JPH0354090B2

JPH0354090B2 -

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Publication number: JPH0354090B2
Application number: JP57135290A
Authority: JP
Priority date: 1981-08-04
Filing date: 1982-08-04
Publication date: 1991-08-19
Also published as: JPS5829715A; US4439357A; DE3130770A1; EP0071888A2; EP0071888A3; ATE20700T1; DE3130770C2; EP0071888B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は赤血球のβプロピオラクトン処理、溶
血、H⁺型陽イオン交換樹脂による溶血質の処理、
基質脂質の定量分離および滅菌濾過による、肝炎
の恐れのない無菌、無発熱素、無基質のヘモグロ
ビン溶液の製造方法に関する。

ヘモグロビン溶液は生体中の赤血球にかかわり
なく、酸素を輸送することができる。しかしこの
溶液の生理的適合のために、溶血によつてヘモグ
ロビンが遊出する血液の血漿と細胞成分をなるべ
く完全に除去することが必要である（血漿蛋白
質、基質、白血球、血小板）。

赤血球を生理的電解質溶液に懸濁させ、次に間
欠操作の遠心分離機で遠心分離により赤血球を分
離することによつて、血漿蛋白質と赤血球を分離
する上記のヘモグロビン溶液の製造方法が、西独
特許出願第2248475号（日本国特開昭50−12223号
公報に対応）により公知である。

フランク・デ・ヴエヌート、ハロルド・ジエ
イ・フリードマン、ジエイ・ライアン・ヌヴイ
ユ、カールシー・ベツク著「代用血液としてのヘ
モグロビン溶液の評価」（Appraisal of
Hemoglobin Solution as ａ Blood
Substitute）、「外科・産婦人科」（Surgery，
Gynecology ＆ Obstetrics）1979年９月、149
巻417−436頁に、晶出によつてヘモグロビンを得
る種々の方法が記載されている。

赤血球の洗浄に必要な間欠式遠心分離（血液遠
心分離機）も、晶出法に必要な透析も、臨床用に
必要な大量のヘモグロビン溶液の製造には不適当
な処理法である。慣用の間欠操作式遠心分離機の
容量は例えば約６に過ぎない。多数の間欠操作
式遠心分離機の使用は、極めて不経済である。

電解質溶液による赤血球の洗浄は最終製品の高
い電解質含量をもたらす。これは特殊な用途、例
えば開放心臓の手術での心臓冠状血管の潅注（心
臓発作）には不都合である。

西独特許出願第2248475号（日本国特開昭50−
12223号公報に対応）に記載された方法を除き、
その他のすべての製造方法では、使用の際に血清
肝炎の伝染が排除されない。

ところが西独特許出願第2248475号（日本国特
開昭50−12223号公報に対応）に記載されたβプ
ロピオラクトンによるる滅菌法も、この処理が最
初の処理段階として行われる欠点がある。つまり
使用されるβプロピオラクトンの量が、赤血球濃
縮液の製造に応じて残留する血漿蛋白質の残量に
作用するのである。このため赤血球に対して、残
留血漿量に従つて異なるβプロピオラクトン濃度
が作用する。

大量の血液を細胞成分と血漿に分離するための
連続操作式遠心分離機も知られており、例えば無
ヘモグロビン血漿の製造のために屠殺場で使用さ
れる。しかしこの方法では赤血球がはなはだしく
傷むので、特に多数回の通過でほぼ完全に破壊さ
れる。それ故、この連続式遠心分離は赤血球の洗
浄には不適当である。

本発明の目的とするところは、肝炎の恐れのな
い無菌、無発熱素、無基質のヘモグロビン溶液を
種々の適用領域に対して、臨床用に必要とされる
ような大量を経済的に製造することができ、かつ
赤血球の損傷の無い洗浄を可能にする、上記のヘ
モグロビンの製造方法を提供することである。

この目的は本発明により次のようにして達成さ
れる。すなわち赤血球濃縮液を１乃至６倍の容積
の、糖、糖アルコールまたは高分子量コロイドの
５乃至15％水溶液と撹拌しながら混合し、塩とし
て生理的に適合する酸で懸濁液のPH値を５乃至
6.5に調整し、撹拌機を停止した後、赤血球を沈
降させ、上澄液を除き、場合によつては上述の洗
浄処理を得た赤血球沈殿物で単数回または複数回
反復し、沈殿物のPH値を７乃至８に調整し、沈殿
物を均質化し、そのヘマトクリツトを55乃至60％
に調整し、希釈したβプロピオラクトン溶液で数
分乃至25分処理し、続いて前述の洗浄処理を単数
回または複数回反復し、赤血球を蒸留水にかき混
ぜて得た溶血質を次にH⁺型陽イオン交換体で、
PH値が5.0乃至5.5に低下するまで処理し、遠心分
離及び／又は濾過によつて樹脂と沈殿した基質を
除去し、PH値7.2乃至7.6並びに所望のヘモグロビ
ン濃度に調整し、場合によつては使用目的に応じ
て必要な添加物を加え、濾過による滅菌処理をす
るのである。

懸濁液中の赤血球は沈降しようとする。この現
象は血球沈降と呼ばれ、医学診断において炎症性
過程の識別のために使用される。正常な血球沈降
は約５mm／時である。各種の物質の添加によつ
て、赤血球沈降が速められる。沈降促進剤の応用
例が文献で知られている。例えばアール．ジー．
シユトラウス「デキシトラン、ヒドロキシエチル
殿粉および新しい低分子量ヒドロキシエチル殿粉
の赤血球沈降特性の生体内比較」（In vitro
Comparison of the Erythrocyte Sedimenting
Properties of Dextran，Hydroxyethyl Starch
and New Low−Molecular−Weight
Hydroxyethyl Starch）、「フオツクスツアング」
（Vox Sang）37：268−271（1979年）(3)によれ
ば、血小板および白血球濃縮液の製造のために高
分子量コロイドが使用される。オー・アカーブロ
ムおよびシー・エフ・ヘヒマン「スウエーデンに
おける赤血球細胞の冷凍保存の進歩」（Progress
in Freeze−Preservation of Red Blood Cells
in Sweden）（赤血球の低温冷凍保存に関するシ
ンポジウム、1973年11月27−28日、フランクフル
ト／マイン）(4)によれば、急速冷凍貯蔵の後に解
凍された赤血球濃縮液からグリセリンを除去する
際に、糖または糖アルコールが使用される。この
場合、種々の濃度のグルコースとフルクトースの
混合物が使用され、特定の配合比が指定される。
電解質濃度は10乃至最大15mmol／に制限され
る。このようにして(4)により沈降促進剤としての
砂糖または砂糖アルコールの使用が公知である
が、しかしこの促進剤を使用した沈降法はこれま
でヘモグロビンの製造においては（20年間）一度
も試みられたことがなかつた。何故なら酸素を輸
送するヘモグロビン溶液の分野の当業者は、赤血
球の急速冷凍を取扱う保存血液製造業者の分野に
示唆を求めないからである。

本発明による方法においては、上述の文献の記
述と異なり、砂糖または砂糖アルコールだけで沈
降が可能であることが判明した。数種の糖の特定
の混合物は本発明方法には必要でなく、前述のよ
うな広汎な用途を考えると望ましくないのであ
る。

同様にして、適当に低いPH値で処理すれば、多
重沈降を唯１種の糖濃度で行えば十分である。

本発明によれば、最大貯蔵期間を超えたために
輸液にもはや適さない赤血球濃縮液を、血液の種
類にかかわりなくプールして、１乃至６倍、好ま
しくは2.5倍の容積の５乃至15％、好ましくは10
％糖または糖溶液または高分子量コロイドと撹拌
しながら混合する。砂糖または砂糖アルコールと
してグルコース、マンニトール、フルクトース、
ソルビトール、キシリトール並びに二糖類、例え
ばサツカロース、麦芽糖を使用することができ
る。高分子量コロイドとしてヒドロキシエチル殿
粉またはデキシトランが適する。懸濁液のPH値は
生理的に適合する酸、例えば1N塩酸で５乃至
6.5、好ましくは5.4に調整する。特に原料の電解
質含量が高い時は、PH値5.4が好適であることが
判明した。

懸濁液の温度は全処理工程を通して２乃至18
℃、特に好ましくは10℃に保存するとよい。撹拌
機を停止した後、赤血球を15分乃至10時間、特に
好ましくは60分間沈降させる。沈降時間の後、上
澄を除き、沈殿物の容積を定め、洗浄処理を反復
する。こうして得た赤血球沈殿物を、PH値の７乃
至８、好ましくは7.4への調整によつて離解し、
撹拌により均質化する。沈殿物のヘマトクリツト
を沈降液により55乃至60％に調整する。次に撹拌
しながらβプロピオラクトン溶液を速やかに添加
する。1.5％沈降液で調合したばかりのβプロピ
オラクトン溶液を沈殿物リツトル当り0.166使
用することが好ましい。βプロピオラクトンの添
加の前に赤血球を２回または多数回洗浄すること
は、前に述べた方法と比べて、βプロピオラクト
ンの滅菌効果に影響する残留血漿がほとんど存在
しないという利点がある。このことは、常に不変
のβプロピオラクトン濃度が一定の赤血球容積に
作用することを意味する。

20分の作用時間の後にβプロピオラクトンはほ
とんど完全に反応している。反応生成物の除去の
ために、更に単数回または複数回、好ましくは３
回の洗浄を前述のように行う。洗浄した赤血球に
蒸留水を添加して、溶血を生じさせる。溶血は
1.5乃至５倍、特に好ましくは2.5倍の容積の蒸留
水でPH７で行うことが好ましい。基質の分離のた
めに、50乃至150、好ましくは80mval／の量の
H⁺型陽イオン交換樹脂で、PH値が5.0乃至5.5、好
ましくは5.1に低下するまで、溶血質を処理する
のが適当である。特に適当な陽イオン交換樹脂
は、乾燥樹脂ｇ当り４乃至5mvalの交換能力を持
つスルホン酸ポリスチロール陽イオン交換体、お
よび耐熱性、粒度、顔料含量および交換能力の点
で実質的に互いに異なるその他のポリスチロール
樹脂である。詳しくはケイ．ドルフナー著「イオ
ン交換体」（Ionenaustauscher）ワルター．デ．
グルイター、ベルリン（1964年）から知ることが
できる。

PH値を5.2乃至６、好ましくは5.65に上げた後、
イオン交換体を濾別し、沈殿した基質を連続遠心
分離及び／又は濾過により除く。PH値を7.2乃至
7.6、好ましくは7.4に調整し、所望のヘモグロビ
ン濃度に調整し、また場合によつては別の添加物
を添加した後溶液を滅菌濾過処理の前に再度遠心
分離及び／又は予備濾過する。

添加物は用途に応じて、ヘモグロビンの酸素送
出の改善のための電解質または効果物質、例えば
2.3−ジホスホグリセリン酸塩、燐酸ピリドキサ
ールまたはヘキサ燐酸イノシトールであることが
できる。

本発明の方法により沈降容器の大きさと利用可
能な遠心器能力に応じて、１回のバツチで任意の
量が製造される。

本発明による製品は添加物の種類に従つて、心
臓冠状血管（心臓発作）または切断また挫滅した
四肢の潅注に使用され、あるいは例えば西独特許
公報第2449885号または第2617822号に記載された
ような、化学的に改良された注射用ヘモグロビン
溶液の製造のための原料として使用される。

例え心臓発作用溶液は少量のNaおよびグルコ
ース含量を必要とする一方、四肢の潅注のために
は生理的Na値と高いグルコース含量が望ましい。

科学の現状では、人体に適用するにはヒト赤血
球を使用しなければならない。

実施例１ 111の赤血球濃縮液を160入り冷却式撹拌機付
真空容器にプールした。体積が26となつた。全
処理工程を通して温度を約10℃に保持した。10％
のグルコース溶液65を加え、PH値を5.4に調整
した後、10分間撹拌した。次に該混合物を45分間
沈降させて、上澄を吸出した。沈殿物は18.4％の
ヘモグロビンを含み、ヘマトクリツトが49％であ
つた。２回目の洗浄のために10％のグルコース溶
液112を補充し、PH値を5.4に修正し、10分間撹
拌し、改めて45分間沈降させた。

1N NaOHでPH値を7.4に上げた上で、沈殿物
（28、ヘマトクリツト67％、ヘモグロビン25.5
％）を撹拌して均質化した。ヘマトクリツトを10
％グルコース溶液で55乃至60％（59％）に調整し
た。次に4.9の1.5％βプロピオラクトン溶液を
10％グルコースに速やかに加え、撹拌しながら20
分間作用させた。その際PH値が7.14に低下した。
３回目の沈降のために10％グルコース溶液を補充
して1000リツトルにし、PH値を再び5.4に調整し
た。この沈降処理と４回目および５回目の沈降処
理は、前述のような行つた。第３回、第４回、第
５回の沈殿物の容積は31、27および24リツトルで
あつた。５回目の沈殿物のPH値を1N NaOHで
7.0に調整した。60リツトルの蒸留水と混合して、
溶血を生じさせた。30分間激しく撹拌した後、溶
血の完全性を調べた。基質の除去のためにまず
NaCl143ｇ、次に固形物ｇ当りの交換能を
4mval、ポリスチロール地の製造の際のジビニル
ベンゾール分８％、粒度297乃至840μmのH⁺型高
純度（pA級）陽イオン交換樹脂2.94Kgを加えた。
PH値が連続的に低下した。

PH5.1に達した時、2.5リツトルのNaOHを撹拌
しつつ徐々に加えた。PH値が5.65に上昇した。イ
オン交換体を粗目の篩で、また沈殿した基質を約
5000ｇで連続遠心分離により、分離した。こうし
て清澄した溶液のPH値を1N NaOH1.4リツトル
の添加により7.4に調整した。NaCl247ｇ、
NaHCO₃110ｇ、グルコース715ｇを加え、再び
遠心分離した。

最後の濾過による滅菌処理は二重に、すなわち
滅菌濾過に通常使用されるように、まず深い濾層
により、次に膜濾過器で行つた。

収量 60リツトルヘモグロビン含量８％実施例２ 122の赤血球濃縮液を実施例１と同様にプール
した。容積は29リツトル、温度10℃であつた。10
％マンニトール溶液72.5リツトルを加え、1N
HClでPH値を5.4に調整した後、10分間撹拌した。
沈降時間は45分であつて、沈殿物はヘモグロビン
22.8％を含み、ヘマトクリツト45％であつた。２
回目の洗浄を82.5リツトルの10％マンニトール溶
液で行つた。沈殿物の容積は24リツトルであつ
た。βプロピオラクトン処理を実施例１と同様に
行つた。３回目、４回目、５回目の洗浄のための
10％マンニトール溶液の量は75、65および63リツ
トルであつた。沈殿物の容積は26、25および17リ
ツトルであつた。以後は実施例１と同様に処理し
た。

収量 35リツトルヘモグロビン含量９％実施例３第１洗浄液 0.9％NaCl中の６％ヒドロキシエチル殿粉第２洗浄液 1.3％NaHCO₃中の６％ヒドロキシエチル殿粉１リツトルの洗浄液１を10リツトル入り容量に
予め入れ、７の赤血球濃縮液（合計約1.7）を
撹拌しつつ加えた。次に別の2.5の洗浄液１を
赤血球懸濁液に加え、赤血球懸濁液と洗浄液の比
を１：２とした。75分以内に細胞が沈降し、その
上澄と沈殿物の比が約１：１となつた。上澄を吸
出し、沈殿物を3.5の洗浄液２で撹拌しつつ再
懸濁し、続いて60分間沈降させた。なお0.18％の
蛋白質を含む上澄を除いた。ヘマトクリツト57.5
％の沈殿物に、βプロピオラクトン1.5％を含む
洗浄液１を415mlを加え、撹拌しつつ20分作用さ
せた。次に洗浄液２を補充して６とした。

60分の後に、ヘモグロビン0.15％を含む上澄を
吸出し、洗浄液１で沈降を繰返した。続いて実施
例１のように処理した。

収量 5.5 ヘモグロビン含量７％

Claims

【特許請求の範囲】１赤血球のβプロピオラクトン処理、溶血、
H⁺型陽イオン交換樹脂による溶血質の処理、基
質、脂質の定量分離および滅菌濾過による、肝炎
の恐れのない無菌、無発熱素、無基質の低カリウ
ム含量ヘモグロビン溶液の製造方法において、赤
血球濃縮液を１乃至６倍の容積の糖の、糖アルコ
ールのまたは高分子量コロイドの５乃至15％水溶
液と攪拌しながら混合し、塩として生理的に適合
する酸で懸濁液のPH値を５乃至6.5に調整し、攪
拌機を停止した後、赤血球を沈降させ、上澄液を
除き、場合によつては上述の洗浄処理を、得られ
た赤血球沈殿物で単数回または複数回反復し、該
沈殿物のPH値を７乃至８に調整し、沈殿物を均質
化し、そのヘマトクリツトを55乃至60％に調整
し、希釈したβプロピオラクトン溶液で数分乃至
25分処理し、続いて前述の洗浄処理を単数回また
は複数回反復し、赤血球を蒸留水にかき混ぜて得
た溶血質を次にH⁺型陽イオン交換体で、PH値が
5.0乃至5.5に低下するまで処理し、遠心分離及
び／又は濾過によつて樹脂と沈降した基質を除去
し、PH値7.2乃至7.6並びに所望のヘモグロビン濃
度に調整し、場合によつては使用目的に応じて必
要な添加物を加え、濾過による滅菌処理をするこ
とを特徴とする肝炎の恐れのない無菌、無発熱
素、無基質のヘモグロビン溶液の製造方法。２該洗浄処理の際に懸濁液の温度を２乃至18℃
に保つことを特徴とする特許請求の範囲第１項に
記載の方法。３該沈降処理の前に該懸濁液のPH値を5.4に調
整することを特徴とする特許請求の範囲第１項又
は第２項に記載の方法。４該赤血球を15分乃至10時間にわたつて沈降さ
せることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至
第３項の何れか１項に記載の方法。５該βプロピオラクトン処理の前に沈殿物のPH
値を7.4に調整することを特徴とする特許請求の
範囲第１項乃至第４項の何れか１項に記載の方
法。６該赤血球の洗浄をβプロピオラクトン処理の
前に２回、後に３回行うことを特徴とする特許請
求の範囲第１項乃至第５項の何れか１項に記載の
方法。