JPH03505257A - 生きている生物もしくは潜在的に攻撃作用をもつ物質の抗酸化作用のフリーラジカルによる測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 見凹しと翫称 生きている生物もしくは潜在的に攻撃作用をもつ物質の抗酸化作用のフリーラジ カルによる測定方法及豆Ω立里 この発明は、生きている生物もしくは潜在的に攻撃作用をもつ物質の抗酸化作用 を、フリーラジカルを用いてアッセイもしくは評価する新しい方法に間するもの である。

本発明は、特に生きている生物の細胞の抗酸化作用を評価する一方、フリーラジ カルによってひきおこされる細胞融解を増加、加速させることと、阻害、減少さ せることのできる化学物質もしくは天然の物質を例とするような、潜在的な攻撃 力をもつ物質の酸化作用もしくは抗酸化作用を評価する方法に関するものである 。

従来の技術 一般的にフリーラジカルが生物、特に生物の細胞に対して、悪影響を示すことは よく知られている。フリーラジカルは、細胞のもつ酵素及び分子的な性質から由 来する細胞の抵抗性によって程度差はあるが、細胞壁を攻撃する。その細胞壁が フリーラジカルによって分解、貫通、こわされてしまうと、細胞の内容物が外へ 出てしまう、このことについては以下に述べる文献が参考になる。

Ｃｈｅｍｉｃａｌ＾ｂｓｔｒａｃｔｓ　　１０７．　　２１３２３５ｖＣｈｅ＋ ａｉｃａｌ＾ｂｓｔｒａｃｔｓ　　１０７．　　２３２４５４ｇＣｈｅ＋ａｉｃ ａｌ＾ｂｓｔｒａｃｔｓ　　１００．　　９９３４５ｊＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　７２（ｎ”　９）、ｐａｇｅ　５９１４゜ａｂｓｔｒａｃ ｔ　　ｎ’　　５７１６９　　（１９８１）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒ ａｃｔｓ　７３　　（ｎ’　１２）、ｐａｇｅ　８８１７ａｂｓｔｒａｃｔ　　 ｎ”　　８４４２０　　（１９８２）ＭｉｋｉらによるＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈ ｅ＋ａ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２５Ｂ（ｎ”　２）３７３−３８０　（１９８２ ）を記述しているＣＡ　Ｈユ、２１３２３Ｓｖの抄録には、ラット赤血球がフリ ーラジカルにょフて融解するのを、α−トコフェロールによつて防ぐことができ る旨示している。

上記に示したＣＡ　１００，９９３４５ｊの抄録によると［これは、Ｅ、Ｂ、　 ５ｐｅｋｔｏｒらによるＬａｂ、［１ｔｌｏ　（ｎ　’″１）　ｐａｇｅ　２６ −２８　（１９８４）を記述している］、試料（血漿もしくはを髄液）の抗酸化 作用の全活性が、細胞試料（この場合は赤血球の膜）中にフリーラジカルの誘導 した後に、ＵＶランプを用いる５３２ｎｍの吸収によって測定できると述べられ ている。

本発明では以下の理由から新しい溶液の使用を推奨する。すなわち、（１）フリ ーラジカルは、細胞試料そのものから発生するのではなく、細胞試料に加えたフ リーラジカルのイニシエーター（起爆薬）から発生する、（！■）細胞試料は最 初から潜在的な攻撃作用をもっ物質で汚染されている、ことである。

只！しと１國 本発明では、生きている生物もしくは潜在的な攻！作用をもつ物質の抗酸化作用 について、これを測定もしくは評価する新しい方法が推奨される。この方法は、 フリーラジカルを細胞融解の方法として用いることも含めて、以下の点に特徴を もつている。

１）生物学的に適当な培養溶液に、フリーラジカルの発生源及び細胞試料を接触 するように入れる。その際、その細胞試料工は （ａ）ヒト、動物及び植物の細胞 （ｂ）上記細胞の断片及び （Ｃ）　　リボゾームを含む合成細胞壁及びその断片から成るグループより選ぶ こととする。上記の細胞試料Ｉは、最初から潜在的な攻撃力をもつ物質ＩＩによ って汚染されている。

２）フリーラジカル発生源からフリーラジカルを遊離させる。

３）フリーラジカルによる細胞試料Ｉの融解は、汚染されていない細胞試料を含 むコントロール群との比較によって評価する。

この方法では、細胞試料■の酸化状態もしくは上記の試料■に対する物質１１の 影響を測定する。

特に、細胞試料の融解の評価は「動力学物に」　［フリーラジカルの発生源、細 胞試料及び、特定のテストすべき物質ＩＩを含む試料溶液の（一定体積の）サン プルを一定の時間間隔をおいて測定することによるコ、もしくは「非動力学的に 」　［細胞試料と、特定のテストすべき物質ＩＴ及び量を増加して加えていくフ リーラジカルの発生源を含む試料溶液のサンプルを濃度依存性に関して測定する ことによる］、行なう。

動力学的評価を行なう場合は、細胞試料■のフリーラジカルに対する抵抗性は、 上記の細胞試料の５０％を融解するのに要する時間として示される。

濃度依存性の評価を行なう場合は、細胞試料のフリーラジカルに対する抵抗性は 、上記細胞試料Ｉの５０％を融解するのに必要なフリーラジカルの発生源の濃度 として示される。

及朋（ＤｎＢｆｔ１里 フリーラジカルを放出する物質及び、巨大分子をつくるための重合分野で一般に 用いられる物質は、適切なフリーラジカルの発生源として本発明中に示される。

以下の物質は特にこういった物質として適している。たとえば、ベンゾイルパー オキシド、Ｃ，−Ｃ，なかでもＣ，−Ｃ４アルキルバーベンゾエート（特に、ｎ −ブチルパーベンゾエート、ｔ−ブチルパーベンゾエート、１ｓｏ−プロピルバ ーベンゾエート、ｎ−プロピルバーベンゾエート）、１−８の炭素原子、特に３ または４つの炭素原子（特にジイソプロループの中のジアルキルパーオキシジカ ーボネート、クメンヒドロシキバーオキシド、アゾ−ビス（イソブチロニトリル ）、　２，２′−アゾ−ビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、　２−２′ −アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）、およびそれらの塩酸塩などのような酸 付加塩や、その類似体などがよい。

酸化されてフリーラジカルの発生源となるのに好ましい物質は、動力学的評価も しくは反応率が、０次のオーダーで（これはフリーラジカルの放出が時間がたっ ても一定であることを示している）あるか、動力学的評価もしくは反応率が、１ 次のオーダーである（これは、フリーラジカルの放出と時間の関係が直線である ことを示している）。この酸化されてフリーラジカルの発生源となるのに好まし い物質は、本発明によると、１つは、　２．２′　−アゾ−ビス（２−アミジノ プロパン）ジヒドロクロライド、（これは、水相で１次のオーダーの動力学的評 価を示す）、もう１つは、２．２’−アゾ−ビス（２，４−ジメチルバレロニト リル）（これは、油相または有機溶媒中で１次のオーダーの動力学的評価を示す ）である、フリーラジカルの発生源から、フリーラジカルを放出することは、そ れ自体を行なう条件による。たとえば、熱、光（特に可視領域の光もしくは紫外 の光）、陽子、電子、Ｘ線である。この放出は、フォトンもしくは、熱によって 開始されるのがよい。

たとえば、　２．２′−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライ ドの水溶液を３７℃まで熱すると、以下の反応によフて酸化されたフリーラジカ ルの放出がおこる。

本発明による細胞試料Ｉは、ヒト、動物、植物の細胞、合成されたもの、上記細 胞の断片、たとえば細胞壁などを含む。

フリーラジカルの反応が起こる際に放出され得るような色素性もしくは蛍光性の マーカーを含んだ細胞試料Ｉを使うと便利である。

本発明によると適切な細胞試料工とは、ヒト、動物、植物起源の生きた細胞で、 特に色素をもっているようなものである。たとえば、生きている細胞のなかには 、ヘモグロビン、クロロフィル、キサントフィル、カロチン、アンソシアニンな どの色素をもっているものがあるが、これらの色素は細胞融解の際に放出される ので、分光光度計を用いて、吸光度の変化を測定することで検出できる。生きて いる細胞のなかでも、動物起源、特にヒトなどの哺乳類を代表するような血の暖 かい動物から採取した赤血球が、最もすすめられる材料である。赤血球を選ぶ理 由は以下に述べるとおりである。

一赤血球などの血液細胞は、比較的短い半減期（ヒト起源の赤血球の場合は８０ 日）をもつこと。

−赤血球はフリーラジカルに対しての保護力をもつ分子的、酵素的なそなえがあ るので、その生物の他の細胞にとフでかわるものとして考えられる。

−赤血球は入手しやすく、利用しやすい。特に数ｍｌの体積の血液試料は短時間 のうちに得られる。

動物の血漿からＪＬｌ！シた赤血球が、フリーラジカルと酸化型の会合をしやす くなっているときには、酵素的及び分子的方法でもって、この会合に抵抗しよう とするが、ついには細胞膜もしくは細胞壁の形がそれによって変化し、細胞の内 容物が外へ出てしまう。赤血球の場合は、この内容物の放出は、反応溶液中に流 れ出たヘモグロビンの量を分光光度計で測ることによって容易に検出できる。テ ストする赤血球の集団の抵抗性は、赤血球に含まれるヘモグロビンの５０％（Ｗ ／Ｗ）が放出されるのに要する時間（動力学的な評価）もしくは５０％の溶血を ひきおこすのに必要なフリーラジカル発生源の量（ＣＨＢ。、ｌ）（濃度依存性 の評価）として示される。

用いられる細胞材料には、細胞（この場合、色素細胞が好ましい）の細胞壁もし くは、細胞壁の断片も含まれる。

この系に最も適したＭ５胞壁は、フリーラジカルによる細胞融解の際に放出され るような色素を十分な量含んでいるものである。

細胞試料は、合成された細胞壁であることもある。適当なものとしては、フリー ラジカルによる細胞融解の際に放出されるような色素を含むマーカーが、表面に コートもしくは固定されているようなりボゾームを含んでいるものがよい、リボ ゾームや、そのような色素マーカーを含む細胞膜を用いると、コントロールとし て、正常なヒトや動物や植物の試料を探さなくてもすむので、本発明によるアッ セイ方法をよりよく標準化する上で、特に利点がある。

本発明によると、用いられる細胞試料として好ましいのは、赤血球であり、更に 特に好ましいのはフリーラジカルによる細胞融解の際に放出される色素マーカー をコートもしくは固定しであるリボゾームである。この場合、テストされたフリ ーラジカルに対する抵抗性は、５０％の融解をおこすのに必要な時間、つまり、 ５０％（１’ｌ／Ｗ）の色素マーカーが放出されるのに必要な時間（動力学的な 評価）もしくは、５０％の融解をひきおこすのに必要なフリーラジカル発生源の 濃度（濃度依存性の評価）として示される。

「潜在的に攻撃作用をもつ物質ＩＩに細胞試料が汚染されている」という表現は 、上記で規定した細胞試料ｌが、この発明に示した測定を行なう前に少なくとも ０．５時間は、物質！■に接触しているか、もしくは、少なくとも０．５時間は 、物質ＩＩの作用を受けたということを示している。

上記の細胞試料■を物質ＩＩに接触させるという過程には、物質１１を生きてい る生物に入れて、その後本発明における方法に基づいて測定を行なうために、物 質１１に汚染された色素細胞を回収することも含まれている。また注射（試験管 内受精によく用いられる技術による）もしくは浸透性などによるそれ自体よく知 られた方法によって、物質ＴＩを細胞試料工にとりこませることも、これに含ま れる。

潜在的に攻繋力をもっている物質Ｈは、物理的性買（Ｘ線、ベータ線、プロトン など）もしくは、化学的性質（テスト物質、対間物質、代謝物など）、もしくは 物理化学的物質（熱分解によるフリーラジカルの放出を特に含むたばこの煙など ）をもつものもある。

生物学的に調整されたテスト溶液は、水溶液であれ、有機溶媒溶液であれ、すで に物質■！で汚染された細胞材料ｌ、フリーラジカルの発生源、および場合によ りては細胞培養や、生物学的アッセイの分野でよく用いられいる添加物、特に保 存剤を１つかそれ以上、含んでいる。上記のテスト溶液に含まれる物質Ｉ＋は、 フリーラジカルの放出が始まる少なくとも０．５時間前には、細胞試料とフリー ラジカルの発生源を含む溶液に加えられているか、もしくは汚染後すでに前記の 細胞材料と混ぜられているかのどちらかである。汚染は、物質Ｉ＋　（もしくは その前駆体）を細胞を採取する予定の生物に投与すること（故意にもしくは偶然 に）や、細胞膜から物質！■を試験管内で吸収させることによりておこる。

生体に投与することによって生きている細胞を汚染する場合は、このｍ胞はその 内部および／もしくは膜に、汚染物質もしくは少なくともその代謝物のひとつを 含むことになる。吸収によつて生きている細胞もしくは合成したｍＩｌ！成分を 汚染する場合は、固定された汚染物質の大部分は細胞壁中または細胞壁上にみい だされる。吸収による汚染では、脂質を含む汚染物質を用いるのが好ましい、細 胞壁への吸収は、細胞材料と汚染物質を適当な溶液中で、適当な温度でインキュ ベートすることによって効率良く行なわせることができる。また汚染物質は、前 もって選んでおいた？８媒で希釈すべきである。さらに反応時間や、用いる細胞 試料の濃度を変えると、反応溶液中の汚染物質が、自然あるいは合成細胞壁へ吸 収、固定される量も変ってくる。つまりあるときは全部、あるときはほんの一部 分（多くの場合はこうなる）というように。

物質１１が化学物質であるならば、どんな物質でも、時に酸化剤、抗酸化剤、ま たはその物質の成分や関連する代謝物でもテストできる。テストもじくはアッセ イできる物質は、色素（特にフラボノイド）、タンパク買、酵素、ベブタイド、 アミノ酸、抗体及び抗原、また一般的に抗体を生じさせる物質なら、何でもでき る。生体やｉｌＢ胞に働かかける物質は、上記のテスト及び／又はアッセイでき る物質として、特に考えやすい。

本発明によるアッセイ方法を実行するには、まず、細胞材料を単離、洗浄して、 できれば等張の生物学的溶液に懸濁する。インキュベーションの温度は、１０〜 ６０℃、で診れば１５〜４０℃がよいが、３７℃が最適である。

その際１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の細胞材料に対して、５０〜２００　　ｍｍｏｌ ／ｊ２のフリーラジカルの発生源を加える。

本発明を実施するのに最もよい方法を述べると、赤血球から成る細胞試料もしく は、リボゾームと遊翻し得るカラーマーカーを含んだ合成細胞壁断片を、ｉ衝能 をもった等張の生理学的血清に懸濁して、３７℃でインキュベートする。その際 に、１°ＯＯ＋ａＭの２，２°−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロ クロライドを紐体積２ｍｌになるように水性の生物学的溶液にとかして加えるか 、あるいは、２．２゛−アゾ−ビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）を同じ 割合で有機性の生物学的溶液にとかして加える。フリーラジカルの発生源からの フリーラジカルの放出は、フォトンで開始するのがよいが、できれば、加熱ショ ック（この場合は、３７℃に暖める）によりて開始する方がよい、サンプル（０ ，０２ｍ１）は、一定時間ごとに（たとえば２０分おきに）、細胞の残漬がみえ なくなるまで（ふつうは１５０〜６００分、ときに２００〜３００分）採取する 。各々のサンプルをＩＩｇｌの生理学的血清で希釈して、遠心分離する［たとえ ば３０００〜９０００ｇで（できれば３０００〜６０００ｇで）１０〜６０秒が よい（というのは９０００ｇ以上のきびしい条件で遠心すると、細胞の機械的な 融解がおこって、測定できなくなる可能性があるからである］、得られた上滑の 一部（０，２＋ｍｌ　）をマイクロプレートもしくは、マイクロセルのセットの 穴にいれて、分光光度計を用いて、吸光度を測定する（色素８胞もしくは、合成 細胞壁の起源にかかわらず、３５０〜６００ｎ■で測定する。もし、細胞材料が 赤血球である場合は４０５〜４１０ｎＩＩと５４０％ｍで測定する。） 実際には、吸光度の変化を細胞材料が完全に融解したとき（１００％）の吸光度 と比較してパーセンテージで結果を表わす。実験値にあわせた理論曲線より、５ ０％が融解するのに必要な時間（この時間が長ければ長いほど、上記に述べた実 験条件下で加わる試験管内酸化力に対する抵抗力が、赤血球や合成細胞壁の場合 には強いことを示す）、シグモイドカーブの頂点の傾き及び潜伏時間（上記のシ グモイドカーブの変曲点での接線によって決める）が得られる。

上記に述べた動的評価は、量依存性の評価におきかえることができる。

本発明によるアッセイ方法は、行なうのが非常に簡単で、診断もしくは、種々の 分子やその代謝物、特に酸化作用や抗酸化作用をもつ分子や、長期間作用するよ うな分子のスクリーニングを目的とするようなアッセイキットとして市場に出す ことができる。このアッセイで述べた物質ＩＩを構成するような分子の血漿に対 してこのアッセイを行なうこともできる。

本発明の方法は以下に述べるような場合に特に有用である。

（ｉ）抗マラリア薬品のアッセイ、これらの薬剤は一般に赤血球やりボゾームの フリーラジカルに対する抵抗性を減少させる。

（ｉｔ）糖尿病の診断薬、この病気は、生体において低酸化性影響を引き起こす 。

（ｉ　ｉ　ｉ）食品あるいは食品添加物、特に着色料の生体に対する影響を調べ る。

このアッセイ方法は、非常に短い時間、たとえば、５時間以内に行なえる点が便 利である。

本発明において、細胞材料としてリボゾームを用いる場合には、以下に述べるよ うなりポゾーム調整法がよい。

調整Ａ： リボゾームの集合体およびフリーラジカルの作用で放出されるような色素マーカ ーあるいは蛍光マーカーを含む粒子と、各々の粒子の結合を確実にするような結 合方法。

調整Ｂ： リボゾームの集合体およびフリーラジカルの作用で放出されるような色素マーカ ーあるいは蛍光マーカーから成るリボゾームのマトリックスと、そのマトリック スの結合を確実にするような方法。

調整Ｃ： 上記の調整Ｂによるマトリックスから成るリボゾーム層をしっかりと結合するよ うな、化学作用をおこさない支持体。

調整Ｄ： 化学作用をおこさない支持体は、上記のフリーラジカルの反応の際に放出される 色素マーカーもしくは蛍光マーカーでコートした少なくともひとつの表面、少な くともひとつの部分をもっており、この表面、部分は、リボゾームとこれらの層 の結合を確実にするような結合材の混合物におおわれている。ここでは、リボゾ ームの層は色素あるいは蛍光マーカーでおおわれている部分でマスクされている 。

調整Ｅ： 穴のあいた化学作用をおこさせない支持体は、フリーラジカルの反応の際に放出 されて飽和状態になる色素マーカーもしくは蛍光マーカーを含んでいる。上記の 支持体は、調整りで述べたりポゾーム層でコートされており、上記のマーカーで マスクされている。

調整Ｆ： 調整りの方法によフてつくフたりボゾームマトリックスは、色素ペプチド物置の 分野でよく知られた型の色素マーカー（ＥＰ−Ａ−０２１３０６１０参照）によ って表面をおおわれている。フリーラジカルの反応下では、上記のマーカーを含 むリボゾームの断片や細片は、マトリックスから分離される。この分離された断 片や細片は、濾過や遠心によって集められ、既知の方法によフて着色するのに適 当な生物学的溶液に再懸濁される（ＥＰ−Ａ−０２８０６１０参照）。

上記の調整Ｄ−Ｅにおいて、フリーラジカルの反応下で放出される色素マーカー もしくは蛍光マーカーは、リボゾームマトリックスで物理的にマスクされている 。その厚さは、比較的うすい方が、フリーラジカルの反応下で上記のマーカーに 近づきやすくなる。ｍ整Ａ−Ｃにおいては、フリーラジカルの反応下で放出され る色素マーカーあるいは蛍光マーカーの完全な物理的マスク、もしくは、上記マ ーカーとりボゾームのより緻密な結合を、固定や隔離によりて得ることができる 。

最後に、アッセイキットは以下のものを含むことが推奨される。

（ｉ）本発明による細胞材料 （ｉｆ）フリーラジカルの発生源、及び／もしくは生物学的な希釈溶液。

五施碧 さらに、この発明における利点、特徴は、以下に述べる実施例をみるとよりはっ きりと理解できるであろう、以下の実施例は、この発明の限界を説く為に利用さ れるものではなく、車なる例示的説明である。実施例１〜９は動力学的なアッセ イについて、実施例１０〜１５は量依存性のアッセイに関して述べている。

実施例１ 本発明方法を定量化するために、２．２°−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン ）ジヒドロクロライドのラット赤血球に対する影響について調べた。

ラットの赤血球を採取して洗浄後、等張の生理学的血清に懸濁する［ヘマトクリ ット１５％（Ｗ／Ｖ））、この赤血球をＯｍＭ（コントロール）、２５ｍＭ、５ ０ｍＭ。

１００ｍＭの量の２．２゛−アゾ−ビス（２−７ミジノプロパン）ジヒドロクロ ライドに接触させる。そのときの水性生物学的培養液の終体積は２車ｌである。

フリーラジカルの放出は、反応溶液を３７℃に熱して開始する。２００〜２４０ 分の間、２０分間隔で０．０２ｍ１のサンプルを採取する。その後、生理的血清 で１車ｌに希釈した各サンプルを遠心する（１５秒、４ｏｏｏｇ）、上清の一部 （９，２車ｌ）をマイクロプレートの穴に穆して、分光光度計で５４０ｎｍの吸 光度を読む。

図１に結果を示した。これは、５０％の瀉血率（ｔｓｏｘ）を得るのに要する時 間（分）で示されている。

曲線（ａ）は１００ｍＭの濃度の２．２′−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン ）ジヒドロクロライドを用いたときの値を示しているが、これをみると、ｔ、。

、値は、１５８分である０曲線（ｂ）は５０ｍＭの濃度の２．２゜−アゾ−ビス （２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライドな用いたときの値を示しており、 ｔ　５ｏｉｌ値は２１４分である０曲線（ｄ）はコントロールテスト、つまり、 ２゜２′−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライドを加えない ときの値を示している。

この図１の結果は、フリーラジカルを発生する分子に関しての細胞融解に対する 影響が量依存性であることを示している。

実施例２ この例では、抗酸化剤、特にアスコルビン酸の影響について検討している。

上記の実施例１に述べた方法に従りて、操作をすすめる。すなわち、まずラット の赤血球と１００　ｇａｏｌ／　ｆｌの２．２°−アゾ−ビス（２−アミジノプ ロパン）ジヒドロクロライドと、０（抗酸化剤のない状態）もしくは０．１ｍｍ ｏｌ／ｕのアスコルビン酸を含んだ水性の生物学的培養液（生理的血清）を用意 する。赤血球とフリーラジカルの発生源をアルコルビン酸と接触させて０．５時 間後に、フリーラジカルの放出を開始する。

その結果は図２に示したように、スコルビン酸のないコントロールでは〔曲線（ ａ）ｌｔｓ。、値が１５８分であるのに対して、　０．１　＋＋ｖ＋ｏｌ／ｕの アスコルビン酸の存在下では［曲線（ｂ）］ｌｔｓ、値は、２４４分である。言 い換えると、アルコルビン酸のような抗酸化剤の存在下では、フリーラジカルに よる細胞融解のスピードがおそくなるということが示されている。

実施例３ この実施例では、ラットの赤血球の膜にとりこまれた抗酸化剤、すなわち、ブチ ルヒドロキシトルエン［ＢＨＴと略す、体系的命名法によると、２．６−ジ（１ ，１−ジメチルエチル）−４−メチルフェノールコの影響について述べる。

実施例で述べた操作に従う。すなわち、健康なラットの赤血球（コントロール） と、ＢＨＴとその溶媒、すなわちエタノール（ＢＨＴの赤血球膜への吸収をよく するための）存在下で、３７℃、０．５時間、前も９てインキュベートした赤血 球を用意して、アッセイを行なうために再懸濁的血清のなかにいれて、１００ｍ 国０１／Ｌの２，２゛−アゾーヒ゛ス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロラ イドと才妾触させた後、その反応溶液を３７℃に熱する。

結果を図３に示した。コントロールの曲線（ａ）はｔｇｏｘが１６３分であった ０曲線（ｂ）は、ＢＨＴの溶媒、すなわち０．５％Ｗ　／　Ｖ濃度のエタノール と、健康なラットの赤血球を前もって３７℃で０．５時間、インキュベートした 場合の値を示しているが、この場合のｔ、。、値は１５７分であった０曲線（ｃ ）は、（ｂ）で用いた赤血球と同じ赤血球であるが、這う点は、ＢＨＴとエタノ ール（０，０３ｍｍｏｌ　／　ＡのＢ）ＩＴ及び０．５％（ｗ／ｖ）のエタノー ルを含んだテスト溶液）を同条件で前もってインキュベートする点である。この 場合のｔｇｏｘ値は１９３分であった０曲線（ａ）および（ｂ）と曲線（Ｃ）を 比較すると、ＢＨＴは細胞融解に対する保護能をもつことがわかる。いいかえる と、ここで用いた抗酸化剤は、フリーラジカルによる細胞融解のベースをおとす ことができる。

実施例４ この実施例では、異なる２つの検体から採取した赤血球の比較について述べる。

赤血球を分離、洗浄したのちに、同じ濃度で懸濁してフリーラジカルの発生−＃ 、（この場合は、１００　ｍｍｏｌ／　ｊ２の２．２°−アゾ−ビス（２−アミ ジノプロパン）ジヒドロクロライドを用いた）からのフリーラジカルの反応がお こるようにする。

この結果は図４に示した０曲線（ａ）は、おとなの喫煙者から採取した赤血球の 溶血率を示しているが、ｔｇｏｘ値は、８４．４分であった０曲線（ｂ）は、お となの非喫煙者から採取した赤血球の溶血率を示しているが、ｔ、。、値は、９ ３．３分であった０曲線（ａ）と（ｂ）を比較すると、喫煙者の方が、フリーラ ジカルによる毒性に対する耐性が、非喫煙者に比べて信いことがわかる。

実施例５ この実施例では、酸化状態に対する放射線照射の影響を調べるために、植物細胞 を用いた。

カミルレ細胞を２つの群にわけて、２つのうちの１群には、３．７　ｘｌＯ’　 Ｂｑ　（１００マイクロキニーリー）の放射線を照射する。その後この放射線照 射群と非放射線照射群の両方を化学反応がおこらないような状態で（窒素あるい はアルゴンをいれて）７力月間保存する。両群の細胞を水性の生物学的培養液に 懸濁して、フリーラジカルの発生源、すなわち２，２゛−アゾ−ビス（２−アミ ジノプロパン）ジヒドロクロライドと、１５℃で０．５時間接触させる。フリー ラジカルの放出は、３０〜４０℃で熱することで開始し、実施例１で述べた方法 に従ってサンプルを採取して分析する。細胞材料の融解に関する動的研究による と、前もって放射線照射した細胞は、非照射群の細胞に比べて、フリーラジカル に対する抵抗性が低いことが判明した。それぞれに相当する曲線は図３で得られ た曲線とよく似ている（放射線照射した細胞の融解曲線、および非照射群の細胞 の融解曲線は、各々図３のｂおよびＣの曲線の形とほぼ同じである）。

実施例６ カミルレの種に３．７　ＸＩＯ’　Ｂ　ｑの放射線照射をして、二′の放射線照 射群と非放射線照射群を、８力月間化学反応をおこさないような状態で保存する 。その後、放射線照射群、非照射群ともに極を地面にまいて、はえてきたものを ラットの赤血球と、生理的血清中で、１５℃、１時間接触させる。フリーラジカ ルの発生源、つまり、２．２′−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロ クロライドな加えて、実施例１で示した操作を行なう、この赤血球の融解の動的 変化は、放射線照射したカミルレの種からはえたものの存在下、あるいは、非照 射のものの存在で、それぞれ、図３のａ、ｂもしくはＣの曲線にあてはまるよう な値を示した。このことにより、種の酵素的・分子的なしくみは、放射線照射に よって変わるか、あるいは、一部分こわれることがあることがわかる。

この実施例５および実施例６では、本発明による方法は、植物が消費される前に どの程度分解されているかをテストするかどうかの決定に、動物および／もしく は植物由来の食品の買をテストする方法として用いることができることを示して いる。

実施例フ 実施例３に示した方法に従りて、ＢＨＴをフェノチアジンに代えて操作を行なう 、フェノチアジンは、予期しない抗酸化作用を示した。つまり、フリーラジカル による赤血球の融解速度をおそくしたのである。

実施例８ 実施例７で示した方法に従って、赤血球を、調整Ｃで示したりポゾームから成る 合成細胞壁に代えて操作を行なりた。フェノチアジンの抗酸化作用は、実施例７ で得られたのと同じような結果になった。

実施例９ 凍結乾燥した茶を、煮沸した水で乾燥した葉を抽出、濾過、凍結乾燥することに よって得る。１つの群は、凍結乾燥する前にイオン化照射（５０ＫＧｙ）　し、 もう１群は、非照射のコントロール群とした。各群を９力月間、真空で保管する 。

実施例３で示した操作を、ＢＨＴの変わりに、茶の照射群もしくは非照射群にか えて行なう、照射群は、コントロール群に比べてフリーラジカルに対する抵抗性 が低いことがわかった。

実施例１０〜１５ 以下に示す実施例１０〜１５は量依存性型の反応を示すアッセイ条件のもとで９ 、抗フリーラジカル活性の測定について示しである。

水溶性培養液（水もしくは生理的血清）に溶解したフリーラジカル発生源［２， ２°−アゾ−ビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロライトコを、濃度を増 やしながら一部（２０〜３００ＩＩＩＩＩｏｌ）を試験管に加えて、凍結乾燥す る。このフリーラジカル発生源を、テストしたい物質を含んだ、あるいは含まな い一定の体積の生理的血清に再熔解して、本発明による細胞材料を一定量加える 。

このテスト培養液を、３７℃で一定時間（２，５時間）インキュベートする。そ の後、フリーラジカルの影響を細胞材料の融解によってアッセイする。

実施例１０では、健康なラットの赤血球を用いてアッセイした。５０％の赤血球 融解を起こすフリーラジカル発生源の濃度（ＣＨｓｏ＊）は、１０８．０±２０ 　ｍｍｏｌ／　Ｊ２であった。

実施例１１では、実施例１０で用いたのと同じ健康なラットの赤血球を使って、 テスト溶液に１０　ｍｍｏｌ／　Ａのマンニトールを含んだ状態でアッセイした 。ＣＨ，。、は１５５６±６．１　ｍｍｏｌ／　ｊＺで、実施例１０で調べたＣ １（ｓｏｗ値と比較すると、マントニールは抗酸化作用をもつことがわかった。

実施例１２では、実施例１０で用いたのと同じ健康なラットの赤血球を使って、 テスト溶液に、酸化作用を持つ物質、すなわち、２５０ｍＭの濃度のアゾジカル ボキシリックアシッドビス（ジメチルアミド）［チオールを酸化する化合物コを 加えて、アッセイを行なった。この過酸化作用をもつ物質は、赤血球のグルタチ オンを使い果たすという点で、フリーラジカルの影響に対する赤血球の感受性を 上げるので、Ｃ）ｌｓｏｘ値は、（実施例１ｏで得られた値と比較すると）　６ ０．８±８．１　ｍｅａｌ／　１１と低くなる。

実施例１３〜１５では、実施例１０〜１２で述べたのと同じような実験系を、赤 血球の代わりに、調整Ｃで述べたりポゾームを含んだ合成細胞材料を用いて行な ったが、実施例１０〜１２で得られた結果と同様の結果を得た。

図１ 図２ 時間（分〕 図３ 図４ 時間（分） 国際調査報告 □−”　　ＰＣＴ／ＦＲ９０１０００６１

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．生きている生物もしくは潜在的に毒性のある物質の抗酸化作用をアッセイ、 評価する方法であって、細胞融解の方法としてフリーラジカルを用いると共に、 以下の点で特徴づけられている方法。 １）フリーラジカルの発生源は、適当な生物学的培養液中で、下記のものから成 るグルーブから選ばれた細胞材料と接触させる。 （ａ）ヒト、動物及び植物細胞 （ｂ）上記細胞の断片 （ｃ）リポゾームを含んだ合成壁及びその断片上記の細胞は最初に、潜在的に毒 性をもつ物質で汚染しておく。 ２）上記のフリーラジカル発生源からのフリーラジカルの放出が行なわれ、そし て、 ３）フリーラジカルによる細胞材料の融解を、汚染されていない細胞材料を含む コントロールとの比較によって評価する。
2. ２．細胞材料がヒト、動物、もしくは植物起源の色素細胞を含むグルーブから選 ばれるクレーム１の方法。
3. ３．色素細胞が、ヒトもしくは植物起源の赤血球であるクレーム２の方法。
4. ４．細胞材料が合成壁の断片であるクレーム１の方法。
5. ５．細胞材料がリポゾーム材料であるクレーム４の方法。
6. ６．上記のフリーラジカルの発生源が０あるいは１次のオーダーの動物変化によ ってフリーラジカルを放出する物質クループから選ばれるものであるクレーム１ の方法。
7. ７．酸化作用のあるフリーラジカルを放出する物質から成るグループより、フリ ーラジカルの発生源が選ばれるクレーム１の方法。
8. ８．フリーラジカルの発生源が、２，２′−アゾービス（２−アミジノプロパン ）ジヒドロクロライドであるクレーム１，６，７のいずれかの方法。
9. ９．５０〜２００ｍｍｏｌ／ｌのフリーラジカルの発生源を、水性の生物学的培 養液に溶かした１０〜２０％（ｗ／ｖ）濃度の細胞材料に接触させるクレーム１ の方法。
10. １０．フリーラジカルを３７℃にインキュベートすることによって発生させるク レーム１または９の方法。
11. １１．（ｉ）クレーム１の細胞材料、及び、もしも必要なら（ｉｉ）フリーラジ カルの発生源および／もしくは、生物学的希釈用培養溶液を含むことを特徴とす るアッセイキット。