JPH0358708B2 - - Google Patents
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- JPH0358708B2 JPH0358708B2 JP59059300A JP5930084A JPH0358708B2 JP H0358708 B2 JPH0358708 B2 JP H0358708B2 JP 59059300 A JP59059300 A JP 59059300A JP 5930084 A JP5930084 A JP 5930084A JP H0358708 B2 JPH0358708 B2 JP H0358708B2
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- ahm
- cell line
- cells
- lymphocytes
- human
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はヒト骨髄腫由来リンパ芽球細胞系およ
びこれを親細胞とするハイブリドーマ細胞系に関
するものである。 （従来技術） 1975年にケーラー（Ko¨hler）とミルスタイン
（Milstein）はモノクローナル抗体を分泌するマ
ウスハイブリドーマ細胞系を産出する方法を確立
した（ネイチヤー（Nature）、256、495（1975））。
マウスハイブリドーマ細飽系の研究は急速に進歩
したが、その理由は融合させる相手となる誘発性
マウスプラズマ細胞腫（inducible mouse
plasmacy−tomas）の入手が容易であることに
少なくともある程度は起因するものである。容易
に入手可能なマウス骨髄腫は生体内（in vivo）
で自由自在に誘発させ、試験管内（in vitro）で
増殖させることができる。例えば、米国特許第
4172124号、同第4196265号、同第4361509号、同
第4361549号および同第4361550号；ケーラー他、
Eur.J.Immunol.、６、511（1976）；ミルスタイン
他、ネイチヤー、266、550（1977）；コプロウスキ
（Koprowski）他、Proc.Natl.Acad.Sci.、74、
2985（1977）；ウエルシユ（Welsh）、ネイチヤー、
256、495（1977）；メルチヤーズ（Melchers）他
編「リンパ球ハイブリドーマ。微生物学および免
疫学における最近の話題（Lymphocyte
Hybridomas. Current Topics in Microbiology
and Immunology）」、第81巻、スプリンガー−フ
エアラーク（Springer−Verlag）、ベルリン、
1978を参照。 モノクローナル抗体に関する研究の多くはヒト
−マウスハイブリドーマの産出に係わるものであ
つた。例えば、クローチエ（Croce）他、Proc.
Natl.Acad.Sci.、76、3416（1979）；レイン
（Lane）他、J.Exp.Med.、155、333（1982）；およ
びピツカリング（Pickering）他、J.Immunol.、、
128、406（1982）を参照。ヒトモノクローナル抗
体を分泌する種間ハイブリドーマに関する主要な
問題は安定性の欠如である。このようなハイブリ
ドーマは特にヒト染色体を失う傾向を有してい
る。この件に関しては、クローチエ他、Eur.J.
Immunol.、10、486（1980）を参照。マウス−マ
ウスハイブリドーマにおいて認められるように、
種内細胞ハイブリツドはこのような不安定性を示
さない。 ヒト−ヒトハイブリドーマ細胞系の開発は遅れ
ていたが、その理由は主として適当なヒト骨髄腫
細胞系が入手困難なためである。1968年以降報告
された新規のヒト骨髄腫細胞系は１種のみであ
る。カプラス（Kapras）他、サイエンス
（Science）、216、997（1982）参照。 しかしながら、ヒト−ヒトハイブリドーマに関
する研究が全く行なわれなかつたという訳ではな
い。例えば、オルソン（Olsson）他、Proc.Natl.
Acad.Sci.、77、5429（1980）、およびクローチエ
他、ネイチヤー、288、488（1980）はヒトモノク
ローナル抗体を分泌するヒトハイブリドーマの生
成を報告した。使用されたヒト骨髄腫細胞はそれ
ぞれヒトＢ細胞系U266およびGM1500の突然変
異体であつた。また、英国特許明細書
GB2086937Aを参照。さらに、ARH−77プラズ
マ細胞白血病由来系の高速増殖突然変異体に基づ
くヒト−ヒトハイブリドーマ系がエドワーズ
（Edwards）他、Eur.J.Immunol.，12、641
（1982）に記載された。 このように、より効率的にヒトハイブリドーマ
細胞系を産出するために、リンパ球、特にヒトリ
ンパ球と融合することのできるヒト骨髄腫細胞系
が要望されている。 （発明が解決しようとする課題） 本発明は上記要望に鑑み、効率的に製造するこ
とのできるヒトハイブリドーマ細胞系を提供する
ことをその目的とするものである。 （課題を解決するための手段） 本発明は、IgA免疫グロブリン分子を分泌する
ことができるATCC番号CRL−8220として寄託
されたヒト骨髄腫由来リンパ芽球細胞系AHM−
Ｉとそのヒポキサンチン燐酸リボシル基転移酵素
欠損突然変異体とからなる群より選ばれる細胞
系、および該細胞系からなる親細胞をリンパ球と
融合してなるハイブリドーマ細胞系を提供するも
のである。 本発明においては、まず、連続的に増殖する
（すなわち永続的な）ヒト骨髄腫由来リンパ芽球
細胞系が樹立された。この細胞系は多発性骨髄腫
を有すると診断された64才の白人男性より得た末
梢血液リンパ球の培養液に由来するものでAHM
−Ｉと命名された。 この患者から得た血清を分析すると、高いIgG
値（11200mg／dl、平常値は660〜1760mg／dl）お
よび若干高いIgA値（600mg／dl、平常値は60〜
320mg／dl）が認められた。また血清電気泳動に
よつて、ラムダＬ鎖を有するIgG型のＭ成分（an
Ｍ−component of the IgG type with lambda
light chains）の存在することが明らかとなつ
た。骨髄を生検すると、プラズマ細胞様を呈する
細胞による腫瘍に冒されていることが認められ
た。 この患者より得た血液をフイコル勾配（ａ
Ficoll gradient）上で分別した。界面の細胞は
洗浄し、20％の牛胎仔血清と2mMのグルタミン
と50μｇ／mlのゲンタマイシンとを含有する
RPMI 1640培地中に浮遊させた。こうして得た
培養液は湿潤した５％CO2雰囲気中において37℃
で６週間培養した。この培養期間の最後におい
て、培養液中に細胞の凝集が観察され、これらは
実在するリンパ芽球と考えられた。これらの細胞
を採取し、10mlの新鮮な培地に再び浮遊させ、37
℃で８日間培養した。こうして得た培養液に含ま
れる総生細胞数は７×105個であり、これらの細
胞は新鮮な培地に再び接種した。そして、継代比
率１：10〜１：15で連続して継代を行なつた。こ
のAHM−Ｉと命名された細胞系は12カ月間培地
中で連続継代した。倍加時間は24〜48時間である
と思われる。この細胞系は供給細胞（feeder
cells）の不在下で限界稀釈することによつてク
ローニングした。 光学および電子顕微鏡の示すところによれば
AHM−Ｉはヒトリンパ芽球細胞系であると思わ
れる。この細胞は付着性もしくは固着依存性では
なく、浮遊培養液中で増殖する。培養液中におい
て細胞は凝集する傾向があり、数千個の細胞から
なる凝集塊となることがある。接種濃度５×104
細胞／mlの細胞系は大体６日後に２×106細胞／
mlに増殖する。 老廃したAHM−Ｉ培養液上澄を免液沈降させ
たところ、この細胞系はラムダＬ鎖を有するIgA
を分泌することが明らかとなつた。細胞表面上に
はIgA1のＨ鎖が検出された。IgGは培養液上澄中
においても細胞表面上においても検出されなかつ
た。 ２つのヒトＢリンパ球標織、すなわちHLA−
DRおよびB1（スタシエンコ（Stashenko）他、J.
Immunol.、125、1678（1980））がAHM−Ｉ細胞
の表面上に検出された。また酵素分析によつて
も、この細胞系がヒト由来のものであることが確
認された。AHM−Ｉは以下のヒト酵素、すなわ
ちヌクレオシドフオスフオリラーゼ、グルコース
−６−燐酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、マ
ンノース燐酸異性化酵素、ペプチターゼＢ、アス
パラギン酸アミノ基転移酵素および乳酸脱水素酵
素を含むことが認められた。 AHM−Ｉのヒポキサンチン燐酸リボシル基転
移酵素欠損（HPRT欠損）突然変異体はエチル
メタンスルフオン酸塩を用いる公知の突然変異誘
発法によつて樹立した。突然変異の誘発後、６−
チオグアニンを7.5×10-6M含有する培地中でこ
の濃度を１×10-4Mまで緩慢に増加させながら細
胞を増殖させることによつてHPRT欠損変種を
選択した（ウエルシユ（Welsh）、ネイチヤー、
256、495（1977））。HPRT欠損突然変異体は
AHM−Ｉと異なり、ヒポキサンチン（１×
10-4M）とアミノプテリン（４×10-7M）とチミ
ジン（1.6×10-5M）とを含有する培地（HAT培
地）中では増殖しない。 現在までにAHM−ＩのHPRT欠損突然変異体
は50〜100種樹立された。このような突然変異体
の１つでAHM−3D3と命名されたものは詳細に
研究された。一般に、AHM−3D3はヒト末梢血
管リンパ球、該リンパ球から分離されたＢリンパ
球、およびヒトリンパ節に由来するリンパ球と融
合することができる。 細胞系AHM−ＩおよびAHM−3D3は1983年
３月10日にアメリカ模式菌培養収集（the
American Type Culture Collection，12301
Parklawn Drive，Rockville，Maryland，
20852）に供託され、それぞれATCC登録番号
CRL−8220およびCRL−8221として登録された。 AHM−Ｉから突然変異もしくはハイブリツド
化等によつて脈生した細胞はAHM−Ｉの娘系で
あると考えられる。本発明において「派生した細
胞」とはAHM−Ｉ細胞系をその系統に含む細胞
系全てを意味する。 上述のようにAHM−Ｉから突然変異によつて
細胞系を派生させることができる。このような突
然変異は自然突然変異であつても公知の方法であ
る細胞突然変異促進手段の使用によるものであつ
てもよい。前記手段としては様々なものが当業者
に公知であるが、一般に使用されるのはエチルメ
タンスルフオン酸塩である。しかしながら、紫外
線照射、メチルメタンスルフオン酸塩、Ｎ−メチ
ル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、お
よびエチルニトロソ尿素等、他の手段を使用する
こともできる。ジヤコビ（Jakoby）およびパス
タン（Pastan）編、「酵素学の方法。細胞培養
（Methods In Enzymology Cell Culture）」、第
58巻、アカデミツクプレス（Academic Press）、
ニユーヨーク、1979、p.308参照。望まれる特性
を有する細胞のスクリーニングを容易にするた
め、典型的には適当な試薬で細胞を選択する。例
えば、前記特性がヒポキサンチン燐酸リボシル基
転移酵素欠損性である場合に適当な試薬の典型的
なものは６−チオグアニンである。 AHM−Ｉから突然変異によつて得られる細胞
系の特性はリンパ球とのハイブリツド化もしくは
融合における適性を除いて一般に重要ではない。
しかしながら、実用上、このような突然変異細胞
系はAHM−Ｉを維持できない条件下でも増殖す
る（すなわち、連続培養が可能である）ように
AHM−Ｉと異なつた少なくとも１つの特性を有
するべきである。この特性により、突然変異細胞
をAHM−Ｉ細胞から容易に分離することが可能
にある。このような特性として様々なものが当業
者に公知であるが、特に有用かつよく知られてい
る特性はヒポキサンチン燐酸リボシル基転移酵素
欠損性である。AHM−Ｉから派生し、ヒポキサ
ンチン燐酸リボシル基転移酵素欠損性を示す突然
変異細胞系の一例はATCC登録番号CRL−8221
を有する細胞系AHM−3D3である。 またAHM−Ｉからハイブリツド化によつて細
胞系を派生することも可能である。この場合、一
般に公知の方法により、融合促進手段の存在下で
AHM−Ｉ突然変異細胞系由来の細胞をリンパ球
に融合させる。特に好ましい融合促進手段は分子
量的1000のポリエチレングリコールである。もち
ろん他の手段、例えば電場パルス（タイシー
（Teissie）他、サイエンス、216、537（1982））お
よびセイダイウイルス（ダビツドソン（David−
son）、エクスペリメンタルセルリサーチ（Ex−
perimental Cell Research）、55、424（1969））
等を使用することも可能である。あらゆる突然変
異細胞系に由来する細胞を使用することが可能で
あるが、AHM−3D3等、ヒポキサンチン燐酸リ
ボシル基酵素欠損性を有する突然変異細胞系が特
に有用である。 使用されるリンパ球の由来は一般に重要でな
い。すなわち、これらのリンパ球はマウス、ラツ
ト、ヒトあるいは他種のリンパ球とすることがで
きる。ある種の適用、例えば体液中の微量なハプ
テンもしくは抗原の免疫検定に使用されるモノク
ローナル抗体の製造等には、マウスもしくはラツ
トのリンパ球が好ましいかも知れない。しかしな
がら、他の場合にはヒトリンパ球が望まれること
が多く、一般にヒトリンパ球の使用が好ましい。 リンパ球の供給源も重要ではない。リンパ球が
ヒト由来のものである場合には、末梢血液リンパ
球、末梢血液リンパ球から分離されたＢリンパ
球、あるいはリンパ節もしくは脾臓から分離され
たリンパ球とすることができる。 ハイブリツド細胞系をモノクローナル抗体の製
造に使用しようとする場合にはリンパ球を免疫源
に感作させることが典型的である。本発明におい
て「免疫源」とは抗原およびハプテンの双方を意
味するものである。このような感作は当業者に公
知の方法で行なわれる。実用上、ヒト由来のリン
パ球を用いて試験管内で感作を行なうことが典型
的である。また、ヒト以外のリンパ球を用いる場
合には生体内で感作を行なうことが典型的であ
る。 場合によつては、AHM−Ｉと異なる少なくと
も１つの特性、例えばヒポキサンチン燐酸リボシ
ル基転移酵素欠損性を回復させるように突然変異
細胞系から公知の方法により細胞を逆選択するこ
とが望ましいかも知れない。例えばシユルマン
（Shulman）他、ネイチヤー、276、269（1978）
を参照。こうして得られる回復された細胞をさら
に突然変異させると、回復された細胞を維持でき
ない条件下でも増殖できるように前記細胞とは異
なつた少なくとも１つの特性を有しており、リン
パ球とハイブリツド化することのできる新しい突
然変異細胞系を産出することができる。そして、
この新しい突然変異細胞系は上述のように免疫源
に感作させたリンパ球と融合させることができ
る。 AHM−Ｉ細胞から得られるデオキシリボ核酸
は公知の方法によつてリンパ球のトランスフエク
シヨンに用いることができる。例えばジヨナク
（Jonak）他、ハイブリドーマ（Hybridoma）、
２、124（1982）およびクーパー（Cooper）、サイ
エンス、218、801（1982）を参照。 以下に示す非制限的な実施例により本発明を詳
細に説明する。特に断わりのない限り、温度は摂
氏であり、割合は重量％である。 （発明の効果） IgA免疫グロブリン分子を分泌することができ
るATCC番号CRL−8220として寄託されたヒト
骨髄腫由来リンパ芽球細胞系AHM−Ｉとそのヒ
ポキサンチン燐酸リボシル基転移酵素欠損突然変
異体とからなる群より選ばれる本発明の細胞系は
抗体を産生することのできるハイブリドーマ細胞
系を製造する上で極めて有用なものである。ま
た、本発明のハイブリドーマ細胞系は、リンパ球
の増殖、制御、および分化、リンパ球に表現され
る遺伝子座の決定、および新生物変成の生化学的
要因の検査等の研究モデルとして有用である。さ
らに、本発明のハイブリドーマ細胞系から産生さ
れるモノクローナル抗体は実験的および臨床的免
疫学、分子生物学および細胞生物学において実用
性の高いものであり、臨床分析、特に体液および
組織中における微量のハプテンおよび抗原の免疫
検定に有用である。 （実施例） 実施例 １ AHM−3D3とヒト末梢血液リンパ球との間の
ハイブリツド製造 正常な血液をフイコル勾配遠心分離（Ficoll
gradient centrifugation）して得た１千万個のヒ
ト末梢血液リンパ球を１×107個のAHM−3D3細
胞と混合し、得られた細胞混合物は800×ｇで10
分間遠心分離することによりペレツト化した。ペ
レツトは徐々に粉砕し、37゜まで加熱した。分子
量1000の37％ポリエチレングリコール（コツホー
ライトラボラトリーズ社（Koch−Light
Laboratories，Ltd.）製）0.5mlを粉砕ペレツト
に50秒間にわたつて撹拌しながら添加した。こう
して得られた融合混合物は5.0mlの無血清RPMI
−1640の培地（RPMI−1640、2mMのグルタミ
ン、50ｇ／mlのゲンタマイシン、および５×
10-5Mの２−メルカプトエタノール）で２分間に
わたつて徐々に稀釈した。次の１分間にわたつ
て、さらに5.0mlの前記培地を添加した。融合混
合物は遠心分離し、細胞を50mlの無血清培地で２
回洗浄した。そして、細胞を５×106細胞／mlの
濃度で、20％牛胎仔血清を含有するRPMI−1640
培地中に浮遊させた。 50μの上記細胞浮遊液（2.5×105細胞）をそ
れぞれ24時間前に４×103個のBalb／ｃマウス腹
膜浸出細胞と50μの20％牛胎仔血清含有RPMI
−1640培地からなる培養液を接種しておいた96ウ
エルマイクロタイタープレート（ａ 96−well
microtiter plate）の各ウエル中に分散した。 プレートは湿潤５％CO2を保つ培養器内で37℃
において一晩培養した。一晩の培養後、２倍濃縮
HAT（２×10-4Mのヒポキサンチン、８×10-7M
のアミノプテリン、および3.2×10-5Mのチミジ
ン）を補給した100μの血清含有培地を各ウエ
ルに添加し、さらに５日間培養した。その後、１
日置きに培地の一部を新鮮な通常濃度HAT培地
と交換することによつて培養液を補給した。 融合後３〜４週間目において培地のいくつかに
は活発に増殖する細胞が存在しており、AHM−
3D3とヒトリンパ球との間の融合が成功したこと
が示された。これらの融合細胞産生物はAHM−
3D3が増殖しないHAT含有培地中においても増
殖し続けた。 正常なヒト末梢血液リンパ球の他、ヒトリンパ
節由来のリンパ球、およびＢリンパ球に富んだ末
梢血液リンパ球群をAHM−3D3と融合した。第
１表はこれら３つの実験結果を要約するものであ
る。 【表】 来リンパ球
３ 末梢血液由 13 6 1〓2.5〓1
0５
来Bリンパ
球
現在までに行なわれた融合実験の示すところに
よればAHM−3D3と末梢血液リンパ球との融合
頻度は供給したリンパ球１〜３×106個に対して
１回であつた。一方、リンパ節細胞に対する融合
頻度は供給リンパ球７×105〜１×106個に対して
１回であつた。分離したＢ細胞を使用する場合、
融合頻度は供給リンパ球２〜３×105個に対して
１回に増加し、マウス融合系とほぼ匹敵する値と
なり、報告された最新のヒト−ヒトハイブリツド
形成率、すなわち供給リンパ球106〜108個に対し
て１回という値（エドワーズ（Edwards）他、
ヨーロツパ免疫学誌（European
JournalofImmunology）、12、641（1982））より
も明らかに優れている。 実施例 ２ AHM−3D3による免疫グロブリンの製造 実施例１で得た10個のハイブリドーマに対し
て、母細胞系AHM−3D3により製造されたもの
とは異なる免疫グロブリンの合成試験を行なつ
た。各ハイブリドーマ細胞系の細胞は、5μCi／
mlの14C−標識ロイシンを添加した無ロイシン
RPMI−1640培地中で48時間培養した。各培養液
の上澄は分離し、公知の方法によつて様々な免疫
グロブリンアイソタイプ特異性抗血清を用いる免
疫沈降（immunoprecipitation）を行なつた。こ
うして得た免疫沈澱物は洗浄し、10％のグリセロ
ールと２％のドデシル硫酸ナトリウムと５％の２
−メルカプトエタノールとを含有するPH6.8のト
リスHCl緩衝液を添加し、２分間煮沸することに
より溶離させた。 そして試料に対し、0.192Mのグリシンと0.1％
のドデシル硫酸ナトリウムとを含有する0.25M、
PH8.3のトリス緩衝液中の５〜20ポリアクリルア
ミド勾配ゲル上で電気泳動を行なつた。電気泳動
の後、50％のメタノールと10％の氷酢酸とを含む
0.125％クーマシーブル−水溶液でゲルを染色固
定した。そして、ゲルはジメチルスルフオキシド
に浸漬して水分を除去した。ジメチルスルフオキ
シドは、2.5−ジフエニルオキサゾール（PPO）
を22.2％（重量／体積）含むジメチルスルフオキ
シド溶液で置換した。環境温度で２時間培養を行
なつた後、PPO溶液を除去し、蒸留水で１時間
置換した。そしてゲルは乾燥し、−70℃において
一晩にわたり、デユポンライトニングプラス
（Dupont Lightening Plus ）増感紙上のコダツ
ク（Kodak）XAR−5X線フイルムに露出した。 ゲルから得た電気泳動パターンにより、10個の
ハイブリドーマ細胞系のうち９個までが、カツパ
Ｌ鎖（kappa light chains）を有するIgM分子を
分泌することが明らかになつた。10番目のハイブ
リドーマはカツパＬ鎖を有するIgA分子を分泌し
た。これに対し、AHM−3D3はラムダＬ鎖を有
するIgAを分泌するものである。
びこれを親細胞とするハイブリドーマ細胞系に関
するものである。 （従来技術） 1975年にケーラー（Ko¨hler）とミルスタイン
（Milstein）はモノクローナル抗体を分泌するマ
ウスハイブリドーマ細胞系を産出する方法を確立
した（ネイチヤー（Nature）、256、495（1975））。
マウスハイブリドーマ細飽系の研究は急速に進歩
したが、その理由は融合させる相手となる誘発性
マウスプラズマ細胞腫（inducible mouse
plasmacy−tomas）の入手が容易であることに
少なくともある程度は起因するものである。容易
に入手可能なマウス骨髄腫は生体内（in vivo）
で自由自在に誘発させ、試験管内（in vitro）で
増殖させることができる。例えば、米国特許第
4172124号、同第4196265号、同第4361509号、同
第4361549号および同第4361550号；ケーラー他、
Eur.J.Immunol.、６、511（1976）；ミルスタイン
他、ネイチヤー、266、550（1977）；コプロウスキ
（Koprowski）他、Proc.Natl.Acad.Sci.、74、
2985（1977）；ウエルシユ（Welsh）、ネイチヤー、
256、495（1977）；メルチヤーズ（Melchers）他
編「リンパ球ハイブリドーマ。微生物学および免
疫学における最近の話題（Lymphocyte
Hybridomas. Current Topics in Microbiology
and Immunology）」、第81巻、スプリンガー−フ
エアラーク（Springer−Verlag）、ベルリン、
1978を参照。 モノクローナル抗体に関する研究の多くはヒト
−マウスハイブリドーマの産出に係わるものであ
つた。例えば、クローチエ（Croce）他、Proc.
Natl.Acad.Sci.、76、3416（1979）；レイン
（Lane）他、J.Exp.Med.、155、333（1982）；およ
びピツカリング（Pickering）他、J.Immunol.、、
128、406（1982）を参照。ヒトモノクローナル抗
体を分泌する種間ハイブリドーマに関する主要な
問題は安定性の欠如である。このようなハイブリ
ドーマは特にヒト染色体を失う傾向を有してい
る。この件に関しては、クローチエ他、Eur.J.
Immunol.、10、486（1980）を参照。マウス−マ
ウスハイブリドーマにおいて認められるように、
種内細胞ハイブリツドはこのような不安定性を示
さない。 ヒト−ヒトハイブリドーマ細胞系の開発は遅れ
ていたが、その理由は主として適当なヒト骨髄腫
細胞系が入手困難なためである。1968年以降報告
された新規のヒト骨髄腫細胞系は１種のみであ
る。カプラス（Kapras）他、サイエンス
（Science）、216、997（1982）参照。 しかしながら、ヒト−ヒトハイブリドーマに関
する研究が全く行なわれなかつたという訳ではな
い。例えば、オルソン（Olsson）他、Proc.Natl.
Acad.Sci.、77、5429（1980）、およびクローチエ
他、ネイチヤー、288、488（1980）はヒトモノク
ローナル抗体を分泌するヒトハイブリドーマの生
成を報告した。使用されたヒト骨髄腫細胞はそれ
ぞれヒトＢ細胞系U266およびGM1500の突然変
異体であつた。また、英国特許明細書
GB2086937Aを参照。さらに、ARH−77プラズ
マ細胞白血病由来系の高速増殖突然変異体に基づ
くヒト−ヒトハイブリドーマ系がエドワーズ
（Edwards）他、Eur.J.Immunol.，12、641
（1982）に記載された。 このように、より効率的にヒトハイブリドーマ
細胞系を産出するために、リンパ球、特にヒトリ
ンパ球と融合することのできるヒト骨髄腫細胞系
が要望されている。 （発明が解決しようとする課題） 本発明は上記要望に鑑み、効率的に製造するこ
とのできるヒトハイブリドーマ細胞系を提供する
ことをその目的とするものである。 （課題を解決するための手段） 本発明は、IgA免疫グロブリン分子を分泌する
ことができるATCC番号CRL−8220として寄託
されたヒト骨髄腫由来リンパ芽球細胞系AHM−
Ｉとそのヒポキサンチン燐酸リボシル基転移酵素
欠損突然変異体とからなる群より選ばれる細胞
系、および該細胞系からなる親細胞をリンパ球と
融合してなるハイブリドーマ細胞系を提供するも
のである。 本発明においては、まず、連続的に増殖する
（すなわち永続的な）ヒト骨髄腫由来リンパ芽球
細胞系が樹立された。この細胞系は多発性骨髄腫
を有すると診断された64才の白人男性より得た末
梢血液リンパ球の培養液に由来するものでAHM
−Ｉと命名された。 この患者から得た血清を分析すると、高いIgG
値（11200mg／dl、平常値は660〜1760mg／dl）お
よび若干高いIgA値（600mg／dl、平常値は60〜
320mg／dl）が認められた。また血清電気泳動に
よつて、ラムダＬ鎖を有するIgG型のＭ成分（an
Ｍ−component of the IgG type with lambda
light chains）の存在することが明らかとなつ
た。骨髄を生検すると、プラズマ細胞様を呈する
細胞による腫瘍に冒されていることが認められ
た。 この患者より得た血液をフイコル勾配（ａ
Ficoll gradient）上で分別した。界面の細胞は
洗浄し、20％の牛胎仔血清と2mMのグルタミン
と50μｇ／mlのゲンタマイシンとを含有する
RPMI 1640培地中に浮遊させた。こうして得た
培養液は湿潤した５％CO2雰囲気中において37℃
で６週間培養した。この培養期間の最後におい
て、培養液中に細胞の凝集が観察され、これらは
実在するリンパ芽球と考えられた。これらの細胞
を採取し、10mlの新鮮な培地に再び浮遊させ、37
℃で８日間培養した。こうして得た培養液に含ま
れる総生細胞数は７×105個であり、これらの細
胞は新鮮な培地に再び接種した。そして、継代比
率１：10〜１：15で連続して継代を行なつた。こ
のAHM−Ｉと命名された細胞系は12カ月間培地
中で連続継代した。倍加時間は24〜48時間である
と思われる。この細胞系は供給細胞（feeder
cells）の不在下で限界稀釈することによつてク
ローニングした。 光学および電子顕微鏡の示すところによれば
AHM−Ｉはヒトリンパ芽球細胞系であると思わ
れる。この細胞は付着性もしくは固着依存性では
なく、浮遊培養液中で増殖する。培養液中におい
て細胞は凝集する傾向があり、数千個の細胞から
なる凝集塊となることがある。接種濃度５×104
細胞／mlの細胞系は大体６日後に２×106細胞／
mlに増殖する。 老廃したAHM−Ｉ培養液上澄を免液沈降させ
たところ、この細胞系はラムダＬ鎖を有するIgA
を分泌することが明らかとなつた。細胞表面上に
はIgA1のＨ鎖が検出された。IgGは培養液上澄中
においても細胞表面上においても検出されなかつ
た。 ２つのヒトＢリンパ球標織、すなわちHLA−
DRおよびB1（スタシエンコ（Stashenko）他、J.
Immunol.、125、1678（1980））がAHM−Ｉ細胞
の表面上に検出された。また酵素分析によつて
も、この細胞系がヒト由来のものであることが確
認された。AHM−Ｉは以下のヒト酵素、すなわ
ちヌクレオシドフオスフオリラーゼ、グルコース
−６−燐酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、マ
ンノース燐酸異性化酵素、ペプチターゼＢ、アス
パラギン酸アミノ基転移酵素および乳酸脱水素酵
素を含むことが認められた。 AHM−Ｉのヒポキサンチン燐酸リボシル基転
移酵素欠損（HPRT欠損）突然変異体はエチル
メタンスルフオン酸塩を用いる公知の突然変異誘
発法によつて樹立した。突然変異の誘発後、６−
チオグアニンを7.5×10-6M含有する培地中でこ
の濃度を１×10-4Mまで緩慢に増加させながら細
胞を増殖させることによつてHPRT欠損変種を
選択した（ウエルシユ（Welsh）、ネイチヤー、
256、495（1977））。HPRT欠損突然変異体は
AHM−Ｉと異なり、ヒポキサンチン（１×
10-4M）とアミノプテリン（４×10-7M）とチミ
ジン（1.6×10-5M）とを含有する培地（HAT培
地）中では増殖しない。 現在までにAHM−ＩのHPRT欠損突然変異体
は50〜100種樹立された。このような突然変異体
の１つでAHM−3D3と命名されたものは詳細に
研究された。一般に、AHM−3D3はヒト末梢血
管リンパ球、該リンパ球から分離されたＢリンパ
球、およびヒトリンパ節に由来するリンパ球と融
合することができる。 細胞系AHM−ＩおよびAHM−3D3は1983年
３月10日にアメリカ模式菌培養収集（the
American Type Culture Collection，12301
Parklawn Drive，Rockville，Maryland，
20852）に供託され、それぞれATCC登録番号
CRL−8220およびCRL−8221として登録された。 AHM−Ｉから突然変異もしくはハイブリツド
化等によつて脈生した細胞はAHM−Ｉの娘系で
あると考えられる。本発明において「派生した細
胞」とはAHM−Ｉ細胞系をその系統に含む細胞
系全てを意味する。 上述のようにAHM−Ｉから突然変異によつて
細胞系を派生させることができる。このような突
然変異は自然突然変異であつても公知の方法であ
る細胞突然変異促進手段の使用によるものであつ
てもよい。前記手段としては様々なものが当業者
に公知であるが、一般に使用されるのはエチルメ
タンスルフオン酸塩である。しかしながら、紫外
線照射、メチルメタンスルフオン酸塩、Ｎ−メチ
ル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、お
よびエチルニトロソ尿素等、他の手段を使用する
こともできる。ジヤコビ（Jakoby）およびパス
タン（Pastan）編、「酵素学の方法。細胞培養
（Methods In Enzymology Cell Culture）」、第
58巻、アカデミツクプレス（Academic Press）、
ニユーヨーク、1979、p.308参照。望まれる特性
を有する細胞のスクリーニングを容易にするた
め、典型的には適当な試薬で細胞を選択する。例
えば、前記特性がヒポキサンチン燐酸リボシル基
転移酵素欠損性である場合に適当な試薬の典型的
なものは６−チオグアニンである。 AHM−Ｉから突然変異によつて得られる細胞
系の特性はリンパ球とのハイブリツド化もしくは
融合における適性を除いて一般に重要ではない。
しかしながら、実用上、このような突然変異細胞
系はAHM−Ｉを維持できない条件下でも増殖す
る（すなわち、連続培養が可能である）ように
AHM−Ｉと異なつた少なくとも１つの特性を有
するべきである。この特性により、突然変異細胞
をAHM−Ｉ細胞から容易に分離することが可能
にある。このような特性として様々なものが当業
者に公知であるが、特に有用かつよく知られてい
る特性はヒポキサンチン燐酸リボシル基転移酵素
欠損性である。AHM−Ｉから派生し、ヒポキサ
ンチン燐酸リボシル基転移酵素欠損性を示す突然
変異細胞系の一例はATCC登録番号CRL−8221
を有する細胞系AHM−3D3である。 またAHM−Ｉからハイブリツド化によつて細
胞系を派生することも可能である。この場合、一
般に公知の方法により、融合促進手段の存在下で
AHM−Ｉ突然変異細胞系由来の細胞をリンパ球
に融合させる。特に好ましい融合促進手段は分子
量的1000のポリエチレングリコールである。もち
ろん他の手段、例えば電場パルス（タイシー
（Teissie）他、サイエンス、216、537（1982））お
よびセイダイウイルス（ダビツドソン（David−
son）、エクスペリメンタルセルリサーチ（Ex−
perimental Cell Research）、55、424（1969））
等を使用することも可能である。あらゆる突然変
異細胞系に由来する細胞を使用することが可能で
あるが、AHM−3D3等、ヒポキサンチン燐酸リ
ボシル基酵素欠損性を有する突然変異細胞系が特
に有用である。 使用されるリンパ球の由来は一般に重要でな
い。すなわち、これらのリンパ球はマウス、ラツ
ト、ヒトあるいは他種のリンパ球とすることがで
きる。ある種の適用、例えば体液中の微量なハプ
テンもしくは抗原の免疫検定に使用されるモノク
ローナル抗体の製造等には、マウスもしくはラツ
トのリンパ球が好ましいかも知れない。しかしな
がら、他の場合にはヒトリンパ球が望まれること
が多く、一般にヒトリンパ球の使用が好ましい。 リンパ球の供給源も重要ではない。リンパ球が
ヒト由来のものである場合には、末梢血液リンパ
球、末梢血液リンパ球から分離されたＢリンパ
球、あるいはリンパ節もしくは脾臓から分離され
たリンパ球とすることができる。 ハイブリツド細胞系をモノクローナル抗体の製
造に使用しようとする場合にはリンパ球を免疫源
に感作させることが典型的である。本発明におい
て「免疫源」とは抗原およびハプテンの双方を意
味するものである。このような感作は当業者に公
知の方法で行なわれる。実用上、ヒト由来のリン
パ球を用いて試験管内で感作を行なうことが典型
的である。また、ヒト以外のリンパ球を用いる場
合には生体内で感作を行なうことが典型的であ
る。 場合によつては、AHM−Ｉと異なる少なくと
も１つの特性、例えばヒポキサンチン燐酸リボシ
ル基転移酵素欠損性を回復させるように突然変異
細胞系から公知の方法により細胞を逆選択するこ
とが望ましいかも知れない。例えばシユルマン
（Shulman）他、ネイチヤー、276、269（1978）
を参照。こうして得られる回復された細胞をさら
に突然変異させると、回復された細胞を維持でき
ない条件下でも増殖できるように前記細胞とは異
なつた少なくとも１つの特性を有しており、リン
パ球とハイブリツド化することのできる新しい突
然変異細胞系を産出することができる。そして、
この新しい突然変異細胞系は上述のように免疫源
に感作させたリンパ球と融合させることができ
る。 AHM−Ｉ細胞から得られるデオキシリボ核酸
は公知の方法によつてリンパ球のトランスフエク
シヨンに用いることができる。例えばジヨナク
（Jonak）他、ハイブリドーマ（Hybridoma）、
２、124（1982）およびクーパー（Cooper）、サイ
エンス、218、801（1982）を参照。 以下に示す非制限的な実施例により本発明を詳
細に説明する。特に断わりのない限り、温度は摂
氏であり、割合は重量％である。 （発明の効果） IgA免疫グロブリン分子を分泌することができ
るATCC番号CRL−8220として寄託されたヒト
骨髄腫由来リンパ芽球細胞系AHM−Ｉとそのヒ
ポキサンチン燐酸リボシル基転移酵素欠損突然変
異体とからなる群より選ばれる本発明の細胞系は
抗体を産生することのできるハイブリドーマ細胞
系を製造する上で極めて有用なものである。ま
た、本発明のハイブリドーマ細胞系は、リンパ球
の増殖、制御、および分化、リンパ球に表現され
る遺伝子座の決定、および新生物変成の生化学的
要因の検査等の研究モデルとして有用である。さ
らに、本発明のハイブリドーマ細胞系から産生さ
れるモノクローナル抗体は実験的および臨床的免
疫学、分子生物学および細胞生物学において実用
性の高いものであり、臨床分析、特に体液および
組織中における微量のハプテンおよび抗原の免疫
検定に有用である。 （実施例） 実施例 １ AHM−3D3とヒト末梢血液リンパ球との間の
ハイブリツド製造 正常な血液をフイコル勾配遠心分離（Ficoll
gradient centrifugation）して得た１千万個のヒ
ト末梢血液リンパ球を１×107個のAHM−3D3細
胞と混合し、得られた細胞混合物は800×ｇで10
分間遠心分離することによりペレツト化した。ペ
レツトは徐々に粉砕し、37゜まで加熱した。分子
量1000の37％ポリエチレングリコール（コツホー
ライトラボラトリーズ社（Koch−Light
Laboratories，Ltd.）製）0.5mlを粉砕ペレツト
に50秒間にわたつて撹拌しながら添加した。こう
して得られた融合混合物は5.0mlの無血清RPMI
−1640の培地（RPMI−1640、2mMのグルタミ
ン、50ｇ／mlのゲンタマイシン、および５×
10-5Mの２−メルカプトエタノール）で２分間に
わたつて徐々に稀釈した。次の１分間にわたつ
て、さらに5.0mlの前記培地を添加した。融合混
合物は遠心分離し、細胞を50mlの無血清培地で２
回洗浄した。そして、細胞を５×106細胞／mlの
濃度で、20％牛胎仔血清を含有するRPMI−1640
培地中に浮遊させた。 50μの上記細胞浮遊液（2.5×105細胞）をそ
れぞれ24時間前に４×103個のBalb／ｃマウス腹
膜浸出細胞と50μの20％牛胎仔血清含有RPMI
−1640培地からなる培養液を接種しておいた96ウ
エルマイクロタイタープレート（ａ 96−well
microtiter plate）の各ウエル中に分散した。 プレートは湿潤５％CO2を保つ培養器内で37℃
において一晩培養した。一晩の培養後、２倍濃縮
HAT（２×10-4Mのヒポキサンチン、８×10-7M
のアミノプテリン、および3.2×10-5Mのチミジ
ン）を補給した100μの血清含有培地を各ウエ
ルに添加し、さらに５日間培養した。その後、１
日置きに培地の一部を新鮮な通常濃度HAT培地
と交換することによつて培養液を補給した。 融合後３〜４週間目において培地のいくつかに
は活発に増殖する細胞が存在しており、AHM−
3D3とヒトリンパ球との間の融合が成功したこと
が示された。これらの融合細胞産生物はAHM−
3D3が増殖しないHAT含有培地中においても増
殖し続けた。 正常なヒト末梢血液リンパ球の他、ヒトリンパ
節由来のリンパ球、およびＢリンパ球に富んだ末
梢血液リンパ球群をAHM−3D3と融合した。第
１表はこれら３つの実験結果を要約するものであ
る。 【表】 来リンパ球
３ 末梢血液由 13 6 1〓2.5〓1
0５
来Bリンパ
球
現在までに行なわれた融合実験の示すところに
よればAHM−3D3と末梢血液リンパ球との融合
頻度は供給したリンパ球１〜３×106個に対して
１回であつた。一方、リンパ節細胞に対する融合
頻度は供給リンパ球７×105〜１×106個に対して
１回であつた。分離したＢ細胞を使用する場合、
融合頻度は供給リンパ球２〜３×105個に対して
１回に増加し、マウス融合系とほぼ匹敵する値と
なり、報告された最新のヒト−ヒトハイブリツド
形成率、すなわち供給リンパ球106〜108個に対し
て１回という値（エドワーズ（Edwards）他、
ヨーロツパ免疫学誌（European
JournalofImmunology）、12、641（1982））より
も明らかに優れている。 実施例 ２ AHM−3D3による免疫グロブリンの製造 実施例１で得た10個のハイブリドーマに対し
て、母細胞系AHM−3D3により製造されたもの
とは異なる免疫グロブリンの合成試験を行なつ
た。各ハイブリドーマ細胞系の細胞は、5μCi／
mlの14C−標識ロイシンを添加した無ロイシン
RPMI−1640培地中で48時間培養した。各培養液
の上澄は分離し、公知の方法によつて様々な免疫
グロブリンアイソタイプ特異性抗血清を用いる免
疫沈降（immunoprecipitation）を行なつた。こ
うして得た免疫沈澱物は洗浄し、10％のグリセロ
ールと２％のドデシル硫酸ナトリウムと５％の２
−メルカプトエタノールとを含有するPH6.8のト
リスHCl緩衝液を添加し、２分間煮沸することに
より溶離させた。 そして試料に対し、0.192Mのグリシンと0.1％
のドデシル硫酸ナトリウムとを含有する0.25M、
PH8.3のトリス緩衝液中の５〜20ポリアクリルア
ミド勾配ゲル上で電気泳動を行なつた。電気泳動
の後、50％のメタノールと10％の氷酢酸とを含む
0.125％クーマシーブル−水溶液でゲルを染色固
定した。そして、ゲルはジメチルスルフオキシド
に浸漬して水分を除去した。ジメチルスルフオキ
シドは、2.5−ジフエニルオキサゾール（PPO）
を22.2％（重量／体積）含むジメチルスルフオキ
シド溶液で置換した。環境温度で２時間培養を行
なつた後、PPO溶液を除去し、蒸留水で１時間
置換した。そしてゲルは乾燥し、−70℃において
一晩にわたり、デユポンライトニングプラス
（Dupont Lightening Plus ）増感紙上のコダツ
ク（Kodak）XAR−5X線フイルムに露出した。 ゲルから得た電気泳動パターンにより、10個の
ハイブリドーマ細胞系のうち９個までが、カツパ
Ｌ鎖（kappa light chains）を有するIgM分子を
分泌することが明らかになつた。10番目のハイブ
リドーマはカツパＬ鎖を有するIgA分子を分泌し
た。これに対し、AHM−3D3はラムダＬ鎖を有
するIgAを分泌するものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ IgA免疫グロブリン分子を分泌することがで
きるヒト骨髄腫由来リンパ芽球細胞系AHM−Ｉ
（ATCC番号CRL−8220として寄託）とそのヒポ
キサンチン燐酸リボシル基転移酵素欠損突然変異
体とからなる群より選ばれる細胞系。 ２ 突然変異細胞系AHM−3D3（ATCC番号
CRL−8221として寄託）に相当することを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の細胞系。 ３ IgA免疫グロブリン分子を分泌することがで
きるヒト骨髄腫由来リンパ芽球細胞系AHM−Ｉ
（ATCC番号CRL−8220として寄託）とそのヒポ
キサンチン燐酸リボシル基転移酵素欠損突然変異
体とからなる群より選ばれた親細胞をリンパ球と
融合してなるハイブリドーマ細胞系。 ４ 前記親細胞として突然変異細胞系AHM−
3D3（ATCC番号CRL−8221として寄託）が用い
られていることを特徴とする特許請求の範囲第３
項記載のハイブリドーマ細胞系。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48253883A | 1983-04-06 | 1983-04-06 | |
| US482538 | 1983-04-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59198970A JPS59198970A (ja) | 1984-11-10 |
| JPH0358708B2 true JPH0358708B2 (ja) | 1991-09-06 |
Family
ID=23916474
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59059300A Granted JPS59198970A (ja) | 1983-04-06 | 1984-03-27 | ハイブリドーマ細胞系 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0124301A1 (ja) |
| JP (1) | JPS59198970A (ja) |
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Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DK554986A (da) * | 1986-11-19 | 1988-07-18 | Novo Industri As | Human-human hybride cellelinier samt dermed producerede monoklonale cancerantistoffer |
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| NZ198851A (en) * | 1980-11-07 | 1984-07-31 | Wistar Inst | Stable,continuous human myeloma cell line capable of hybridisation with antibody-producing cells:production of hybrid cell line |
-
1984
- 1984-02-21 CA CA000447951A patent/CA1218947A/en not_active Expired
- 1984-03-27 JP JP59059300A patent/JPS59198970A/ja active Granted
- 1984-04-04 EP EP84302307A patent/EP0124301A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CA1218947A (en) | 1987-03-10 |
| JPS59198970A (ja) | 1984-11-10 |
| EP0124301A1 (en) | 1984-11-07 |
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