JPH0357747B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はグルコアミラーゼの製造法に関する。
更に詳しくは、グルコアミラーゼ産生能を有する
ロドスポリデイウム属に属する赤色酵母を用いる
グルコアミラーゼの製造法に関する。 グルコアミラーゼ（EC3.2.1.3）は、アミログ
ルクシダーゼとも呼ばれ、アミロース、アミロペ
クチン、グリコーゲン、デキストリン等のα−
１，４グルコシド結合を有する多糖に作用し、そ
の非還元末端からグルコース単位に切断していく
酵素として知られている。 従来、グルコアミラーゼを産生する微生物とし
て糸状菌のリゾープス属及びアスペルギルス属に
属する菌株が知られており、特にリゾープス・デ
レマー（R.delemar）、リゾープス・ニベウス
（R.niveus）、リゾープス・ジヤバニカス（R.
javanicus）、アスペルギルス・ニガー（A.niger）
及びアスペルギルス・アワモリ（A.awamori）
等がグルコアミラーゼ産生能の高い菌株として知
られている。そして又酵母菌又は酵母類似菌のエ
ンドミコプシス属、及びエンドミセス属に属する
菌株も強力なグルコアミラーゼ産生菌として知ら
れている。 本発明者は、酒造用糖化酵素を得る目的で広く
自然界よりグルコアミラーゼ産生能の高い酵母菌
株をスクリーニングすることを試みた。そして鋭
意研究した結果、澱粉工場周辺の土壌よりグルコ
アミラーゼ産生能の高い酵母の１菌株を見い出す
ことに成功した。 そして本菌株について菌学的性質を検討した結
果、赤色酵母の１種であるロドスポリデイウム
（Rhodosporidium）属に属することがわかつた。 これまで酵母菌又は酵母類似菌でグルコアミラ
ーゼを産生する菌株として、前記したエンドミコ
シプシス属、エンドミセス属に属する菌株の他に
もサツカロミセス・セレビゼー（S.
cerevisiae）；ジヤーナル・オブ・バクテリオロ
ジー（J.Bacteriol.）第138巻1022〜1025頁
（1979）、リポミセス・コノネンコアン（K.
kononenkoan）；ヨーロツピアン・ジヤーナル・
オブ・アプライド・マイクロビオロジカル・バイ
オテクノロジー（Eur.J.Appl.Microbiol.
Biotechnol.）第11巻241〜250頁（1979）、サツカ
ロミセス・ジアスタテイカス（S.diastaticus）；
ジヤーナル・オブ・インストラクチユアル・ブリ
ユワーリー（J.Inst.Brew.）第87巻244〜247頁
（1981）等が知られているが、ロドスポリデイウ
ム属に属する菌株でグルコアミラーゼ産生能を有
することの報告はなく、かつ適当な栄養培地で本
菌株を培養し、培養物から採取されるグルコアミ
ラーゼは、酒造用糖化酵素としてのみならずブド
ウ糖製造用酵素としての用途も期待できることを
知り本発明を完成したものである。 次に本菌株の菌学的性質について述べる。 ａ 各培地における生育状態 本菌株は麦芽汁寒天培地又はMY寒天培地に
おいてよく生育し、その細胞形態は大きさが
2.5μ×5μであり、楕円形をなしている。増殖の
形態は多極出芽であり、そして偽菌糸又は真菌
糸を形成するが２週間の生育においても
ballistospore（射出胞子）は観察されなかつた。
又、麦芽汁寒天培地、MY寒天培地、オートミ
ール寒天培地において分裂子を形成しないが
teliospore（テリオスポア）、clamp connection
（クランプコネクシヨン）をオートミール寒天
培地上で形成する。 ｂ 各生理的性質 硝酸塩の同化 （＋） ビタミンの要求性 （−） デンプン様物質の生成 （−） アルブチンの分解性 （＋） カロチノイドの生成 （＋） 生成色素はα−カロチンである。 尿の分解 （＋） グルコース、シユークロースの発酵性がな
い。 ｃ 各種糖類の資化性 グルコース ＋ ガラクトース ＋ Ｌ−ソルボース ＋ シユークロース ＋ マルトース ＋ セロビオース ＋ トレハロース ＋ ラクトース − メリビオース − ラフイノース ＋ メレジトース ＋ イヌリン ＋ 可溶性澱粉 ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｄ−リボース ＋ Ｌ−ラムノース − エタノール ＋ グリセロール ＋（弱） エリスリトール − リビトール ＋（弱） イノシツト − Ｄ−マニトール ＋ ガラクチトール ＋ α−メチル−Ｄ− Ｄ−グルチトール ＋ グルコシド ＋ サリシン ＋ DL乳酸 − コハク酸 ＋（弱） クエン酸 − 以上の結果、特にカロチノイド色素を生成する
こと及び射出胞子が形成されないこと等より本菌
株はThe Yeast第２版（1971） 803〜814頁の
記載に基づき、ロドスポリデイウム属に属するこ
とがわかり、本菌株をRhodosporidium sp.J−
5Bと命名した。そして本菌株はFERM−ＰNo.
6948として工業技術院微生物研究所に寄託されて
いる。 本菌株を培養しグルコアミラーゼを生産するに
際し、使用する栄養培地としてはトウモロコシ、
大麦、小麦、コメ等の殻粉又はそれらの澱粉、ジ
ヤガイモ、サツマイモ、タピカオ等の芋類澱粉、
デキストリン、オリゴ糖、二糖類、単糖類等の各
種糖類、及び殻物を加工する際に得られる小麦
〓、白糖、米糖等の穀物廃物などを適宜組み合せ
て用いる。そして更に又、ペプトン、キナコ、大
豆ミール、コーンステイープリカー、塩安、硫
安、硝安等の有機、無機窒素源及びリン酸二カ
リ、硫酸アグネシウム、リン酸一カリウム等の無
機塩、及び酵母エキス、麦芽エキス等の微量栄養
素を随時添加するのもよい。培養方法としては、
通気撹拌もしくは振盪培養による液体培養、或い
は小麦〓等を用いての固体培養方法を行うことが
できる。 培養条件として液体培養の場合、初発pHは４
〜７の範囲で20〜40℃で２〜７日間通気撹拌もし
くは振盪培養を行えばよく、固体培養の場合、水
分含量30〜70％の小麦〓を用い20〜40℃で２〜７
日間培養を行えばよい。培養終了後、培養物から
グルコアミラーゼ含有液を採取するには液体培養
の場合は濾過、遠心分離等の手段にて行う。固体
培養の場合には、水又は各種塩溶液にて抽出す
る。該含有液中の粗グルコアミラーゼは通常の精
製手段即ちアルコール分画、塩析、塩基性陰イオ
ン交換クロマトグラフイー等を適宜組み合せて更
に精製することができる。 次に栄養源を小麦〓及び米糖の組み合せによる
液体培地でRhodosporidium sp.J−5B FERM−
ＰNo.6948を培養してグルコアミラーゼ含有液を
得、次いで硫安塩析、DEAE−セルロースカラム
クロマトグラフイー処理して得られた部分精製グ
ルコアミラーゼの酵素化学的性質について記す。 (1)作用 穀類、芋類の各種澱粉に作用し、よくグルコ
ースを生成し、かつイソマルトース、イソマル
トトリオース等の転移糖を生成しない。又、生
澱粉（小麦澱粉、デユラム種）にも作用しグル
コースを生成する。 (2) 基質特異性 アミロース、アミロペクチン、グリコーゲ
ン、デキストリン等のα−１，４グルコシド結
合を有する多糖に作用する。 (3) 至適pH 0.4mlの各緩衝液に0.1mlの酵素溶液及び0.5ml
の２％可溶性澱粉を加え、40℃、10分反応させ
て本酵素の至適pHを求めたところpH4〜６付
近であつた（第１図に示す）。なおpH2.2〜8.0
の範囲はマツキルバイン（Macllvain）緩衝液
を用い、pH8.0〜10の範囲はコルソフ
（KoIthoff）氏緩衝液を用いた。 (4) 安定pH範囲 本酵素の安定pHを、pH1〜２の範囲は塩酸
カリ緩衝液で、pH2.2〜8.0の範囲はMacIlvain
緩衝液で、pH8.0〜10の範囲はKolthoff氏緩衝
液でそれぞれ測定した。その結果、本酵素は
pH4〜７の範囲では30℃、24時間放置しても安
定であることがわかつた（第２図に示す）。 (5) 至適温度 本酵素溶液0.1mlに0.1M酢酸緩衝液（pH5.0）
を0.4ml加え、各温度にて10分間反応せしめ本
酵素の至適温度を求めた。その結果、本酵素の
至適温度は50℃付近であつた（第３図に示す）。 (6) 温度安定性 本酵素溶液0.1mlに0.1M酢酸緩衝液（pH5.0）
を0.4ml加え、各温度に10分放置後、急冷し、
残存する活性を測定することにより本酵素の温
度安定性を求めたところ、本酵素は47℃、10分
処理した場合でも安定であつた（第４図に示
す）。 (7) 阻害剤等の影響 本酵素に対する各種金属イオン（10^-3M）
の影響について表１に示す。

【表】

【表】 本酵素に対する各種阻害剤（10^-3M）の影
響について表２に示す。

【表】 表１、２より明らかのように本酵素はＮ−ブロ
モサクシイミド、KMnO₄で顕著に阻害され、
Fe³⁺、Cu²⁺、及びHg²⁺、モノヨード酢酸、
EDTAで若干阻害されるものの、他の金属イオ
ンではほとんど阻害されなかつた。 更に以上の性質を有する本酵素は、培養物から
採取して得られる粗酵素の状態においても、５％
可溶性澱粉に作用させ、経時的に分解生成する糖
類をペーパークロマトグラフイーにて検討した結
果、イソマルトース及びイソマルトトリオース等
の生成はみられず、かつ生成糖もグルコースが大
部分でありオリゴ糖の生成はほとんどみられない
ので、従つて、本菌株のRhodosporidium sp.J−
5B FERM−ＰNo.6948はグルコアミラーゼ産生能
の高い菌株であることが判明した。それ故に本菌
株を使用し、生産されるグルコアミラーゼはブド
ウ糖製造用として最適なものである。更に、生澱
粉分解作用を有するので将来の省エネルギー対策
用としても期待されうるものである。 以下に、本発明を実施例につき説明する。なお
本発明で用いたアミラーゼ活性測定法は次の通り
である。１％の澱粉溶液にグルコアミラーゼを40
℃で10分間作用させたのち、生成した還元力をソ
モギー法で定量して1.8mgのグルコース相当の還
元力を示すときの酵素活性を1.0I.Uとした。 実施例 １ Rhodosporidium sp.J−5B FERM−ＰNo.6948
をMY寒天斜面培地上で37℃、２日間増殖させ、
その１白金耳をあらかじめ500ml容三角フラスコ
に小麦〓５％、米糖0.5％からなる培地100ml
（pH5.5）を入れ110℃、20分間オートクレーブ殺
菌して得られる培地に接種し、30℃で毎分160回
転の振盪条件で４日間培養した。培養液を遠心分
離して得られた上清のグルコアミラーゼ活性は
158I.Uであつた。 実施例 ２ トウモロコシ粉10％からなる培地50ml
（pH5.5）を500ml容の坂口フラスコに入れ、110
℃、20分殺菌した後、あらかじめ
Rhodosporidium sp.J−5B FERM−ＰNo.6948を
MY寒天斜面培地上で２日間増殖させておいたも
のの１白金耳を接種し、毎分120回転の振盪培養
機にて30℃４日間培養した。培養終了後、全培養
液を50mlとし、その濾過についてグルコアミラー
ゼ活性を測定したところ134I.U／mlであつた。 実施例 ３ 実施例１に準じてRhodosporidium sp.J−5B
FERM−ＰNo.6948を培養し、次いで培養液を濾
過して得られるグルコアミラーゼ含有液80mlに対
し41gの硫酸アンモニウムを加え、生ずる沈澱を
集め、少量の水に溶解後透析し、更にDEAE−セ
ルロースカラムクロマトグラフイーにて処理し、
カラムに未吸着区分を集めグルコアミラーゼ活性
含有液50mlを得た。こうして得られた部分精製グ
ルコアミラーゼ活性は200I.U／mlであつた。 実施例 ４ 25ジヤーフアーメンターに小麦〓300g、ジ
ヤガイモ澱粉100g及び水10を加えた後、２
Kg／cm²の加圧下で40分間蒸煮殺菌し30℃に冷却し
た培養培地に、あらかじめ500ml容の坂口フラス
コ３本のそれぞれにジヤガイモ澱粉１％、酵母エ
キス0.5％からなる培地100mlを入れ
Rhodosporidium sp.J−5B FERM−ＰNo.6948を
30℃、２日間培養したものを接種し、30℃、65時
間通気撹拌培養を行つた。培養液を濾過してグル
コアミラーゼ含有液8.5を得た。この含有液の
グルコアミラーゼ活性は150I・Ｕ／mlであつた。 実施例 ５ 100ml容三角フラスコに可溶性澱粉２％、ポリ
ペプトン0.7％、KH₂PO₄0.1％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、酵母エキス0.01％、米糖0.5％から
なる培地30mlを分注し、110℃、20分殺菌後、あ
らかじめスラントに植え継いだRhodosporidium
sp.J−5B FERM−ＰNo.6948の１白金耳を接種
し、30℃で毎分160回転の通気撹拌培養を行い、
５日間培養した。培養液を濾過してグルコアミラ
ーゼ活性90I.U／mlを含有する液25mlを得た。 実施例 ６ 小麦〓400gに水400mlを加え混和した後２容
三角フラスコ４個に入れ、その各々に120℃、30
分殺菌後、あらかじめ500ml容坂口フラスコに可
溶性澱粉１％、酵母エキス0.5％からなる培地100
mlにRhodosporidium sp.J−5B FERM−ＰNo.
6948の１白金耳を接種し２日間振盪培養したもの
10mlを加え、30℃、４日間静置培養した。培養終
了後、それぞれの三角フラスコに400mlずつの水
を加え、よく撹拌後培養物を濾過し、濾液を集め
合計1500mlのグルコアミラーゼ含有液を得た。 この含有液は1g〓当り190I.Uのグルコアミラ
ーゼが含まれていた。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図及び第４図は本発明の
Rhodosporidium sp.J−5B FERM−ＰNo.6948を
培養して得られるグルコアミラーゼの至適pH曲
線、pH安定曲線、至適温度曲線及び温度安定曲
線をそれぞれ示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ グルコアミラーゼ産生能を有するロドスポリ
   デイウム属に属する酵母を栄養培地で培養し、培
   養物からグルコアミラーゼを採取することを特徴
   とするグルコアミラーゼの製造法。