JPH03505974A

JPH03505974A - 放線菌目のヌクレオチド配列、核酸の合成又は検出への応用、このような配列の発現産物と免疫組成物としての応用

Info

Publication number: JPH03505974A
Application number: JP2506961A
Authority: JP
Inventors: ハンス，アラン　ジョンソン; グランシャン　デロウ，ベルナール; ルヴィーフルボール，ベロニーク; ジクエ，ブリジット
Original assignee: アンスティトウ　ナショナル　ドゥ　ラ　サントゥ　エドゥ　ラ　ルシュルシュ　メディカル―アンセルム; アンスティトゥ　パストゥール
Priority date: 1989-04-17
Filing date: 1990-04-13
Publication date: 1991-12-26
Also published as: WO1990012875A1; FR2645878A1; CA2031195A1; US5817459A; FR2645878B1; EP0419648A1; US5877273A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】放線菌目のヌクレオチド配列、核酸の合成又は検出への応用、このような配列の発現産物と免疫組成物としての応用この発明は放線菌目、ことにマイクバクテリアのヌクレオチド配列、この配列に含まれるオリゴヌクレオチド、それらの放線菌目ＤＮＡ合成のプライマーとして及び放線菌目特にマイクバクテリアのＤＮＡ及び／又は転写産物の検出用プローブとしての用途、その配列の発現産物、それらの用途とその産物に指向した抗体、放線菌目を検出及び同定する方法と用途、ならびにその発現産物からなる免疫組成物に関する。

結核とらい病が、重要な公衆の健康問題であることが知られている。世界で結核にかかっている人は最近では約６０ｘ！０＠人で、らい病にかかっている人は約＋５Ｘｌｏ＠人である。フランスでは、毎年約１０４の新しい結核症が現われる。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕ！ｒｉｎ、ウシ型結核菌の弱毒化種）でのワクチン化が全人口に有効ということではない。この有効性は、英国のような西欧国での約８０％からインドの０％まで変動している（チングレブットの最近のワクチン化トライアルの結果）。

通常の抗結核剤に耐性のヒト型結核菌（Ｍ、　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ也）の種の出現と、他の原因、特に免疫抑制の患者（大多数の場合ＡＩＤＳ）におけるトリ型結核菌（Ｍ、　ａｖｉｕｍ）のような普通のマイクバクテリアの増加によるマイクバクテリア症の存在からマイコバクテリアの迅速な検出・同定法を開発する緊急性があ結核症と池の関連マイクバクテリア症の診断を行なうのは困難である。

すｔわち実際上、これろの疾叡に・感応性の微生物；よ少量であることが多く、これらか常法で検出可能であるとき；よ、既に病気が進行しており、も者の周囲の人にうつりやすい。これらの細菌は非常に長い世代時間（大腸菌の２０分に対し、ヒト型結核菌は２４時間）であるので、これらの微生物を培養することは困難である。従って、微生物の同定に６〜８週を必要として、患者への適切な処置に用いろる耐性記録を得るには長くかかる微生物の培養を必要と七ず、微生物が低濃度で存在しても病理サンプルを直接使用できる検出テストの必要が必須となる。

マイクバクテリア感染を同定するために最近臨床上用いられているいくつかの方法がある。

第１に、顕微鏡で微生物を直接検出するものが挙げられるが、この方法は速いか、観察されろマイクバクテリアの種を同定できず、信頼しうる検出をするにはサンプル中に多数の微生物が存在（＞　Ｉ　Ｏ’／ｍｌ）　Ｌないと（ＢＡＴＥＳ　Ｊ、、　ＣＨＥＳＴ、　１９７９．７６゜（ｓｕｐｐｌ、）、　７５７−７６３）感度を欠くのである。

陽の場合の培養物は、１００％に近い特異性を有し、単離されるマイクバクテリアの種の同定ができるが、上記し１こように、生体外でのマイクバクテリアの生育には３〜６週の期間でのみ達することができ、感染部位でマイクバクテリアが少ししか存在しないと、陽の結果を確実にするのには繰り返しの培養が必要である（ＢＡＴＥＳ　Ｊ、、１９７９　：　ＢＡＴＥＳ　Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、、入ｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　　Ｄｉｓ、、１９ｇ６．　１３４．　４１５〜４１７）。

血清法はある条件下で有用である二とが証明できるが、感度が低く及び／又：よ特異性が低いことから使用が制限される（ＤＡ−ＮＩＥＬ　Ｔ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｔｎ、　Ｒｅｖ、　Ｒｏｓｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１９８７．１３５゜１１３７−１１５１）。

マイコバクテリアの存在又は非存在は、ＤＮＡ配列に特異性のプローブを用いてＤＮＡ又はＲＮ　Ａとのハイブリダイゼーションで測定することもできる。（ＫＩＥＨＮ　Ｔ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９ｇ７．２５．１５５１−１５５２；　ＲＯＢＥＲＴＳ　Ｍ、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１９８７．２５．１２３９−１２４３：　ＤＲＡＫＥ　Ｔ、Ａ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９８７．２５．１４４２−１４４５）。

しかし、これらの方法はまｆ二微生物の培養を必要とする。

各種のマイクバクテリアのめる種のＤＮＡ配列と、かつ特にマイクバクテリア抗原をコードするある種の遺伝子が報告されている。特にＰＣＴ国際出＠Ｗ　０８ｇ１００．９７４　（その発明者はＹＯＵＮＧ　Ｒ，）に挙げることができ、その内容は、Ｎａｔａｒｅ、　１９ｇ、１゜３１６、４５０で発行された報告に要約されている。これらの刊行物は、らい菌（Ｍ、　Ｌｅｐｒａｌｅ）の５つの免疫優性抗原をコードする遺伝子を記載しており、かつ特に６５−ｋ　Ｄ抗原をコードする遺伝子が配列されている。またＰＣＴ国際出＠Ｗ０８８１０５．８２３（ＨＬＩＳＳＯＮ　Ｒ，、ＹＯＵＮＧ　Ｒ，と５ＨＩＮ？１ＩＣＫ　Ｔ、が共同発明者）が挙げられ、その内容はＪ、　ＢＡＣＴ、、　１９ｇ７．１６９．１０８０〜１０８８に発表された報告に要約されており、これには蛋白抗原特に６５ −　ｋ、　Ｄ抗原をコードするヒト型結核菌の遺伝子が記載されている。この国際出願に：よ、５つの免疫学的に活性なな蛋白をコードするヒト型結核菌の遺伝子を、バタテリオファージλｇ　ｔ　１．　ｌ中で表現されｆこ組み換えＤ　Ｎ　Ａライブラリィ−を、この細菌の蛋白抗原に指向しｌニモノクローナル抗体のコＩツク／ヨンで系統的スクリーニングで単離していることが特に挙げられる。

ヒト型結核菌の抗原の１つ、６５−　ｋ　Ｄ蛋白ｉ：！、ヒト型結核菌とらい菌に共通の決定子を宵する。

ＰＣＴ国際出＠　ＷＯ８８１０Ｓ。５９１（特にＴ、　５ＨＩＮＮＩＣＫが共同発明者である少は、５４０側アミノ酸の組み換え蛋白（６５−ｋＤ蛋白）、またその蛋白のＤＮＡ配列と表現ベクター並びに組み換え蛋白の用途を記載している。この出願は、この蛋白の配列に対応するペプチドとその用途ら記載している。

（ｔ！！のマイクバクテリア（Ｍ、　ａｆｒｉｃａｎｕｍ、　　Ｍ、　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、　　Ｍ。

１）ｏｖ　ｉ　ｓ　ＢＣＧとＭ、　ａｖｉｕｍ）の蛋白をコードする遺伝子ち単離されム：ｅこれは特にτＨＯＬト；　（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１９８７．５５．１４６６−１４７５）が挙げらｎ、これは、大腸菌に表現されたウシ型結核菌Ｂ　ＣＧの６４−　ｋ　１）蛋白が８己載されている。

しかし、大抵の生体サンプル中に存在するマ・イコバク１リアのＤＮＡ！！よ陽性ノブナルを得るのには不十分でのる。このことからこの技法は直接生体サンプルから抽出したマイコバクテリアのＤＮＡを同定するのは不適当であることが証明される。

また、一連の研究で異なるマイクバクテリア間でのある程度の構造相同性が示されている。１．かじ、ヒト型結核菌とウシ型結核菌のＤＮＡ配列の差異は１．６５−ｋＤ抗原の読み枠の３゛部位であると記載されている（ＳＨＩＮＮＩＣＫ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７．　ＴＨＯＬＥｅｔ　ａｌ、、　１９８７）　、・らい菌のＤＮＡにおいて類似部位：よ観察されていない（ＨＥＨＲＡ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　１９８６゜８３、７０１３−７０１７．またＰＣＴ国際出１０８８１０００，９７４）。

また、遺伝子工学で作られたマイコバクテリアに対するワクチンを記載している文献がある。特にＰＣＴ国際出願８８１０２．［１２７には、マイクバクテリアの抗原を表現でき、かつ得られるべきマイクバクテリアに保護免疫反応を可能にする組み換えポックスウィルスを記載しているものを挙げることができる。

先行技術の各穫検出法では、放線菌目感染を直接生体サンプルから検出し、かつ迅速に同定することができない一方、少量に存在し得ても、グループ、スビーンス（種）又は菌種の特異的同定もできない。

この発明の先行技術の状聾を構成する追加文献を次に挙げる。

ＢＡＥＳＳ　１．、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、　１ｌｉｃｒｏｂｉｏ１．５ｃａｎｄ、、　１９７９．８７．２２１−２２６：　ＢＥ、！、ＵＣＡＧＥ　Ｓ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　１９８１．２２．１８５９−１８６２＋　　ＥＩＳＥＮＡＣＦＩ　　Ｋ、Ｄ、　　ｅｔ　　ａＬ、、　　Ａｍ、　　Ｒｅｖ、　　Ｒｅ５ｐｉｒ、　　Ｄｉｓ、B １９ｇ６．１３３．１０６５−４０６８；　（ＪＥＯＲＣＩ（ＩＵ　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａ−ｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ、１９８８．１６．１５−２６；　ＧＬ、’１ＳＳＲＯＴＨＪ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＮＥｎｇｌ、　Ｊ、　！Ｊｅｄ、、　１９８０．３０２．１４４１−１４５０；　ＨＡｖＫＩＮＳ　Ｃ，Ｃ，ｅｔ　ａｌ、。

Ａｎｎ、　　Ｉｎｔｅｒｎ、　　Ｗｅｄ、、　　１９８５．　１０：ｌ、　　１８４−１８８：　　ＩＭＡＥＤＡ　　Ｔ、、　　Ｉｎｔ、　@Ｊ。

Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１９ｇ５．　３５．　１４７−１５０＋　　ＩＭＡＥＤＡ　　Ｔ、　　ａｔａｌ、、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔｅＩｌｌａｔ、ｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１９８ｇ、　３８．１５１−１５６；ＫＯＧＡＮ　ｓ、ｃ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　１９８７．３１７．９８５−９９０；ＬＩ　Ｈ，ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ、）、　１．９８８．３３５．４１４−４１７：　ＬυＭ、Ｃｅｔ　ａＬ、　Ｉｎｆｅｃｔ、、　Ｉｍｍｕｎ、、　１９８７．５５．２３７８−２３８２；　！ＭＡＸＩへＴＩＳ　Ｔｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｒ＋ｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　ＭｅＦＡＤＤＩＪ　ｊ、ｊｅｔ　ａｊ、、　Ｍｏ１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｉ、、　１９８７．１．２８３−２９１＋　ＰＡＯＣ，Ｃ，ａｔａｌ９．　丁ｕｂｅｒｃｌｅ、　　１９８ｇ、　　６９．　２７−３６：　　ＰＡ置　　Ｒ，、Ｊ、　　Ｇｅｎ、　　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、、　１９８６．１３２．５４１−５５１；　５ＡＩＫＩ　Ｒ，に、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ。

１９８８、　２３９．　４８７−４９１　二　５ＡＩＩＧＥＲＦ、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ、　１９７７、７４．５４ｆｉ３−５４６７：　ＳＭＩＤＡ　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｔ、　Ｊ。

Ｌｅｐｒｏｓｙ、　１９８８．５６．４４９−４５４：　ＴＦＩＥＩＮ　Ｓ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔ、ｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　１９８６．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　３３−５０；　ＴＨＯＬＥ　Ｊ、Ｅ、Ｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、、　１９ｇ５．５０．８００− ８０６、ＶＡＴＳＯＮ　Ｅ、Ａ、。

Ｃａｎａｄ、　Ｊ、　Ｐｕｂ、　ｔｌｅａｌｔ、ｈ、　１９３５．２６．２６Ｐ！−２７５：　ＷＯＬＩ！ｌ５ＫＹ　Ｅ、。

Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、　　１９７９．１１９．　１ＯＬｉ５９従って、この発明の目的は、限定数で存在する微生物力）ら抽出される少量のＤＳへの検出を可能にする検出・量定法を提供するもので、その方法は迅速であり、放線菌目の感染時（こマイクバクテリアの感染、ノカルディア感染又はロドコッカス感染を、培養を行ノーうことなく、病理サンプルから直接同定することがでさるものである。

この発明の対象は、放線菌目から誘導されたペプチド配夕ＩＩで、その配列はマイクバクテリア、ノカルディア及びＣ７ドコソカスからなる群から遣損された放線菌目に共通の遺伝子の類似配夕ＩＪからなり、その配列には保存部位と変動部位力（あり、カスつ２５Ｏ〜５００の間の塩基対からなることを特徴とする。

ヌクレオチド配列：よ、この発明では二本ｌｌＤＮＡ配列、−木端Ｄ　Ｎ　Ｊ〜配列の両者支びこれらＤ　Ｎ　Ａ配列の転写産物を意味すると理解さるべきである。

放線菌目（ＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅＬａｌｅｓ）とは、この発明で用いられた意味ではノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）のような放線画枠（Ａｃｔ　ｉｎｏ−ｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）及びマイコバクテリウム科（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）又はロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　）を意味すると理解さるべきである。

マイコバクテリアは敗グループに分けられ、少なくとも５０穫がある。この発明では、ウシ型結核菌（Ｍ、ｂｏν１ｓ）ＢＣＧ、ウシ型結核菌、ヒト型結核菌、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ、　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）とマイコバクテリウム・マイクロティ（！ルラーレ（Ｍ、　１ｎｔｒａｃｅｌ　ｕ　ａｒｅ）とバラ結核菌（Ｍ、　ｐａｒａｔｕｂｅｒ−ｃｕｌｏａｉｓ）からなるグループがＭＡＩＰグループとされる。

異なるグループ及び／又は種のヌクレオチド配列の比較で、同−又は類似のフラグメントを異なるグループに共通の遺伝子内で例証し、相間性を異なる配列間で明確にすることが可能である。

この発明の有利な具体例によれば、その配列は６５−ｋＤマイコバクテリア抗原をコードする遺伝子で少なくとも８０％の相同性を有する。

二の発明の有利な変形例によれば、その配列はマイコバクテリアの少なくとも８種、すなわち、Ｈ，ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、　Ｍ、　ａｖｉｕ＊、　Ｍ、　ｒｏｒｔｕｉｔｕｗ、　Ｍ、　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｔ、　ＢＣＧ、　Ｍ、　ｋａｎｓａｓｉｉ。

輩、ｎａｌｍｏｅｎｓｅとＭ、　Ｉｌｌａｒｉｎｕｍで、３８３塩基対の相同からなる。

３８３塩基対は、次式（１）のアミノ酸配列を有する表現産物に対応する。

Ｘ　、　−ＴＹＲ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＩＬＥ−ＧＬＹ−Ａ　ＬＡ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＶＡ　Ｌ　−Ｘ　ｔ　−ＧＬＵ　−ＶＡ　Ｌ−ＡＬＡ　| ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＴＩＩＲ−ＡＳＰ　−ＡＳ　Ｐ−ＭＡＬ−ＡＬＡ−Ｘ　、　− ＡＳＰ−Ｘ　、　−ＴＨＲ−ＴＨＲ−ＴＨＲ−ＡＬＡ−ＴＨmｉ　− ＶＡＬ−ＬＥＩＪ−Ｘ、−ＧＬＮ−Ｘ、−ＬＥｔｌ−ＶＡＬ−Ｘ、−ＧＬＵ−ＧＬＹ−ＬＥＤ−ＡＲＧ−ＡＳＩＩ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＧＬＹ−ＡＬＡ− ＡＳＮ−Ｘｓ　−ＬＥＬＩ−Ｘｓ　−Ｘ　＋　ｏ−ＬＹＳ−Ｘ　＋　１−ＧＬＹ −ＩＬＥ−ＣＬＵ−ＬＹＳ−ルＡ| ＶＡＬ−ＧＬＵ−Ｘ＋ｔ−ｖＡＬ−ＴＨＲ−Ｘｔｓ−Ｘ、−ＬＥＵ−ＬＥＵ−Ｘ＋５−Ｘ１＊−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＣＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＴＨＲ−ＬＹＳ−Ｘ、ｆｆ−ＧＬＮ−ＩＬＥ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−Ｔｌｌｌ−ＡＬＡ−Ｘ　、、−ＩＬＥ−ＳＥＲ−Ｘ　１ｓ−ＧＬＹ−ＡＳＰ−Ｘｔｏ　−３ＥＲ−ＩＬＥ−ＧＬＹ− Ｘｓ　１−Ｘｔ　ｔ　−ＩＬＥ−Ｘ　ｔ　ｓ　−Ｌ　−Ｌ　５４ＥＴ−ＡＳＰ− ＬＹＳ−ＶＡＬ−ＧＬＹ　−Ｘ　ｘ　ａ　−ＧＬＩＩ−ＧＬＹ−ＶＡＬ−Ｉ　ＬＥ−ＴＩ（Ｒ−Ｘ　ｌ　？　−Ｘ　ｔ　ｍ　−ＧＬkＩ−ＳＥＲ− Ｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（１）上記式中、Ｘ、は存在しないか又はＡＳＰ−ＰＲＯ配列を示す。

Ｘ、ハＬＹｓ又’１ＧＬＩＪ。

Ｘ、はＧＬＹ又は入ＬＡ。

Ｘ、１ｉＧＬＹ又！！　ＡＲＧ　。

Ｘｉ！ＡＬＡ又＋１ＶＡＬ。

Ｘ、は入り入又はＡＲＧ。

Ｘ、はＡ１２Ｇ又はＬＹＳ。

Ｘ、ｉ！ＰＲＯ又はＬＥｔｌ　。

Ｘ、はＧＬＹ又’＊ＳＥＲ。

Ｘ　＋　ｏ　ハＬＥｔ！又！ｔＰＲＥ。

Ｘ　ＩＩはＮＲＧ又はＣＹＳ　。

ｘｌ、はＬＹＳ又ハＡＬＡ。

Ｘ、、１ｉＧＬＵ又１ｔＡＬＡ。

Ｘ、、ハＴＨＲ又＋＊ＬＹＳ。

ＸｔＳはＬＹＳ又はＡＳＰ。

Ｘ　＋＊ハＳＥＲ，ＧＬＹ、　ＰＲＯ又ハＴＨＲ。

Ｘ　ＩｆｆはＡＳＰ又は（ｌｉＬυ。

Ｘ　ｔｓ！＊ＡＬＡ、　ＧＬＹ又はＶＡＬ。

Ｘ、、ハＡＬＡ又ハＶＡＬ。

ＸｓｏｌｔＯＬＮ又はＡＬＡ。

Ｘ、、ｆｌｓＰ又ハＧＬＵ。

Ｘ１１はＬＥＤ又はＰＲＯ。

Ｘ、は糺Ａ又はＶＡＬ。

Ｘｓ４は（ｌｉＬｔｌ又＋＊ＡＳＰ。

Ｘ　、　、　ｆｔ　Ａ、ＬＡ又（＊ＧＬＹ。

Ｎ２．はＡＳＮ又＋＊ＬＹＳ。

Ｘ、、ハＶＡＬ又ハｓＥＲ。

Ｘ、はＧＬＵ又はＧＬＹをそれぞれ示し。

ｘｏは存在しないか又はＡＳＮ−ＴＩＩＲ−ＰＩＥ−ＧＬＹ−ＬＥＵ−ＧＬＮ配列を示す。

この発明の他の有利な変形例では、その配列が３４３塩基対からなり、次式（ＩＩ）に対応する。

かつその配列はｓ　　６０−　ｋ　Ｄ抗原をコードするマイクバクテリアの遺伝子の配列に類似するマイクバクテリアム・フナーチュイタム（Ｍ、　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）のフラグメントに対応する。

このフラグメントは、特に次の制限部位からなる；Ａｃｃｌｌ、Ａｈａｌｌ、　Ｂａｎ１．　Ｂａｎ１ｌ、　Ｂｂｖｌ、　ＢｓｐＬ２８６．　ＢｓｔＸｌ、　ｆＪｏ［。

Ｄｄｅｌ、　　ＥｃｏＲ目、　　Ｅｓｐｌ、　Ｆｎｕ４）ＩＩ、　　）ｌａａｌｌ、　　）ｌａｅｌｌｌ、　　ＨａｐＨ，Ｈｇａｌ。

Ｈｉｎｆ！、　Ｈｐｈｌ、　Ｍａｅｌｌｌ、　Ｍｂｏｌｌ、　Ｍｎ１Ｉ、　！１ａｒｌ、　＋ｌｃｏ［、Ｎ１ａｌｌｌ。

５ａｅｌ、　５ａｅ１１．５ａｕ３Ａ、　５ａｕ９６Ａ、　５ｃｒＦ１．５ｔｙｌ、　Ｔａｑｌ、　Ｙｍａｌｌｌ。

この発明の池の有利な変形例では、その配列は３４３ヌクレオチドからなり、次式ＣＩ［［）に対応する。

かつこの配列は、６５−ｋＤ抗原をコードするマイコバクテリアの遺伝子の配列に１ｉＩ（ｌａのＭＡ　ｒ　Ｐグループに共通のフラグメントに対応する。

このフラグメントは、特に次の制限部位からなる。

Ａｃｃｌｌ、　Ａ４１１．　Ａｈａｌｌ、　Ｂａｎ１．　Ｂｂｖｌ、　Ｂｇｌｌ、　Ｂｓｐ１２ｇ８．　ＢｓｔＥＩＩ。

ＢｓｔＸＩ、　ＩＪｏｌ、　Ｅａｅｌ、　Ｈａｅｌｌ、　）Ｉａｅｌｌｌ、　Ｈｐｈｌ、　Ｍａｅｌｌｌ、　Ｍｎ１ｌ。

Ｎａｒｌ、　　Ｐｖｕｌ、　　５ａｃｌｌ、　　５ａｕ３Ａ、　　５ａｕ９８人、　　Ｔａｑｌ。

この発明の具体例の池の有利な変形例では、その配列は３４３ヌクレオチドからなり、次式（ＩＶ）に対応する。

かつこの配列は、結＠埠園部の６：１ｉ−ｋＤ抗原をコードする遺伝子の配列のフラグメントに対応する。

そのフラグメントは、特に次の制限部位からなる；Ａｃｃｌｌ、　Ａｈａｌｌ、　Ｂａｎ１．　Ｂｂｖｌ、　ＢｓｔＸｌ、　Ｃｆｏｌ、　Ｅａｅｌ、　）［ａｅｌｌｌ。

Ｈｐｈｌ、　Ｍａｅｌｌｌ、　Ｍｎ１１．　Ｎａｒｌ、　Ｎｒｖｌ、　５ａｃ１１．５ａｕ３Ａ、　５ａｕ９６Ａ。

ａｑ　１この具体例のなお他の有利な変形では、その配列は３４３ヌクレオチドからなり、次の式（Ｖ）に対応する。

ＣＧＧＣＯＡＣＧＣＣＡＣＣ，〜ＣＣＡＣＧＧ　　ＣＣ，’ｌ□ＣＴＧＴＧＣＴ　　ＣＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧ　　ＡＧＧbＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧ　　ＴＯＯ丁ＧＧＴＧＣＣ０ＧＴＧＡＣＡＣＧＡ　　ＧＣＧＣＧＴＣＣＧＣｌ〜ＡＣＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣfＣＣＡＡＣＣＴＣＧ（、Ｃ（ｌｉｃｃＧＧｃｃｃｃＡ　　ＡＣＣＣＡＣＴＧＧＧ　　ＣＣＴＣＡ入ＧＣＱＣＧＣＣＡＴＣＧＡＧＡ　　ＡＧＧＣ`ＣＴＣＧＡＧＴＴＧＣＡＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴ　　ＴＧＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＴＴＣＣＣＧ　　ＣＣＧＴ、ＡＧＣＴＣＴ　　ＴＣＣＧＴＣ`ＧＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧ　、ＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＣＡＧＴＡＧＴＧ　ＧＣＡＡＣＴＣＣＴＣＡＣｉｆｌ？この配列は、６５−ｋＤ抗原をコードするマイコバクテリアの遺伝子の配列に類似のマイコバクテリウム・カンサンイのフラグメントに対応する。

このフラグメントは、特に次の制限部位からなる。

Ａｃ５１１．　Ａｈａｌｌ、　Ａｌｕｌ、　Ａｏｓｌ、　Ｂａｎ１．　Ｂｇｌｌ、　Ｂｓｐ１２８６．　ＢｓｔＥｌｌ。

Ｃｆｏｉ、Ｅａｅｌ　ＨａｐＨ，Ｈｇａｌ、　Ｈｐｈｌ、　Ｔｈｏｌｌ、　Ｍｎ１１．　Ｎａｅｌ、　！１ｌａｌｌｌ。

Ｒｉａｌ、　　５ａｕ３人、　　５ａｕ９６人、　　Ｓｒａ！１１．　５ｔｙ１．　　Ｔａｑｌ。　Ｔｔｈｌｌｌｌ、この具体例の他の有利な変形によれば、この発明は３４３ヌクレオチドからなり次の式（Ｖｌ）からなる。

ＣＡＡＣＧ丁ＣＧＣＧ　　ＧＣＣＧＧＴＧＣＣ６へ　ＡＣＣＴＧＣＴＣＡＩＩ：　　ＣＴＴＣＡＡＧＴＧＣＧＧＣＡ’Ｔ、ＣＧへＧＡ　　ＡiｉＧｃｃＧＴｃＧＡＧ丁ＴＧＣＡＯＣＧＣＣＧＧＣＣＡＣＧＧＴ　　ＴＧＧＡＣＧＡＧＴＣＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧ　　ＣＣＧＴＡＧＣＴＣＴ　　ＴＣＣＧＣＣＡfＣＴ１９０　　　　　２００　　　　　２１０　　　　　２２Ｇ　　　　　　２３０　　　　　２４０ＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＣＣＧＧＣＣＡＡＱＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧ　ＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＴＴＣＣＡＧＴＧＧ　　ＣＴＣＴＧＧＧＡＣＧ　　ＡＧＴＴＣＧＧＣＣＧ　　Ｇ丁ＴＣＣＴＣＣＡＧ　　ＣＴＣＴＩＩ：ＧＴＴＣＣＴＣＧsＣＴＡＧＣＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＴＣＧＧ　　ＴＧＧＯＣＧＡＣＣＡ　　ＧＴＣＧＡＴＣＧＯＴ　　ＧＡＣＣＴＧＡＴＣＧ　　ＣＣＧＡＧfＣＧＡＴＧＣＧＣＴＧＧＣＧＧ　ＣＡＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＧＣＴＧＧＴ　ＣＡＧＣＴＡＧＣＣＡ　ＣＴＣＧＡＣＴＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＴＡＧＧＡＣＡ、へＧＧＴＴ　ＧＧＣＡＡＣＧＡＧＧ　ＣＣＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＴＣＡＧＧＡＧ　ＴＣＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＡ　　ＣＣＧＴＴＧＣＴＣＣＣＧＣ，へＧＴＡＧＴＧ　　ＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧこの配列は、６５−ｋＤ抗原をコードするマイクバクテリアのこのフラグメントは、特に次の制限部位からなる。

Ａｃｃｌｌ、　　八ｈａ１１．　　Ａｌｕｌ、　　Ａｏｓｌ、　　Ｂａｎ１．　　ＢｓｔＥＩｌ、　　Ｅａｅｌ、　　Ｅｓｐｌ。

Ｆｎｕ４Ｈ１，Ｈａｅｌｌ、　　Ｈｉｎｆｌ、　　Ｉ（ｐｈｌ、　　Ｍｂｏｌｌ、　　Ｍｎ１１．　　Ｎａｅｌ、　　５ａｕ３人。

５ｔｙ１．　Ｔａｑｌ。

この具体例の他の有利な変形では、その配列は３４３ヌクレオチドからなり次の式（■）に対応する。

ＧＣＣＧＡＣＣＧＣＡ　ＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧ　ＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡ　ＧＴＣＧＡＴＣＧＧＣＧＡＣＣＣＧＡＴＣＧ　ＴＣＧＡＧＧＣＧＡs ＣＣＯＣＴＧＧＣＧＴ　ＣＧＣＴＡＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＧＴ　ＣＡＧＣＴＡＧＣＣＧ　ＣＴＧＧＧＣＴＡＧＣＡＧＣＴＣＣＧＣＴＡＧＧＡＣＡＡＧＯＴＣ，Ｇ（ｉｃＡＡｃＧＡＧＧ　ＧＣＧＴＣＡＴＴ、八ＣＣ０ＴＣＧＡＧＧＡＧ　ＴＣＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧ　ＣＣＣＴＴｔｌ；ＣＴＣＣＣＧＣ，へＧＴＡＡＴＧ　ＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧこの配列は、６６−ｋＤ抗原をコードするマイクバクテリアの遺伝子の配列に類似のマイコバクテリウム・マリヌム（Ｍ、　ｍａｒ−ニミ）のフラグメントに相当する。

そのフラグメントは、特に次の制限部位からなる。

Ａａｔｌ、　Ａｏｓｌ、　Ａｈａｌｌ、　Ａｌｕｌ、　Ｂｂｖｌ、ＢｓｔＥｌｌ、　Ｃｆｏｌ、　Ｅａｅｌ。

Ｆｎｕ４旧、　Ｈａｅ［１，ｌ１ｌａｐＨ，Ｆｌｉｎｆｌ、　Ｍｂｏｌｌ、　Ｍｎ１１．　Ｎａｅｌ、　Ｐｖｕｌ。

二の具竺例の他の変形では、その配列は３４３ヌクレオチドからなり１５次式（ ■）に相当する。　　　　　”ＧＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣ，’１ＡＧＣＴＧＣＴＣＧＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧＡ’ＧＡＣＣＡＡＧＧ　　ＡＧＣＡＧＡＴ’bＧＣＣＣＧＧＣＡＣＴＧＧ　　ＣＧＧＴ’ｒＣＧＡＣＧ　　ＡＧＣＴＧＴ、ＣＧＣＧ、ＧＴＴＣＣＴＣＣＡＧ、ＣＴＣＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＴＣsＡＧＣＧｃｃｃｃＡｃｃｃｃｃ　ｃａｃＡＴｃｒｃｃｃ　ｃｃｃｃｃｃＡｃｃｃ　ＧＴＣＣＡＴＣＧＧＴ　ｃｘｃｃｒｃＡＴｃＧｃｃｃＡｃｃｃｃ、魔■ ＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣ（ＣＧＴＡＧＡＧＧＣＧＣＣＣＧＣＴＧＣＧ　ＣＡＧＧＴＡＧＣＣＡ　ＣＴＣＧＡＣＴＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＴＡ３２０　　、　　３３０　　　　　　　　　　　３４３ＧＣＡＣＡＡＱＧＴＣＧｆｌ；ＣＡＡＧＧＡＡＧ　　ＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＴＣＧＡＧＧへＧ　　ＡＧＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＧ　ＣＣＧＴＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＣＧこの配列は、６５−ｋＤ抗原をコードするマイコバクテリアのそのフラグメントは、特に次の制限部位かみなる。

Ａｃ’ｃｌｊ、’　Ａｈａｌ’１．　Ａ’ｌｕｌ、””、Ａｏｓｌ、”’　Ｂ’ ：ｎｌ、’　Ｂｓｐ１２８６’、、’Ｃ？ｏｌ’、　ｌ”ａ■戟A’ 二の発明の主題はま―、この発明によるヌクレオチド配列のフラグメントからなることを特徴とするオリゴヌクレオチドである。

これらのフラグメントの中で、特に次のらのを挙げることができる。

次の式（■）：５’　　ＧＡＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（ＩＸ）の配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドであり、このような配列は特に結核桿菌グループの６５−ｋＤ抗原をコードする遺伝子の“＋°ストランドのスタートコドン後の塩基配列３９７−４１６に相当し、この配列を以後ＴＢ−１と表示する。

次の式（Ｘ）；５′ＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴ　　　　　　　　（Ｘ　）の配列を宵することを特徴とするオリゴヌクレオチドであり、この配列は、結核細菌グループの６５−ｋＤ抗原をコードするする遺伝子の“−２ストランドのストランドコドン後の５３５−５５４の塩基配列を相補し、この配列を次後ＴＢ−２と表示する。

次の式（℃）：５′ＧＣＧＧＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＧＣＣＧＴＧ　　　　　　　　（ｌ［）の配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドで、この配列は結核挿画の認識をし、以後ＴＢ−３と表示する。

次の式（店）；５’　ＣＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＣＧＧＴＧＧＣＣＧ　　　　　　　　（■）の配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドで、この配列は結核埠菌の認識をし、以後ＴＥ−４と表示する。

次の式（ＸＩ［［）：５’、ＣＴＧＣＣＡＣ（１’ＧｃＧＧｃｃＡＴｃＴｃｃ　、　　　　　　　（ＸＩ［［）の配列を有することで特徴づけられるオリゴヌクレオチドで、この配列はＭＡＩＰグループ桿細菌の認識をし、以後ＴＢ−５と表示され、このヌクレオチドは有利に単一のＢｇｌｌ制限部位から得る。

次の式（ｘ■）：５’　ＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＴＡＴＣＴＣＣ（χ■）の配列を有することで特徴づけられるオリゴヌクレオチドで、この配列はマイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｌｆｏｒｔｕ一旦旦）を認識し、以後ＴＢ−６と表示する。

次の式（ＸＶ）：５’　ＡＡＣＧＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣＣＡＡ　３’　　　　　　　（ＸＶ）の配列を有することで特徴づけられるオリゴヌクレオチドで、その配列を以後ＴＢ−７と表示する。

次の式（ＸＶＩ）：５′ＧＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣ３″　　　　　　（χ■）の配列を有することで特徴づけられるオリゴヌクレオチドで、その配列を以後ＴＢ− ８と表示する。

次の式（Ｘ■）：５’　ＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧ　３’　　　　　　　　（Ｘ■ ）の配列を有することで特徴づけられるオリゴヌクレオチドで、その配列を以後ＴＢ−９と表示し、このオリゴヌクレオチドＴＥ３−９は有利には単一のＢａｎ　Ｉ制限部位からなる。

次の式（Ｘ■）：３′ＣＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＡＡＴＣＴＧＣＴＣ５’　　（Ｘ〜１）の配列を有することで特徴づけられるオリゴヌクレオチドで、その配列は結核桿菌グループの認識をし、以後ＴＢ−１０と表示される。

次の式（ＸＩＸ）　：５’　　ＧＧＴＧＣＴＣＧＣＣＣＡＧＧＣＧＴＴＧＧＴＣＣＧＣ３’　　　　　　　　　　（ＸＩＸ）の配列を有することで持黴づけられるオリゴヌクレオチドで、その配列はＭＡＴＰ桿菌グループの認識をし、以後ＴＢ−１１と表示される。

次の式（Ｘ（）・５’　ＴＧＴ（ｉＣＴＣＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＴＣＡＡＡ　３′（ＸＸ）の配列を有することで特徴づけられるオリゴヌクレオチドで、その配列はマイコバクテリウム・カンサソイ（！Ａ、ｋａｎｓａｓｉｉ）の認識をし、以後ＴＢ− １２と表示される。

さらに他の具体例にによれば、そのオリゴヌクレオチド類は、特にアプライド　バイオンステムズ（米国）に上り市販の装置を用いて合成的に得られる。

この発明の主題は、また、各ブライマーが上で定義したごときヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列のフラグメントからなることを特徴とする放線菌目のＤＮＡ又はＲＮＡの合成用の一対のプライマーである。

このようなブライマーは全放線菌口中に存在する抗原をコー′ドする遺伝子、特に６５−ｋＤ抗原をコードする遺伝子中に存在するＤ　Ｎ　Ａ又はＲＮＡ配列又は後者のフラグメントの合成を可能にする。

一対のブライマーの具体例によれば、それらは式（ＩＸ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−１）と式（Ｘ）のオリゴヌクレオチ・ド（ＴＢ−２）の対からなるのが有利である。

一対のプライマーの他の具体例は、式（ＸＶ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−７）と式（ＸＶ［）のオリゴヌクレオチドの対からなるのが有利である。

プライマーＴＢ−１とＴＢ−２は、マイコバクリチア、ノカルデア又はロドコッカスのような関連細菌中に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ配列の合成を可能とする。

この発明の主題はまｆ二、ヌクレオチドプローブで、これらは上で定義したヌクレオチド配列又は後者のフラグメントからなり、適切なフランス特許第８１／２４，１３１号に記載された乙ののように、放射性同位元素、適当な酵素、蛍光色素、抗体又は塩基類似体のような標識を用いて標識化されているものからなるのを特徴とする。

この発明の有利な具体例では、そのプローブは、弐Ｘ［（ＴＢ−３）、弐店（ＴＢ−４）、ＸＩＩＩ（ＴＢ−５）、ＸＩＶ（ＴＢ−６）、Ｘ■（ＴＢ−９）、Ｘ ■（ＴＢ−１ｏ）、ＸＩＸ（ＴＢ−１１）及びＸＸ　（ＴＢ−１２）のオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる。

プローブＴＢ−６は、特に扇、フオーチュイタム（ｆｏｒｔｕｉｔｕ口）を検出でき、プローブＴＢ−５とＴＢ−１１はＭＡ、ＩＰグループのマイクバクテリアを検出てき、プローブＴＢ−３、ＴＢ−４、ＴＢ−９とＴＢ−１０は結核桿菌グループのマイクバクテリアを検出可能にし、プローブＴＢ−１２は墓、カンサンイ（ｋａｎｓａｓｉｉ）を検出可能にする。

この発明の主題はま八；、上記の配列の何れか１つでコード化されたペプチド又はペプチドフラグメントである。特に次のものを挙げることができる。

上記の式（ＩＩ）の３４３ヌクレオチドの配列をコード化し、次式（Ｘｌｌ）に相当することで特徴づけられるペプチド及び／又はペプチドフラグメント：ＴＹＲ−ＧＬＵ−ＬＹＳ　−ＩＬＥ−ＧＬＹ−ＡＬＡ−ＧＬＵ−ＬＥＵ−ＶＡＬ −ＬＹＳ−ＧＬＵ−’／ＡＬ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＬＹＳ−ＴＨＲ−ＡＳＰ−ＡＳＰ−’／Ａ１．−Ａ　Ｌ、１ｔ−ＧＬＹ−ＡＳＰ−ＧＬＹ−Ｔ）ＩＲ−ＴＨＲ− ＴＨＲ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−、ＩＩ　ＬＡ−ＧＬＮ−ＡＬＡ−ＬＥＩｊ−ＶＡ　Ｌ−ＡＲＧ−ＯＬＤ−ＧＬＹ−ＬＥＵ−ＡＲＣ−ＡＳＮ−ＭＡ　Ｌ−ＡＬＡ−、’１ＬＡ−ＧＬＹ−ＡＬ八−１へ５Ｎ−ＰＲＯ−ＬＥＵ−ＧＬＹ −ＬＥＵ−ＬＹＳ−：へＲＧ−ＧＬＹ−ＩＬＥ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−ＶＡＬ−Ｔｌ（Ｒ−ＧＬＵ−Ｔ）ＩＲ−ＬＥじ−ＬＥＵ− ＬＹＳ−８ＥＲ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＴＩ（Ｒ−ＬＹＳ −ＧＬＵ−ＧＬＮ　−＋　ＬＥ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＴＩ（Ｒ−ＡＬＡ−ＧＬＹ　 −１ＬＥ−３ＥＲ−ＡＬＡ−ＧＬＹ−、’ｔＳＰ−ＧＬＮ　−Ｓ　ＥＲ−Ｉ　ＬＥ−ＧＬＹ−Ａ　５Ｐ−ＬＥＵ−Ｉ　ＬＥ−ＡＬ、’ｌ−ＧＬ狽戟| ＡＬＡ−ＭＥＴ−ＡＳＰ−ＬＹＳ−ＶＡＬ−ＧＬＹ−ＡＳＮ−ＧＬＩＢ−ＧＬＹ −ＶＡＬ−ＩＬＥ−ＴＩ（ｌ’１−ＶＡＬ−ＧＬＵ−ＧＬＵ−ＳＥＲ，（Ｅ　）上記式（ＩＩＩ）の３４３ヌクレオチドの配列でコート化された下記式（ＸＸＩＩ）に相当することで特徴化されたペプチド及び／又はペプチドフラグメント。

了’ｔ？、−ＧＬＵ−Ｌ本−Ｘ”−ＣＬ’：’−λＬλ−ＧＬｕ−ＬＥｔＪ−Ｖ λＬ−−ピ５−ＣＬＵ−ＶλＬ−人ＬＡ−ＬＭＳ−泣Ｓ−丁Ｈλ−Ａ５？−Ａ５：’−ＶＡＬ−Ａ！ニーＣゴーＡ５Ｅ’−ＧＬＹ−計Ｂ−τＨＲ−−退一にニー τ１ミλ−Ｖ入Ｌ−二＝υ−ＡＬＡ−ＧＬ（３−λＬλ−ＬＥＵ−Ｖλニー、’ Ｊ、Ｇ−ＧＬ’：ｊ−ＣＬＹ−ＬＺＵ−λ？、Ｇ−、”＋５Ｎ−ＶＡＬ| 人二人−人ＬＡ−ＧＬＹ−人ＬＡ−人５Ｎ−Ｅ’ＲＯ−ＬＥｔＪ−ＧＬＭ−Ｌ二ＩＪ−Ｌ’？５−Ａ−ＲＧ−ＧＬＹ−！ＬＺ−ＣＬＩＪ−４ｖ５−λＬλ−Ｘｌ λニーＧＬローＬＹＳ−ＶＡ−−ＴＦ−”、−ＧＬＵ−Ｔ）！７’、−”’Ｕ− Ｌ工Ｕ　−！−’ｆ　Ｓ　−Ｓ　ＥＡ@−λ二λ− Ｌ”５−ＧＬＵ−ｆｌｔニーＧＬＵ−τビＲ−Ｌ”ｓ−λＳ７−σ−Ｈ−ｙ−＝ −λＬλ−人−λ−フーλ−λ−人二λ−工Ｌｍ−５Ｅλ−―−ｃ、Ｌｘ−ＭＰ −ＧＬＮ−５Ｅλ−ＺＬＸ−ＧＬＹ−λＳ？−”Ｕ−：＝−患−ＧＬＵ−上記式（Ｖ）の３４３ヌクレオチドの配列でコート化された下ｇ２式（ＸＸＩＩＩ）に相当することで特徴化されたペプチド及び／又はペプチドフラグメント。

ＴＹＲ−ＧＬＵ−Ｌ’！’　Ｓ−：　ＬＥ−ＣＬＹ−ｊＱＡ−Ｇ１．、Ｕ−ＬＥＵ−ＶＡＪ、−ＧＬＵ−ＧＬ（Ｊ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＬＹ　I　− Ｌ′１Ｓ−ＴＩ（Ｒ＝ＡＳ？−ＡＳＰ−Ｖｌ−Ｌ−ＡＬＡ−ＧＬ’＋’−ｋｓ？ −ＧＬＹ−ＴＩ（Ｒ−ＴＨＲ−ＴＨＲ−人ＬＡ、−Ｔ！（Ｒ| ＶＡＬ−ＬエローＡＬＡ−ＧＬＮ−人Ｌλ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−Ｌ？！−ＧＬＵ− ＧＬＹ−ＬＥ（Ｊ−人ＲＧ−ＡＳＮ−ＶＡＬ−ＡＸＪ、＝Ａ！Ｊ＝−ＧＬ！−ＡＬＡ−Ａｊ　Ｎ４　ＲＯ−ＬＺｔＪ−ＧＬＹ−Ｌ、ＥＩＪ−Ｔ、ＹＳ−ＡＸＧ− ＧＬ’ｆ−Ｚ　ＬＥ−（：k（Ｊ− ＧＬＹ−にτ−入５Ｐ−ＬＹＳ−■リーＧＬＹ−ＡＳＮ−ＧＬぴ−ＧＬτ−■リーエ＝−τヨーＳコーＧＬＭ−Ｃ−ロージス、（ＬＩＣエエ句上記式（Ｖｌ）の３４３ヌクレオチドの配列でコート化された下呂己式（ＸＸＴＶ）に相当することで特徴化されたペプチド及び／又はペプチドフラグメント。

？Ｙλ−ＧＬＵ−’−ＹＳ−Ｚ＝−ＧＬｒ−ｋＸλ−ＧＬＵ一本Ｕ−■こ−ＬＹ５−ＧＬＵ−■山一応−ｐｙ５−都Ｓ−τジ←Ａ５　？−ＡｓＦ’−■山−Ｍλ −Ｇｒ、Ｍ−Ａ５Ｐ→、ＡＧ−τ揖←τ悪−τＨＲ−患−τＨλ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＶＡＬ−ＣゴーＡＬＡ−”’Ｕ−■ニーＬＹＳ−ＧＬＵ−ＧＬＭ−”υ−ＡＲＧ　−Ａｓ　Ｎ　−Ｖ！Ｑ　−Ａ鳳−ｍ−ａＬ’とづμλ−ＭＮ−二Ｕ−Ｌ：ＴＪ−５Ｅλ−ｐＨＨ−ＬｖＳ−（−２５−（、部−：ニーＣ二ロー＝’ｚｓ− ―−ｖｚこ−ＧＬローＬＹ　Ｓ　−ＶＸＪ、−ＴＦ、、Ｒ−ＧＬＵ−ＴＫＲ−ＬＥＵ−ＬＺＵ−１１，？　５−　ｉ’？、０−ＡkＡ− Ｌ：Ｓ−Ｇ’、、Ｕ−ＶＡＬ−にＬＵ−ＴＦ−”＝−ＬＭＳ”０ＬＩＪ−ＧＬ’ Ｊ−工”−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＴＨＲ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−二”−５Ｅ３．”ＶｋＬ −ＧＬＭ−ＡｓＰ−Ｇ１３−５’ＥＲ−ＸＴ２−（Ａ、Ｙ−ｋＡ？−ＬＥ：Ｕ− Ｚ’、Ｚ−ＡＬＡ−Ｇ　−’Ｊ−Ａニーぼτ−λ５Ｐ−Ｌ？５−Ｖ７山−ＧＬＹ −Ａ！Ｎ−ＧＬＵ−ＧＬＹ−Ｖ）山−：＝−τＦ、Ｒ−ＶＡＬ−ＧＬＵ−Ｇ：＋ローＳＬＬ、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＸＸ工Ｖ）上記式（■）の３４３ヌクレオチドの配列でコード化され、下記式（ＸＸＶ）に相当することで特徴化されたペプチド及び／又はペプチドフラグメント。

入Ｓ？−？　ＲＯ−Ｔ？Ｒ−ＧＬＵ−ＬＹＳ−：”−Ｇ’ｂ’！−ＡＬＡ−ＧＬ ’Ｊ−”Ｕ”ＶＡＬ−’ＬＹＳｆ（Ｌ；−’−’ＡＬ−λＬＡ−ＬＹ５−Ｌ”！ −７７’、？ｙｋ５？−；％Ｓ？−７λＬ−λＬλ−σ−”−ＡｓＰ−人λに− ＴＭＲ−τ五三−τ三？−にニーτ’：：Ｒ−Ｖ肛−”　’υ−ＡＬＡ−ＧＬＮ −ＡＬＡ−ＬＥＵ−Ｖｉ’−Ｌ−ＬＹ　Ｓ　弓ＬＵ−ＧＬ？　−”Ｕ−ＡＲＧ　 −λ５Ｎ−Ｖ　λＬ−λ二λ−；’ＱＡ−Ｇ：＋Ｙ−ＡＬＡ−ＡＳＮ−？Ｆ、Ｃ５ＬＥローＧＬ％ｌ−？？ロー１−Ｙ５−λＲＣ−ＧＬＹ−：ニニーＣＬＵ−Ｌ？５−ＡＬＡ−ＶλＩＬ−ＧＬＵ−Ｌ’！５−ＶＡＬ−ＴＫＩ−ＧＬＵ−’、： ’、Ｒ−”Ｓ−”Ｕ７Ｌ’１Ｓ−５Ｅｌｙ　λ二λ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＶＡＬ− ＣａＬＵ−ＴＦＲ−ＬＹＳ−ＧＬＵ−ＧＬ、’ｌ−：”−人二λ−λ二λ−τＨ？、−λ二λ−λＬλ−二：ニーＳ二？、−Ａ二λ−ＧＬＹ−ｋｓ？−ＧＬＮ− ５＝λ−：ＬニーＧＬ”−λＳ？−？Ｒ，Ｏ−Ｚ”−ＶＡＬ−ＣＬＵ−λ二λ− ！Ｔ−ＡＳＰ−二Ｘ５−ＶλＬ−ＧＬＹ−ＡｓＮ−ＧＬＵ−ＧＴ−？−ｔ／ＡＬ −：”−−Ｒ−■こ−（ａ−’、ニーＣ：：　−５”３．−Ａ−Ｎ　−ＴＦ−’ （−５’　ＦＺ−；Ｌ’！−”Ｕ−こぶ、　　　　　　　（ＸＸＶ　）上記式（ ■）の３４３ヌクレオチドの配列でコード化され、下ｇ己式（ＸＸＶ［）に相当する二とで特徴化され１ニベプチド及び／又はペプチドフラグメント。

τ′！λ−（ＬＵ　−Ｌ”　Ｓ　−：　”　−ＧＬＹ−Ａ！Ｊｉ−ＧＬＵ−ＩｊｌＪ−■ｕ−ＬＭＳ−ＧＬＵ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＬＹＳ−ＬＭＳ−τＦ−Ｑ−ＡＡ　？−？Ｊ？　−ＶＡＬ−にλ−）ＪＪ、−ｋｓ？　−ＧＬＹ−ＴＦＪ−τＦ −Ｒ−ＴＦ−Ｒ−―−笥Ｒ−Ｖλニー？ＦＵ−λ二λ−ＧＬＮ−ＡＸＧ−”Ｕ− ＶλユニーＲＣ−ＧＬＵ−ＧＬ’！−”Ｕ”ＡＡＧ−ＡｓＮ−ＶＡニーλ二λ− λＬλ−ＧＬ”！−λＬλ−ｋｓＮ−ＰＲＯ−Ｌ：（Ｊ−ＧＬＭ−’”Ｕ−”、ＹＳ−Ａ：ｔＧ−ＧＬＹ−：”−ＣＬ−−Ｌ″！Ｓ−にニー■ニベ―Ｕ−にλ− ■μ〆）込−に’Ａ−ＬＹＳ−”　’８−＝−尼？−：Ｈスーにニー！−”５− ＧＬＵ−％７’＋Ｌ−ＧＬＵ−τＭＲ−ＬＹＳ　−ＧＬ’Ｊ　−ＧコーＸ　＝− ＡＬＡ−ＡＬＡ−Ｔ”Ｊ−にニーＣＩＬ？　−Ｚ　”−５ＥＲ−ＡＬＡ−ＧＬ：？−Ａｓ？　−ＡＬＡ−５ＥＡ−：”−ＧＺａＹ−ａｉ；−”Ｕ−：　”　呟詰 −ＧＬ’ニーにユ→’ＸニーｋＳ’；’　−−ＭＳ−Ｖ；ｌニー〇Ｌ’ｆ−ＬＹｓ−ＧＸ−Ｕ−Ｃ；ＬＹ−ＶＶユニーニーτＨ：ｌ−ｖ肚−ｕ　ｉ−Ｕ　| にＬＵ−５北、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（頭）この発明の主題はまた、上記の少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチドフラグメントと任意に少なくとも医薬的に受容な賦形剤とからなることを特徴とする免疫性を有する塑性物である。

この発明の主題はまた、適切−動物を二の発明によるペプチド又はペプチドフラグメントで免疫化することによって得ろれることを特徴とするポリクロナール又はモノクロナール抗体で、！５る。

このような抗体はＥＬＩＳＡ又はＲＩＡタイプの公知法により、検査されるも宮からの適切なサンプル中におけるマイクバクテリアの存在を証明するのに応用できることを見出している。

二の発明の主題：１また、生体サンプルを（１）二の発明による一対のプライマーと接＠させ、そのＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１つのフラグメントを増幅させ、（２）その後、増幅されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列をこの発明による少なくとも１つのヌクレオチドプローブで検出することを特徴とする、適当に抽出処理された生体サンプル中に存在しうる、マイクバクテリア、ノカルディアとロドコッカスからなる群から選ばれた放線菌目の少量について増幅とハイブリッド形成によって、放線菌目のＤ　Ｎ　、Ａ及び／又は転写産物を検出し迅速に同定する方法である。

（１）で行われる方法は、特に、所謂Ｑβレプリカーゼ法（ＬＩＺＡＲＤＩ　ＰＪ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、　１９８Ｌ　６）又は所謂ＰＣＲ（ポリメラーゼ　チェイン反応）法（セチウス社出願のヨーロッパ特許出願第２００，３６３号、同第２０１．１８４号及び同第２２９，７０１号）のような遺伝子増幅の技術の１つである。

このような方法は、行なうべき放線菌目特にマイコバクテリアの異なるグループを、一方でＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントを増幅する非特異性プライマーを用い、他方でグループ又は属特異性ブライマーを用いて、区別する特異的、直接的及び速やかなテストを可能とする利点を有する。

この方法の有利な具体例によれば、加えて、（３）上記の工程（２）中でハイブリッド化されたプローブを適当な制限酵素を用いて切断し、（４）得られたプローブフラグメントを検出することからなる。

この具体例の変形によると、制限酵素はＢａｎ　ＩとＢｇｌｌからなる群から選ぶのが有利である。

このような具体例では、放線菌目の属又はグループを検出しうる利点を有する。

この方法の他の有利な具体例では、増幅したＤＮＡ又はＲＮＡ配列の検出を、２つの適当なヌクレオチドプローブを用いて行ない、その方法は付加的に（３）２つのハイブリッド化プローブを酵素的にカップリングさせ、（４）２つの結合したプローブを含有するフラグメントを検出することからなる。

この方法の他の有利な具体例で：よ、検出・同定工程前の工程中、生体サンプルからの遠心分離ベレットを適当な溶菌液に懸濁し、はぼ９５℃で適当な時間培養し、その培養自体は緩衝液を媒地に添加することを伴い、その後ＤＮＡが適当な抽出手段で抽出されることにより、生体サンプルからＤＮＡが単離される。

この具体例の有利な変形によれば、使用される溶菌溶液は０、ＩＮ　ＮａＯＨ，２Ｍ　ＮａＣ１と０．５％ＳＤＳからなる液である。

この具体例の池の有利な変形では、培養は約９５℃の温度で約１５分間行われる。

この発明の主題は加えて、少なくとも１つの放線菌目の細菌、特に少なくとも１つのマイクバクテリアの検出方法を行うため簡易使用のキット、アウトフィツト又は調整セットであって、その検出を行うための適当量の適当な緩衝液と試薬とは別に、この発明によるー・対のプライマーの適当量と、この発明による少なくとも１つのヌクレオチドプローブ又はプローブフラグメントからなることを特徴とする。

上記の変形とは別に、この発明は次に記述し、この発明の主題である方法を補う実施例に関する記載から明らかになるであろうその他の変形からなる。

しかし、この実施例はこの発明の主題を例示するためにのみ与えられる乙のでそれによって限定されｔいことを明白に理解さるべきである。

（マイコバクテリウムフォーチュイタム）の検出と比較同定ｉ）マイコバクテリアＤＮＡの単離生体エキスを適当な方法で処理し、遠心分離する。ＤＮＡを抽出するγ二めに、２Ｍ塩化ナトリウムと０．５％ＳＤＳを含む０．ＩＮ水酸化ナトリウム５０αζ 中に、上記遠心分離したベレットを再度懸濁し、９５°Ｃで１５分間（時々ゆるく振盪１．なから）培養し、ついで０．１？ｖｌリス塩酸、ｐＨ７、Ｏ，ｌス（！を加えた後、ＤＮＡをフェノール−クロロホルムの１昆合液で３回抽出し、エタノールで結晶化し、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭトリス塩酸、ｐ＋− １８，５０メｔＱに、理解する。

ｂ）ＤＮＡ増幅Ｓ　Ａ、　ｌ　Ｋ　＋等（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、　１９ｇ８．２３９　、４８７− ４９１　）及びヨー０−／バ特許出願第２００．３６２号に記載のように増幅を行なう　５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，３）　１．５− ２．４ｒｎＭ塩化マグネンウム、ゼラチン１００μ９／ｘＱ、３００μＭデオキノリボヌクレオチド（４つのデオキンリボヌクレオチド　ｄＡ、ｄＧ。

ｄＣ及びｄ＋の混合物）、ＴＢ−１及びＴＢ−２で表示される本発明のブライマー（反応開始剤）５０ｐＭ、タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼ２単位、及びヒトの細胞とマイクバクテリアとの混合物エキスｌＯ〜５０μＱもしくはマイクバクテリアから抽出し？＝ＤＮＡ５０ｎｇを含有する反応を混合物０．１収を９４℃で１．５分間、５０℃で２分間及び７２℃で２分間保持し、このサイクルを約４０回繰り返す。最後のサイクルの後、試料を３７℃に１０分間保持し、ついで４℃ で保存する。

Ｃ７増幅試料のサザンプロット法による分析増幅試料の一定量ｌＯμＱを取り、２％アガロースゲルの電気泳動に付す。次いでこのＤＮＡをナイロンフィルター上に移す（標準法：　Ｒｅｅｄ　Ｋ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１９８５゜１３、７２０７）。ついでＤＮＡを載せ１ニフィルターを２Ｘ　５ＳＰＥ溶液（２０Ｘ　　５ＳＰＥ′Ｉｓ液：＊、３，０鼠塩化＋　ｌ−ＩＪ　ラム、２００ｍＭＮλＨ２ＰＯ，及び２０ｍＭ　　ＥＤＴ、Ａに相当する）で、洗浄、ついで、）Ｘ　　５ＳＰＥと５ＸデンハートＣＩＸ　デンハ−ト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液は、０．０２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）　、０．０２％ポリビニルピロリドン及び０１０２％ウシ血清アルブミンに相当する〕からなる溶液中、６３°Ｃで２時間、プレハイブリダイゼイション混合物で処理し、ついで本発明の３つの試料、５位末端に”Ｐ　Ｃ２ｘ　１．０　’ｃｐｍ／ｚｃ、比活性１〜３　μＣｉ／ｐｍｏｌ　）の標識を付しｔ二ＴＢ−４、同ＴＢ−５及びＴＢ−６を含む上記溶液中で、６３℃で一層ハイブリッド形成を行なう、得られたプロット（ｂｌ、ｏｌ：）または析出物を０．５％ＳＤＳ含膏の［１，１Ｘ　ＳＳＣ溶液（ＩＸ　　ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウムとｆｌ、ｏ１５蔦クエン酸ナトリウムに相当）中で室温で２時間、０．５％ＳＤＳ含有の５ｘｓｓｐＥｉ容液中６７〜７２℃で２〜４分間さらに０５％ＳＤＳ含宵の０．水酸　　ＳＳＣ溶液中室温で２時間洗浄する。得られ１；析出物を乾燥すると、少量生成するハイブリッドは、Ｘ　Ａ　Ｒ−５フィルム１こ露出することにより目視される。

ドツト−プロット分析では、増幅試料ｌＯμＱを２５ｍＭＥＤＴＡ含宵の０，４Ｍ水酸化ナトリウムＯ，Ｌｅ（中２分間９５℃に加熱；、て変性させる。試料を急速に冷却し、ナイロン膜にフィツトした多数のウェル（ＢＩＯＲＡＤ、　（米国））、もしくは少数のウェル（ＣＥＲＡ　ＬＡＢＯ（フランス））中に入れた。各ウェルは２０ＸＳＳＰＥ　　０．４ｘＱで２回洗浄、膜を８０℃に１時間加熱すると上記と同様にハイブリッド化が行わｎる。図１に示すような結果が得られた。

図１はウシ型結核菌ＣＢ）、トリを結核菌（Ａ）及びｑ、（Ｏバクテリウムフオーチュイタム（Ｆ）の増幅ＤＮＡと、それぞれ特異性プローブＴ　Ｂ　−４、′ ｒ　Ｂ　−５及びＴＢ−６とツバイブリッド形成を示す。

実施例２・実施例１で得られｆ二配ｙ＋Ｉと文献に記載のＤＮＡ配列Ｄ　：Ｑ　Ａをフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させ、１．ｍＭＥＤ　Ｔ　Ａ含有のｌｏｍＭｈリス塩＃ｉ、（ｐＨ８）に再度溶解する。

ついでＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで加水分解し、Ｍ１３ｍｐ１．８フアージ及びＭ１３ｍｐ１．９フアージにクローン化し、ｄＧＴＰの代わりにｄ−ａｚａＧＴＰの存在下、Ｔ７ボリメラーゼ又はタブクボリメラーゼを用いてサンガー法により配列する。

増幅Ｄ　Ｎ　Ａ　！ｉ図２に示すように、６５−ｋＤマイコバクテリア抗県の遺伝子コードの予期領域に対応し、ウシ型結核菌、トリ型結核菌、バラ結核菌及びマイコバクテリウムフオーチュイタムの６５−　ｋ、　Ｄ抗原の遺伝子コードから得られる増幅フラグメントのＤＮＡ配列は特異的である。

ウシ型結核菌の増幅Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、ウシ型結核菌の６５−ｋＤ抗１５７１　（ＴＨＯｌ、Ｅ　ｅｔ、　ａｌ、、　１９８７）及びヒト型結核菌の６５−ｋＤ抗原（ＳＨＩＮＮＩＣＫ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７）の遺伝子コードに対応する領域に一致する。

トリ型結核菌、バラ結核菌及びマイコバクテリウムフオーチュイタムからの増幅ＤＮＡ配列は、ｉクシ型結核菌及びヒト型結核菌からの増幅ＤＮＡ配列と非常によく似ており、かつこれらの配列に対応すると推定される翻訳産物は、図２に示すようにウシ型結核菌／ヒト型結核菌の６５＝ｋ　Ｄ抗原によく近似している。

図３はトリ型結核菌（図３ｉＬ）、マイコバクテリウムフオーチュイタム（図３ｂ）、ヒト型結核菌（図３ｃ）及びウシ型結核菌ＢＣＧ　（図３ｄ）の６５−ｋＤ抗原の遺伝子コードの中に含有される３４３ヌク１ノオチドのフラグメントの制限部位数を示す。

実施例３：方法の感度の増大方法の感度は、生体培地の胸膜液で希釈１．たＢＣＧを用いて試験した。この方法は、液体のｉ当り約１０個の桿菌を検出することかできる：このことはマイコバクテリアの検出に際し、直接試験法が同定せずに１０’〜１０’個の桿菌／ｆｆ１ｃをノ要とするか、この直接試験法をかなり改善した。

さらに、この試験法は、ａ縮と培養の後でマイコバクテリアの検出と同定をする法よりもっと急速に行なうことができる。

図４は、ヒトの血液の単核細胞１０６と各ラン型結核菌の桿菌らＸ１０’Ｃカラムｌ）、６Ｘ１０’（カラム２）、６Ｘ１０’（カラム３）、６００（カラム４）、６０（カラム５）及び６（カラム６）とを含有する試料から抽出し、タックポリメラーゼ及びオリゴヌクレオチドブライマーＴＢ−１とＴＢ−２を用いて増幅して得られにＤ　Ｎ　、Ａの結果を示す（図４．ゲル；図４ｂ：ドット　プロット）。

実施例４；オリゴヌクレオチド制限試験に上る結核桿菌グループの増幅配列の検出制限試験により結核挿画グループに属するマイクバクテリアの増幅配列の存在を検出するために、５′位末端に３ｆｆｐの標識を付したオリゴヌクレオチドＴＢ −９４Ｘ１０’ｃｐｍをＩＯＸ緩衝１Ｑ（４０１１１）１）リス塩酸（ｐＨ７，０）、６０ｄ塩化マグネノウム及び６０ｍＭ２−メルカプトエタノール）２μｅを加えて最終容量が１５μＱとなるように混合する。増幅生成物を加え、この試験管を９５℃で５分間インキュベートし、ついで５２℃で２時間インキュベートする。１３ａｎｌ（２５単位）１ｆ２を加え、試験管を３７℃で１〜２時間インキュベートする。２０％フィコール、２５ｆｆｉＭＥＤＴＡを含有する９５％ホルムアミド４μｇ、ブロモフェノールブルー２５μ９／ＩＱ及びキルンシアツール２５μ？／　ｚ（を加えて、試験管を６５℃で１０分間加熱し、その１２μａを３０％ポリアクリルアミドゲルの電気、永Ｍ（３４０ｖ、１〜２時間）に付す。ついでこのゲルをＸ線フィルムに３〜１８時間露出し、陽性を示す試料には制限酵素によるＴＢ−９の切断により生成したオリゴヌクレオチドＴＢ−９の５′ 位末端に１１個のヌクレオチドのフラグメントに対応するバンドの存在が確認された。

実施例５．二の発明のオリゴヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドは、３８０　Ｄ　ＤＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ）　（ＡＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯ８ＹＳＴＥＭＳ、　ｆＪ）を用いるホスファミジット（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法（ＢＥＡｌｉＣＡＧＥ、　１９８５．上２己）１こより合成され、ＴＢ−１、ＴＢ−２、ＴＢ−３、ＴＢ−４、ＴＢ−５、ＴＢ−６、Ｔ’Ｂ　−７、ＴＢ−８及びＴＢ−９が得られる。

実施例６：オリゴヌクレオチド制限試験によるＭＡＩＦグループの増幅された配列の検出試薬数は異なるが、実施例４と同様に行なう。

−オリゴヌクレオチドＴＢ−５が用いられる。

−１０Ｘｆｆｌ衝液は５００ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ８，０）　、１．ＯＤｍｌＡ塩化マグネシウム及び４００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する；−制限酵素はＢｇｌｔ（１０単位）を用いる。

実施例４と同様に陽性の試料は、制限酵素ＢｇｌｌによるオリゴヌクレオチドＴＢ−５の切断により生成する９個のヌクレオチドのフラグメントに相当するバンドの存在により同定される。

図５はオリゴヌクレオチド制限試験法による増幅マイクバクテリアＤＮＡ配列の検出を示す。

精製したマイコバクテリアＤＮＡを増幅し、トリ型結核菌（カラム１−５）、ウノ型結核菌ＢＣＧ　（カラム６）及びマイコノくクテリウムフォーチュイタム（カラム７）からの増幅生成物の各当量を、３１Ｐのｆｆ！識を付しｎオリゴマクレオチドＴＢ−５と制限酵素Ｂｇｌｌを用いて、上記と同様に測定する。次の酵素活性に対応する酵素量を加える＝１単位（試料１．６及び７）：５単位（試料２）；１０単位（試料３）：２０単位（試料４）、及び５０単位（試料５）。

オートラジオグラムを単一強化スクリーンに３時間露出する。

図５は、カラム１〜５において切断されたオリゴマーが明確に現れていることを示し、従ってトリ型結核菌に同定される。

実施例７：唾液試料中のマイコバクテリアＤＮＡの検出ヒト型結核菌から精製した１）％Ａ（図６．Ｔ）、トリ型結核菌かみ精製したＤＮＡ　（図６．Ａ）及びＭ、フオーチニイタムから精製したＤＮＡ　（図６．Ｆ）並びに陰の培養の結果を示す唾液試料から抽出したＤ　Ｎ　Ａ　（図６．カラム１〜６）力）もしくはヒト型結核菌で陽の培養を生じる唾液試料から抽出しｔ二ＤＮＡ（図６．カラム７及び８）は、ＰＣＨの場合には、タックポリメラーゼを用い、もしくは池のポリメラーゼ及び第１ノゴマーヌクレオチドＴＢ−１及びＴＢ−２を用（１て増幅される。増幅配列の試料をフィルターに付着させ（ドツト　プロット）、５′位末端に１Ｐの標識を付し１こオリゴマーヌクレオチドＴＢ−４、ＴＢ−５及びＴＢ−６とハイブリッドを形成させる。

ヒト型結核菌のＤＮＡ：よ、ＴＢ−４とハイブリッドを形成するのがみられる。

上記から明らかなように、実施例、具体例、使用法をここにさらに詳しく記載しにが、本発明はこれらの実施例、使用法に限定されない。

一方、この発明は、その思想または範囲から逸脱することなく、当該分野の専門家によるあらゆる変法を包含する。

図　１７日−６・ □ 圓４１　２　３　　今　　ミ　　　６　７圓６国際調査報告一一一一一一〜−ｍｋ　　ＩＸ’Ｔ／ｒＤ　　ＱＩＩ／ｆｆ１Ｍ’＋ｆｆ１ｊ− ｍ−−６−−−−１ｔ＆　　ＰＣＴ／ＦＲ９０１００２７４国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．マイコバクテリア、ノカルジアとロドコッカスからなる群より選ばれた放線菌目の共通の遺伝子の類似配列からなり、その配列内には保存領域と変形領域があり、かつその配列が２５０〜５００の間の塩基対からなることを特徴とする放線菌目方ら誘導されたヌクレオチド配列。２．６５−ｋＤマイコバクテリア抗原をコードする遺伝子を有する少なくとも８０％の相同性を存することを特徴とする請求の範囲１項記載の配列。３．マイコバクテリアの少なくとも８種、すなわちヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ），パラ結核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＢＣＧ、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・マルモエンス（Ｍ．ｍａｉｍｏｅｎｓｅ）とマイコバクテリウム・マリナム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）における３８３塩基対同族体からなることを特徴とする請求の範囲２項記載の配列。４．次式（Ｉ）【配列があります】（Ｉ）（上記式中、Ｘ１は存在しないか又はＡＳＰ−ＰＲＯ配列を示す、Ｘ２はＬＹＳ又はＧＬＵ，Ｘ３はＧＬＹ又はＡＬＡ，Ｘ４はＧＬＹ又はＡＲＧ，Ｘ５はＡＬＡ又はＶＡＬ，Ｘ６はＡＬＡ又はＡＲＧ，Ｘ７はＡＲＧ又はＬＹＳ，Ｘ８はＰＲＯ又はＬＥＵ，Ｘ９はＧＬＹ又はＳＥＲ，Ｘ１０はＬＥＵ又はＰＨＥ，Ｘ１１はＡＲＧ又はＣＹＳ，Ｘ１２はＬＹＳ又はＡＬＡ，Ｘ１３はＧＬＵ又はＡＬＡ，Ｘ１４はＴＨＲ又はＬＹＳ，Ｘ１５はＬＹＳ又はＡＳＰ，Ｘ１６はＳＥＲ，ＧＬＹ，ＰＲＯ又はＴＨＲ，Ｘ１７はＡＳＰ又はＧＬＵ，Ｘ１８はＡＬＡ，ＧＬＹ又はＶＡＬ，Ｘ１９はＡＬＡ又はＶＡＬ，Ｘ２０はＧＬＮ又はＡＬＡ，Ｘ２１はＡＳＰ又はＧＬＵ，Ｘ２２はＬＥＵ又はＰＲＯ，Ｘ２３はＡＬＡ又はＶＡＬ，Ｘ２４はＧＬＵ又はＡＳＰ，Ｘ２５はＡＬＡ又はＧＬＹ，Ｘ２６はＡＳＮ又はＬＹＳ，Ｘ２７はＶＡＬ又はＳＥＲ，Ｘ２８はＧＬＵ又はＧＬＹをそれぞれ示し，Ｘ２９は存在しないか又はＡＳＮ− ＴＨＲ−ＰＨＥ−ＧＬＹ−ＬＥＵ−ＧＬＮ配列を示す。）のアミノ酸配列を有する表現産物に相当することを特徴とする請求の範囲３項記載による配列。５．３４３の塩基対からなり、かつ次式（ＩＩ）：【配列があります】（ＩＩ）に相当することを特徴とする請求の範囲１〜４項記載の何れか１つによる配列。６．特に次の制限部位：ＡｃｃＩＩ，ＡｈａＩＩ，ＢａｎＩ，ＢａｎＩＩ，ＢｂｖＩ，Ｂｓｐ１２８６，ＢｓｔＸＩ，ＣｆｏＩ，ＤｄｅＩ，ＥｃｏＲＩＩ，ＥｓｐＩ，Ｆｎｕ４ＨＩ，ＨａｅＩＩ，ＨａｅＩＩＩ，ＨａｐＩＩ，ＨｇａＩ，ＨｉｎｆＩ，ＨｐｈＩ，ＭａｅＩＩＩ，ＭｂｏＩＩ，ＭｎｌＩ，ＮａｒＩ，ＮｃｏＩ，ＮｌａＩＩＩ，ＳａｃＩ，ＳａｃＩＩ，Ｓａｕ３Ａ，Ｓａｕ９６Ａ，ＳｃｒＦＩ，ＳｔｙＩ，ＴａｑＩ，ＹｍａＩＩＩ．からなることを特徴とする請求の範囲１〜４項記載の何れか１つによる配列。７．３４３のヌクレオチドからなり、かつ次式（ＩＩＩ）：【配列があります】（ＩＩＩ）に相当し、かつ６５−ｋＤ抗原をコードするマイコバクテリア遺伝子の配列に類似のＭＡＩＰグループに共通のフラグメントに相当することを特徴とする請求の範囲１〜４項の何れか１つに記載の配列。８．特に次の制限部位：ＡｃｃＩＩ，ＡＦＬＩ，ＡｈａＩＩ，ＢａｎＩ，ＢｂｖＩ，Ｂｇ１Ｉ，Ｂｓｐ１２８６，ＢｓｔＥＩＩ，ＢｓｔＸＩ，ＣｆｏＩ，ＥａｅＩ，ＨａｅＩＩ，ＨａｅＩＩＩ，ＨｐｈＩ，ＭａｅＩＩＩ，ＭｎｌＩ，ＮａｒＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩＩ，Ｓａｕ３Ａ，Ｓａｕ９６Ａ，ＴａｑＩ．からなることを特徴とする請求の範囲１〜４項の何れか１つに記載の配列。９．３４３ヌクレオチドからなり、次式（ＩＶ）：【配列があります】（ＩＶ）に相当し、かつ結核桿菌グループの６５−ｋＤ抗体をコードする遺伝子の配列のフラグメントに相当することを特徴とする請求の範囲１〜４項の何れか１つに記載の配列。１０．特に次の制限部位：ＡｃｃＩＩ，ＡｈａＩＩ，ＢａｎＩ，ＢｂｖＩ，ＢｓｔＸＩ，ＣｆｏＩ，ＥａｅＩ，ＨａｅＩＩＩ，ＨｐｈＩ，ＭａｅＩＩＩ，ＭｎｌＩ，ＮａｒＩ，ＮｒｖＩ，ＳａｃＩＩ，Ｓａｕ３Ａ，Ｓａｕ９６Ａ，ＴａｑＩ．からなることを特徴とする請求の範囲１〜４項の何れか１つに記載の配列。１１．３４３ヌクレオチドからなり、次式（Ｖ）：【配列があります】に相当し、かつ６５−ｋＤ抗原をコードするマイコバクテリアの遺伝子の配列に類似のマイコバクテリウム・カンサシイのフラグメントに相当することを特徴とする請求の範囲１〜４項の何れか１つに記載の配列。１２．特に次の制限部位：ＡｃｃＩＩ，ＡｈａＩＩ，ＡｌｕＩ，ＡｏｓＩ，ＢａｎＩ，ＢａｎＩＩ，Ｂｓｐ１２８６，ＢｓｔＥＩＩ，ＣｆｏＩ，ＥａｅＩ　ＨａｐＩＩ，ＨｇａＩ，ＨｐｈＩ，ＭｂｏＩＩ，ＭｎｌＩ，ＮａｒＩ，ＮｌａＩＩＩ，ＲｓａＩ，Ｓａｕ３Ａ，Ｓａｕ９６Ａ，ＳｆａＮＩ，ＳｔｙＩ，ＴａｑＩ，ＴｔｈＩＩＩＩ．からなることを特徴とする請求の範囲１１項記載による配列。１３．３４３ヌクレオチドからなり、次式（ＶＩ）：【配列があります】に相当し、６５−ｋＤ抗原をコードするマイコバクテリアの遺伝子の配列に類似のマイコバクテリウム・マルモエンスのフラグメントに相当することを特徴とする請求の範囲１〜４項の何れか１つによる配列。１４．特に次の制限部位：ＡｃｃＩＩ，ＡｈａＩＩ，ＡｌｕＩ，ＡｏｓＩ，ＢａｎＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＥｓｐＩ，Ｆｎｕ４ＨＩ，ＨａｅＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＨｐｈＩ，ＭｂｏＩＩ，ＭｎｌＩ，ＮａｒＩ，Ｓａｕ３Ａ，ＳｔｙＩ，ＴａｑＩ．からなることを特徴とする請求の範囲１３項記載による配列。１５．３４３ヌクレオチドからなり、次式（ＶＩＩ）：【配列があります】に相当し、かつ６５−ＫＤ抗原をコードするマイコバクテリアの遺伝子の配列に類似のマイコバクテリウム・マリナムのフラグメントに相当することを特徴とする請求の範囲１〜４項記載の何れか１つによる配列。１６．特に次の制限部位：ＡａｔＩ，ＡｏｓＩ，ＡｈａＩＩ，ＡｌｕＩ，ＢｂｖＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＣｆｏＩ，ＥａｅＩ，Ｆｎｕ４ＨＩ，ＨａｅＩＩ，ＨａｐＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＭｂｏＩＩ，ＭｎｌＩ，ＮａｒＩ，ＰｖｕＩ，Ｓａｕ３Ａ，ＳｔｙＩ，ＴａｑＩ，ＴｔｈＩＩＩＩ．からなることを特徴とする請求の範囲１５記載による配列。１７．３４３ヌクレオチドからなり、次式（ＶＩＩ）：【配列があります】に相当し、かつ６５−ｋＤ抗原をコードするマイコバクテリアの遺伝子の配列に類似するノカルジア・アステロイテスのフラグメントに相当することを特徴とする請求の範囲１〜４項の何れか１つに記載の配列。１８．特に次の制限部位：ＡｃｃＩＩ，ＡｈａＩＩ，ＡｌｕＩ，ＡｏｓＩ，ＢａｎＩ，Ｂｓｐ１２８６，ＣｆｏＩ，ＥａｅＩ，Ｆｎｕ４ＨＩ，ＨａｅＩＩＩ，ＨｇａＩ，ＨｐｈＩ，ＭｂｏＩＩ，ＭｎｌＩ，ＮｌａＩＩＩ，ＳａｃＩＩ，Ｓａｕ３Ａ，Ｓａｕ９６Ａ，ＳｆａＮＩ，ＳｔｙＩ，ＴａｑＩ，ＴｔｈＩＩＩＩ．１９．請求項１〜１８の何れか１つによるヌクレオチド配列のフラグメントからなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。２０．次式（ＩＸ）：【配列があります】（ＩＸ）の配列を有し、ＴＢ−１で表示される請求の範囲１９項記載によるオリゴヌクレオチド。２１．次式（Ｘ）：【配列があります】（Ｘ）の配列を有し、ＴＢ−２で表示される請求の範囲１９項記載によるオリゴヌクレオチド。２２．次式（ＸＩ）：【配列があります】（ＸＩ）の配列を有し、ＴＢ−３で表示される請求の範囲１９項記載によるオリゴヌクレオチド。２３．次式（ＸＩＩ）：【配列があります】（ＸＩＩ）の配列を有し、ＴＢ−４で表示される請求の範囲１９項記載によるオリゴヌクレオチド。２４．次式（ＸＩＩＩ）：【配列があります】（ＸＩＩＩ）の配列を有し、ＴＢ−５で表示される請求の範囲１９項記載によるオリゴヌクレオチド。２５．シングルＢｇｌＩ制限部位からなることを特徴とする請求の範囲２４項によるオリゴヌクレオチド。２６．次式（ＸＩＶ）：【配列があります】（ＸＩＶ）の配列を有し、ＴＢ−６で表示される請求の範囲１９項によるオリゴヌクレオチド。２７．次式（ＸＶ）：【配列があります】（ＸＶ）の配列を有し、ＴＢ−７で表示される請求の範囲１９項によるオリゴヌクレオチド。２８．次式（ＸＶＩ）：【配列があります】（ＸＶＩ）の配列を有し、ＴＢ−８で表示される請求の範囲１９項によるオリゴヌクレオチド。２９．次式（ＸＶＩＩ）：【配列があります】（ＸＶＩＩ）の配列を有し、ＴＢ−９で表示される請求の範囲１９項によるオリゴヌクレオチド。３０．シングルＢｇｌＩ制限部位からなることを特徴とする請求の範囲２９項によるオリゴヌクレオチド。３１．次式（ＸＶＩＩ）：【配列があります】（ＸＶＩＩ）の配列を有し、ＴＢ−１０で表示される請求の範囲１９項によるオリゴヌクレオチド。３２．次式（ＸＩＸ）：【配列があります】（ＸＩＸ）の配列を有し、ＴＢ−１１で表示される請求の範囲１９項によるオリゴヌクレオチド。３３．次式（ＸＸ）：【配列があります】（ＸＸ）の配列を有し、ＴＢ−１２で表示される請求の範囲１９項によるオリゴヌクレオチド。３４．合成的に得られることを特徴とする請求の範囲１９〜３０３項の何れか１つによるオリゴヌクレオチド。３５．各プライマーが請求の範囲１〜３４項の何れか１つによるヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列のフラグメントからなることを特徴とする放線菌目のＤＮＡ又はＲＮＡの合成用プライマー対。３６．請求の範囲２０項による式（ＩＸ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−１）と請求項２１による式（Ｘ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−２）の対からなることを特徴とする請求の範囲３５項によるプライマー対。３７．請求の範囲２７項による式（ＸＶ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−７）と請求項２８による式（ＸＶＩ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−８）との対からなることを特徴とする請求の範囲３５項によるプライマー対。３８．請求の範囲１〜３４項の何れか１つによるヌクレオチド配列又はそのフラグメントからなり、これらが放射性同位元素、適切な酵素、蛍光色素、抗体又は塩基同族体のような標識を用いて適宜標識化されていることを特徴とするヌクレオチドプローブ。３９．請求の範囲２２項による式（ＸＩ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−３）、請求の範囲２３項による式（ＸＩＩ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−４）、請求の範囲２４又は２５項による式（ＸＩＩＩ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−５）、請求の範囲２６項による式（ＸＩＶ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−６）、請求の範囲２９又は３０項による式（ＸＶＩＩ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−９）、請求の範囲３１項による式（ＸＶＩＩＩ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−１０）、請求の範囲３２項による式（ＸＸＩ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−１１）及び請求の範囲３３項による式（ＸＸ）のオリゴヌクレオチド（ＴＢ−１２）からなる群より選ばれることを特徴とする請求の範囲３８項によるプローブ。４０．請求の範囲５又は６項による式（ＩＩ）の３４３ヌクレオチドの配列でコードされかつ次式（ＸＸＩ）：【配列があります】（ＸＸＩ）に相当することを特徴とするペプチド及び／又はペプチドフラグメント。４１．請求の範囲７又は８項の式（ＩＩＩ）の３４３ヌクレオチドの配列でコード化され、かつ次式（ＸＸＩＩ）：【配列があります】（ＸＸＩＩ）に相当することを特徴とするペプチド及び／又はペプチドフラグメント。４２．請求の範囲１１項の式（Ｖ）の３４３ヌクレオチドの配列でコード化され、かつ次式（ＸＸＩＩＩ）：【配列があります】（ＸＸＩＩＩ）に相当することを特徴とするペプチド及び／又はペプチドフラグメント。４３．請求の範囲１３項の式（ＶＩ）の３４３ヌクレオチドの配列でコード化され、かつ次式（ＸＸＩＶ）：【配列があります】（ＸＸＩＶ）に相当することを特徴とするペプチド及び／又はペプチドフラグメント。４４．請求の範囲１５項の式（ＶＩＩ）の３４３ヌクレオチドの配列でコード化され、かつ次式（ＸＸＶ）：【配列があります】（ＸＸＶ）に相当することを特徴とするペプチド及び／又はペプチドフラグメント。４５．請求の範囲１７項の式（ＶＩＩＩ）の３４３ヌクレオチドの配列でコード化さわ、かつ次式（ＸＸＶＩ）：【配列があります】（ＸＸＶＩ）に相当することを特徴とするペプチド及び／又はペプチドフラグメント。４６．請求の範囲４０〜４５項の何れか１つによる少なくとも１つのペプチド及び／又はペプチドフラグメトと任意に少なくとも１つの医薬的に受容な賦形剤とからなることを特徴とする免疫性を有する組成物。４７．適当な動物を請求の範囲４０〜４５項の何れか１つによるペプチド又はペプチドフラグメントで免疫化して得られることを特徴とするポリクロナール又はモノクロナール抗体。４８．生体サンプルを（１）請求の範囲３５〜３７項のいずれか１つによる一対のプライマーと接触させ、そのＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１つのフラグメントを増幅させ、（２）その後、増幅されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列を請求の範囲３８又は３９項による少なくとも１つのヌクレオチドプローブで検出することを特徴とする、適当に抽出処理された生体サンプル中に存在しうるマイコバクテリア、ノカルディアとロドコッカスからなる群から選ばれた放線菌目の少量について増幅とハイブリダイゼーションによって、放線菌目のＤＮＡ及び／又は転写産物を検出し迅速に同定する方法。４９．更に、（３）工程（２）中で適当な制限酵素を用いてハイブリッド化されたプローブを分解し、かつ（４）得られたプローブフラグメントを検出することからなることを特徴とする請求の範囲４８項による方法。５０．制限酵素がＢａｎＩとＢｇｌＩの群から選ばれることを特徴とする請求の範囲４９項による方法。５１．増幅したＤＮＡ又はＲＮＡ配列の検出を２つの適当なヌクレオチドプローブを用いて行ない、その方法は更に（３）２つのハイブリッド化プローブを酵素的に結合させ、かつ（４）２つの結合したプローブを含有するフラグメントを検出することからなることを特徴とする請求の範囲４８項による方法。５２．生体サンプルからの遠心分離ペレットを適当溶菌溶液中に懸濁し、次いで約９５℃で適当な時間培養し、培養自体は媒体に緩衝溶液の添加を伴い、その後ＤＮＡが適当な抽出手段で抽出される、検出・同定工程前の工程中生体サンプルからＤＮＡが単離されることを特徴とする請求項４８〜５１の何れか１つによる方法。５３．使用される溶菌溶液が０．１ＮＮａＯＨ，２Ｍ　ＮａＣｌ及び０．５％ＳＤＳからなる溶液であることを特徴とする請求の範囲５２項による方法。５４．培養が約９５℃の温度で約１５分間行われることを特徴とする請求の範囲５２又は５３項による方法。５５．検出を行なうための適当量の適当な緩衝液と試薬とは別に、請求の範囲３５〜３７項の何れか１つによる適当量の一対のプライマーと請求の範囲３８又は３９項による適当量の少なくとも１つのヌクレオチドプローブ又はプローブフラグメントからなることを特徴とする請求の範囲４８〜５１項の何れか１つによる検出法を行なうための簡易キット、アウトフィット又は調整セット。