対して相同性であるか、あるいは実質 的に相同性であるアミノ酸配列またはその殺虫性部分を有することができるが、 好ましいタンパク質は第７図に示すアミノ酸配列に対して相同性であるか、ある いはその殺虫性部分である。その考えられる殺虫性部分は、例えば、次のものを 包含する：ｂｐ８９１で開始しｂｐ約２７００終わる第７図に示すヌクレオチド 配列との配列の相同性まｔ；は実質的な配列の相同性を有するヌクレオチド配列 からなるＤＮＡ断片によりエンコードされる。好ましいタンパク質は、約１３０ ｋＤの分子量を有するもの、最も好ましくは第７図に示すアミノ酸配列に対して 相同性であるものである。

本発明は、また、（１）プロモーター領域を含有するＤＮＡ断片および（２）前 述の殺虫性タンパク質をエンコードするＤＮＡ断片からなる、微生物または植物 中で発現することができるキメラ遺伝子に関する。利用する特定のプロモーター 領域は、微生物または植物細胞により認識されなくてはならない：すなわち、そ れは微生物または植物のＲＮＡポリメラニゼ酵素と結合し、そしてこの酵素を殺 虫性をエンコードするＤＮＡ断片の転写開始亜種イスラエレンシスに向けること ができなくてはならない。

微生物中の発現を望む場合、好ましくは微生物はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ ｏｌｉまたは藍藻である。他の微生物、とくに他の原核生物または下等真核生物 、例えば５菌・かびの数を使用することができる。原核生物の例は、次のものを 包含する二大腸菌（（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉ ａ）、シゲラ（Ｓｈ　ｉｇｅ　］　ｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ）およびプロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）；バシラセア（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　１ｉｃ ｅ）；リゾビアセアエ（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）、例えば、リゾビウム（Ｒ ｈ　１ｚｏｂ　ｉｕｍｕ）およびアグロバクテリウム（Ａｇｒａｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ）；スピリラセアエ（Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、例えば、ジモモナス（ Ｚ　ｙ　ｍ　ｏ　ｍｏｎａｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アエロモナス （Ａｅｒ。

ｍｏ　ｎ　ａ　ｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、デスル７才ビブリオ（Ｄｅｓ ｕｌｆｏｖｔｂｒｉｏ）、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）；ラクトバシラセ アエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；シュードモナダセアエ（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ）およびアセト／＜クテル（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）；アゾトバクテラセア エ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）；ニトロバクテラセアエ（Ｎｉｔｒｏ ｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）；およびシアノフィタ（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）（藍 藻）。例示的真核生物は、次のものを包含する：藻類、例えば、ロドフイタ（Ｒ ｈｏｄ。

ｐｈｙｔａ）、フエオフイタ（Ｐｈａｅｏｐｈｙｔａ）およびクロロフイタ（Ｃ ｈ’１ｏｒｏｐｈｙｔａ）；菌・かび類、例えば、フイコミセテス（Ｐｈｙｃｏ ｍｙｃｅｔｅｓ）およびアスコミセテス（Ａｓｃｏｍｙｃｅ　ｔ　ｅ　ｓ　）　 、これは酵母、例えば、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅｓ）およびシゾサツカロミセス（Ｓｃｈ　ｉ　ｚｏａｃｃｈａ　ｒ。

ｍｙ　ｃ　ｅ　ｓ）　；バシジオミセテス（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）酵 母、例えば、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、アウレオバシジウム（Ａ ｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）およびスポロポロムセス（Ｓｐ。

ｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）；および菌根菌。

Ｅ、ｃｏｌｉを宿主として使用する好ましいプロモーター領域は、１ａｃＺプロ モーターを含有するものである。ここでＥ、ｃｏｌｉおよび他の微生物のための 他のプロモーター領域ならびに遺伝子の発現を促進する他の調節配列は、当業者 にとって明らかであろおう。参照、例えば、次の文献を参照：Ｏｌｄ　　ａｔ　 　ａｌ、、「遺伝子操作の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　　ｏｆ　　Ｇｅｂｎｅ 　　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）Ｊ、ｃａｒｒ　　ｅｔ　　ａｌ、編（Ｂｌａｃ ｋｗｅｌｌ　　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　ＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓＳ　１９８ ５）；Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ−Ｒｅｖ、ｏｆ　　Ｇｅ ｎｅｔｉｃｓ、１３：３１９（１９７９）。

好ましい実施態様において、キメラ遺伝子は、さらに、３゛逆向き反復配列から なる。上に記載したように、３′逆向き反復配列は本発明の新規な殺虫性をエン コードする断片の３′末端から下流に位置ＤＮＡ配列を包含し、このＤＮＡ配列 は、ｍ　ＲＮ　Ａに転写するとき、安定なヘヤピンループ構造を形成する。この 逆向き反復配列を付加して、殺虫性をエンコードするバチルス・スリンギエンシ ス亜種イスラエレンシスＤＮＡ新井の発現のレベルを増加する。当業者は認識す るように、安定なループ構造を形成するために、逆向き反復ＤＮＡ配列はとの配 列の相同性または実質的な配列の相同性を共有するが、反対向きである、互いに 近接する２つの領域を含有する。ループの構造がより安定になるほど、タンパク 質の発現の増強作用は大きくなる。当業者は理解するように、逆向き反復におけ る２つの領域の相同性が大きくなりかつこれらの２つの領域が近接するほど、生 ずるループ構造の安定性は大きくなる。適当な逆向き反復配列は、当業者にとっ て容易に明らかであり、そして、例えば、配列 ５’　−ＴＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴ ＴＴＴＡＡ−３’　、ならびに、次の文献に記載されているいるように、亜種ク ルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）δ−エンドトキシン構造遺伝子の３′末端を越え て見いだされる逆向き反復配列を包含する：Ｗ。

ｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ、、「微生物の分化の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ ｔｉｏｎ）Ｊ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｎ１ｎｔｈ　　 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　５ｐｏｒｅｓ　　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ１カリ フォルニア州アシロマー、１９８４年９月、Ｈｏｃｈ　　ｅｔａｌ、編、Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　　５ｏｃｉｅｔｙ　　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｂｉ０１０ｇ３’ｓ　ワ シントン、Ｄ、Ｃ，。好ましい逆向き反復配列は、５″−ＴＴＡＡＡＡＡＣＣＡ ＴＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＴＡＡ−３’ を有する。

当業者は認識するように、本発明の断片の３′末端から下流に位置するとき、ま たタンパク質の発現を増強するように働く、他のＤＮＡ断片が存在する。１つの このような断片は、ポリアデニル化部位、例えば、次の文献に記載されているも のであることができるであろう：タンパク質生物合成の分子の機ｉ（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｂｉｏｓｙｎｔｈ ｅｓｉｓ）Ｊ、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ　　ｅｔ　　ａｌ、編、ｐｐ、５６２−５６ ５　（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ニューヨーク　１９７７）；Ｗａｔｓｏｎ 　　ｅｔ　　ａｌ、、「組み換え体ＤＮＡ：短い過程（ＲｅｃＯｍｂｉｎａｎｔ 　　ＤＮＡ：ＡＳｈｏｒｔ　　Ｃｏｕｒｓｅ）Ｊ、（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｄｍａｎ 　　＆ＣＯ９、ニューヨーク、１９８３）；およびＡｌｂｅｒｔｓ　　ｅｔ　　 ａｌｏ、「細胞の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　。

ｆ　　ｔｈｅ　　Ｃａ１ｌ）」、（Ｇａｒｌａｎｄ　　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ。

ニューヨーク、１９８３）。

Ｅ、ｃｏｌｉを利用する最も好ましい実施態様において、キメラ遺伝子のプロモ ーター領域は１ａｃＺプロモーターを含有し、そして遺伝子はさらに３′逆向き 反復配列からなる。最も好ましい実施態様は第９図に図解する構成体である。

本発明のキメラ遺伝子の発現のために適当な植物細胞、ならびにこのような発現 を促進するプロモーターおよび他の調節配列は、欧州特許出願第１９３．２．５ ９号およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、ｏｆ　　 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３：３１９（１９７９）、他の適当な植物細胞およびプロ モータ・−は当業者にとって明らかであろう。

本発明は、また、このようなキメラ遺伝子を含有する微生物および植物細胞、お よびｌまたは２以上のそれらの細胞中にこのようなキメラ遺伝子番含有する植物 組織、植物種子および植物に関する。キメラ遺伝子を使用して、このような微生 物、植物細胞、植物組織、植物種子および／または植物の性質または特性を変更 する。一般の遺伝子操作手順を利用して、キメラ遺伝子、例えば、次の文献に記 載されているキメラ遺伝子で微生物および植物の形質転換を突施することができ る：マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、「モレキュラー・クローニング（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ、コールド拳スプリング（ｌハーバ−（Ｃ。

Ｉｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）（１９８２）および欧州特許出願第１ ９３，２５９号および欧州特許出願第１４２，９２４号。探求する性質または特 性の変更は、特記しない限り、微生物、植物細胞、植物組織、植物種子および／ または植物が有する殺虫性の性質または特性である。

殺虫量の前述のタンパク質からなる殺虫性組成物および、保護すべき位置に、殺 虫量のこのようなタンパク質を適用するからなる、昆虫を抑制する方法は、また 、本発明の範囲内である。

使用において、このようなタンパク質を含有する、分離したタンパク質または完 全な微生物まｔ；は植物細胞を保護すべき場所（区域）に適用する。保護すべき 場所は、例えば、昆虫の有害生物の棲息環境または成長する植物または植物を成 長すべき区域を包含する。タンパク質を分離するために、微生物または植物は、 普通の手段、例えば、酵素分解または洗浄剤などを使用して溶菌し、そして標準 の技術、例えば、クロマトグラフィー、抽出、発現などにより精製することがで きる。あるいは、微生物または植物は収穫しそして乾燥するか、あるいは完全な かつ生きている適用した微生物、植物細胞、植物組織、植物種子および／または 植物であることができる。

分離しｌ；タンパク質または収穫しかつ乾燥したタンパク質含有微生物または植 物細胞は、単独であるいは組成物で使用することができる。組成物は、種々の方 法で、特定の使用に依存して、ある数の普通の添加剤を使用して配合することが できる。添加剤は湿潤剤、洗浄剤、安定剤、付着剤、伸展剤または増量剤を包含 することができる。組成物の例は、ペースト、ダスティング粉末、湿潤性粉末、 粒体、餌およびエーロゾル組成物を包含する。他の殺虫剤、ならびに殺菌・かび 剤、殺生物剤、除草剤または肥料を、また、このようなタンパク質、微生物また は植物細胞と一緒に使用して、追加の利点または利益を得ることができる。

このような組成物は普通の方法で調製することができる。使用するタンパク質ま たはタンパク質含有微生物まｌ；は植物細胞の量は、種々の因子、例えば、標的 有害生物、使用する組成物、組成物を適用すべき区域および存在する気候条件に 依存する。一般に、殺虫性タンパク質の濃度は、配合物に基づいて、少なくとも 約０．１重量％、よりしばしば約０゜１５〜約０．８重量％であろう。

実際には、保護された区域、すなわち、殺虫性タンパク質を単独であるいは組み 合わせて適用した区域において、昆虫のあるものは餌を取る。

あるいは、昆虫のあるものは、完全な生きているキメラ遺伝子を有する微生物、 植物細胞、植物組織、植物種子および／または植物の餌を取る。

いずれの場合においても、昆虫は殺虫性タンパク質を摂取し、そして死亡するか 、あるいは損傷を受ける。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は例示のノｉを 目的とし、そして本発明の範囲を限定すると解釈すべきではない。すべての分子 量Ｉノボリアクリルアミドゲルの試料の推定した重量に基づく近領の重量平均分 子量である。

Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ　　ＴＧＩ　（１２、ａ　（ｌａｃ−ｐｒｏ）、５ｕｐＥ、ｔ ｈｉ、ｈｓｄＤ５／ｆ’　ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃｅ−ｌａｃＺ ＡＭ１５、ａｍｐ’）［メディカル・リサーチ・カランシル（Ｍｅｄｉｃａｌ　 　Ｒｅ５ｅａｃｈ　　Ｃｏｕｎｃｉｌ　（ＭＲＣ）、分子生物学研究所、英国ケ ンブリッジ、から入手可能］およびｐＵｃ１８　［Ｙａｎｉｓｃｈ　　ｅｔ　　 ａｌ、、Ｇｅｎｅ、３３：１０３　１１９（１９８５）に記載されていおり、そ して二ニー・イングランド・ノ（イオラブス（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）、米国ミゾリー州ベセスダ、から入手可能］を、それぞれ、クロ ーニングの宿主およびベクターとして使用した。ＤＮＡ配列決定のために、Ｍ１ ３ｔｇ１３０［アマーンヤム（Ａｍｅ　ｒ　ｓｈａｍ）ＰＬＣｓ英国パツキンガ ムシャイヤー、アマ−シャツ、から入手しＩ；）を使用した。

制限エンドヌクレアーゼは、二ニー・イングランド・ノくイオラブス（Ｎｅｗ　 　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国ミゾリー州ベセスダ、から入手し 、そしてマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、［モレキュラー・クローニング（ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）４、：）−ルド・スプリング＋ハーバ−（Ｃ ｏｌｄ　　５ｐｒｉｎ’ｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）（１９８２）により推奨される緩 衝液中で使用した。Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼれらはある数の源から容易に入手可 能である。仔ウシ腸ホスファターゼ［ＢＣＬ、ベーリンガー・オーポレーション （ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＣｏｒ、）（ロンドン）リミテッド、英国イーストサセ ックス、から容易に入手可能］を使用して、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｉ ’：＋、ｒモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ）：寅験室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ 、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏ ｒ）（１９８２）に記載されている中程度の塩緩衝液中でベクターＤＮＡを脱リ ン酸化した。３ＩＳ−メチオニン、α−”Ｐ−ｄＡＴＰおよびａ　　”Ｓ　　ｄ ＡＴＰをアマ−ジャム（Ａｍｅ　ｒｓｈａｍ）ＰＬＣ，英国パツキンガムシャイ ヤー、アマ−ジャムから購入しＩ；。

Ｓａｎｇｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ−、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、ヱ４　：　５４６３−５４６８　（１９７７）およびＢａ ｎｋｉｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、「生命科学における技術（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ　　ｉｎ　　ｔｈｅ　　Ｌｉｆｅ　　５ｃｉｅｎｃｅｓ）Ｊ、Ｖｏｌ、Ｂ５０ ８．１−３４　（１９８３）をここにおけるＤＮＡ配列決定のために使用しＩ； 。ランダムＤＮＡ断片は、カップホーン（ｃ　ｕ　ｐ　　ｈ　ｏ　ｒ　ｎ）超音 ｍ％理装置［ヒート・システムスーウルトラソニックス・インコーホレーテッド （Ｈｅａｔ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）、Ｐｌａｉｎｆｉｅ ｌｄｓ米国ニューヨーク、Ｗ−３７５型１を使用して発生させた。超音波処理し たＤＮＡを末端修復し、次いで低いゲル化温度のアガロース［ＦＭＣコーポレー ション（Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｍａｒｉ’ｎｅ　　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　　 Ｄｅｖｉｓｏｎｓ　メイン州０４８４１０ツクランド］のゲル電気泳動を使用し て、大きさで分画し、そして要求される分画を精製しｔ；。次いで、末端修復し 大きさで分画したＤＮＡをＳｍａ　Ｉ制限リン酸化しｔ：Ｍ１３３ｔｇ１３０中 に結合した。

組み換え体は１００μｇ／ｍＱのアンピシリンを含有する２ＸＴＹ培地（ｂａｎ ｋｉｅｒおよびＢａｒｒｅｌ、１９８３）中で中程度対数期に増殖させ、次いで 誘発因子Ｉ　ＰＴＧ　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を０．５ミリモルの濃度に添加した。

細胞を４０−４４時間の増殖後遠心により収穫し、そして生ずる細胞沈澱を脱イ オン水で洗浄し、次いで５０ミリモルのトリス−アセテート、ｐＨ８，０，１０ ％ｗ／ｗスクロース、２ｍｇ／ｍａのりゾチーム中に再懸濁した。この懸濁液を 氷上で１ｏ分間インキュベーションし、次いで３０秒の４〜５期間で最大強度で 超音波処理［ダ’７７ｚス量インスフルメ７ン（Ｄａｗｅｓ　　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ］、英国ロンドン］　した。生ずるリゼイトの一部をポリアクリルアミ ドゲルまたは毒性の分析に使用した。

ここで利用する抗血清はニューシーラント白ウサギにＳＤＳポリアクリルアミド ゲルからゲル精製により分離した、亜種イスラエレンシス１３０ｋＤの二重のも のを注射してレイズさせた［Ｗａｌｋｅｒ　　ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　ｐｅｐ ｔｔａｅ　　ａｎｄ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ　　Ａｎａｌｙｓ ｉｓ）Ｊ、２５７　２６５　（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　　）Ｔｏｌｌａ ｎｄ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｐｒｅｓｓ）、１９８０］。精製したタン パク質を７０インド完全アジユバント（第１回の注射）または７０インド不完全 アジユバント（引き続く注射）で乳化したのち、皮下注射した。７０インド完全 アジユバントおよび７０インド不完全アジユバントは、ディフコ・ラボラトリー ズ（Ｄｉｒｃ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）から入手した。

抗血清はイムノブロッティング［Ｔｏｗｂｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、プロシーデ インダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　７６：４３５０−４３５４ 　（１９７９）］により、セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合抗ウつギ免疫グ ロブリンを使用して特異性および滴定について分析して、結合した抗体を検出し た［Ｈａｗｋｅｒｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、アナリティカル・バイオケミストリー （Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１土新規な亜種イスラエレンシス１３０ ｋＤのδ−エンドトキシン遺伝子のクローニング 精製しｔニア２ｍＤのプラスミドを、Ｗａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、ＦＥＢＳ　 　Ｌｅｔｔｓ、、１７５　：　３３７−３８１　（１９８４）の前に記載されて いるようにして、バチルス・スリンギエンシス亜種イスラエレンシスから分離し 、祖クローニング実験における亜種イスラエレンシスＤＮＡ源として使用した。

Ｐｓｔｌ制限した７２ｍＤのプラスミドをＰｓｔ■リン酸化ｐＵｃｌａ中に結合 し、そして生ずる結合を使用してＥ、ｃｏｌｉ　　ＴＧＩをアンピシリン抵抗性 に形質転換した。トリトン−溶菌［Ｗａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、ＦＥＢＳ　　 Ｌｅｔｔｓ、、１７５：３３７−３８１　（１９８４）］　を使用して組み換え 体から分離したＤＮＡを使用して、Ｅ、ｃｏｌｉの生体外ｔｒｖ−翻訳系［アマ −ジャム（ａｍｅｒｓｈａｍ）ＰＬＣ，英国パツキンガムシャイヤー、アマ−ジ ャム、から入手可能な転写−翻訳系］においてタンパク質合成をプライミングし た。生体外系からの産生物を、免疫沈澱［Ｈｏｗｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、モレキ ュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティックス（Ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、　Ｇｅ ｎｅｔｉｃ、）、−目３６　：　５２５−５３０　（１９８２）　］により、精 製したイスラエレンシス１３０ｋＤタンパク質に対してレイズした抗血清を使用 して、次いでＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動［１ａ　ｅｍｍ　ｌ　ｉ 、ネイチ＋　　（Ｎａｔｕｒｅ）、２又ヱ：　６８０−６８５　（１９７０）に 記載されているように］およびフルオログラフィー［Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ、 アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　） 、９８：１３１−１３５　（１９７９）に記載されているように］により分析し た。この手順を使用して、生体外系における分子量１１０ｋＤの交差反応性ポリ ペプチドおよび切頭誘導体の合成を指令する組み換え体（ｐ１３０／ＰＩ−１と 表示する）を分離した。この組み換え体は、７２ｍＤからの８ｋｂのＰｓｔｌ断 片のキメラおよびクローニングベクターｐＵｃ１８を収容した。参照、第１図。

切頭誘導体は、このＥ、ｃｏｌｉｔｒｖ−翻訳系を使用するとき、しばしば観察 され、そして多分生体外の翻訳の異常な開始または停止のための人工物である。

次いで、ｐ１３０／ＰＬ−Ｉ　　ＤＮＡをＸｂａ　Ｉで制限し、そして生ずる断 片をドレツェン（Ｄｒｅｔｚｅｎ）ら９、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ）、土工２　：　２９５−２９８　（１９８１）に記載されている手 順を使用してゲル精製した。制限分析により、１．８ｋｂおよび１．５４ｋｂの Ｘｂａｌ断片が３．３４ｋｂのＸｂａｌ−Ｘｂａｌ断片から誘導され［５ｅｋａ ｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、３３：１５１−１５８　（１９８５）に前に 記載されているように］、そしてｌ３０ｋＤの亜種イスラエレンシスのポリペプ チドをエンコードすることが配列の分析により示されｆ−［ヤマモトら、「無を 推動物の病理学の基礎および応用の面（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　　ａｎｄ　　 ＡｐｐｌｉｅｄＡｓｐｅｃｔｓ　　　ｏｆ　　　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　　 　Ｐａｔｈｏｌ。

ｇｙ）」、Ｓａｍｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｔ、編、（Ｆ　ｏ　ｒ　ｔ　ｈ　　Ｉ　 ｎ　ｔ　ｅ　ｒｎａｔｉｏｎｌ　　ＣＣｏ１１ｏｑｕｉｕ　　ｏｆ　　Ｉｎｖｅ ｒｔｅｂｒａｔｅ　　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、オランダ国（１９８６）］。

この１３０ｋＤの遺伝子に相当する上流の配列を分離する試みにおいて、３．３ ４ｋｂのＰｓｔｌ−Ｘｂａｌ断片から得られた１、５４ｋｂのＰｓｔＩ−Ｘｂａ ｌおよび１．８ｋｂのＸｂａＩ断片を、７エインバーグ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）ら 、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、 ±３２　：　６−１３　（１９８３）の方法を使用して、１０”−１０’ｃｐｍ ／μｇの比活性に放射線標識した。

遺伝子のバンクを、また、Ｃｌ　ａ　Ｉ制限したイスラエレンシス７２ｍＤプラ スミドをＣ１ａｌ制限したホスファターゼ処理したｐＵｃｌａ中に結合して構成 した。次いで、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＴＧＩを生ずる結合混合物で形質転換すること によって得られた組み換え体を、グルンステイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）ら、プ ロシーデインダス・オブ・ナンヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ。

）ＵＳＡ、７旦：　６０９１−６０９５　（１９７５）に記載されているように して、放射線標識したプローブを使用して、相同性遺伝子の存在についてスクリ ーニングした。参照、第２図。３．５ｋＤのＣｌａｌ部位を収容する組み換え体 は、これらの断片をプローブとして使用して強いハイブリダイゼーションシグナ ルを与えた。それ以上の分析は、これらの挿入はｐ１３０／ＰＬ−１の８ｋｂの Ｐｓｔｌ断片とオーバーラツプしていることを示した。完全な１３０ｋＤのδ− エンドトキンン遺伝子を含有する構成体は、第２図に示すように作られ、そして ｐＰｃ１３０と表示した。

興味あることには、Ｃｏａｌ制限した７２ｍＤのプラスミドの遺伝子バンクのハ イブリダイゼーション研究の間、オートラジオグラフィーの露出ののとき、３． ５ｋｂのインサートを含有するコロニーより多少弱いシグナルを生成する他のハ イブリダイゼーションコロニーが同定された。これらのコロニーは、３．９ｋｂ のＣＩａＩ断片およびｐＵＣ１８のキメラ（ｐｃｃ１３０と表示する）を収容す ることが発見された。Ｅ。

ｃｏｌｉ生体外系におけるこれらの組み換え体の１つから抽出したＤＮＡの分析 、参照第３図、は、抗１３０ｋＤ二重のもの血清により免疫沈澱された、切頭誘 導体に加えて、はぼ１００ｋＤのポリペプチドをエンコードすることが示された 。ｐＣＣ１３０の制限地図は第４図に示されている。この３．９のインサートの ヌクレオチド配列は、デオキシヌクレオチド鎖の停止法を使用して決定し、そし て３．０５ｋｂの延長したオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、位置８ ９１で出発して、同定しｔ：。参照、第５図。

ｐｃｃ１３０が有する切頭δ−エンドトキシン遺伝子のカルボキシ末端をエンコ ードする断片を分離する試みにおいて、第６図に示す１．８ｋｂのＨｉｎｄｌｌ ｌ−Ｃｌａｌ断片を、ゲル精製し、フエインバーグ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）ら、ア ナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、上３ ２　：　６−１３　（１９８３）の方法を使用して、放射線標識し、そして遺伝 子特異的プローブとして使用した。Ｈｉｎｄｌｌ＋制限亜種イスラエレンンス７ ２ｍＤプラスミドＤＮＡをクローニングベクターｐＵｃｌｓ中に結合ことによっ て構成した遺伝子バンクのハイブリダイゼーションの研究は、第６図にを示す２ ．３ｋｂのＨｉｎｄｌｌ！断片を分離し、この断片は第５図にを示すヌクレオチ ド位置３９３６におけるＣｌａｌ部位の３′側に５２０ｂｐを延長する。ＤＮＡ の配列決定は、この断片がｐｃｃ１３０の切頭オーブンリーディングフレームに よりエンコードされるタンパク質の３′末端をエンコードすることかを示した。

標準の組み換えＤＮＡ技術を使用して、ｐＵｃ１８のキメラおよび分子量１３０ ｋＤのポリペプチドをエンコードするオープンリーディングフレームから成るｐ ｃＨ１３０（第６図にを示す）を構成した。第７図はｐｃＨ１３０４，４６ｋｂ の完全なヌクレオチド配列を提供し、この配列は亜種イスラエレンシスから新規 な１３０ｋＤのδ−エンドトキシン遺伝子を構成する。ヌクレオチド８９１かも ヌクレオチド４４３０に延びるオープンリーディングフレームに相当するアミノ 酸配列は、対応する配列の下に示されている。

分子量１３０ｋＤの生体内発現を、Ｅ、ｃｏｌｉ組み換え体のイムノブロッティ ングを使用して分析した。精製した亜種イスラエレンシス１３０ｋＤ二重のもの に対してレイズした抗血清を使用して、δ−エンドトキシンの発現を検出しｔ； 。ｐｃＨ１３０を収容するＥ、ｃｏｌｉ組み換え体は、分子量１３０ｋＤの遺伝 子産生物を発現する。しかしながら、発現のレベルは極端に低かった。

ｐｃＨ１３０のＯＲＦの新規な構造遺伝子の配列と、前に報告したバチルス・ス リンギエンンス亜種イスラエレンシスのδ−エンドトキシン遺伝子のヌクレオチ ド配列との比較は、第８図に８いてマトリックスの分析によりを提供される。詳 しくは、第８図（ａ）は、ｐｃＨ１３０遺伝子のヌクレオチド配列を、記載され た１３０ｋＤの遺伝子亜種イスラエレンシスｐＰｃ１３０　　［５ｅｋａｒら、 Ｇｅｎｅ、３３　：１５１−１５８　（１９８５）およびヤマモトら、「無を推 動物の病理学の基礎および応用の面（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　　ａｎｄ　　Ａ ｐｐｌｉｅｄ　　Ａｓｐｅｃｔｓ　　ｏｆ　　Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　　Ｐ ａｔｈｏｌｏｇｙ）」、Ｓａｍｓｏｎ　　ａｔ　　ａｌ、編、（Ｆｏｒｔｈ　　 Ｉｎｔｅｒｎａｔ　１ｏｎｌ　　ＣＣｏ１１ｏｑｕｉｕ　　ｏｆ　　Ｉｎｖｅｒ ｔｅｂｒａｔｅ　　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙｓオランダ国（１９８６）コと比較する 。第８図（ｂ）は、前に記載された亜種イスラエレンシス７２ｋＤのポリペプチ ド［Ｔｈｏｒｎｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（ Ｊ。

Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１６６：８０１−８１１　（１９８６）］と比較す る。記載された亜種イスラエレンシス２７ｋＤ遺伝子［Ｗａａｌｗｉｊｋ　　ｅ ｔ　　ａｌ、、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ） 、±３：８２０７−８２１６　（１９８５）およびＷａｒｄ　　ｅｔ　　ａｌ、 、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジＨ１３０遺伝子のそれとは、第 ８図（ｃ）において比較されている。最後に、第８図（ｄ）において、ｐｃＨ１ ３０遺伝子は亜種イスラエレンシスＰＩδ−エンドトキシン遺伝子の解読配列［ ５ｃｈｎｅｐｆ　　ｅｔａｌｌ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト リー（Ｊ、Ｂ比較されている。相同性のある領域はある種の既知の遺伝子に関し て存在するが、非類似の有意の領域が残っている。

実施例２ 新規な亜種イスラエレンシス１３０ｋＤのδ−エンドトキシン遺伝子の発現 Ｅ、ｃｏｌｉ中でこのタンパク質の生体内発現を発生する試みにおいて、ｐｃＨ １３０のＯＲＦとｐＵｃ１８の誘発可能なプロモーターとの転写融合体を第８図 に示す方法を使用して構成した。記載されるような合成オリゴヌクレオチドを使 用する部位特異的突然変異［Ｃａｒｔｅｒｅｔ　　ａｔ、、ｒＭ１３におけるオ リゴヌクレオチドの部位特異的突然変異（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　 ５ｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　Ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ　　ｉｎ　　Ｍ１３）Ｊ 、（Ａｎｇｌｉａｎ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙｓ　Ｌｔｄｓ　Ｃｏ１ｃｈｅ ｓｔｅｒｓ英国エセックス］を使用して、ヌクレオチド８６２〜８６７の２塩基 対の変化を指令し、これはこの位置に独特ＢａｍＨＩ制限部位をつくっｔ；。次 いで、この変更されたＤＮＡを使用して、第３図に示すｐＢｃ１３０を構成した 。プラスミドｐＢｃ１３０は、１３０ｋＤのδ−エンドトキシン遺伝子を、１ａ ｃＺプロモーターをもつ転写７レーム中で結合しＩ；シャインーダルガルノ（Ｓ ｈ　１ｎｅ−Ｄａ　Ｉｇｒｎｏ）配列［５ｈｉｎｅ　　ｅｔａｌ、％不イチ＋− （Ｎａｔｕｒｅ）、２５４：３４−３８　（１９７５）］と−緒に含有する。さ らに、最近の反復［参照、Ｗｏｎｇｅｔａｔ、、「微生物分化の分子生物学（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　ｏｆ　　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　　Ｄｉ ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）Ｊ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ 　　Ｎ１ｎｔｈ　　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　５ｐｏｒｅｓ　　Ｃｏｎｆ ｅｒｅｎｃｅ、カリフオ）レニア州アシロマー、１９８４年９月、Ｈｏｃｈ　　 ｅｔ　　ａｌ、編、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　５ｏｃｉｅｔｙ　　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤ、Ｃ，］は、亜種イスラエレンシスのδ−エンド トキシン遺伝子について、亜種イスラエレンシスの構造遺伝子の３′末端を越え る逆向き反復配列がＥ、ｃｏｌｉおよびＢ、５ｕｂｔ　ｉ　ｌ　ｉｓの両者にお いて重要であることを示した。したがって、ｐＢｃ１３０の構成において、ｐＰ ｃ１３０のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃｌａｌ断片から誘導されｔ；３′逆向き反復配列 を、ＯＲＦを越えて亜種イスラエレンシスＤＮＡに結合した。詳しくは、利用し た３′逆向き反復配列は、次の配列を有した：５’　−ＴＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴ ＧＧＡＧＡＡＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＴＡＳ−３’ 逆向き反復配列の存在は、このクローニングされたδ−エンドトキシン遺伝子の 発現を増強することが発見されｔ；。

ｐＢｃ１３０プラスミドを使用するＥ、ｃｏｌｉの形質転換は、マニアチス（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ）ら、」モレキュラー・クローニング（Ｍ。

Ｉｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実験室のマニュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ、コールドφスプリング６ハーバーいる標準の 手順を使用して実施した。次いで、ｐＢｃ１３０を収容するＥ、ｃｏｌｉ細胞を １ａｃＺ誘発因子（ＩＰＴＧ）の存在下に４４時間、組み換え体の増殖について の一般手順において上に記載したように、液体培地中で増殖した。収穫したリゼ イトを前述のようにしてつくり、そしてポリアクリルアミドゲルの電気泳動によ り分析し、次いでイムノブロッティングした。抗１３０ｋＤ二重のものδ−エン ドトキシン血清は、分子量＋３０ｋＤのポリペプチドと特異的に交差反応した（ 第１０図）。

実施例３ 新規な亜種イスラエレンシス１３０ｋＤδ−エンドトキ７ン遺伝子の殺カ性活性 ｐＵｃ１８およびｐＢｃ１３０を含有するＥ、ｃｏｌｉの培養物を、組み換え体 の増殖についての一般手順において上に記載したように、増殖させ、そしてベク ターの１ａｃＺプロモーターをＩ　ＰＴＧで誘発させた。組み換え体Ｅ、ｃｏｌ ｉのリゼイトを、前に記載した手順（Ｔｈ。

ｍａｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　　５ｃｉ０．６旦：１８１−１９７ （１９８３））に従い、３ｍＱの水道水中の２５匹のエデス・ニジブチ（Ａｅｄ ｅｓ　　ａｅｇｙｐｔ　ｉ）の３齢期の幼虫に添加した。３６時間後、ｐＢｃ１ ３０を収容するｌ：、ｃｏｌｉで処置した幼虫は死亡した。

ｐＵｃ１８含有Ｅ、ｃｏｌｉ細胞で処置した幼虫は、病気の作用を示さなかった 。

エデス・ニジブチの幼虫を殺すために要求されるＥ、ｃｏｌｉ　　ｐＢＣ１３０ からのリゼイトの最小量は、また、決定されなかった。このアッセイにおいて使 用したｐＢｃ１３０リゼイト中のδ−エンドトキシン抗原は合計タンパク質の１ ％であるという仮定に基づいて、ア・ノセイはｌＯμｇ／ｍＱのδ−エンドトキ シンタンパク質を含有した。したがって、これは力の幼虫で７０％の致死率を３ ６時間以内で達成するために十分な濃度であろう。

ここに例示しかつ説明しＩ；ものに加えて種々の変更は当業者とって明らかであ り、そしてこのような変更は次の請求の範囲の範囲内に包含されることを意図す る。

ｘ　　　！２３　　　ｉ２ ＦＪＧ、２ ＦＩＧ、５ｂ Ｆ　　Ｉ　　Ｇ、　　５ｃ ＦＩＧ、７Ｇ Ｆ　　Ｉ　　Ｇ、　　７ｂ ＦＩＧ、７ｃ ＦＩＧ、７ｄ ｆｌＧ、８４　　　　　ＦＩＧ、８８ ＦＩＧ、８ＣＦＩＧ、８Ｄ ＦｊＧ、９ 国際調査報告 ・ＩＩ啼・ｆｌ−−―Ｉ埠ＬＩＩＩ＾−ｎｕ＋−自ｐ噸・ｌＩＮ、ＰＣＴ／ＵＳ ８８１０２０７３国際調査報告 ＵＳ　８８０２０７：Ｉ ＳＡ　　２３３３３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ｂｐ１で開始しｂｐ４４５１で終わる第７図に示すヌクレオチド配列との配 列の相同性または実質的な配列の相同性を有するヌクレオチド配列、およびその 殺虫性部分からなる殺虫性タンパク質をエンコードするＤＮＡ断片。 ２、ｂｐ８９１で開始しｂｐ４４３０で終わる第７図に示すヌクレオチド配列と の配列の相同性または実質的な配列の相同性、およびその殺虫性部分を有する、 請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片。 ３、ｂｐ８９１で開始しｂｐ約２７００終わる第７図に示すヌクレオチド配列と の配列の相同性または実質的な配列の相同性、およびその殺虫性部分を有する、 請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片。 ４、第７図に示すアミノ酸配列に対して相同性であるか、あるいは実質的に相同 性であるアミノ酸配列を有する殺虫性タンパク質をエンコードするヌクレオチド 配列からなるＤＮＡ断片。 ５、エンコードされる殺虫性タンパク質のアミノ酸配列は第７図に示すアミノ酸 配列に対して相同性であるか、あるいは実質的に相同性である、請求の範囲第２ 項記載のＤＮＡ断片。 ６、エンコードされる殺虫性タンパク質は約１３０ｋＤである、請求の範囲第２ 項記載のＤＮＡ断片。 ７、エンコードされる殺虫性タンパク質は約１３０ｋＤである、請求の範囲第４ 項記載のＤＮＡ断片。 ８、プロモーター領域を含有するＤＮＡ断片および請求の範囲第２項記載のＤＮ Ａ断片からなる、微生物中で発現することができるキメラ遺伝子。 ９、プロモーター領域を含有するＤＮＡ断片および請求の範囲第４項記載のＤＮ Ａ断片からなる、微生物中で発現することができるキメラ遺伝子。 １０、微生物は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である、請求の範囲 第８項記載のキメラ遺伝子。 １１、微生物は藍藻である、請求の範囲第８項記載のキメラ遺伝子。 １２、プロモーター領域はｌａｃＺプロモーターを含有する、請求の範囲第１０ 項記載のキメラ遺伝子。 １３、さらに３′逆向き反復配列からなる、請求の範囲第８項記載のキメラ遺伝 子。 １４、さらに３′逆向き反復配列からなる、請求の範囲第１０項記載のキメラ遺 伝子。 １５、プロモーター領域はｌａｃＺプロモーターを含有する、請求の範囲第１４ 項記載のキメラ遺伝子。 １６、第９図に図解する請求の範囲第１５項記載のキメラ遺伝子。 １７、請求の範囲第８項記載のキメラ遺伝子を含有する微生物。 １８、請求の範囲第９項記載のキメラ遺伝子を含有する微生物。 １９、請求の範囲第１０項記載のキメラ遺伝子を含有する微生物。 ２０、請求の範囲第１１項記載のキメラ遺伝子を含有する微生物。 ２１、請求の範囲第１２項記載のキメラ遺伝子を含有する微生物。 ２２、請求の範囲第１３項記載のキメラ遺伝子を含有する微生物。 ２３、請求の範囲第１４項記載のキメラ遺伝子を含有する微生物。 ２４、請求の範囲第１５項記載のキメラ遺伝子を含有する微生物。 ２５、請求の範囲第１６項記載のキメラ遺伝子を含有する微生物。 ２６、微生物の性質または特性を変更するための請求の範囲第８項記載のキメラ 遺伝子の使用。 ２７、プロモーター領域を含有するＤＮＡ断片および請求の範囲第２項記載のＤ ＮＡ断片からなる、植物中で発現することができるキメラ遺伝子。 ２８、プロモーター領域を含有するＤＮＡ断片および請求の範囲第４項記載のＤ ＮＡ断片からなる、植物中で発現することができるキメラ遺伝子。 ２９、請求の範囲第２７項記載のキメラ遺伝子を含有する植物細胞。 ３０、請求の範囲第２８項記載のキメラ遺伝子を含有する植物細胞。 ３１、１または２以上のその細胞中に請求の範囲第２７項記載のキメラ遺伝子を 含有する植物組織。 ３２、１または２以上のその細胞中に請求の範囲第２８項記載のキメラ遺伝子を 含有する植物組織。 ３３、１または２以上のその細胞中に請求の範囲第２７項記載のキメラ遺伝子を 含有する植物種子。 ３４、１または２以上のその細胞中に請求の範囲第２８項記載のキメラ遺伝子を 含有する植物種子。 ３５、１または２以上のその細胞中に請求の範囲第２７項記載のキメラ遺伝子を 含有する植物。 ３６、１または２以上のその細胞中に請求の範囲第２８項記載のキメラ遺伝子を 含有する植物。 ３７、植物細胞、植物組織、植物種子または植物の性質または特性を変更するた めの請求の範囲第２７項記載のキメラ遺伝子。 ３８、第７図に示すアミノ酸配列との配列の相同性または実質的な配列の相同性 を有するアミノ酸配列からなる殺虫性タンパク質、およびその殺虫性部分。 ３９、タンパク質の分子量は約１３０ｋＤである、請求の範囲第３８項記載の殺 虫性部分。