JPH0357084B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は歯科治療に於ける歯根管処理剤、同処
理用キツト乃至複合キツトに関する。

現在、う歯の治療に於いては、歯エナメル質を
削切後抜髄し、次いで歯根管（歯髄管）内壁に固
着残存する象牙芽細胞（Odontoblast）層をマイ
クロエンジン等の機械的手段により可及的に除去
しその後の処置を行なうという施術方法がしばし
ばなされている。

この方法によるとき、象牙芽細胞の除去程度の
判断が施術者の勘に頼らざるを得ないものである
ためその除去はしばしば不完全なものとなり易
く、その結果、残留象牙芽細胞中のライソゾーマ
ル酵素（Lysosomal Enzyme）などの作用によ
り長期経時後には歯根部に膿瘍を誘発する等の障
害が生起するものとなる。

先行技術に於ける歯科治療上の上記課題に鑑
み、本発明の主たる目的は抜髄後も歯根管内壁に
固着残存する象牙芽細胞層を機械的手段を要する
ことなく生化学的に極めて効果的に除去処理し得
る新規な歯根管処理剤乃至歯根管処理用キツト類
を提供することにある。

本発明の上記課題は、各種プロテアーゼ、就
中、コラゲナーゼを主成分とし、緩衝液、酵素賦
活物質等を補助成分とする歯根管処理剤又は施療
時に同剤を簡便に提供するための後記本発明各種
組合わせキツト類により効果的に達成される。す
なわち、本発明者らは歯根管壁固着象牙芽細胞が
プロテアーゼ、特にコラゲナーゼの作用により極
めて効果的に消化離脱処理され得ることを始めて
知見し、本発明に到達したものである。

以下、本発明処理剤乃至キツト類につきその構
成、用法・用量及び作用効果等をより詳細に分説
する。

象牙芽細胞消化離脱処理用酵素等 本発明に於いて使用され得る当該酵素は、未変
性コラーゲン基質に特異的に作用するコラゲナー
ゼと、これ以外のトリプシン、キモトリプシン、
ペプシン、パパイン等々のプロテアーゼ（以下、
これを「プロテアーゼ一般」と云う）とに大別さ
れる。

本発明者らの知見によれば、象牙芽細胞は所謂
コラーゲン・フアイバを介して幼若象牙質に固定
されており、従つて、これにコラゲナーゼを作用
させることにより極めて効果的且つ特異的に幼若
象牙質から離脱せしめ得るものである。これに対
し、プロテアーゼ一般の場合は、コラーゲン・フ
アイバのみならず細胞壁等にも作用するものと思
料され、この点でコラゲナーゼと作用機作を相違
するものであるが、充分高活性の酵素液を使用す
ればこれらのみによつても象牙芽細胞の略完全な
消化除去は可能である。

他方、両者の作用機作のこれらの相違をより効
果的に利用するものとして、抜髄後の歯根管をプ
ロテアーゼ一般により可及的に予備消化処理し、
次いでコラゲナーゼにより完全除去処理する方法
が提案され得る。すなわち、この方法によるとき
は予備消化処理によりコラゲナーゼのコラーゲ
ン・フアイバへの浸透がより加速されるものであ
り、結果的に迅速且つ確実な治療が達成され得る
ものである。

尚、本発明で使用し得るこれら酵素としては通
常市販の剤で足りるが、それらの種類、性質、緩
衝液等につき要約して示せば下記の通りである。

１ コラゲナーゼ Clositridium histolyticum，M.tuberculosis，
Bacteroides melaninogenicus，Streptomyces
madurae，Trichophyton schoenleinnii，
Aspergillus oryzae等々の各種微生物産生コラゲ
ナーゼ、マウス・フイブロブラスト等の各種動物
組織中存在コラゲナーゼ等々を典型的酵素として
例示し得るが、本発明はこれらに限定されもので
はなく、未変性コラーゲンに特異的に作用し得る
その他多種多様なコラゲナーゼを適宜使用し得る
ものであることは明らかである。これらコラゲナ
ーゼは通常、その賦活物質（activator）として
カルシウムイオン又はマグネシウムイオンを要求
し、他方、その至適PHは産生源により各相違する
が略PH6.5〜９の範囲内にある。従つて、本発明
処理剤にあつては、通常、コラゲナーゼ凍結乾燥
粉末乃至錠剤等を塩化カルシウム（Cacl₂）、炭酸
カルシウム（CaCO₃）等の賦活剤含有緩衝液に
溶解して実用に供される。

２ プロテアーゼ一般 ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カテ
プシン、フイシン、パパイン、ブロメライン等々
の所謂エンドペプチダーゼを主とし、PH値等の作
用条件が略一致しその作用を阻害しないものであ
る限りこれらに更にアミノぺプチダーゼ、カルボ
キシぺプチダーゼ等の所謂エキソぺプチダーゼを
混合併用し得る。

尚、これらの酵素は全て市販品をそのまま利用
し得る。

他方、前述予備消化処理に使用する場合、市販
コラゲナーゼ剤とその至適PH値を略一致させ得る
という点で、トリプシンが極めて好適である。

３ 緩衝液 リン酸塩、ホウ酸塩、トリス・HCL緩衝液等、
歯科治療上許容され得るものである限り各種の周
知緩衝液を適宜選択使用し得る。

尚、本発明処理剤の使用時間は比較的短時間と
なし得るので、反応終了後直ちに洗浄する限りそ
の毒性等の副作用は実質的に殆ど問題にならない
ものである。

４ 賦活剤 コラゲナーゼは通常その賦活物質としてCa²⁺
又はMg²⁺等を要求するものであることは前述の
通りであるが、これらはCaCl₂，CaCO₃，Ca
（CH₃COO）₂，MgCl₂，MgCO₃等、各種無機乃至
有機塩の形態で10^-3〜10^-1％程度の微量、添加さ
れれば足りる。

尚、緩衝液としてリン酸塩系のものを使用した
場合でも、例えばCaCl₂であれば約５×10^-3％程
度は安定的に溶存し得るので充分使用に耐え得
る。

５ 阻害剤 コラゲナーゼはEDTA，EGTA，σ−フエナ
ントロリン等のキレート剤乃至ジチオスレイトー
ル、システイン等のSH基保護剤によつて、その
活性を速やかに阻害される。

したがつて、これらの薬剤をコラゲナーゼの反
応停止液、洗浄液、口腔粘膜の保護剤として用い
得る。

用法・用量 １ 各種酵素の活性単位 本発明で使用する各種酵素の活性単位は合衆国
シグマ社（P.O.BOX 14508，ST.LOUIS，MO.，
63178 U.S.A.）規定に準じて下記の通り定義さ
れる。

ａ コラゲナーゼ１単位は、カルシウムイオンの
存在下PH7.4、37℃、５時間未変性コラーゲン
に作用させたとき、ニンヒドリン呈色で
1.0μmoleのロイシンに相当する量のアミノ酸
を遊離する活性として定義される。

ｂ トリプシン１単位は、PH7.6、25℃で１分間
当り1.0μmoleのα−Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−ア
ルギニンエチルエステル（BAEE）を加水分解
する活性として定義される。

ｃ その他の非特異的プロテアーゼ１単位は、PH
7.4、37℃で５時間カゼインに作用させたとき、
ニンヒドリン呈色で1.0μmoleのロイシンに相
当する量のアミノ酸を遊離する活性として定義
される。

２ 用量・用法 本発明処理剤は、う歯々冠部切削抜髄後、歯根
管を充分洗浄し、次いでこれを満たす量当該処理
剤を注入充填し、所定時間静置反応させ、その終
了後、再洗浄するという施術方式で使用される。

この洗浄にあたっては、歯科用次亜塩素酸ナト
リウム液を使用することも可能であるが、酵素と
してコラゲナーゼを用いる場合には、EDTA等
の前記阻害剤も用い得る。

歯科施療上、上記静置反応に要する時間は可及
的に短時間であることが望まれ、実際上は１時間
以内、より好ましくは数十秒〜数分の範囲内であ
るべきである。この観点からすれば、当該処理剤
に於ける各種酵素の活性は下記のように設定され
るべきである。

ａ コラゲナーゼ：少なくとも100Units／ml、
より好ましくは100〜10000Units／ml。

ｂ トリプシン：少なくとも500Units／ml、よ
り好ましくは10³〜８×10⁵Units／ml。

ｃ その他の非特異的プロテアーゼ：少なくとも
500Units／ml、より好ましくは、1500〜
50000Units／ml。

尚、用量の上記規定は、前述二段階処理方法の
場合にも、適切なものとして妥当するものと言い
得るが、より低活性でも使用され得る。

又、歯根管１本の容量は通常約１〜10μ程度
であり且つ歯１本当りのその数は１〜４本程度で
あるので、１回の施療に要する処理剤の量は、治
療歯数にもよるが、一般に20〜100μ程度とな
ろう。

従つて、施術に当り0.5〜１ml程度の処理剤を
調製することが実際的であるが、０〜４℃では約
１ケ月安定保存可能であるので、より大量を予め
調製、冷却保存してもよい。

キツト類 一般に酵素液は経時失活の可能性を有するもの
であるため、本発明処理剤はこれをキツトの形態
で提供することが特に有利である。本発明キツト
類につきその典型例の幾つかを以下に要約して示
す。

１ コラゲナーゼキツト 〔 第１アンプル： 0.067M，PH7.4リン酸塩緩衝液……１ml 第２アンプル： コラゲナーゼ（136Units／mg）……５
mg 及びCaCl₂ ……0.05mg 〔 第１アンプル： 0.01M，PH8.0リン酸塩緩衝液……１ml 第２アンプル： コラゲナーゼ（136Units／mg）……10
mg 及びCaCl₂ ……0.02mg 〔 第１アンプル： 0.002％CaCl₂含有 0.01M，PH8.0 リン酸塩緩衝液……１ml 第２アンプル： コラゲナーゼ（1000Units／mg）……0.1
mg 〔 第１アンプル： 0.05M CaCl₂含有 0.05M，PH7.0 ホウ酸塩緩衝液……１ml 第２アンプル： コラゲナーゼ（180Units／mg）……0.83
mg 尚、上記第１アンプルに代えて、より大容量の
バイアルとして使用時に上記量分取するようにし
てもよい。

２ プロテアーゼ一般キツト 〔 第１アンプル： 0.067M，PH7.4リン酸塩緩衝液……１ml 第２アンプル： トリプシン（8500Units／mg）……１mg 及びCaCl₂ ……0.01mg 〔 第１アンプル： 0.01M，PH8.0リン酸塩緩衝液……１mg 第２アンプル： トリプシン（8500Units／mg）……0.5mg 及びCaCl₂ ……0.05mg 〔 第１アンプル： 0.002％CaCl₂含有 0.01M，PH8.0 リン酸塩緩衝液……１mg 第２アンプル： トリプシン（8500Units／mg）……0.1mg 尚、その他のプロテアーゼ・キツトの場合も上
記に準じて提供される。

３ 複合型キツト 上記「2.プロテアーゼ一般キツト」を予備処理
用第１キツトとし、同「1.コラゲナーゼキツト」
を本処理用第２キツトとした組合せキツト。

以下、実験例により本発明をより詳細に説明す
る。

実験例 １ ウシより精製したタイプ及びコラーゲンを
基質として、in vitroにおけるコラゲナーゼの作
用を測定した。最終濃度150Units／mlとなる様、
トリス・HCl緩衝液に溶かしたコラゲナーゼ（和
光純薬社製、180Units／mg）とCaCl₂を混和し37
℃とした。最終濃度1.5mg／mlのコラーゲン基質
を添加することによつて反応を開始させた。一定
時間反応後停止させ、反応液中の未分解のコラー
ゲン基質を除去し、分解を受けたコラーゲン量を
280nmの吸収より求めた。第１０図に示す用量−
反応曲線からin vitroの系においては、15秒以内
という短時間でコラーゲンが分解され、CaCl₂の
至適濃度は50〜100mMであることが認められる。

実験例 ２ その周囲に付着する歯肉等の不用組織が完全に
除去された成牛の歯の歯冠部をグラインダにて横
切断し露出歯髄を摘出後、グラインダにて縦切断
し生理食塩水で充分洗浄して牛試料歯とした。

この試料歯を、コラゲナーゼ（シグマ社製グレ
ード、Type Ｖ−Ｓ；136Units／mg）をPH7.4，
0.067M−リン酸塩緩衝液（0.005％CaCl₂含有）
に溶解して得られるコラゲナーゼ活性６，
800Units／mlの処理液により試験管中で37℃、
60分間浸漬処理して処理試料歯とした。

次にこの処理試料歯を生理食塩水で充分洗浄
後、PH7.4，0.067M−リン酸塩緩衝液で希釈した
２％−グルタルアルデヒド溶液に浸漬して電子顕
微鏡用サンプルとした。

添付第１乃至２図は夫々拡大率1000倍及び
10000倍の無処理試料歯（対照）の走査型電子顕
微鏡写真図であり、他方、第３乃至４図は同じく
拡大率１，000及び10，000倍の上記コラゲナーゼ
処理試料歯電子顕微鏡写真図である。

これらを対比すれば明らかなように、コラゲナ
ーゼ処理された試料歯に於いては象牙芽細胞のみ
ならずコラーゲン・フアイバも含めて非常に鮮や
かに除去されていることが確認できる。

実験例 ３ 処理液としてトリプシン（シグマ社製グレ−
ド、Type，8500Units／mg）をPH7.4，
0.067Mリン酸塩緩衝液（0.005％CaCl₂含有）に
溶解して得られるトリプシン活性4.25×10⁵
Units／mlの酵素液を使用した他は前記実験例２
と同様にして、牛試料歯を処理して電子顕微鏡用
サンプルを得た。第５乃至６図は当該処理試料歯
の電子顕微鏡写真図（各1000及び10000倍）であ
る。

図から明らかなように、トリプシン処理試料歯
に於いては象牙芽細胞は略完全に除去されている
がコラーゲン・フアイバの一部は未消化のまま残
留しているが認められる。

実験例 ４ 緩衝液のPH値を各プロテアーゼの至適PH値に調
整した点を除き前記実験例２と同様にして牛試料
歯をキモトリプシン、ペプシン及びパパイン液
（各プロテアーゼ活性；140000Units／ml）にて
処理し、電子顕微鏡用サンプルを得た。

結果は、トリプシン処理とほぼ同等であると判
定された。

実験例 ５ 牛試料歯を前記と同様のトリプシン処理液で37
℃、10分間予備処理し、次いで生理食塩水で充分
洗浄後、前記と同様のコラゲナーゼ処理液で37
℃、10分間処理した。電子顕微鏡観察の結果、象
牙芽細胞、コラーゲン・フアイバ共に完全に除去
されていることが確認された。

実験例 ６ 前記実験例２と同一条件下、牛試料歯を試験管
内で浸漬処理し、処理液の280nmに於ける光学密
度（O.D）及び蛋白質含有量（Folin−Lowry変
法；牛血清アルブミン標準）の経時変化を測定し
た。結果を第７乃至８図に示す。

図から明らかなように、当該条件下での処理に
あつては、10〜15分経時により所定の目的が達成
される。

実験例 ７ １ 前記実験例２と同一条件下、ヒト試料歯（男
26才；部位、左下８番；症状Ｃ−２）を処理
し、電顕用サンプルを得た。電子顕微鏡観察の
結果、象牙芽細胞、コラーゲン・フアイバ共に
完全に除去されていることが確認された。

尚、試料歯として縦切断せず通常の治療の通
りマイクロエンジンで削切、抜髄したものを使
用し、その歯根管（歯髄腔）に処理液を注入、
処理した場合も上記と同等の結果が得られた。

２ ヒト試料歯を前記実験例２乃至４に準じて処
理し、処理歯を電子顕微鏡観察した結果、牛歯
の場合とほぼ同等の結果が得られることが確認
された。

実験例 ８ 牛試料歯を各種活性のコラゲナーゼ処理液で浸
漬処理し、処理液の280nmに於ける光学密度（O.
D）の経時変化（ΔO.D）を測定して第９図に示
す用量−反応曲線を得た。図から、歯象牙芽細胞
除去処理に実質的に有効な処理液の最小活性は約
100Units／ml程度と認められる。

尚、当該処理液は、前出シグマ社コラゲナーゼ
（136Units／mg）の各１〜10mgを、PH7.4，0.05M
−トリス・塩酸緩衝液（0.005％CaCl₂含有）１ml
に溶解して調製されたものである。

他方、トリプシン乃至その他のプロテアーゼ類
についても上記と同様な実験を行ない、施療上実
質的に有用な用量（活性）を前述の通り求めたも
のである。

実験例 ９ ICR系マウス一群10頭を使用し、コラゲナー
ゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パ
パインを各々生理的食塩水に溶解乃至懸濁、その
0.5mlを経口投与し、14日間マウスの生死を観察
した。コラゲナーゼについては、100mMCaCl₂存
在下においても同様の実験を行なつた。

Litchfield ＆ Wilcoxon法に従つて算出した
LD₅₀値は、いずれの場合においても5000mg／Kg
体重以上であり、無毒性であつた。

【図面の簡単な説明】

添付第１乃至６図は本発明実験例に於ける電子
顕微鏡写真図、同第７乃至１０図は同実験説明図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プロテアーゼを主成分とする歯根管処理剤。 ２ 前記プロテアーゼがトリプシン、キモトリプ
   シン、ペプシン及びパパインより成る群から選択
   された酵素であることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の前記処理剤。 ３ 前記プロテアーゼがコラゲナーゼであること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の前記
   処理剤。 ４ コラゲナーゼを、所要の場合その賦活物質を
   含有する緩衝液に溶解して成る特許請求の範囲第
   ３項に記載の前記処理剤。 ５ そのコラゲナーゼ活性が、少なくとも
   100Units／mlであることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項に記載の前記処理剤。 ６ そのコラゲナーゼ活性が、100−
   10000Units／mlであることを特徴とする特許請
   求の範囲第５項に記載の前記処理剤。 ７ 前記賦活物質がカルシウム又はマグネシウム
   イオンであることを特徴とする特許請求の範囲第
   ４乃至６項に記載の前記処理剤。 ８ コラゲナーゼ剤とこれをその至適PHに維持す
   るための緩衝液との組合わせから成る歯根管処理
   用キツト。 ９ 前記コラゲナーゼ剤を所定量の前記緩衝液に
   溶解したときそのコラゲナーゼ活性が少なくとも
   100Units／mlである特許請求の範囲第８項に記
   載の前記キツト。 １０ そのコラゲナーゼ活性が100−
   10000Units／mlである特許請求の範囲第９項に
   記載の前記キツト。 １１ 前記緩衝液がリン酸塩緩衝液、トリス緩衝
   液及びホウ酸緩衝液のいずれかである特許請求の
   範囲第８乃至１０項のいずれかに記載の前記キツ
   ト。 １２ 所要の場合、コラゲナーゼ賦活剤を更に組
   合わせて成る特許請求の範囲第８乃至１１項のい
   ずれかに記載の前記キツト。 １３ 前記賦活剤が前記コラゲナーゼ剤及び／又
   は前記緩衝液に予め添加されて成る特許請求の範
   囲第１２項に記載の前記キツト。 １４ 前記賦活剤がカルシウム塩又はマグネシウ
   ム塩である特許請求の範囲第１３項に記載の前記
   キツト。 １５ コラゲナーゼ以外のプロテアーゼ剤を主剤
   として有する予備処理のための第１キツトと、コ
   ラゲナーゼ剤を主剤として有する本処理のための
   第２キツトとを組合わせて成る歯根管処理用複合
   キツト。 １６ 前記プロテアーゼがトリプシン、キモトリ
   プシン、ペプシン及びパパインのいずれかである
   特許請求の範囲第１５項に記載の前記複合キツ
   ト。 １７ 前記第１キツトが前記プロテアーゼ剤とこ
   れをその至適PHに維持するための緩衝液と、前記
   第２キツトが前記コラゲナーゼ剤とこれをその至
   適PHに維持するための緩衝液とを組合わせてなる
   特許請求の範囲第１５又は１６項に記載の前記複
   合キツト。 １８ 前記プロテアーゼ剤を所定量の前記緩衝液
   に溶解したときそのプロテアーゼ活性が500−８
   ×10⁵Units／mlである特許請求の範囲第１７項
   に記載の前記複合キツト。 １９ 前記コラゲナーゼ剤を所定量の前記緩衝液
   に溶解したときそのコラゲナーゼ活性が100−
   10000Units／mlである特許請求の範囲第１７項
   に記載の前記複合キツト。 ２０ 前記プロテアーゼ剤がトリプシン剤である
   特許請求の範囲第１８項に記載の前記複合キツ
   ト。