JPH0353877A - 異種蛋白発現用融合酵母菌、該菌の製造方法および異種蛋白の製造方法 - Google Patents
異種蛋白発現用融合酵母菌、該菌の製造方法および異種蛋白の製造方法Info
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- JPH0353877A JPH0353877A JP1188173A JP18817389A JPH0353877A JP H0353877 A JPH0353877 A JP H0353877A JP 1188173 A JP1188173 A JP 1188173A JP 18817389 A JP18817389 A JP 18817389A JP H0353877 A JPH0353877 A JP H0353877A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、単一の異種蛋白質または２種以」二の相異な
る異種蛋白質を大量に産生し得る酵母菌、当該酵母菌の
製造方法および上記酵母菌を使用することによる異種蛋
白質の製造方法に関する。
る異種蛋白質を大量に産生し得る酵母菌、当該酵母菌の
製造方法および上記酵母菌を使用することによる異種蛋
白質の製造方法に関する。
組換ＤＮＡ技術の出現によって多種多様の有用なポリベ
プチドの微生物による生産が可能となった。多くの噛乳
動物ポリペプチド類、例えばヒト戒長ホルモン、インタ
ーフェロンが既に種々の微生物により生産されている。
プチドの微生物による生産が可能となった。多くの噛乳
動物ポリペプチド類、例えばヒト戒長ホルモン、インタ
ーフェロンが既に種々の微生物により生産されている。
この技術によって種々の有用なポリペプチドの微生物に
よる生産が可能となり、種々のワクチン、ホルモン、酵
素、抗体等の蛋白質を微生物に生産さセることかできる
ようになった。
よる生産が可能となり、種々のワクチン、ホルモン、酵
素、抗体等の蛋白質を微生物に生産さセることかできる
ようになった。
しかしながら、微生物、特に大腸菌由来の蛋白質標品に
は夾雑エンドトキシンがしばしば見出される。これは目
的とする蛋白質製品から除去しなければならない。
は夾雑エンドトキシンがしばしば見出される。これは目
的とする蛋白質製品から除去しなければならない。
細胞により分泌される蛋白質の安価で且つ有利な製造の
前提条件となる大きな規模において噛乳動物細胞を増殖
せしめることは困難であることが証明されている。呻乳
動物細胞の世代時間は微生物のそれに比べて相当長く、
従って、十分に高い細胞濃度を得るために長時間の培養
が要求される。
前提条件となる大きな規模において噛乳動物細胞を増殖
せしめることは困難であることが証明されている。呻乳
動物細胞の世代時間は微生物のそれに比べて相当長く、
従って、十分に高い細胞濃度を得るために長時間の培養
が要求される。
また、噛乳動物細胞の培養によって得られる細胞濃度は
、微生物の大規模生産において一般に到達する細胞濃度
に比べて相当に低い。その上、細胞株の改良を行うこと
が微生物に比較して困難である。
、微生物の大規模生産において一般に到達する細胞濃度
に比べて相当に低い。その上、細胞株の改良を行うこと
が微生物に比較して困難である。
すべての真核生物は遺伝情報を発現する機構を有するか
ら、真核生物遺伝子の発現は、大腸菌等原核生物におい
てよりも真核生物宿主において一層効率的に行われるで
あろう。使用に適ずる０｛ム生物の内、酵母菌が最も取
扱いやすい。
ら、真核生物遺伝子の発現は、大腸菌等原核生物におい
てよりも真核生物宿主において一層効率的に行われるで
あろう。使用に適ずる０｛ム生物の内、酵母菌が最も取
扱いやすい。
酵母菌は微生物であるから、これを培養するのは容易で
ある。培養液の容積当りから得られる細胞量は、大腸菌
に比べて酵母の方が相当に高い。
ある。培養液の容積当りから得られる細胞量は、大腸菌
に比べて酵母の方が相当に高い。
さらに、酵母菌の発酵的挙動はよく理解されており、そ
して大規模発酵のための条件はすでに確立されている。
して大規模発酵のための条件はすでに確立されている。
その上、酵母細胞はエンドトキシンを含有しない。
従って、工業微生物学の十分に開発された技法と最近開
発された組換ＤＮＡ技法とを用いて酵母菌により異種蛋
白を製造することが有利なことが明らかである。
発された組換ＤＮＡ技法とを用いて酵母菌により異種蛋
白を製造することが有利なことが明らかである。
一方、酵母菌の育種方法としては、胞子による交配が知
られており、胞子を形或するサッカロξセス・セレビシ
エとその近縁株の間で交配が行われていた。
られており、胞子を形或するサッカロξセス・セレビシ
エとその近縁株の間で交配が行われていた。
近年交配によらない酵母菌の育種方法としてプロトプラ
スト融合が注目されており、胞子を作らない酵母菌の育
種や、異なる種属の間の酵母菌の育種などが試みられる
ようになっている。
スト融合が注目されており、胞子を作らない酵母菌の育
種や、異なる種属の間の酵母菌の育種などが試みられる
ようになっている。
酵母菌のプロトプラストによる細胞融合の研究が最初に
報告されたのは１９７７年になってからであり、その後
、種々の種属について同種属間および異種属間の融合の
研究が盛んに行われるようになった。細胞融合では性や
種の障害をこえて細胞の融合が起こりうる。また単に細
胞（プロトプラスト）間の融合だけではなく、ξトコン
ドリアのようなオルガネラとの融合も可能である。
報告されたのは１９７７年になってからであり、その後
、種々の種属について同種属間および異種属間の融合の
研究が盛んに行われるようになった。細胞融合では性や
種の障害をこえて細胞の融合が起こりうる。また単に細
胞（プロトプラスト）間の融合だけではなく、ξトコン
ドリアのようなオルガネラとの融合も可能である。
本発明の他の目的は、遺伝子組換え技法により形質転換
された酵母菌同志を融合させた新規融合酵母菌を提｛Ｊ
ｊすることである。
された酵母菌同志を融合させた新規融合酵母菌を提｛Ｊ
ｊすることである。
本発明の他の目的は、当該新規融合酵母菌の製造方法を
提供することである。
提供することである。
本発明のさらに他の目的は、１種または２種以上の異種
蛋白質を効率的に産生ずる方法を提供することである。
蛋白質を効率的に産生ずる方法を提供することである。
従来、遺伝子組換え技法により形質転換された有用蛋白
質を産生ずる酵母菌同志を融合するという試みは知られ
ていない。
質を産生ずる酵母菌同志を融合するという試みは知られ
ていない。
特に、有用蛋白質を産生させるべく形質転換された酵母
菌が、有用蛋白をコードする異種遺伝子を宿主酵母の染
色体上に組み入れたものである酵母菌の時、それらを融
合するという試みは知られていない。
菌が、有用蛋白をコードする異種遺伝子を宿主酵母の染
色体上に組み入れたものである酵母菌の時、それらを融
合するという試みは知られていない。
さらに当該融合された酵母菌を使用して、異種蛋白の発
現量を増大させたり、複数の異種蛋白を同一細胞から得
たりすることも知られていない。
現量を増大させたり、複数の異種蛋白を同一細胞から得
たりすることも知られていない。
即ち、本発明は次の要旨を有するものである：（１）染
色体に異種蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み込まれた
異種蛋白産生能を有する第１の酵母菌と、染色体に異種
蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み込まれた異種蛋白産
生能を有する第２の酵母菌とを融合させてなる、両親酵
母菌の異種蛋白産生能を合せ持つ融合酵母菌。
色体に異種蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み込まれた
異種蛋白産生能を有する第１の酵母菌と、染色体に異種
蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み込まれた異種蛋白産
生能を有する第２の酵母菌とを融合させてなる、両親酵
母菌の異種蛋白産生能を合せ持つ融合酵母菌。
（２）染色体に異種蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み
込まれた異種蛋白産生能を有する第１の酵母菌と、染色
体に異種蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み込まれた異
種蛋白産生能を有する第２の酵母菌とを融合させること
を特徴とする両親酵母菌の異種蛋白産生能を合せ持つ融
合酵母菌の製造方法。
込まれた異種蛋白産生能を有する第１の酵母菌と、染色
体に異種蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み込まれた異
種蛋白産生能を有する第２の酵母菌とを融合させること
を特徴とする両親酵母菌の異種蛋白産生能を合せ持つ融
合酵母菌の製造方法。
（３）前記（１）に記載の融合酵母菌を培養して異種蛋
白質を生成させ、これを採取することを特徴とする異種
蛋白質の製造方法。
白質を生成させ、これを採取することを特徴とする異種
蛋白質の製造方法。
以下に本発明を具体的に説明する。
本発明に関して、酵母菌を製造するために使用されるプ
ラスミドは、宿主酵母菌染色体中に存在する遺伝子の一
部のＤＮＡ配列（例えば、ＬＥＵ２ 、 ＨＩＳ４ 、
ＴＲＰＩ 、 ＵＲＡ３ 、 ｒｉｂｏｓｏｍｅＤ
ＮＡ遺伝子等）を含有する。相同な配列により、全プラ
スξドまたはその線状断片は組換により宿主酵母菌染色
体に安定に導入することができる。即ち、増殖中、子孫
細胞は選択圧が存在しない場合でも導入された遺伝物質
を安定に保持する。
ラスミドは、宿主酵母菌染色体中に存在する遺伝子の一
部のＤＮＡ配列（例えば、ＬＥＵ２ 、 ＨＩＳ４ 、
ＴＲＰＩ 、 ＵＲＡ３ 、 ｒｉｂｏｓｏｍｅＤ
ＮＡ遺伝子等）を含有する。相同な配列により、全プラ
スξドまたはその線状断片は組換により宿主酵母菌染色
体に安定に導入することができる。即ち、増殖中、子孫
細胞は選択圧が存在しない場合でも導入された遺伝物質
を安定に保持する。
例えば、酵母菌染色体遺伝子中の天然に存在する配列お
よび異種遺伝子を含むプラスミドは、前記染色体遺伝子
の座に安定に組み込まれ得る。
よび異種遺伝子を含むプラスミドは、前記染色体遺伝子
の座に安定に組み込まれ得る。
宿主酵母菌染色体配列に相同な配列としては、特にアミ
ノ酸または核酸合或系遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍｅＤＮＡ
，Ｔ３’因子等が使用できる。特に、アごノ酸または核
酸合威系遺伝子は、宿主酵母菌がア旦ノ酸または核酸栄
養要求性株である時、すなわち、該アミノ酸または核酸
合戒系遺伝子が欠損している株においては、宿主の変異
を補完する遺伝子であるので、形質転換体の選択マーカ
ーとして使用することができる。この際、宿主酵母菌の
栄養要求性に原栄養性をもたらす。アくノ酸または核酸
合威系遺伝子としては、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ４、Ｔ
ＲＰＩまたはＵＲＡ３が挙げられる。
ノ酸または核酸合或系遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍｅＤＮＡ
，Ｔ３’因子等が使用できる。特に、アごノ酸または核
酸合威系遺伝子は、宿主酵母菌がア旦ノ酸または核酸栄
養要求性株である時、すなわち、該アミノ酸または核酸
合戒系遺伝子が欠損している株においては、宿主の変異
を補完する遺伝子であるので、形質転換体の選択マーカ
ーとして使用することができる。この際、宿主酵母菌の
栄養要求性に原栄養性をもたらす。アくノ酸または核酸
合威系遺伝子としては、例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ４、Ｔ
ＲＰＩまたはＵＲＡ３が挙げられる。
酵母菌用の選択遺伝子マーカーとしては、上記のように
、宿主酵母菌が栄養要求性株である時、ア旦ノ酸または
核酸合威系遺伝子のようなものが使用できるほか、宿主
酵母菌が抗生物質感受性株である時は、該抗生物質耐性
を発現する遺伝子が使用できる。例えばシクロヘキシド
、Ｇ４１８、クロラムフエニコール、プレオマイシンま
たはハイグロマイシン等の抗生物質に対して耐性を付与
する遺伝子があげられる。
、宿主酵母菌が栄養要求性株である時、ア旦ノ酸または
核酸合威系遺伝子のようなものが使用できるほか、宿主
酵母菌が抗生物質感受性株である時は、該抗生物質耐性
を発現する遺伝子が使用できる。例えばシクロヘキシド
、Ｇ４１８、クロラムフエニコール、プレオマイシンま
たはハイグロマイシン等の抗生物質に対して耐性を付与
する遺伝子があげられる。
本発明に関して、異種蛋白質には特に制限はなく、好ま
しくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＢｓＡｇ，イ
ンターフェロン−α，βあるいはＴ、ウロキナーゼ、或
長ホルモン、インシュリン、各種リンホカインなどが挙
げられる。
しくはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＨＢｓＡｇ，イ
ンターフェロン−α，βあるいはＴ、ウロキナーゼ、或
長ホルモン、インシュリン、各種リンホカインなどが挙
げられる。
このような異種蛋白質遺伝子は、特開昭６２２９９８５
号公報（ヒト血清アルブミン）、特開昭６３−５２８８
３号公報（ＨＢｓＡｇ）、特開昭６１−１８５１８９号
公報（インターフェロンα）、特開昭６１−１０８３９
７号公報（インターフェロンーγ）、特開昭６０−１８
０５９１号公報（ウロキナーゼ）等に記載されている。
号公報（ヒト血清アルブミン）、特開昭６３−５２８８
３号公報（ＨＢｓＡｇ）、特開昭６１−１８５１８９号
公報（インターフェロンα）、特開昭６１−１０８３９
７号公報（インターフェロンーγ）、特開昭６０−１８
０５９１号公報（ウロキナーゼ）等に記載されている。
上述の各文献中では、異種蛋白質遺伝子を含むプラス旦
ドとして開示されている。
ドとして開示されている。
プロモーターは酵母菌、好適にはサツ力ロマイセス３セ
レビシエ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡに由来する。好ましくは、
高発現酵母菌遺伝子のプロモーターを異種蛋白質の発現
のために使用する。即ち、ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩも
しくはＡＤＨｎ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０３
もしくはＰ Ｈ ０ ５ ）遺伝子、またはイソチトク
ロームＣ遺伝子のプロモーター、ガラクトース代謝系の
プロモーター（ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯもしくはＧＡＬ７
）、インへルターゼのプロモーター（ＳＵＣ２）あるい
は解糖系酵素をコードする遺伝子のプロモーター、例え
ばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェ−１
・デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ） 、３−ボスボグリ
セレートキナーゼ（ＰＧＫ） 、ヘキソキナーゼ、ピル
ヘートデカルポキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、
グルコース−６−ホスフエートイソメラーゼ、３−ホス
ホグリセレートムターゼ、ビルヘートキナーゼ、トリオ
ースホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼおよびグルコキナーゼの遺伝子のプロモーター
、あるいはａファクターまたはα−ファクターをコード
する酵母接合フエ口モン遺伝子のプロモーターを使用す
ることができる。
レビシエ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）のゲノムＤＮＡに由来する。好ましくは、
高発現酵母菌遺伝子のプロモーターを異種蛋白質の発現
のために使用する。即ち、ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤＨＩも
しくはＡＤＨｎ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０３
もしくはＰ Ｈ ０ ５ ）遺伝子、またはイソチトク
ロームＣ遺伝子のプロモーター、ガラクトース代謝系の
プロモーター（ＧＡＬＩ、ＧＡＬＩＯもしくはＧＡＬ７
）、インへルターゼのプロモーター（ＳＵＣ２）あるい
は解糖系酵素をコードする遺伝子のプロモーター、例え
ばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェ−１
・デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ） 、３−ボスボグリ
セレートキナーゼ（ＰＧＫ） 、ヘキソキナーゼ、ピル
ヘートデカルポキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、
グルコース−６−ホスフエートイソメラーゼ、３−ホス
ホグリセレートムターゼ、ビルヘートキナーゼ、トリオ
ースホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼおよびグルコキナーゼの遺伝子のプロモーター
、あるいはａファクターまたはα−ファクターをコード
する酵母接合フエ口モン遺伝子のプロモーターを使用す
ることができる。
また、プラスミドは、宿主酵母菌内で自律的に複製でき
ない。すなわち、宿主酵母菌内での自律複製開始領域、
例えば２μｍ ＤＮＡの複製開始領域やＡＲＳ領域（
Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ）を実質的に含まない。
ない。すなわち、宿主酵母菌内での自律複製開始領域、
例えば２μｍ ＤＮＡの複製開始領域やＡＲＳ領域（
Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ）を実質的に含まない。
好ましい態様においては、プラスミド中にシグナル配列
を導入することもできる。シグナル配列は、酵母インへ
ルクーゼ（特開昭６０−４１４８８号公報）、α−ファ
クター遺伝子（特開昭５９１３２８９２号公報）のよう
な酵母菌由来のシ１ｌ グナル配列を使用することができる。また、酵母菌での
分泌発現のために特に合威されたシグナル配列（特願昭
６２−３０６６７４号公報または牛，？願昭６３−３３
６５７号公報）を用いることもできる。
を導入することもできる。シグナル配列は、酵母インへ
ルクーゼ（特開昭６０−４１４８８号公報）、α−ファ
クター遺伝子（特開昭５９１３２８９２号公報）のよう
な酵母菌由来のシ１ｌ グナル配列を使用することができる。また、酵母菌での
分泌発現のために特に合威されたシグナル配列（特願昭
６２−３０６６７４号公報または牛，？願昭６３−３３
６５７号公報）を用いることもできる。
このシグナル配列の導入により、異種遺伝子の発現の後
、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラズム空
間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中への分
泌を達威することができる。
、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラズム空
間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中への分
泌を達威することができる。
これにより収量の相当な増加が可能となる。さらに、細
胞を破壊する必要がないので回収工程を単純化すること
が可能である。
胞を破壊する必要がないので回収工程を単純化すること
が可能である。
また、プラスξドは転写停止のための適当なターごネー
ター、例えばＰ Ｈ ０ ５もしくはＧＡＰＤＨターξ
ネーターを含有する。
ター、例えばＰ Ｈ ０ ５もしくはＧＡＰＤＨターξ
ネーターを含有する。
このプラスごドはプロモーター、異種蛋白コード領域お
よび宿主酵母菌染色体相同領域とは別に、細菌宿主、特
に大腸菌のための複製開始点および遺伝的選択マーカー
を含有することもできる。大腸菌複製開始点および大腸
菌のための選択マーカ１２ 一を酵母ハイブリドヘククー中に使用することに関して
有用な特徴が存在する。まず、大腸菌における増殖およ
び複製により大量のハイブリドヘクターＤＮＡを得るこ
とができ、そして第２に、大腸菌ニ基礎を置くクローニ
ング技法のすべてを用いてハイブリドヘクターの構築を
容易に行うことができる。大腸菌プラスミド、例えばｐ
ＢＲ３２２等は大腸菌複製開始点、および抗生物質、例
えばテトラサイタリンおよびアンビシリンに対する耐性
をもたらす大腸菌遺伝マーカーを含有し、そして酵母ハ
イブリドヘクターの部分として有利に使用される。
よび宿主酵母菌染色体相同領域とは別に、細菌宿主、特
に大腸菌のための複製開始点および遺伝的選択マーカー
を含有することもできる。大腸菌複製開始点および大腸
菌のための選択マーカ１２ 一を酵母ハイブリドヘククー中に使用することに関して
有用な特徴が存在する。まず、大腸菌における増殖およ
び複製により大量のハイブリドヘクターＤＮＡを得るこ
とができ、そして第２に、大腸菌ニ基礎を置くクローニ
ング技法のすべてを用いてハイブリドヘクターの構築を
容易に行うことができる。大腸菌プラスミド、例えばｐ
ＢＲ３２２等は大腸菌複製開始点、および抗生物質、例
えばテトラサイタリンおよびアンビシリンに対する耐性
をもたらす大腸菌遺伝マーカーを含有し、そして酵母ハ
イブリドヘクターの部分として有利に使用される。
従って、本プラスミドは、プロモーター、該プロモータ
ーに制御される異種蛋白コード領域、それに続く転写停
止のためのターミネーターを含み、かつ宿主酵母菌染色
体配列に相同な配列を含むものである。また、本プラス
ミドは、所望により、分泌生産のためのシグナル配列、
酵母菌用の選択遺伝子マーカー、大腸菌の複製開始領域
、大腸菌用選択遺伝子マーカーを含有することができる
。
ーに制御される異種蛋白コード領域、それに続く転写停
止のためのターミネーターを含み、かつ宿主酵母菌染色
体配列に相同な配列を含むものである。また、本プラス
ミドは、所望により、分泌生産のためのシグナル配列、
酵母菌用の選択遺伝子マーカー、大腸菌の複製開始領域
、大腸菌用選択遺伝子マーカーを含有することができる
。
そして、酵母菌の複製開始領域は実質的に含まないもの
である。
である。
本発明において、宿主としては酵母菌、特にサツ力口マ
イセス属もしくはピキア属に属するものが使用される。
イセス属もしくはピキア属に属するものが使用される。
好ましくは、栄養要求性株や、抗生物質感受性株が使用
できる。
できる。
この組換えプラスξドを用いて形質転換体を作製する方
法は以下の通りである。
法は以下の通りである。
組換えプラスミドを宿主酵母菌細胞の染色体上に導入す
る。具体的には、挿入するプラスミドの有する、宿主酵
母菌細胞の染色体に相同な配列中の任意の部位を制限酵
素処理により切断し、直線化したプラスξドを宿主に導
入することが望ましい。直線化されたプラスミドは、宿
主酵母菌細胞染色体上のプラスξドに組み込まれた領域
と相同な領域に組み込まれる。直線化されたプラスミド
は環状プラスξドより、宿主染色体上に組み込まれる頻
度が上昇する。この時使用する宿主酵母菌は、挿入され
るプラスミドが担持する酵母菌用選択マーカー遺伝子に
よって相補する変異を持った変異株、例えばロイシンお
よびヒスチジン要求性変異株でかつ０４１８感受性株で
あるサ・冫カロマイセス９セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２株（ａ
， ｈｉｓ ４， Ｉｅｕ ２＋ ｃａｎ １）等が好
適に用いられる。
る。具体的には、挿入するプラスミドの有する、宿主酵
母菌細胞の染色体に相同な配列中の任意の部位を制限酵
素処理により切断し、直線化したプラスξドを宿主に導
入することが望ましい。直線化されたプラスミドは、宿
主酵母菌細胞染色体上のプラスξドに組み込まれた領域
と相同な領域に組み込まれる。直線化されたプラスミド
は環状プラスξドより、宿主染色体上に組み込まれる頻
度が上昇する。この時使用する宿主酵母菌は、挿入され
るプラスミドが担持する酵母菌用選択マーカー遺伝子に
よって相補する変異を持った変異株、例えばロイシンお
よびヒスチジン要求性変異株でかつ０４１８感受性株で
あるサ・冫カロマイセス９セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２株（ａ
， ｈｉｓ ４， Ｉｅｕ ２＋ ｃａｎ １）等が好
適に用いられる。
宿主酵母菌細胞の形質転換は公知の方法、例えばプロト
プラストポリエチレングリコール法、エレクトロボレー
ション法などにより行う。
プラストポリエチレングリコール法、エレクトロボレー
ション法などにより行う。
次に期待した部位へブラスミドが導入されているか否か
、および導入した遺伝子が安定であるか否かを調べる。
、および導入した遺伝子が安定であるか否かを調べる。
具体的には、サザンブロツテイング法により、形質転換
に利用した宿主酵母菌細胞の染色体配列に相同な配列を
プローブとして、期待通りの部位へブラスミドが導入さ
れていることを確認する。また異種蛋白質をコードする
遺伝子の安定性を、異種蛋白質産生量および栄養要求性
の回復維持を指標に調べ、形質転換体を非選択培地で数
十代培養した後でも、変化しないことを確認する。
に利用した宿主酵母菌細胞の染色体配列に相同な配列を
プローブとして、期待通りの部位へブラスミドが導入さ
れていることを確認する。また異種蛋白質をコードする
遺伝子の安定性を、異種蛋白質産生量および栄養要求性
の回復維持を指標に調べ、形質転換体を非選択培地で数
十代培養した後でも、変化しないことを確認する。
以上、確認試験を行った株は、確かに、目的異１５
種蛋白コード領域を含むプラスごドが、宿主酵母菌細胞
染色体の所望の部位に組み込まれた形質転換体である。
染色体の所望の部位に組み込まれた形質転換体である。
この形質転換体を宿主として使用して再度、該目的蛋白
コード領域を含むプラス旦ドで形質転換させることがで
きる。この場合、酵母菌細胞染色体相同領域としては、
初めの形質転換で使用した領域以外の相同領域も使用で
きる。
コード領域を含むプラス旦ドで形質転換させることがで
きる。この場合、酵母菌細胞染色体相同領域としては、
初めの形質転換で使用した領域以外の相同領域も使用で
きる。
この他、宿主酵母菌細胞の染色体配列に相同な配列とし
て、ｒｉｂｏｓｏｍｅ ＤＮＡやＴｙ因子（Ｔｒａｎｓ
ｐｏｓｏｎｏｆ Ｙｅａｓｔ ｅｌｅｍｅｎｔ） も
挙げられる。これらの遺伝子は細胞当り、複数個存在す
るので、１回の形質転換で、複数個の目的遺伝子を宿主
染色体に組み込むことができる。
て、ｒｉｂｏｓｏｍｅ ＤＮＡやＴｙ因子（Ｔｒａｎｓ
ｐｏｓｏｎｏｆ Ｙｅａｓｔ ｅｌｅｍｅｎｔ） も
挙げられる。これらの遺伝子は細胞当り、複数個存在す
るので、１回の形質転換で、複数個の目的遺伝子を宿主
染色体に組み込むことができる。
以下、具体的に組み込み方法を例示するが本例示は好適
な一手段を示すものであり、この手法に限定されるもの
ではない。相同配列部位は、選択的繰り返しにより代替
え可能である。
な一手段を示すものであり、この手法に限定されるもの
ではない。相同配列部位は、選択的繰り返しにより代替
え可能である。
宿主としては、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株
でかつＧ４１８感受性株であるサッカロマイセス０セレ
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）１６ ＡＨ２２株（ロイシン合或系遺伝子のＬＥＵ２およびヒ
スチジン合威系遺伝子のＨＩＳ４に変異を持つ株）を用
いる。
でかつＧ４１８感受性株であるサッカロマイセス０セレ
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）１６ ＡＨ２２株（ロイシン合或系遺伝子のＬＥＵ２およびヒ
スチジン合威系遺伝子のＨＩＳ４に変異を持つ株）を用
いる。
まず、ロイシン非要求性とするための遺伝子、ＬＥＵ２
を宿主酵母菌の染色体配列と相同の配列として持つプラ
スミドで形質転換する。得られた形質転換体は、染色体
上のＬＥＵ２遺伝子部位に異種蛋白質コード領域を含む
プラスξドが挿入されたものであり、ロイシン非要求性
、すなわちロイシン不含培地でも増殖できる株である。
を宿主酵母菌の染色体配列と相同の配列として持つプラ
スミドで形質転換する。得られた形質転換体は、染色体
上のＬＥＵ２遺伝子部位に異種蛋白質コード領域を含む
プラスξドが挿入されたものであり、ロイシン非要求性
、すなわちロイシン不含培地でも増殖できる株である。
次に、この形質転換体を宿主とし、ヒスチジン非要求性
とするための遺伝子、ＨＩ３４を宿主酵母細胞の染色体
配列と相同の配列として持つプラスＺド（もちろん、異
種蛋白質コード領域も含有する）で形質転換する。得ら
れた形質転換体は染色体上のＨＩＳ４遺伝子部位に異種
蛋白質コード領域を含むプラスミドが挿入されたもので
あり、ヒスチジン非要求性、すなわちヒスチジン不合培
地でも増殖できる株である。この時点で、発現のための
目的遺伝子である異種蛋白質遺伝子は、ＬＥＵ２および
ＨＩＳ４の２箇所に導入されている。
とするための遺伝子、ＨＩ３４を宿主酵母細胞の染色体
配列と相同の配列として持つプラスＺド（もちろん、異
種蛋白質コード領域も含有する）で形質転換する。得ら
れた形質転換体は染色体上のＨＩＳ４遺伝子部位に異種
蛋白質コード領域を含むプラスミドが挿入されたもので
あり、ヒスチジン非要求性、すなわちヒスチジン不合培
地でも増殖できる株である。この時点で、発現のための
目的遺伝子である異種蛋白質遺伝子は、ＬＥＵ２および
ＨＩＳ４の２箇所に導入されている。
次に、上記ロイシンおよびヒスチジン非要求性になった
形質転換体を宿主として、ＴＲＰＩを宿主酵母細胞の染
色体配列と相同の配列として持つプラスくドで形質転換
する。このプ雪スξドは、異種蛋白質コード領域はもち
ろん、Ｇ４１８耐性遺伝子も含有するものである。得ら
れた形質転換体は染色体上のＴＲＰＩ遺伝子部位に異種
蛋白質コード領域および６４１８耐性遺伝子を含むプラ
スごドが挿入されたものであり、抗生物質Ｇ４１８に対
し耐性を示す。従って、この形質転換体は、異種蛋白質
遺伝子を染色体上のＬＥＵ２、ＨＩＳ４およびＴＲＰＩ
遺伝子部位の計３箇所に含有するものである。この時、
挿入の順序は特に問題ではない。
形質転換体を宿主として、ＴＲＰＩを宿主酵母細胞の染
色体配列と相同の配列として持つプラスくドで形質転換
する。このプ雪スξドは、異種蛋白質コード領域はもち
ろん、Ｇ４１８耐性遺伝子も含有するものである。得ら
れた形質転換体は染色体上のＴＲＰＩ遺伝子部位に異種
蛋白質コード領域および６４１８耐性遺伝子を含むプラ
スごドが挿入されたものであり、抗生物質Ｇ４１８に対
し耐性を示す。従って、この形質転換体は、異種蛋白質
遺伝子を染色体上のＬＥＵ２、ＨＩＳ４およびＴＲＰＩ
遺伝子部位の計３箇所に含有するものである。この時、
挿入の順序は特に問題ではない。
宿主として、何種類もの栄養要求変異株が取得できれば
、または何種類もの抗生物質に対して感受性を示す株が
取得できれば、それに応した領域に有用遺伝子を複数導
入することができる。
、または何種類もの抗生物質に対して感受性を示す株が
取得できれば、それに応した領域に有用遺伝子を複数導
入することができる。
このように、宿主染色体上の複数領域に目的遺伝子を挿
入することができる。これら染色体に組み込まれた遺伝
子は、脱落することなく、安定に維持され、かつ複数の
遺伝子を組み込むことにより、目的生産物を多量に取得
することが可能となる。
入することができる。これら染色体に組み込まれた遺伝
子は、脱落することなく、安定に維持され、かつ複数の
遺伝子を組み込むことにより、目的生産物を多量に取得
することが可能となる。
異種蛋白質をコードする遺伝子を染色体上に有する形質
転換酵母同志の融合は、公知の方法、例えばプロトブラ
スト融合法（Ｐｉｅｔｅｒ ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ
ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １
３０， ９４６． １９７７）により行う。融合細胞の
スクリーニングは、例えば栄養要求性の回復や抗生物質
耐性の付与を指標に行うことができる。
転換酵母同志の融合は、公知の方法、例えばプロトブラ
スト融合法（Ｐｉｅｔｅｒ ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ
ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １
３０， ９４６． １９７７）により行う。融合細胞の
スクリーニングは、例えば栄養要求性の回復や抗生物質
耐性の付与を指標に行うことができる。
形質転換株は、公知の培地で培養する。培地としては、
例えばＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト（
Ｄｉｆｃｏ社）、２％バタトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）
、２％グルコース）、．ＹＰＧ液体培地（ＹＰＤの２％
グルコースの代わりに２％ガラクトース使用）等が例示
される。
例えばＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト（
Ｄｉｆｃｏ社）、２％バタトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）
、２％グルコース）、．ＹＰＧ液体培地（ＹＰＤの２％
グルコースの代わりに２％ガラクトース使用）等が例示
される。
本発明をより詳細に説明するために、参考例お１９
よび実施例を挙げるが、本発ＯＩ］はこれらによって何
ら限定されるものではない。
ら限定されるものではない。
なお、本発明において多くの技法、反応および分析方法
は当業界においてよく知られている。特にことわらない
限り、全ての酵素は商業的イＪ（給源、たとえば宝酒造
；ニューイングランド バイオラブス（ＮＥＢ） （Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））マ
ザチューセツツ、米国；アマーシャム（八ｍｅｒｓｃｈ
ａｍ）、英国およびヘセスダ リサーチ ラボラトリー
ズ［Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｌ
ａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ） ） 、メリーランド、米国
から人手することができる。
は当業界においてよく知られている。特にことわらない
限り、全ての酵素は商業的イＪ（給源、たとえば宝酒造
；ニューイングランド バイオラブス（ＮＥＢ） （Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））マ
ザチューセツツ、米国；アマーシャム（八ｍｅｒｓｃｈ
ａｍ）、英国およびヘセスダ リサーチ ラボラトリー
ズ［Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｌ
ａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ） ） 、メリーランド、米国
から人手することができる。
酵素反応のための緩衝液および反応条件は特に断らない
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。
プラス逅ドを用いた大腸菌の形質転換法、プラークハイ
プリダイゼーション法、電気泳動法およびＤＮＡのゲル
からの回収法は、「モレキュラークローニングＪコール
ドスプリングハーハーラボラトリー（ ｒＭｏｌｅｃｕ
ｌｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｊ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
１１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） （３９８２
）に記載されている方法２０ により行った。酵母の形質転換法は、「メソッド・イン
・イースト・ジェネティクス」コールドスプリングハー
バーラボラトリー（ ’Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｙｅａｓ
ｔＧｅｎｅｔｉｃｓ」） （Ｇｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８１）
に記載されている方法で行った。
プリダイゼーション法、電気泳動法およびＤＮＡのゲル
からの回収法は、「モレキュラークローニングＪコール
ドスプリングハーハーラボラトリー（ ｒＭｏｌｅｃｕ
ｌｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｊ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
１１ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） （３９８２
）に記載されている方法２０ により行った。酵母の形質転換法は、「メソッド・イン
・イースト・ジェネティクス」コールドスプリングハー
バーラボラトリー（ ’Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｙｅａｓ
ｔＧｅｎｅｔｉｃｓ」） （Ｇｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８１）
に記載されている方法で行った。
また、酵母の融合方法は「ジャーナル・オブ・バタテリ
オロジー、１３０巻、９４６頁、■９７７年」に記載さ
れている方法で行った。
オロジー、１３０巻、９４６頁、■９７７年」に記載さ
れている方法で行った。
また、ＨＳＡ産住量およびＨＢｓＡｇ産生量の測定は次
の方法によった。
の方法によった。
几Σ人息髪隻曵盟定
ＹＰＤまたはＹＰＧａ ｌ培地で７２時間振盪培養した
上清のＨＳＡ含量をＥ．ＬＩＳＡ法により測定した。
上清のＨＳＡ含量をＥ．ＬＩＳＡ法により測定した。
（ＥＬＩＳＡ法の概要）
Ｃａｐｐｅｌ製抗体〔抗ＩＩＳＡ Ｆ（ａｂ’）ｚフラ
グメント （ヤギ），コード番号０３０１−２２２１
）を０． ５ Ｍ炭酸ナ１・リウム緩衝液（ｐ１１９．
５）で４０００倍に希釈し（抗体濃度：約２μｇ ／
ａｌｌ ）エリザ用プレートの各ウエルＣこ１００ｌｌ
ｌずつ入れて、抗体を感作させる。
グメント （ヤギ），コード番号０３０１−２２２１
）を０． ５ Ｍ炭酸ナ１・リウム緩衝液（ｐ１１９．
５）で４０００倍に希釈し（抗体濃度：約２μｇ ／
ａｌｌ ）エリザ用プレートの各ウエルＣこ１００ｌｌ
ｌずつ入れて、抗体を感作させる。
各ウエルにサンプルを１００ｔｔｌ．ずつ入れる。
Ｃａｐｐｅｌ製抗体（ベルオキシダーゼ結合ＩｇＧフラ
クション、ヤギ抗ＨＳＡ）を加える。
クション、ヤギ抗ＨＳＡ）を加える。
ベルオキシダーゼの４９２ｎｍにおける吸光度を測定す
る。
る。
ＨＢｓＡ の’ｌ
ＹＰＤ培地で７２時間振盪培養した後、遠心により集菌
し、生理食塩水で１回洗浄後緩衝液〔５０ｍＭ｝リスー
ＨＣＩ． （ｐｌｌ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ
］に懸濁した。この懸濁液を１・ミー精工製の超音波発
生装ｉＵＲ−２００Ｐを用いて水冷下レヘル１０にて９
分間処理したのち、０″Ｃ１３０００ｘｇｌＯ分間遠心
し、得られた上澄液のＨＢｓＡｇ活性をアンティヘプセ
ル（株式会社竃ドリ＋字製）によるＲＰＨＡ法にて測定
した。
し、生理食塩水で１回洗浄後緩衝液〔５０ｍＭ｝リスー
ＨＣＩ． （ｐｌｌ７．５）， １ｍＭ ＥＤＴＡ
］に懸濁した。この懸濁液を１・ミー精工製の超音波発
生装ｉＵＲ−２００Ｐを用いて水冷下レヘル１０にて９
分間処理したのち、０″Ｃ１３０００ｘｇｌＯ分間遠心
し、得られた上澄液のＨＢｓＡｇ活性をアンティヘプセ
ル（株式会社竃ドリ＋字製）によるＲＰＨＡ法にて測定
した。
参考例１
， ＴＲＰ Ｉ ＰＨ０ ５ −ミ
′一−一城逗と乞 ローニング びＨ Ｓ Ａ ＩＩ Ｂ ｓ
Ａ ▲ シそれぞれ次の文献に記載の方法、
それに準しる方法によって調製するか、または市販のも
のを入手した。
′一−一城逗と乞 ローニング びＨ Ｓ Ａ ＩＩ Ｂ ｓ
Ａ ▲ シそれぞれ次の文献に記載の方法、
それに準しる方法によって調製するか、または市販のも
のを入手した。
ＧＡＰＤＩ｛プロモーター： Ｈｏｌｌａｎｄ， ｌＩ
．Ｊ． ａｎｄ Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｐ．， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５４， １２． ５４
６６ （１９７９），Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｈ．Ｊ． ａ
ｎｄ Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｊ．Ｐ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．． ２５４． １９． ９８３９ （１９
７９），特開昭６３−８４４９８号公報 ＧＡＬ １プロモーター及び合威シグナル：特願昭６３
１０３３３９号公報 ＨＢｓＡｇ遺伝子：特開昭６３−５２８８３号公報Ｓｔ
ｌＣ ２シグナル配列：特開昭６０−４１４８８号公報
、特開昭６３−８４４９８号公報 Ｉｓ＾遺伝子：特開昭６２−２９９８５号公報ＰＲ０
５ターミネーター：特開昭６２−１５１１８３号公報Ｇ
−４１８耐性遺伝子： Ｏｋａ，＾．， Ｓｕｇｉｓａ
ｋｉ， Ｈ． ａｎｄＴａｋａｎａｍｉ， Ｍ．， Ｊ
． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．＋ １４７， ２１７（１９
８１Ｌ Ｊｉｍｅｎｅｚ＋ Ａ． ａｎｄ Ｄａｖｉｅ
ｓ， Ｊ．，２３ Ｎａｔｕｒｅ， ２８７， ８６９ （１９８０），特
開昭６１−４０７９３号公報 ＴＲＰＩ：プラスミドｐＢＴ！−１０由来（ベーリンガ
ーマンハイム社より市販） ＬＥＵ２：プラスミドｐＢ．ＴＩ−１由来（ベーリンガ
ーマンハイム社より市販） ＨＩＳ ４ ： Ｄｏｎａｈｕｅ， Ｔ．Ｆ．， Ｄａ
ｖｅｓ， Ｒ．Ｓ．等， Ｃｅｌ１父， ８９ （１９
８３） 大腸菌複製開始領域及びアンピシリン耐性遺伝子：ｐｕ
ｃ １９ （宝酒造より入手） ［ＩＩ］ゑ１１表え上型様築 各プラスξドｐＭＭ−００６、ＰＭＳ−０ ０ ８、ｐ
Ｈｏ−０ １１ ｐＭＭ−０ １ ０およびｐｌＮＴ／
ＨＢの構築はｐＵｃ１９から「モレキュラークローニン
グ」コールドスプリングハーバーラボラトリー（１９８
２））に記載の方法に準して常法通り行った（第１図（
ａ）〜（ｅ）参照）。
．Ｊ． ａｎｄ Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｐ．， Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５４， １２． ５４
６６ （１９７９），Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｈ．Ｊ． ａ
ｎｄ Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｊ．Ｐ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．． ２５４． １９． ９８３９ （１９
７９），特開昭６３−８４４９８号公報 ＧＡＬ １プロモーター及び合威シグナル：特願昭６３
１０３３３９号公報 ＨＢｓＡｇ遺伝子：特開昭６３−５２８８３号公報Ｓｔ
ｌＣ ２シグナル配列：特開昭６０−４１４８８号公報
、特開昭６３−８４４９８号公報 Ｉｓ＾遺伝子：特開昭６２−２９９８５号公報ＰＲ０
５ターミネーター：特開昭６２−１５１１８３号公報Ｇ
−４１８耐性遺伝子： Ｏｋａ，＾．， Ｓｕｇｉｓａ
ｋｉ， Ｈ． ａｎｄＴａｋａｎａｍｉ， Ｍ．， Ｊ
． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．＋ １４７， ２１７（１９
８１Ｌ Ｊｉｍｅｎｅｚ＋ Ａ． ａｎｄ Ｄａｖｉｅ
ｓ， Ｊ．，２３ Ｎａｔｕｒｅ， ２８７， ８６９ （１９８０），特
開昭６１−４０７９３号公報 ＴＲＰＩ：プラスミドｐＢＴ！−１０由来（ベーリンガ
ーマンハイム社より市販） ＬＥＵ２：プラスミドｐＢ．ＴＩ−１由来（ベーリンガ
ーマンハイム社より市販） ＨＩＳ ４ ： Ｄｏｎａｈｕｅ， Ｔ．Ｆ．， Ｄａ
ｖｅｓ， Ｒ．Ｓ．等， Ｃｅｌ１父， ８９ （１９
８３） 大腸菌複製開始領域及びアンピシリン耐性遺伝子：ｐｕ
ｃ １９ （宝酒造より入手） ［ＩＩ］ゑ１１表え上型様築 各プラスξドｐＭＭ−００６、ＰＭＳ−０ ０ ８、ｐ
Ｈｏ−０ １１ ｐＭＭ−０ １ ０およびｐｌＮＴ／
ＨＢの構築はｐＵｃ１９から「モレキュラークローニン
グ」コールドスプリングハーバーラボラトリー（１９８
２））に記載の方法に準して常法通り行った（第１図（
ａ）〜（ｅ）参照）。
プラスミドＰＭＭ−００６は、宿主酵母細胞の染色体配
列と相同な配列として、ロイシン合或系遺伝子のＬＥＵ
２を含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下にＳＵＳ
２シグナル配列、ＨＳＡ構造遺伝子及びＰＨＯ５ターく
ネーターを連結したものである。
列と相同な配列として、ロイシン合或系遺伝子のＬＥＵ
２を含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下にＳＵＳ
２シグナル配列、ＨＳＡ構造遺伝子及びＰＨＯ５ターく
ネーターを連結したものである。
ブラスミドｐＭＳ−００８は、宿主酵母細胞の染色体配
列と相同な配列として、ヒスチジンを或系遺伝子のＨＩ
Ｓ４を含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下にＳＵ
Ｓ２シグナル配列、ＨＳＡ構造遺伝子及びＰＨＯ５ター
ξネーターを連結したものである。
列と相同な配列として、ヒスチジンを或系遺伝子のＨＩ
Ｓ４を含み、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの支配下にＳＵ
Ｓ２シグナル配列、ＨＳＡ構造遺伝子及びＰＨＯ５ター
ξネーターを連結したものである。
プラスミドｐｆ｛Ｏ−０ １ １は、宿主酵母細胞の染
色体配列と相同な配列として、トリプトファン合威系遺
伝子のＴＲＰＩを含み、Ｇ Ａ Ｐ − Ｄ Ｈ ７”
ロモーターの支配下にＳＵＳ２シグナル配列、ＨＳＡ構
造遺伝子及びＰＨ０５ターミネーターを連結したもので
、酵母選択マーカー遺伝子としてＧ４１８耐性遺伝子も
含むものである。
色体配列と相同な配列として、トリプトファン合威系遺
伝子のＴＲＰＩを含み、Ｇ Ａ Ｐ − Ｄ Ｈ ７”
ロモーターの支配下にＳＵＳ２シグナル配列、ＨＳＡ構
造遺伝子及びＰＨ０５ターミネーターを連結したもので
、酵母選択マーカー遺伝子としてＧ４１８耐性遺伝子も
含むものである。
プラスくドｐＭＭ−０ １ ０は、宿主酵母細胞の染色
体配列と相同な配列として、ロイシン合威系遺伝子のＬ
ＥＵ２を含み、ＧＡＬＩプロモーターの支配下に合威（
ｍＨＳＡ）シグナル配列、Ｈ ＳＡ構造遺伝子及びＰＨ
０５ターミネーターを連結したもので、６４１８耐性遺
伝子も併せもつものである。
体配列と相同な配列として、ロイシン合威系遺伝子のＬ
ＥＵ２を含み、ＧＡＬＩプロモーターの支配下に合威（
ｍＨＳＡ）シグナル配列、Ｈ ＳＡ構造遺伝子及びＰＨ
０５ターミネーターを連結したもので、６４１８耐性遺
伝子も併せもつものである。
プラスミドｐｌＮＴ／ＨＢは、宿主酵母細胞の染色体配
列と相同な配列として、ロイシン合威系遺伝子のＬ Ｅ
Ｕ ２を含み、Ｇ Ａ Ｐ − Ｄ Ｈプロモーター
の支配下にＨＢｓＡｇ構造遺伝子およびＰ ＨＯ５ター
ごネークーを連結したものである。
列と相同な配列として、ロイシン合威系遺伝子のＬ Ｅ
Ｕ ２を含み、Ｇ Ａ Ｐ − Ｄ Ｈプロモーター
の支配下にＨＢｓＡｇ構造遺伝子およびＰ ＨＯ５ター
ごネークーを連結したものである。
プラス兆ドＴ）ＭＭ−００６、ｐＭＳ−００８およびｐ
ＨＯ−０１１は、平威元年（１９８９）４月２８日に通
産省工業技術院微生物工業技術研究所へ各々次のとおり
国際寄託されている。
ＨＯ−０１１は、平威元年（１９８９）４月２８日に通
産省工業技術院微生物工業技術研究所へ各々次のとおり
国際寄託されている。
■微生物名：ピーエムエム００６／イー・コーリジェイ
エム１０９ （ｐＭＭ０ ０ ６／Ｈ． ｃｏｌｉ ＪＭＩ Ｏ
９）受託番号：微工研条寄第２４０４号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−２４０４） ■微生物名：ビーエムエス００８／イー・コーリジエイ
エム１０９ （ｐＭｓＯＯ８／Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）受託番号
：微工研条寄第２４０６号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−２４０６） ■微生物名：ピーエッチオ−０１１／イー・コーリエッ
チビ−１０１ （ｐＨ００ １ １／Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ １ ０
１）受託番号：微工研条寄第２４０５号 （ＦＢ，ＲＭ ＢＰ−２４０５） 宿主として、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株
を用いた。
エム１０９ （ｐＭＭ０ ０ ６／Ｈ． ｃｏｌｉ ＪＭＩ Ｏ
９）受託番号：微工研条寄第２４０４号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−２４０４） ■微生物名：ビーエムエス００８／イー・コーリジエイ
エム１０９ （ｐＭｓＯＯ８／Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）受託番号
：微工研条寄第２４０６号 （ＦＥＲＭ ＢＰ−２４０６） ■微生物名：ピーエッチオ−０１１／イー・コーリエッ
チビ−１０１ （ｐＨ００ １ １／Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ １ ０
１）受託番号：微工研条寄第２４０５号 （ＦＢ，ＲＭ ＢＰ−２４０５） 宿主として、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株
を用いた。
サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株は、接合型が
ａ型であり、ヒスチジン合或系遺伝子（ｈｉｓ ４）、
およびロイシン合威系遺伝子（ｌｅｕ ２）に変異を持
つ。従って、培養液中に、ヒスチジンおよびロイシンを
添加しなければ増殖することができない。
ａ型であり、ヒスチジン合或系遺伝子（ｈｉｓ ４）、
およびロイシン合威系遺伝子（ｌｅｕ ２）に変異を持
つ。従って、培養液中に、ヒスチジンおよびロイシンを
添加しなければ増殖することができない。
ＨＳＡ分泌発現用プラスミドｐＭＭ−００６を酵母サソ
カロマイセス・セレビシエ八〇２２株の染色体中２７ に以下の方法により導入した。
カロマイセス・セレビシエ八〇２２株の染色体中２７ に以下の方法により導入した。
ＹＩ’Ｄ培地（イーストＪキストラクト１０ｇ、ノ＼ク
トペブトン２０ｇを水に溶解し９ ０ ０ ｄとした後
オートクレープ滅菌し、別にオートクレープ滅菌した２
０％グルコース１００准と混合した。）５０成中３７゜
Ｃ、一夜振盪培養したサツカロマイセスセレビシエＡＨ
２２を遠心し、得られた細胞を水２０ｍＱに懸濁後、再
度遠心して細胞を得た。
トペブトン２０ｇを水に溶解し９ ０ ０ ｄとした後
オートクレープ滅菌し、別にオートクレープ滅菌した２
０％グルコース１００准と混合した。）５０成中３７゜
Ｃ、一夜振盪培養したサツカロマイセスセレビシエＡＨ
２２を遠心し、得られた細胞を水２０ｍＱに懸濁後、再
度遠心して細胞を得た。
これを１０ｍｌの５０ｍＭジチオスレイトール、１．２
門ソルビトール２ ５ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐｌ１８．５に
懸濁し、３０゜Ｃで１０分間穏やかに振盪した。遠心に
より細胞を集め、１．２Ｍソルビトール１０成に懸濁し
、再度遠心により細胞を集めた。細胞を１０ｍｎの１．
２Ｈソルビトールに懸濁し、遠心により細胞を集めた。
門ソルビトール２ ５ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐｌ１８．５に
懸濁し、３０゜Ｃで１０分間穏やかに振盪した。遠心に
より細胞を集め、１．２Ｍソルビトール１０成に懸濁し
、再度遠心により細胞を集めた。細胞を１０ｍｎの１．
２Ｈソルビトールに懸濁し、遠心により細胞を集めた。
細胞を１０ｍＱの０． ２ ｍｇ ／ ｍｇ．ザイモリ
アーゼ１００Ｔ、１．２Ｍソルビトール、１ ０ｍＭ
ＥＤＴ＾、Ｏ．ｌＭクエン酸ナトリウム、ｐｌ＋５．８
に懸濁後、３０゜Ｃで１時間穏やかに振盪した。遠心で
細胞を集め、１．２Ｍソルビトール、次いで１０ｍＭ塩
化カルシウム、１．２門ソルビトール各１０ｍｌで洗浄
し、遠心で細胞を２８ 集めた。細胞を１ ｍｆｌの１０ｍＭ塩化カルシウム、
１，２Ｈソルビトールに懸濁した。懸濁液１００μｊ［
−滅菌試験管にとり、５μ１（５μｇのｐＭＭ−００６
（ＬＥＤ２遺伝子上のユニークサイトであるＫｐｎ
Ｉで消化し、プラスごドを線状にして用いた。）と混合
し、室温に１５分間静置した。更に、１． ２ ｍｌの
２０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭ塩化
カルシウム、１０ｍＭ｝リスー塩酸、ｐｌ＋７．５を加
え穏やかに混合後、室温で２０分間静置した。遠心で細
胞を集め、０．１一の１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ
塩化カルシウム含有ＹＰＤメディウムに懸濁し、３０゜
Ｃで３０分間穏やかに振盪した。懸濁液１．５、１０、
２０および５０μｌをそれぞれ寒天培地と混合して、４
５゜Ｃに保温した１０威のロイシン不含培地からなるプ
レートに拡げた。プレートが固化したら、３０゜Ｃで３
日間静置培養した。形成したコロニーを爪楊枝で採取し
、３ ｍｆｌの０．７％イーストナイトロジェンヘース
、２％グルコースに懸濁後、３０゜Ｃで２日間振盪培養
した。そのうちの１． ５ ｍｌを遠心し、細胞を集め
、３ ｄのＹＰＤ培地（イーストエキストラクト１０ｇ
、ハタトペプトン２０ｇを水に溶解し、９ ０ ０ ｍ
ｆｌとした後オートクレープ滅菌し、別にオートクレー
プ滅菌した２０％デキストロース１００−と混合した。
アーゼ１００Ｔ、１．２Ｍソルビトール、１ ０ｍＭ
ＥＤＴ＾、Ｏ．ｌＭクエン酸ナトリウム、ｐｌ＋５．８
に懸濁後、３０゜Ｃで１時間穏やかに振盪した。遠心で
細胞を集め、１．２Ｍソルビトール、次いで１０ｍＭ塩
化カルシウム、１．２門ソルビトール各１０ｍｌで洗浄
し、遠心で細胞を２８ 集めた。細胞を１ ｍｆｌの１０ｍＭ塩化カルシウム、
１，２Ｈソルビトールに懸濁した。懸濁液１００μｊ［
−滅菌試験管にとり、５μ１（５μｇのｐＭＭ−００６
（ＬＥＤ２遺伝子上のユニークサイトであるＫｐｎ
Ｉで消化し、プラスごドを線状にして用いた。）と混合
し、室温に１５分間静置した。更に、１． ２ ｍｌの
２０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭ塩化
カルシウム、１０ｍＭ｝リスー塩酸、ｐｌ＋７．５を加
え穏やかに混合後、室温で２０分間静置した。遠心で細
胞を集め、０．１一の１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭ
塩化カルシウム含有ＹＰＤメディウムに懸濁し、３０゜
Ｃで３０分間穏やかに振盪した。懸濁液１．５、１０、
２０および５０μｌをそれぞれ寒天培地と混合して、４
５゜Ｃに保温した１０威のロイシン不含培地からなるプ
レートに拡げた。プレートが固化したら、３０゜Ｃで３
日間静置培養した。形成したコロニーを爪楊枝で採取し
、３ ｍｆｌの０．７％イーストナイトロジェンヘース
、２％グルコースに懸濁後、３０゜Ｃで２日間振盪培養
した。そのうちの１． ５ ｍｌを遠心し、細胞を集め
、３ ｄのＹＰＤ培地（イーストエキストラクト１０ｇ
、ハタトペプトン２０ｇを水に溶解し、９ ０ ０ ｍ
ｆｌとした後オートクレープ滅菌し、別にオートクレー
プ滅菌した２０％デキストロース１００−と混合した。
）に懸濁し、３０゜Ｃで振盪培養した。培養上清のＨＳ
Ａｉｌｌ度をＲＰＨＡ法にて測定したところ、３日目で
最高２０μｇ ／ ｍｆｌのＨＳＡが検出された。
Ａｉｌｌ度をＲＰＨＡ法にて測定したところ、３日目で
最高２０μｇ ／ ｍｆｌのＨＳＡが検出された。
かくして得られた形質転換体をＴＭＭ−２１と命名した
。
。
■サザンブ口ッティング法によりＩＩＳＡ遺伝子がどこ
に導入されたかを調べたところ、確かに染色体中のＬＥ
［．ｌ ２領域に導入されていることが確認できた。
に導入されたかを調べたところ、確かに染色体中のＬＥ
［．ｌ ２領域に導入されていることが確認できた。
■｝Ｉｓ＾遺伝子の安定性をＩＳＡ産生量とロイシン非
要求性を指標に測定したところ、非選択培地で約６０世
代培養した後でも、１００％のＩＩｓＡ遺伝子が保持さ
れていた。
要求性を指標に測定したところ、非選択培地で約６０世
代培養した後でも、１００％のＩＩｓＡ遺伝子が保持さ
れていた。
参考例２
プラスミドとして参考例１にて構築したｐＭ３００８お
よびｐ Ｈ００１１を、宿主としてサツ力口マイセス・
セレビシエＡＨ２２株を使用し、参考例１と同様にして
形質転換酵母菌ＴＭＳ−３４を得た。
よびｐ Ｈ００１１を、宿主としてサツ力口マイセス・
セレビシエＡＨ２２株を使用し、参考例１と同様にして
形質転換酵母菌ＴＭＳ−３４を得た。
参考例３
プラスさドとして参考例１にて構築したＰＩＮＴ／ＨＢ
を、宿主としてサッ力口マイセス・セレビシエＡＨ２２
株使用し、参考例１と同様にして形質転換酵母菌ＴＨＢ
Ｓを得た。
を、宿主としてサッ力口マイセス・セレビシエＡＨ２２
株使用し、参考例１と同様にして形質転換酵母菌ＴＨＢ
Ｓを得た。
実施例１
実施例１の細胞融合に使用した親株の性質は第１表にま
とめた通りである。
とめた通りである。
ＹＰＤ培地（イーストエキストラクト１０ｇ１バクトペ
プトン２０ｇを水に溶解して９ ０ ０ ｍｌとした後
オートクレープ滅菌し、別にオートクレープ滅菌した２
０％グルコース１００ｍＮと混合した。
プトン２０ｇを水に溶解して９ ０ ０ ｍｌとした後
オートクレープ滅菌し、別にオートクレープ滅菌した２
０％グルコース１００ｍＮと混合した。
５０ｍｌ中３７゜Ｃ、一夜振盪培養したＴＭＳ−３４）
を遠心し、得られたＴＭＳ−３４を水２０成に懸濁後、
再度遠心してＴＭＳ−３４を得た。これを１０ｉｆｆｉ
の５０ｍＭジチオスレイ１〜−ル、１．２Ｍソルビ１・
−ル２ ５ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐｌ＋８．５に懸濁し、３
０゛Ｃで１０分間穏やかに振盪した。遠心によりＴＭＳ
３４を集め、１．２Ｍソルビトール１０ｍＱに懸濁し、
再度遠心によりＴＭＳ−３４を集めた。ＴＭＳ−３４を
１０ｍ２の１．２Ｍソルビ１・−ルに懸濁し、遠心によ
りＴＭＳ−３４を集めた。ＴＭＳ−３４を１０ｍ２の０
． ２ ｍｇ ／ ｄザイモリアーゼ１００Ｔ、１．２
門ソノレビトーノレ、１ ０ｍＭ ＥＤＴＡ 、０．
１ Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．８に懸濁後、３０
゜Ｃで１時間穏やかに振盪した。遠心でＴＭＳ−３４を
集め、１．２Ｍソルビトール、次いで１０ｍＭ塩化カル
シウム、１．２Ｍソルビトール各１０ｍｌで洗浄し、遠
心でプロトブラスト化されたＴＭＳ−３４を集めた。
再度遠心してＴＭＳ−３４を得た。これを１０ｉｆｆｉ
の５０ｍＭジチオスレイ１〜−ル、１．２Ｍソルビ１・
−ル２ ５ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐｌ＋８．５に懸濁し、３
０゛Ｃで１０分間穏やかに振盪した。遠心によりＴＭＳ
３４を集め、１．２Ｍソルビトール１０ｍＱに懸濁し、
再度遠心によりＴＭＳ−３４を集めた。ＴＭＳ−３４を
１０ｍ２の１．２Ｍソルビ１・−ルに懸濁し、遠心によ
りＴＭＳ−３４を集めた。ＴＭＳ−３４を１０ｍ２の０
． ２ ｍｇ ／ ｄザイモリアーゼ１００Ｔ、１．２
門ソノレビトーノレ、１ ０ｍＭ ＥＤＴＡ 、０．
１ Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．８に懸濁後、３０
゜Ｃで１時間穏やかに振盪した。遠心でＴＭＳ−３４を
集め、１．２Ｍソルビトール、次いで１０ｍＭ塩化カル
シウム、１．２Ｍソルビトール各１０ｍｌで洗浄し、遠
心でプロトブラスト化されたＴＭＳ−３４を集めた。
上記と同様にしてＴＭＭ−２ １をプロトプラスト化し
た。
た。
（ＩＩ） 入 ＴＭＳ−３４とＴＭＭ−２ １ｔ
１昼１色 ３２ プロトプラスト化されたＴＭＳ−３４およびＴＭＭ−２
１をそれぞれ０． ５ ｍＱの１． ２ Ｍソルビトー
ル１０ｍＭ ＣａＣｌｚに懸濁した。上記融合を意図
する２種類の菌株の懸濁液を０． １ ｄずつ試験管に
分注して混ぜあわせた後に室温で１５分間放置した。２
． ４ ｍｌのポリエチレングリコール溶液〔４０％（
Ｉ１／ν〉ポリエヂレングリコール４０００、１０ｍＭ
ＣａＣｌ２および１０ｍＭ｝リス塩酸（ｐＨ ７．
５ ） ）を加え、更に室温で２０分放置した。
１昼１色 ３２ プロトプラスト化されたＴＭＳ−３４およびＴＭＭ−２
１をそれぞれ０． ５ ｍＱの１． ２ Ｍソルビトー
ル１０ｍＭ ＣａＣｌｚに懸濁した。上記融合を意図
する２種類の菌株の懸濁液を０． １ ｄずつ試験管に
分注して混ぜあわせた後に室温で１５分間放置した。２
． ４ ｍｌのポリエチレングリコール溶液〔４０％（
Ｉ１／ν〉ポリエヂレングリコール４０００、１０ｍＭ
ＣａＣｌ２および１０ｍＭ｝リス塩酸（ｐＨ ７．
５ ） ）を加え、更に室温で２０分放置した。
菌体を遠心によって集め、ペレソトを０．４−のｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ用の溶液［１．２Ｍソルビ１・−ル１０
ｍＭＣａＣＩｚｌに懸濁した。３０゜Ｃで３０分間振盪
培養した後に、寒天溶液と混合して最小培地〔イースト
・ナイトロージェン・ヘース（ Ｗ／０）Ｄｉｆｃｏ社
製、＋グルコース〕上に」二層し、３０゜Ｃで数日間培
養して融合酵母菌ＣＦＫＯ−１という）を得た。当該コ
ロニーの総数は２２２であった。
ｒｅｓｓｉｏｎ用の溶液［１．２Ｍソルビ１・−ル１０
ｍＭＣａＣＩｚｌに懸濁した。３０゜Ｃで３０分間振盪
培養した後に、寒天溶液と混合して最小培地〔イースト
・ナイトロージェン・ヘース（ Ｗ／０）Ｄｉｆｃｏ社
製、＋グルコース〕上に」二層し、３０゜Ｃで数日間培
養して融合酵母菌ＣＦＫＯ−１という）を得た。当該コ
ロニーの総数は２２２であった。
融合酵母菌はロイシンとヒスチジンを含まない選択培地
上で分離した。出現した表現型がＬＥＵ”、ＨＩＳ”の
コロニーを滅菌水に懸濁して、単一コロニーを分離して
６４１８耐性を調べたところ、第２表（融合細胞のマー
カー）に示した通り０４１８耐性を示した。したがって
、当該コロニーとして得た株は上記二種類の酵母菌株の
融合した融合酵母菌であると結論される。その理由は次
の通りである。
上で分離した。出現した表現型がＬＥＵ”、ＨＩＳ”の
コロニーを滅菌水に懸濁して、単一コロニーを分離して
６４１８耐性を調べたところ、第２表（融合細胞のマー
カー）に示した通り０４１８耐性を示した。したがって
、当該コロニーとして得た株は上記二種類の酵母菌株の
融合した融合酵母菌であると結論される。その理由は次
の通りである。
すなわち、融合酵母菌であるＦＫ○−ｌの親株であるＴ
ＭＳ−３４はＡＨ２２株（ａ，］ｅｕ２３ １ｅｕ２
−１１２，ｈｉｓ４−５１９，ｃａｎｌ）のＴＲＰＩ，
ＨＩ３４遺伝子座にＩ Ｓ Ａ遺伝子を組み込んだｉｎ
ｔｅｇｒａｎｔである。ＴＲＰＩ遺伝子座に組み込みを
行う際には遺伝子マーカとしてＧ４１８耐性遺伝子を用
いたので、この菌株の表現型はＩｅｕ−，ＨＩＳ＋，Ｇ
４１Ｂ’であり、もう一方の親株であるＴＭＭ−２１は
ＡＨ２２株のＬ Ｅ Ｕ ２遺伝子座にＨＳＡｉｆｉ伝
子を組み込んだｉｎｔｅｇｒａｎｔである。この菌株の
表現形はＩ７ＥＵ” ｈｉｓ− ０４１８ｓであ
ると予想されるからである。したがって、上記の組み合
わせで細胞融合を行った際に２種の親株が融合して出現
する菌株の表現型はＬＥＵ”，Ｈｉｓ“，Ｇ４１８ｒと
なることが予想されるからである。
ＭＳ−３４はＡＨ２２株（ａ，］ｅｕ２３ １ｅｕ２
−１１２，ｈｉｓ４−５１９，ｃａｎｌ）のＴＲＰＩ，
ＨＩ３４遺伝子座にＩ Ｓ Ａ遺伝子を組み込んだｉｎ
ｔｅｇｒａｎｔである。ＴＲＰＩ遺伝子座に組み込みを
行う際には遺伝子マーカとしてＧ４１８耐性遺伝子を用
いたので、この菌株の表現型はＩｅｕ−，ＨＩＳ＋，Ｇ
４１Ｂ’であり、もう一方の親株であるＴＭＭ−２１は
ＡＨ２２株のＬ Ｅ Ｕ ２遺伝子座にＨＳＡｉｆｉ伝
子を組み込んだｉｎｔｅｇｒａｎｔである。この菌株の
表現形はＩ７ＥＵ” ｈｉｓ− ０４１８ｓであ
ると予想されるからである。したがって、上記の組み合
わせで細胞融合を行った際に２種の親株が融合して出現
する菌株の表現型はＬＥＵ”，Ｈｉｓ“，Ｇ４１８ｒと
なることが予想されるからである。
本発明の融合酵母菌（ＦＫ○−１）を単一コロニーとし
て単離した直後に、ＹＰＤ培地／中試験管にて３０゜Ｃ
にて７２時間振盪培養して、Ｉ Ｓ Ａ産生量をＥＬＩ
ＳＡ法にて測定した結果を第３表にまとめた。同様にし
て親株であるＴＭＳ−３４及びＴＭＳ−２１を同一の条
件下に振盪培養して、ＨＳＡ産生量をＥＬＩＳＡ法にて
測定した結果を第３表にまとめた。この結果からも明ら
かなように、融合細胞のＨＳＡ産生量は親株と比較して
上昇していた。
て単離した直後に、ＹＰＤ培地／中試験管にて３０゜Ｃ
にて７２時間振盪培養して、Ｉ Ｓ Ａ産生量をＥＬＩ
ＳＡ法にて測定した結果を第３表にまとめた。同様にし
て親株であるＴＭＳ−３４及びＴＭＳ−２１を同一の条
件下に振盪培養して、ＨＳＡ産生量をＥＬＩＳＡ法にて
測定した結果を第３表にまとめた。この結果からも明ら
かなように、融合細胞のＨＳＡ産生量は親株と比較して
上昇していた。
また、非選択培地であるＹＰＤプレート上で８回継代（
１回継代／１日）培養（３０℃、７２時間）した融合酵
母菌のＨＳＡ産生量を調べて第４表に示した。この結果
からも明らかなように、非選択培地中で長期継代培養後
もＩＳＡ産生量はほとんど低下していなかった。
１回継代／１日）培養（３０℃、７２時間）した融合酵
母菌のＨＳＡ産生量を調べて第４表に示した。この結果
からも明らかなように、非選択培地中で長期継代培養後
もＩＳＡ産生量はほとんど低下していなかった。
さらに、非選択培地であるＹＰＤプレート上で８回継代
（１回継代／１日）した各クローンから１０個ずつ単一
クローンを単離して、マーカー保存率を調べてることに
よって、マーカーの安定性を調べて第５表に示した。こ
の結果からも明らかなように、非選択培地中で長期継代
培養後もマーカー遺伝子を安定に保持していた。
（１回継代／１日）した各クローンから１０個ずつ単一
クローンを単離して、マーカー保存率を調べてることに
よって、マーカーの安定性を調べて第５表に示した。こ
の結果からも明らかなように、非選択培地中で長期継代
培養後もマーカー遺伝子を安定に保持していた。
実施例２
実施例２の細胞融合に使用した親株の性質は第１表にま
とめた通りである。
とめた通りである。
実施例１と同様にして、ＴＭＳ−３４およびＴＭＭ−２
３をプロトブラスト化した後に融合させてＴＭＳ−３４
とＴＭＭ−２３との融合細胞（ＦＫＯ−３という）を得
た。当該コロニーの総数は２０６であった。
３をプロトブラスト化した後に融合させてＴＭＳ−３４
とＴＭＭ−２３との融合細胞（ＦＫＯ−３という）を得
た。当該コロニーの総数は２０６であった。
融合細胞はロイシンとヒスチジンを含まない選択培地上
で分離した。出現した表現型がＬＥＵ’ＨＩＳ”のコロ
ニーを滅菌水に懸濁して、単一コロニーを分離して０４
１８耐性を調べたところ、第２表（融合細胞のマーカー
）に示した通りＧ４１８耐性を示した。したがって、当
該コロニーとして得た株は二種類の上記酵母菌株の融合
したも３５ のであると結論される。その理由は次の通りである。
で分離した。出現した表現型がＬＥＵ’ＨＩＳ”のコロ
ニーを滅菌水に懸濁して、単一コロニーを分離して０４
１８耐性を調べたところ、第２表（融合細胞のマーカー
）に示した通りＧ４１８耐性を示した。したがって、当
該コロニーとして得た株は二種類の上記酵母菌株の融合
したも３５ のであると結論される。その理由は次の通りである。
すなわち、融合酵母菌であるＦＫＯ−３の親株であるＴ
ＭＳ−３４は、既に述べた通りその菌株の表現型はＩｅ
ｕ−，ＨｒＳ”，Ｇ４１Ｂ’であり、他の親株であるＴ
ＭＭ−２３はＡＨ２２株のＬＥＵ２遺伝子座にＨＳＡ遺
伝子を組み込んだｉｎｔｅｇｒａｎｔである。この菌株
の表現形はＬＥＵ’ｈ ｉ ｓ− ， ０４ １ ８’
である。したがって、上記の組み合わせで細胞融合を行
った際に２種の親株が融合して出現する菌株の表現型は
ＬＥＵ’，ＨＩｓ“，Ｇ４１８’となることが予想され
るからである。
ＭＳ−３４は、既に述べた通りその菌株の表現型はＩｅ
ｕ−，ＨｒＳ”，Ｇ４１Ｂ’であり、他の親株であるＴ
ＭＭ−２３はＡＨ２２株のＬＥＵ２遺伝子座にＨＳＡ遺
伝子を組み込んだｉｎｔｅｇｒａｎｔである。この菌株
の表現形はＬＥＵ’ｈ ｉ ｓ− ， ０４ １ ８’
である。したがって、上記の組み合わせで細胞融合を行
った際に２種の親株が融合して出現する菌株の表現型は
ＬＥＵ’，ＨＩｓ“，Ｇ４１８’となることが予想され
るからである。
本発明の融合細胞（ＦＫＯ−３）を単一コロニーとして
単離した直後に、ＹＰＤ培地／中試験管にて３０゜Ｃに
て７２時間振盪培養して、ＩＳＡ産生量をＥＬＩＳＡ法
にて測定した結果を第６表にまとめた。同様にして親株
であるＴＭＳ−３４及びＴＭＳ−２３を同一の条件下に
振盪培養して、Ｈ Ｓ Ａ産生景をＥＬＩＳＡにて測定
した結果を第３６ ６表にまとめた。融合細胞のＩＳＡ産生量は親株と比較
して上昇していた。なお、糖源としてグルコースを使用
した場合と、ガラクトースを使用した場合とを比較する
と、ガラクトースを使用した場合の方が産生量は多かっ
た。ＦＫＯ−３の片親であるＴＭＭ−２３のＩＳＡ遺伝
子の転写ユニットがＧＡＬＩプロモーターをもつので、
ＦＫＯ３ではＨＳＡ遺伝子の一部は構戒的に、他は誘導
的に発現しているものと推定される。
単離した直後に、ＹＰＤ培地／中試験管にて３０゜Ｃに
て７２時間振盪培養して、ＩＳＡ産生量をＥＬＩＳＡ法
にて測定した結果を第６表にまとめた。同様にして親株
であるＴＭＳ−３４及びＴＭＳ−２３を同一の条件下に
振盪培養して、Ｈ Ｓ Ａ産生景をＥＬＩＳＡにて測定
した結果を第３６ ６表にまとめた。融合細胞のＩＳＡ産生量は親株と比較
して上昇していた。なお、糖源としてグルコースを使用
した場合と、ガラクトースを使用した場合とを比較する
と、ガラクトースを使用した場合の方が産生量は多かっ
た。ＦＫＯ−３の片親であるＴＭＭ−２３のＩＳＡ遺伝
子の転写ユニットがＧＡＬＩプロモーターをもつので、
ＦＫＯ３ではＨＳＡ遺伝子の一部は構戒的に、他は誘導
的に発現しているものと推定される。
さらに、非選択培地であるＹＰＤプレート」二で８回継
代（１回継代／１日）培養（３０゜Ｃ、７２時間）した
融合酵母菌のＨＳＡ産生量を調べて第７表に示した。こ
の結果からも明らかなように、非選択培地中で長期継代
培養後もＩＳＡ産生量は実質的に低下していなかった。
代（１回継代／１日）培養（３０゜Ｃ、７２時間）した
融合酵母菌のＨＳＡ産生量を調べて第７表に示した。こ
の結果からも明らかなように、非選択培地中で長期継代
培養後もＩＳＡ産生量は実質的に低下していなかった。
また、非選択培地であるＹＰＤプレート上で８回継代（
１回継代／１日）培養した各クローンから１０個ずつ単
一クローンを単離して、マーカー保存率を調べてること
によって、マーカーの安定性を調べて第８表に示した。
１回継代／１日）培養した各クローンから１０個ずつ単
一クローンを単離して、マーカー保存率を調べてること
によって、マーカーの安定性を調べて第８表に示した。
この結果からも明らかなように、非選択培地中で長期継
代培養後もマーカー遺伝子を安定に保持していた。
代培養後もマーカー遺伝子を安定に保持していた。
実施例３
実施例３の細胞融合に使用した親株の性質は第１表にま
とめた通りである。
とめた通りである。
実施例ｌと同様にして、ＴＭＳ−３４およびＴＨＢＳを
プロトプラスト化した後に融合させてＴＭＳ−３ ４と
ＴＨＢＳとの融合細胞（ＦＫ○−４という）を得た。当
該コロニーの総数は４９であった。
プロトプラスト化した後に融合させてＴＭＳ−３ ４と
ＴＨＢＳとの融合細胞（ＦＫ○−４という）を得た。当
該コロニーの総数は４９であった。
融合細胞はロイシンとヒスチジンを含まない選択培地上
で分離した。融合細胞のコロニーを滅菌水に懸濁して、
単一コロニーを分離してＧ４１８耐性を調べたところ、
第２表（融合細胞のマーカー）に示した通りＧ４１８耐
性を示した。したがって、当該コロニーとして得た株は
二種類の菌株同志の融合した細胞であると結論される。
で分離した。融合細胞のコロニーを滅菌水に懸濁して、
単一コロニーを分離してＧ４１８耐性を調べたところ、
第２表（融合細胞のマーカー）に示した通りＧ４１８耐
性を示した。したがって、当該コロニーとして得た株は
二種類の菌株同志の融合した細胞であると結論される。
その理由は次の通りである。
すなわち、融合酵母菌であるＦＫＯ−４の親株であるＴ
ＭＳ−３４はＡＨ２２株のＨＩＳ４、Ｔ３ｑ ＲＰＩ遺伝子座にＩ Ｓ Ａ遺伝子を組み込んだｉｎｔ
ｅｇｒａｎ ｔである。この菌株の表現型はＩｅｕ−，
ＨＩｓ”，Ｇ４１８’であり、他の親株であるＴＨＢＳ
はＡＨ２２株のＬＥＵ２遺伝子座にＨ Ｂ ｓ Ａｇ遺
伝子を組み込んだｉｎｔｅｇｒａｎｔである。この表現
形はｈ ｉ ｓ− ，ＬＥＵ”″．Ｇ４１Ｂ’である。
ＭＳ−３４はＡＨ２２株のＨＩＳ４、Ｔ３ｑ ＲＰＩ遺伝子座にＩ Ｓ Ａ遺伝子を組み込んだｉｎｔ
ｅｇｒａｎ ｔである。この菌株の表現型はＩｅｕ−，
ＨＩｓ”，Ｇ４１８’であり、他の親株であるＴＨＢＳ
はＡＨ２２株のＬＥＵ２遺伝子座にＨ Ｂ ｓ Ａｇ遺
伝子を組み込んだｉｎｔｅｇｒａｎｔである。この表現
形はｈ ｉ ｓ− ，ＬＥＵ”″．Ｇ４１Ｂ’である。
したがって、上記の組み合わせで細胞融合を行った際に
２種の親株が融合して出現する菌株の表現型はＬＥＵ−
，ＨＩＳ’ ，Ｇ４ １８でとなることが予想される
からである。
２種の親株が融合して出現する菌株の表現型はＬＥＵ−
，ＨＩＳ’ ，Ｇ４ １８でとなることが予想される
からである。
本発明の融合酵母菌（ＦＫＯ−４）を単一コロニーとし
て単離した直後に、ＹＰＤ培地／中試験管にて３０゜Ｃ
にて７２時間振盪培養して、ＨＳＡ産生量をＥＬＩＳＡ
法にて、またＨＢｓＡｇをＲＰＨＡ法にて測定した結果
を第９表にまとめた。
て単離した直後に、ＹＰＤ培地／中試験管にて３０゜Ｃ
にて７２時間振盪培養して、ＨＳＡ産生量をＥＬＩＳＡ
法にて、またＨＢｓＡｇをＲＰＨＡ法にて測定した結果
を第９表にまとめた。
同様にして親株であるＴＭＳ−３４及びＴ Ｈ Ｂ Ｓ
を同一の条件下に振盪培養して、ＩＳＡ産生量をＥＬＩ
ＳＡ法にて、またＨＢｓＡｇをＲ Ｐ Ｈ Ａ法にて測
定した結果を第９表にまとめた。融合細胞のＨＳＡ産生
量は親株と比較して上昇していた。
を同一の条件下に振盪培養して、ＩＳＡ産生量をＥＬＩ
ＳＡ法にて、またＨＢｓＡｇをＲ Ｐ Ｈ Ａ法にて測
定した結果を第９表にまとめた。融合細胞のＨＳＡ産生
量は親株と比較して上昇していた。
さらに、非選択培地であるＹＰＤプレート上で８回継代
（１回継代／Ｉ日）培養した融合酵母菌のＩＳＡ産生量
をＥＬＩＳＡ法にて、またＨＢｓＡｇ産生量をＲＰＨＡ
法にて測定した結果を第１０表にまとめた。この結果か
らも明らかなように、非選択培地中で長期継代培養後も
ＨＳＡおよびＨＢｓＡｇ産生量は実質的に低下していな
かった。
（１回継代／Ｉ日）培養した融合酵母菌のＩＳＡ産生量
をＥＬＩＳＡ法にて、またＨＢｓＡｇ産生量をＲＰＨＡ
法にて測定した結果を第１０表にまとめた。この結果か
らも明らかなように、非選択培地中で長期継代培養後も
ＨＳＡおよびＨＢｓＡｇ産生量は実質的に低下していな
かった。
さらに、非選択培地であるＹＰＤプレート上で８日間（
１回／１日）植え次いだ各クローンから１０個ずつ単一
クローンを単離して、マーカー保存率を調べてることに
よって、マーカーの安定性を調べて第１１表に示した。
１回／１日）植え次いだ各クローンから１０個ずつ単一
クローンを単離して、マーカー保存率を調べてることに
よって、マーカーの安定性を調べて第１１表に示した。
この結果からも明らかなように、非選択培地中で長期継
代培養後もマーカー遺伝子を安定に保持していた。
代培養後もマーカー遺伝子を安定に保持していた。
［効果］
本発明によれば、同し異種蛋白質を発現する２種の親株
から、融合酵母菌を製造することによって当該異種蛋白
産生量を上昇させることが出来るので異種蛋白産生効率
を大幅に改善することが可能である。
から、融合酵母菌を製造することによって当該異種蛋白
産生量を上昇させることが出来るので異種蛋白産生効率
を大幅に改善することが可能である。
また、本発明によれば、各々異種蛋白質を発現する２種
の親株から、融合酵母菌を製造することによって二種類
以上の外来蛋白質を産生ずる融合酵母菌菌の育種が実現
できる。これによって、例えば生産コストの安い蛋白質
と生産コス１・の高い蛋白質を産生している菌株同志を
融合すれば、両蛋白質を産生ずる菌株を取得できるため
大幅なコスト・ダウンが実現できる可能性がある。また
、菌体外分泌と菌体内産生をうまく組み合わせれば、外
来蛋白質同志の相互の夾雑も最小限に抑えられるであろ
う。
の親株から、融合酵母菌を製造することによって二種類
以上の外来蛋白質を産生ずる融合酵母菌菌の育種が実現
できる。これによって、例えば生産コストの安い蛋白質
と生産コス１・の高い蛋白質を産生している菌株同志を
融合すれば、両蛋白質を産生ずる菌株を取得できるため
大幅なコスト・ダウンが実現できる可能性がある。また
、菌体外分泌と菌体内産生をうまく組み合わせれば、外
来蛋白質同志の相互の夾雑も最小限に抑えられるであろ
う。
〔以下余白］
融合酵母菌ＦＫＯ−１と親株のＩＩｓ＾産生Ｃｌｏｎｅ
Ｎｏ． ＵＳＡ産生量（ｍｇ／ｌ） ＦＫＯ−１−０１ ＦＫＯ−１−０２ ＦＫＯ−１−０３ ＦＫＯ−１−０７ ＦＫＯ−１−１０ ＦＫＯ−１−１１ ＦＫＯ−１−１２ ＦＫＯ−１−１３ ＦＫＯ−１−１６ ＦＫＯ−１−２０ ＴＭＳ−３４ ＴＭＭ−２１ ５１．０ ４９．５ ３８．５ ３６．０ ３９．０ ３９．０ ３７．０ ３７．５ ４５．０ ４１．３ ３０．０ ２２，５ 第６表 単一コロニーとして分離した直後に培養した融合酵母菌
ＦＫＯ−３と親株のＨＳＡ産生Ｃｌｏｎｅ 糖 ＨＳ＾産生量 （ｍｇ／ｌ） ＦＫＯ−３−０１ ＰＫＯ−３−Ｏｆ ＦＫＯ−３−０９ ＦＫＯ−３−０９ ＦＫＯ−３−１１ ＦＫＯ−３−１１ ＦＫＯ−３−１２ ＦＫＯ−３４２ ＦＫＯ−３−１５ ＦＫＯ−３−１５ ＦＫＯ−３−１６ ＦＫＯ−３−１６ ＴＭＳ−３４ ＴＭＳ−３４ ＴＭＭ−２３ ＴＭＭ−２３ デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース ２６．６ ４７．３ ２７．８ ４１．１ ２６．３ ４４．５ ２５．０ ４５．０ ２８．６ ４３．８ ２６．２ ４４，７ ３１．０ ３０．０ 検出限界以下 ２４．８ 第９表 単一コ１コニーとして分離した直後に培なした融合酵母
菌ＦＫＯ−４と親株のＩＩｓ＾産生１１３Ａ産生＋ｆｆ
ｉ（ｍｇ／Ｉ） Ｉｆ Ｂ ｓ Ａ ｇ産生＋ｉｔ（２”）０−４−０１ ０−４−０４ ０−４−０７ ０−４−１１ ０−４−１２ ０−４−１３ ０−４−１６ ：）−４−１８ ３−４−１９ ）−４−２０ ３−３４ ３３ ２４．８ １９．５ １７．９ ２０．０ ２１．２ ２２．５ ２３．５ １８．５ ２２．０ ２３ ０ ２２．５ 検出限界以下 Ｊ ３ ｍｆｌ ／中試験管にて３０゛Ｃで７２時間振
盪ＩＨ：４養。
Ｎｏ． ＵＳＡ産生量（ｍｇ／ｌ） ＦＫＯ−１−０１ ＦＫＯ−１−０２ ＦＫＯ−１−０３ ＦＫＯ−１−０７ ＦＫＯ−１−１０ ＦＫＯ−１−１１ ＦＫＯ−１−１２ ＦＫＯ−１−１３ ＦＫＯ−１−１６ ＦＫＯ−１−２０ ＴＭＳ−３４ ＴＭＭ−２１ ５１．０ ４９．５ ３８．５ ３６．０ ３９．０ ３９．０ ３７．０ ３７．５ ４５．０ ４１．３ ３０．０ ２２，５ 第６表 単一コロニーとして分離した直後に培養した融合酵母菌
ＦＫＯ−３と親株のＨＳＡ産生Ｃｌｏｎｅ 糖 ＨＳ＾産生量 （ｍｇ／ｌ） ＦＫＯ−３−０１ ＰＫＯ−３−Ｏｆ ＦＫＯ−３−０９ ＦＫＯ−３−０９ ＦＫＯ−３−１１ ＦＫＯ−３−１１ ＦＫＯ−３−１２ ＦＫＯ−３４２ ＦＫＯ−３−１５ ＦＫＯ−３−１５ ＦＫＯ−３−１６ ＦＫＯ−３−１６ ＴＭＳ−３４ ＴＭＳ−３４ ＴＭＭ−２３ ＴＭＭ−２３ デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース デキストロース ガラクトース ２６．６ ４７．３ ２７．８ ４１．１ ２６．３ ４４．５ ２５．０ ４５．０ ２８．６ ４３．８ ２６．２ ４４，７ ３１．０ ３０．０ 検出限界以下 ２４．８ 第９表 単一コ１コニーとして分離した直後に培なした融合酵母
菌ＦＫＯ−４と親株のＩＩｓ＾産生１１３Ａ産生＋ｆｆ
ｉ（ｍｇ／Ｉ） Ｉｆ Ｂ ｓ Ａ ｇ産生＋ｉｔ（２”）０−４−０１ ０−４−０４ ０−４−０７ ０−４−１１ ０−４−１２ ０−４−１３ ０−４−１６ ：）−４−１８ ３−４−１９ ）−４−２０ ３−３４ ３３ ２４．８ １９．５ １７．９ ２０．０ ２１．２ ２２．５ ２３．５ １８．５ ２２．０ ２３ ０ ２２．５ 検出限界以下 Ｊ ３ ｍｆｌ ／中試験管にて３０゛Ｃで７２時間振
盪ＩＨ：４養。
１産生量はＥｌ．ＩＳＡ法にて測定。
３八．産生量はＲＩＩＩＩＡ法にて測定。
第１図（ａ）〜（ｅ）は、それぞれプラスミドｐＭＭ０
０６、ｐＨＯ０ １ｌＳｐＭｓＯＯ８、ｐＭＭＯ１０お
よびｐｌＮＴ／ＨＢを示す。 手続補正書印発） 平或１年１０月１２日 特言午庁長官 殿 平成１年１０月
１３日差出１．事件の表示 平或１年特許願第１８８１７３号 ２．発明の名称 異種蛋白発現用融合酵母菌、該菌の製造方法および異種
蛋白の製造方法 ３．補正をする者 事件との関係 特許出願人 氏名（名称） 株式会社ミドリ十字 ４．代理メ■５４１ 住所 大阪市中央区平野町三丁目３番９号（湯本ビル） Ｔａ （０６） ２２７−１１５６ ？細書の「発明の詳細な説明」の欄および「図面１
／く；■霞ゝ＼６．゜補正
の内容 （１）明細書第２１頁第１３行のｒＥＬＩｓＡ法」の後
に「あるいはＲＰＨＡ法」を加入する。 （２）明細書第２１頁第１７行のｒ ０． ５ Ｍ Ｊ
を「０．０５ＭＪに訂正する。 （３）明細書第２１頁第２０行の「感作」を「吸着」に
訂正する。 （４）明細書第２２頁第４行〜６行の「加える。 ベルオキシダーゼ・・・測定する。」を「添加後、発色
液を加えて発色した色素を４９２ｎｍで定量する。」に
訂正する。 （５）明細書第２４頁第１０行の「（宝酒造より人手）
」の後に「及びＴ）ＡＴ１５３Ｊを加入する。 （６）明細書第２４頁第１４行のｒｐＵｃｌ９Ｊの後に
「またはｐＡＴ１５３Ｊを加入する。 （７）明細書第２５頁第ｌ行、第７行および第ｌ３行の
「ＳＵＳ２」をｒｓＵｃ２Ｊに訂正ずる。 （８）明細書第２９頁第１３〜１５行の「寒天培地・・
・拡げた。」を「４５゜Ｃに保温した１０成の寒天培地
と混合して、ロイシン不合培地からなるプレートに拡げ
た。」に訂正する。 （９）明細書第３３頁第１２行のｒｃａｃ１ｇの後にｒ
ｉ ｎ ＹＰＤＪを加入する。 （ｉｌｌ） 明細書第３６頁第１〜２行、第３８頁第
１８〜１９行および第４１頁第ｌＯ〜１１行の「マーカ
ー保存率を調べることによって、」を削除する。 （ＩＩ）明細書３７頁第１５行のｒＹＰＤ培地」の後に
「またはＹＰＧ培地」を加入する。 ０２）明細書第３８頁第１〜５行の「融合細胞の・・・
産生量は多かった。」を「糖原としてグルコースを使用
した場合と、ガラクトースを使用した場合とを比較する
と、ガラクトースを使用した場合の方が産生量は多かっ
た。 ガラクトースを糖源とした時の融合細胞のＨＳＡ産生量
は親株と比較して上昇していた。」に訂正する。 ０３）明細書第３８頁第１１〜１２行の「７２時間」を
削除する。 圓 明細書第４０頁第９行のｒＬＥＵＪを「ＬＥＵ４」
に訂正する。 ０５１ 明細書第４０頁第２０行の「比較して上昇し
ていた。」を「比較してほとんど変化なかった。Ｊに訂
正する。 ０６）明細書第４８頁第５表、第５１頁第８表、および
第５４頁第Ｉ１表を別紙の通り差し換える。 ｑ力 図面の第１図 （ａ）〜（ｅ） を別紙の通り
差し換える。
０６、ｐＨＯ０ １ｌＳｐＭｓＯＯ８、ｐＭＭＯ１０お
よびｐｌＮＴ／ＨＢを示す。 手続補正書印発） 平或１年１０月１２日 特言午庁長官 殿 平成１年１０月
１３日差出１．事件の表示 平或１年特許願第１８８１７３号 ２．発明の名称 異種蛋白発現用融合酵母菌、該菌の製造方法および異種
蛋白の製造方法 ３．補正をする者 事件との関係 特許出願人 氏名（名称） 株式会社ミドリ十字 ４．代理メ■５４１ 住所 大阪市中央区平野町三丁目３番９号（湯本ビル） Ｔａ （０６） ２２７−１１５６ ？細書の「発明の詳細な説明」の欄および「図面１
／く；■霞ゝ＼６．゜補正
の内容 （１）明細書第２１頁第１３行のｒＥＬＩｓＡ法」の後
に「あるいはＲＰＨＡ法」を加入する。 （２）明細書第２１頁第１７行のｒ ０． ５ Ｍ Ｊ
を「０．０５ＭＪに訂正する。 （３）明細書第２１頁第２０行の「感作」を「吸着」に
訂正する。 （４）明細書第２２頁第４行〜６行の「加える。 ベルオキシダーゼ・・・測定する。」を「添加後、発色
液を加えて発色した色素を４９２ｎｍで定量する。」に
訂正する。 （５）明細書第２４頁第１０行の「（宝酒造より人手）
」の後に「及びＴ）ＡＴ１５３Ｊを加入する。 （６）明細書第２４頁第１４行のｒｐＵｃｌ９Ｊの後に
「またはｐＡＴ１５３Ｊを加入する。 （７）明細書第２５頁第ｌ行、第７行および第ｌ３行の
「ＳＵＳ２」をｒｓＵｃ２Ｊに訂正ずる。 （８）明細書第２９頁第１３〜１５行の「寒天培地・・
・拡げた。」を「４５゜Ｃに保温した１０成の寒天培地
と混合して、ロイシン不合培地からなるプレートに拡げ
た。」に訂正する。 （９）明細書第３３頁第１２行のｒｃａｃ１ｇの後にｒ
ｉ ｎ ＹＰＤＪを加入する。 （ｉｌｌ） 明細書第３６頁第１〜２行、第３８頁第
１８〜１９行および第４１頁第ｌＯ〜１１行の「マーカ
ー保存率を調べることによって、」を削除する。 （ＩＩ）明細書３７頁第１５行のｒＹＰＤ培地」の後に
「またはＹＰＧ培地」を加入する。 ０２）明細書第３８頁第１〜５行の「融合細胞の・・・
産生量は多かった。」を「糖原としてグルコースを使用
した場合と、ガラクトースを使用した場合とを比較する
と、ガラクトースを使用した場合の方が産生量は多かっ
た。 ガラクトースを糖源とした時の融合細胞のＨＳＡ産生量
は親株と比較して上昇していた。」に訂正する。 ０３）明細書第３８頁第１１〜１２行の「７２時間」を
削除する。 圓 明細書第４０頁第９行のｒＬＥＵＪを「ＬＥＵ４」
に訂正する。 ０５１ 明細書第４０頁第２０行の「比較して上昇し
ていた。」を「比較してほとんど変化なかった。Ｊに訂
正する。 ０６）明細書第４８頁第５表、第５１頁第８表、および
第５４頁第Ｉ１表を別紙の通り差し換える。 ｑ力 図面の第１図 （ａ）〜（ｅ） を別紙の通り
差し換える。
Claims (7)
- （１）染色体に異種蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み
込まれた異種蛋白産生能を有する第１の酵母菌と、染色
体に異種蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み込まれた異
種蛋白産生能を有する第２の酵母菌とを融合させてなる
、両親酵母菌の異種蛋白産生能を合せ持つ融合酵母菌。 - （２）第１の酵母菌に組み込まれたＤＮＡ配列がコード
する蛋白質と第２の酵母菌に組み込まれたＤＮＡ配列が
コードする蛋白質とが同一蛋白質である請求項１記載の
融合酵母菌。 - （３）第１の酵母菌に組み込まれたＤＮＡ配列がコード
する蛋白質と第２の酵母菌に組み込まれたＤＮＡ配列が
コードする蛋白質とが異なる蛋白質である請求項１記載
の融合酵母菌。 - （４）染色体に異種蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み
込まれた異種蛋白産生能を有する第１の酵母菌と、染色
体に異種蛋白をコードするＤＮＡ配列が組み込まれた異
種蛋白産生能を有する第２の酵母菌とを融合させること
を特徴とする両親酵母菌の異種蛋白産生能を合せ持つ融
合酵母菌の製造方法。 - （５）第１の酵母菌に組み込まれたＤＮＡ配列がコード
する蛋白質と第２の酵母菌に組み込まれたＤＮＡ配列が
コードする蛋白質とが同一蛋白質である請求項４記載の
融合酵母菌の製造方法。 - （６）第１の酵母菌に組み込まれたＤＮＡ配列がコード
する蛋白質と第２の酵母菌に組み込まれたＤＮＡ配列が
コードする蛋白質とが異なる蛋白質である請求項４記載
の融合酵母菌の製造方法。 - （７）請求項１に記載の融合酵母菌を培養して異種蛋白
質を生成させ、これを採取することを特徴とする異種蛋
白質の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1188173A JP2855130B2 (ja) | 1989-07-19 | 1989-07-19 | 異種蛋白発現用融合酵母菌、該菌の製造方法および異種蛋白の製造方法 |
| EP90113645A EP0409156A1 (en) | 1989-07-19 | 1990-07-17 | Fused yeast for foreign protein expression, methods of producing said yeast and methods of producing foreign proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1188173A JP2855130B2 (ja) | 1989-07-19 | 1989-07-19 | 異種蛋白発現用融合酵母菌、該菌の製造方法および異種蛋白の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0353877A true JPH0353877A (ja) | 1991-03-07 |
| JP2855130B2 JP2855130B2 (ja) | 1999-02-10 |
Family
ID=16219038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1188173A Expired - Lifetime JP2855130B2 (ja) | 1989-07-19 | 1989-07-19 | 異種蛋白発現用融合酵母菌、該菌の製造方法および異種蛋白の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0409156A1 (ja) |
| JP (1) | JP2855130B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0683233A2 (en) | 1994-05-18 | 1995-11-22 | The Green Cross Corporation | Process for producing recombinant human serum albumin |
| WO2009139464A1 (ja) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | 株式会社アールテック・ウエノ | ドライアイおよび／または角結膜障害処置のための医薬組成物 |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0671432B2 (ja) * | 1991-03-20 | 1994-09-14 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
| US6268140B1 (en) * | 1994-02-03 | 2001-07-31 | Neugenesis | Combinatorial metabolic libraries |
| US5643745A (en) * | 1994-02-03 | 1997-07-01 | University Of Hawaii | Heterologous dimeric proteins produced in heterokaryons |
| US7148054B2 (en) | 1997-01-17 | 2006-12-12 | Maxygen, Inc. | Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination |
| US6326204B1 (en) | 1997-01-17 | 2001-12-04 | Maxygen, Inc. | Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination |
| US6232112B1 (en) * | 1997-11-24 | 2001-05-15 | Flinders Technologies Pty Ltd Of Flinders University | Reagents and methods for diversification of DNA |
-
1989
- 1989-07-19 JP JP1188173A patent/JP2855130B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-07-17 EP EP90113645A patent/EP0409156A1/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0683233A2 (en) | 1994-05-18 | 1995-11-22 | The Green Cross Corporation | Process for producing recombinant human serum albumin |
| WO2009139464A1 (ja) | 2008-05-15 | 2009-11-19 | 株式会社アールテック・ウエノ | ドライアイおよび／または角結膜障害処置のための医薬組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0409156A1 (en) | 1991-01-23 |
| JP2855130B2 (ja) | 1999-02-10 |
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