JPH0358903A - 植物の病気及び植物の蓄積症を除去する方法 - Google Patents

植物の病気及び植物の蓄積症を除去する方法

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JPH0358903A
JPH0358903A JP19038489A JP19038489A JPH0358903A JP H0358903 A JPH0358903 A JP H0358903A JP 19038489 A JP19038489 A JP 19038489A JP 19038489 A JP19038489 A JP 19038489A JP H0358903 A JPH0358903 A JP H0358903A
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griseoviridis
plant
strain
suspension
vegetation
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Orabui Raateikainen
ラーティカイネン、オラヴィ
Youko Touomisuto
トゥオミスト、ヨウコ
Liszt Tahivonen
タヒヴォネン、リスト
Marja-Leena Rahidenpere
ラヒデンペレ、マルヤーレーナ
Heikki Rosenkvist
ロセンクヴィスト、ヘイッキ
Pekka Seisukari
セイスカリ、ペッカ
Erias Suokas
スオカス、エリアス
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Kemira Oyj
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Kemira Oyj
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、有効な薬剤を生或するストレブトミ!スls
treptomyces)属の微生物で,種、基質若し
くは植生を処理することにより、植物の病気及び植物の
蓄積症を除去する方法に関する。
(従来の技術及び発明が解決しようとする課題)温室に
おける植物の病気をくいとめるために、消毒法や基質の
交代作用(replaceu+ent of thes
ubstrate)を用いたり、様々な栽培法を試るこ
と,或いは薬剤によって抑制すること、等の努力がなさ
れて来た。しかしながら、これらの方法は不便且つ高価
であり、特に薬剤によって抑制する場合は、周囲に不適
切な物質を持ち込むことになってしまう。このため、生
物学的な抑制方法に多くの注目が向けられるようになっ
た。特に、植物の病気の抑制は、化学的抑制剤の使用制
限があるために,残留物による薬害期間が存7Eするた
めに、更には,有効性についての充分な下調べがなされ
ないために、困難なことが尾多かった。
フィンランド特許第821,099号では,十壌性或い
は種子性の病気を除去するために、土壌中にス1−レプ
トミセス属のアクチノマイシ−1〜菌(actinom
ycete fungi)を加える方法が使用されてい
る。これらのストレプトミセス属のアクチノマイシ一ト
菌は、種での病気の活動を抑制する他、病気にかかった
苗木から健康な苗木への病気の伝染を抑制したりする。
英国特許第1,357,538号は、植物の病気に明ら
かに作用するもので5ストレブトミセス属のオーレオ系
微生物(iureofacients microL+
e)により生成される新しい抗生物質を開示している。
その有効な薬剤は、微生物の菌糸体から純粋分離される
米国特許第2,992,162号は、ストレプトミセス
属グリセウス(Streptomyces grise
us)を用いることにより,菌増殖を抑止する抗生物質
、カンジシジン(candicidin )を生成する
方法について述べている。
芳香族へプタエン構造の抗生物質を生成するストレプト
ミセス グリセオビリディス(gr i seov−i
rjdis)アクチノマイシート菌株を、種、基質或い
は植物に加える方法が植物の病気の抑制に有効であると
云うことは、現在も驚くべきこととして認識されている
S(ストレプトミセス).グリセオビリディスアクチノ
マイシ一ト菌株は、例えば、Anderson等による
Antibiotics and Chen+othe
rapy 6(1956)100−115中に述べられ
ている。
以前は、S.グリセオビリディスが芳香族へブタエンを
生或するとは認識されていなかった。
文献によると、抗生物質として大環状芳香族へプタエン
は次のようなタイプの一般構造を有する。
(以下余白) 糖誘導体 (sugar derivative)ここで,RはC
HJ,O}I,H若しくはケトグループのいずれか、R
′はCH,若しくはI−1である. 芳香族へプタエンが菌増殖を抑止する作用を有すること
は知られている。
(a題を解決する為の手段並びに作用)本発明の植物の
病気及び植物の蓄積症を除去する方法は、種、基質若し
くは植生を,ストレブ1へミセス グリセオビリディス
 アクチノマイシ一ト菌株を添加することにより処理す
ることを特長とし,上記菌株が、上記式を有する放香族
ヘブタエン構造の抗生物質を生成するものであり,該抗
生物質が、約368,388及び4 1 2nm (r
lg媒としてDMSOを用いた場合)の波長で紫外線吸
収の極大値を有すること、及び赤外スペクトルでカルボ
ニル範囲1750−1500c+n−’で吸収すること
,で特徴付けられ、且つ、該抗生物質が、水を含有する
極性イI機溶媒及びジメチルスルホキシドに可溶性であ
ることを要旨とするものである。
本発明方法においては、有効な薬剤は、それを生成する
ストレプトミセスグリセオビリディスの菌糸体から純粋
分離する必要はなく、これに代って植物の病気を抑制す
るにおいて、S.グリセオビリディス懸濁液が種、基質
或いは植生に104胞子/ m Qと云う極めて低い濃
度で且つ1 dQ / rnと云う極めて低い度合いで
添加され、これにより経済的となり、また利用が簡単と
なる9芳香族へプタエンを生成するS.グリセオビリデ
ィスは,少なくとも下記の病原体に対して有効であるこ
とが知られている。即ち、アルテルナリア ブラシシコ
ーラ(Alternaria brassicicol
a)、リゾクトニ アソラニ(Rhizoctonia
 solani) % フサリウム カルモルム(Fu
sarium culmorum) .  F .オキ
スポルム(F . oxysporulI1)、アグロ
ノベクテリウムタムファシエンス(Agroaocte
rium tumefaciens)、ピズイウムS 
P (Pythium SP.)ボ1・リチイス シネ
ラ(Botrytis cinerea) 、フオモオ
プシス スクレロチオデイス(Phomopsis s
clerotioides)t”ある。上記例で用いら
れたストレプトミセス グリセオビリディスの菌株は泥
炭(peat)から純粋分離されたものである。
本発明を以下に実施例に基づきより詳細に述べる。
矢41生L 有効薬剤の純粋分離 有効薬剤や抗生物質の純粋分離のため、一般的に使用さ
れている方法は、細胞マス(cell mass)及び
/若しくは培養液から直接抽出し、その後抽出物を濃縮
し且つ精製する方法である。S.グリセオビリディスは
、グルコース4g/Qを含む培養基,イースト抽出物4
g/fl及びモルト抽出物1 0 g / Q上で醗酵
させ細胞マスを分離した。
細胞マス若しくは培養液にアセトニトリル0.5−1容
量部加え、その混合物を振とうした。得られたS濁液を
3.00Orpmで10分間遠心分離した。
上澄液を化合させ蒸発乾固させた。シロップ状の残留物
を水中にS濁させ、HCRによりP Hを3.0に調整
した後、同容量のアセトニトリルをこれに加えその混合
物を振とうした。80g/QのNaCQをこの混合物に
加え、その後アセトニトリルの大半を上澄液として分離
した。更に0.5容量部のアセトニトリルを用い低位相
を抽出し、上澄液を化合させた。必要によって、N a
 O L{により上澄液を洗浄した。上澄液(PH7)
を環状蒸発罐中で蒸発乾固させ、メタノール(10−2
0mQ)中に溶解させた。得られた溶液をテストチュー
ブに移し、窒素気流中で約1mQに濃縮し、その後該チ
ューブの底に沈殿物が生成した。lmkのメタノールそ
のチューブに加え,その後有効薬剤の大半部分が溶解し
、ほとんどの沈殿物が溶けずに残った。鮮明なダークブ
ラウンの溶液をSephadex  L H 2 0ゲ
ル力ラム中に入れクロマトグラフによる分析を行なった
失迩旌又 有効薬剤の精製 純粋分離された有効薬剤を、Saphadex L H
 −20カラムを用いてカラムクロマトグラフイーによ
り精製した。使用された溶離剤はリン酸塩緩衝剤(0.
06M,PH7.2)であり、各段階でこれにメタノー
ル(0−100%)を加えた。混合物を0.4−0.6
mQ/+ninの流量で溶離した。2若しくは4mQの
留分を集め、その上えでフザリウム若しくはアルテリナ
リアに対する効力を調べた。更に、該留分の吸光度を不
純物については254nI1の波長で、有効薬剤につい
ては380nmの波長で測定した。そして、クロマトグ
ラl2をプロット、A2、。若しくはA3.。を留分ナ
ンバーの関数として示している(第1図)。
失見盤主 薄層クロマトグラフィーによる分析(TLC)純粋分離
された留分の純度を評価するために、又,一方バイオオ
ートグラフィー及びH P L C分析の為、薄層クロ
マ1−グラフィーによる分離方法を用いた。薄層クロマ
トグラフ分析を、定常相分質(stationary 
phase n+aterial)  としてシリカ6
0を、また移動相(mobil phase)としてク
ロロホルム、エタノール及び水の50 : 50 : 
8溶液を用いて行なった。薄層部(thin laye
r)は可視光域及び紫外線領域で試験し、有効薬剤のR
f値をバイオオートグラフィー法により決定した。バイ
オオートグラフィーに於いては、供試有機物(アルテル
ナリア ブラシシコーラ)を含む栄養寒天(nutri
ent agar)を当該相の表面に施与し、その後2
8℃で培養することにより、有効薬剤を偏析させた.結
果は3−4日後に判明し、その時には有効薬剤のスポッ
トの位置を{B試有機物が成長していない領域として観
測した。有効薬剤の試料をSephadex L H 
− 2 0カラムに通過させる際に得られたRf値は0
.33であった。
有効薬剤の液体クロマトグラフ分析の為、調整層(pr
eparative layer)クロマトグラフィー
を分析層(analytical layer)クロマ
トグラフィーと同じ方法で行kった。分離留分のRf値
を測定し、各Rf値の領域に対応する試料を取り除き,
その試料から、テ1−ラヒドロフラン若しくはアセトニ
トリル及び水(50:50)の混合物により有効薬剤を
抽出した。その抽出物を効能試験及び液体クロマトグラ
フの評価に供した。
失見鮭士 高圧液体クロマトグラフィ−(HPLC)液体クロマト
グラフィーを. Bischoff ODS}1yps
rsil  R P = 1 8逆相カラム及び等濃度
溶離法(isocratic elution)を用い
て行なった。溶離液として、EDTA水溶液又はアセl
・ニトリル若しくはテトラヒドロフランで混合したアン
モニウムアセテートを使用した。比較薬剤としてアンホ
テリシン(amphotericin) Bを使用した
。これは、非芳香族へプタエンタイプではあるが、アク
チノマイシ一ト菌により生威される有効薬剤と類似の化
合物である。有効薬剤のクロマトグラムを第2図に示す
。有効薬剤の主戊分を符号A,B.Cで示す。含有物は
多或分ポリエンの混合物であり、分離されたポリエン或
分の全ては、UVスペクトルによると、ヘプタエンであ
る。
上記有効薬剤は、tJV光で処理すると分解する。
HPLCに於いて明瞭なポリエンのピークは、UV一処
理サンプルの分析では消滅した。即ち、UV処理すると
、有効薬剤は活性を失い、その結果効力のなくなった薬
剤は有効薬剤のような特徴的なピークを示さなかった. このことから、その効能は上記ボリエンの構造に関係し
ていると結論付けることが出来る。
失嵐班旦 有効薬剤のUV及びIRスペクトル 有効薬剤の紫外線スペクトルでは、ヘプタエンポリエン
の特性曲線が顕著である。アクチノマイシ一ト試料から
抽出した有効薬剤の混合物(ジメチルスルオキシド中4
0μg/mQ)のUVスペクトルを第3図に示す。この
UVスペクトルから判断すると、有効薬剤成分は、典型
的なヘプタン構造を形戊する7つの共役二重結合を含み
、而してこれらの極大波長はλ値で約368,388及
び412である(溶媒としてDMSOを用いた場合)。
IRを用いた有効薬剤の特性測定を、細胞マスから油出
した溶液を濃縮して得られ且つ様々な溶媒で抽出するこ
とにより精製された結晶質の物質上で実施した。
赤外線スペクトルは、カルボニル領@1,750−1,
500am’出吸収を示した(第4図)。
失益班旦 有効薬剤が芳香族であることの確認 科学誌に掲載された記事によると、ヘブタエンが芳香族
であるか否かは、少むくとも,ヘプタエンをアルカリで
加水分解することにより、遊離パラーアミノアセトフエ
ノン(PAAP)を検出することにより、若しくは生合
成で有効薬剤分子に対し結鎖したパラーアミノ安息香酸
(PABA)を検出することにより、実証され得る。P
ABAのラベリング( P A B A − labe
ling)は、例えば放射性PABAを用い且つ有効薬
剤分子から放躬能を検出することにより、検出され得る
。加水分解テストの結果及び放射性PABAによりラベ
゛ル化された有効薬剤の放射能を以下に述べる。
ヘプタエン錯体中のパラーアミノアセトフェノンの確認 原理:純粋分離されたヘプタエン錯体の少量をアルカリ
加水分解し、クロロホルl1を用いて抽出した。パラー
アミノアセ1−フェノン(PAAP)を半調合(sen
+e−preparative) H P L C力ラ
ムを用いてクロロホルム抽出物から純粋分離し,そして
このPAAPをガスクロマ1〜グラフィー及び質量分析
技術を用い分子量135に対応するシグナルを選択的に
IlIOすることにより純粋分離成分中に確認した。分
析結果は、有効薬剤のアルカリ処理がパラーアミノアセ
トフェノンを溶液中に分離させたことを示した。このこ
とは保持時間と質量スペクトルの関係(第5図)での基
部で(onthe basis)検出することができた
。第5図は、HPLCを用いて純粋分離されたパラーア
ミノアセトフエノンに対応する戒分のGC(ガスクロマ
グラフイー)一質量クロマトグラム(A)と、PAAP
のGC保持時間に対応する質量スベク1゛ル(B)とを
表す。
有効薬剤中の放射性”C−PABAの検出原理:菌株6
 1 (strain 61)をY M G (yea
stextract, malt extract,g
lucose medium)培養基(実施例1と同様
の組成)中で戊長させ、且つ培養の最初に”C−PAB
A500.000−1,500,OOOdpm/培養物
(dpm / culture)を加えた。テストチュ
ーブを28℃で約50h振とうし,その後有効薬剤を細
胞マスから抽出した。細胞マス抽出物及び培養基での有
効薬剤含有量をiillJ定した。生合成の間に於ける
放射能の有効薬剤への移行を、放射能を測定するH P
 L C検出器(放射計−Radiomatic)によ
り有効薬剤の放射能を決定することにより立証した。ラ
ベリングの結果を表1に示す。第6図は典型的なラジオ
クロマトグラムを示し、本図では最初のピークが14C
−PABAを、次の幅広ピークが有効薬剤を示す。この
クロマトグラムは放射能が有効薬剤に混和したことを示
し、このことは有効薬剤が芳香性であることも示唆して
いる。このクロマトグラムは、また全ての有効薬剤或分
が識別され(labeled)且つ芳香性であることを
示している。
但し、率は;@養基の活性度であり、その一部は有効薬
剤に混和している。ラベリング効率(labeliB 
efficacy)は添加された放射能に対する生成さ
れた有効薬剤の放射能比を基本として計算した。
有効薬剤の収量(yield of effectiv
e agent) =細胞マス中の有効薬剤μg/g 比放射能(specific activity) =
dpm量/細胞1グラムに対する有効薬剤量 放射能(activity dpm) 二計算上の効能
(65.2%)を用いてcpm表示度数(readin
g)がら計算されたdpi+表示度数 ラベリングテストの結果は,放射能の一部が有効薬剤に
侵入していることを示す。ラジオクロマトグラムによれ
ば、有効薬剤は14C一放射能で識別され、しかしPA
BAの一部はそのまま残り且つ有効薬剤と共に細胞マス
から抽出された。このように,細胞マス抽出物中の識別
された有効薬剤の放射能に対する14C−PABAの放
射能の比はおよそ0.56であった。加えて、混和して
いない多量のPABAが、培養基中に、抽出物に比八で
約1.7倍検出された。上記方法によって分析されたサ
ンプル中に、全部で622,000dpi+(サンプル
2〉及び840,OOOdpm (サンプル3)、即ち
培養物に加えられた放射能の61%及び55%が検出さ
れた。放射能の残り(balance of the 
activity)は細胞マス中に抽出されなかった物
質中に大半が残存した(その放射能は測定されなかった
)。
結果は、有効薬剤が識別された・ことを示し、刊行され
た調査データの存在に基づき、その放剥能は芳香族グル
ープ(パラーアミノアセトフェノン)の薬物作用(me
dication)により有効薬剤分子に関係している
と結論付けることができる。このように、研究対象とさ
れたアクチノマイシ−1ヘ閑株が芳香族へプタエンを生
處することは明らかである。
大黒ffi 有効薬剤の溶解性 有効薬剤を含む細胞マスから抽出された蒸発残渣につい
ての各種溶媒中での18解性を、0.1+nQバッチの
検討対象とされた溶媒に2■の沈殿物を加えることによ
り検討した。
有効薬剤は、アセトニトリル、メタノール,アセトン及
びテトラヒド口フラン更にDMS○の水溶液のような水
を含む極性有機溶媒に溶解した。
失見鼻炙 純粋分離された有効薬剤沈殿物の効能 純粋分離され且つ凍結乾燥された有効薬剤を,デイメチ
ルスルホキシド(DMSO)lmg/1+o(1に溶解
し、それらのMuC値(極小の抑制05度、minim
al inhjbitory concentrati
on)  を溶液希釈広によりiil!定した9、結果
を表2に示す。
K一主 MIC値(μg/mu)を用いて評価した各鈍枠分離さ
れたヘプタエンt4体及び基準薬剤の溶解能溶液希釈テ
ス1・ ここで、 Canはカンジシジン(Candicidin)、Am
B はアンホテリシン(Amphotericin) Bを
表す。
上記溶液希釈テストによると、有効薬剤試料TA54及
びTA541.1(両者共アルカリ洗浄された有機相か
ら得られる)は、カンジシジンとほとんど同じ効果があ
り、アンホテリシンBよりは幾分効果がある。
ボリエン含有量(HPLC分析におけるピーク高さの総
和)の関数としての純粋分離された沈殿物のMIC値は
,カンジシジンと比較した(第7図)試料の純度と云う
考えを提偶する。図は、ポリエン含有量が効能の増加(
M I C値の減少)に伴いどのように増加しているか
を明瞭に示している。純粋分離された有効薬剤TA54
及びT A 5411の純度は、参照薬剤として用いた
カンジシジンのオーダーにほとんど同じである。
夷見鮭ユ ビート基質上でのカリフラワーを立ち枯れさせるアルテ
ルナリアに対するS,グリセオビリディス及び他のアク
チノマイシ一ト菌株(1−10)の作用、及び液状培養
物中でのこれらの菌株にょる有効薬剤の生戊状況につい
て検討した。種をアルテルナリアにより汚染させ且つ種
々のアクチノマイシ一ト菌株(10“胞子/ m Q 
)の懸濁水溶液で処理した。結果を表3に示す。参照菌
株8−10はS.グリセオビリディス アクチノマイシ
一ト菌株の場合もあり得る。
(以下余白) 表一升 S.グリセオビリディス 参照菌株 ここで、 ネにおけるOは健全であること、 1は 発病したこと、 2は枯れてしまったことを表す。
発病抑制効果を次の式に基づき計算した。
表は、有効薬剤を生成する菌株は高い抑制効果を提供し
ていることを示す。
失適舅上立 有効薬剤を生成するグリセオビリデイス アクチノマイ
シ一ト菌株(菌株1.4及び5)の脂肪種子性セイヨウ
アブラナを立枯れさせるリゾクl・ニア(Rhizoc
tonia)に対する作用を蒸気処理された土壌基質上
で検討した。該基質をリゾクトニアで汚染させ且つ種を
アクチノマイシ一ト懸濁水溶液(濃度10“胞子/ m
 Q )で処理した。結果を表4lこ示す。
勇 4 脂肪種子性セイヨウアブラナを立枯れさせるリゾクトニ
アを抑制することは難しく、それに対し化学的に抑制す
る適当な方法は存しない。而して、本発明方法によって
得た結果は非常に優れている。
失旌輿圭ユー 化学薬剤により抑制することが、カーネーションに用い
られて来たが、これは満足するものではかかった。カー
ネーションのフサリウム立枯病をS.グリセオビリディ
ス(菌株1及び2)により抑制することについて検討し
た。その実験を,市販されている温室内でピー1〜基質
上でIi培することにより行なった。結果を表5に示す
表  5 処理Nαについて: 1;非処理例 2;或長期の1mに、1%アクチノマイシ一ト懸濁液(
1 0’胞子/ rgQ )を2回噴霧した。
3;植付ける前に根を1%懸濁液に浸し、成長期に0.
1%懸濁液(104胞子/ lIIQ )を2回噴霧し
た。
4;根を1%懸濁液に浸し、成長期に0.1%懸濁液(
104胞子/ m Q )を2回噴霧した。
5:1%懸濁液により根の浸漬と噴霧を月1回づつ行な
った。
失凰舊実業 脂肪柚子性セイヨウアブラナの収穫量に対する各種スト
レプトミセス グリセオビリディスの数的効果を、畑で
のテストにより検討した。結果を表6に示す。
(以下余白) 表  6 但し、 実施例10−12に既述されたアクチノマイシ
一ト菌株の番号付けは、実施例9の表3中でした番号付
けに対応している。
(発明の効果) 本発明方法においては、植物の病気や植物の蓄積症を除
去するに有効な薬剤として、S.グリセオビリディスの
懸濁液が使用され、しかもこの懸濁液は種、基質或いは
植生に対し極めて低濃度且つ低頻度で添加されるだけで
有効であるから経済的であり且つ簡易である。
【図面の簡単な説明】
第l図はグロマトグラムをスポットし留分ナンバーの関
数として表わした図、第2図は有効薬剤のクロマトグラ
ム,第3図は有効薬剤混合物のUVスペクトル、第4図
は赤外線スペクトル、第5図は保持時間と質量スペクト
ルの関係を表す図、第6図は典型的なラジオクロマトグ
ラム、第7冒1は有効薬剤濃度とMIC値との関係を示
す図である。 一以上一

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、種、基質若しくは植生を、ストレプトミセスグリセ
    オビリディスアクチノマイシート菌株を添加することに
    より処理することを特長とし、上記菌株が、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ (但し、RはCH_3、OH、H若しくはケトグループ
    のいずれか、R′はCH_3若しくはHである)を有す
    る放香族ヘプタエン構造の抗生物質を生成するものであ
    り、 該抗生物質が、約368、388及び412nm(溶媒
    としてDMSOを用いた場合)の波長で紫外線吸収の極
    大値を有すること、及び赤外スペクトルでカルボニル範
    囲1750−1500cm^−^1で吸収すること、で
    特徴付けられ、 且つ、該抗生物質が、水を含有する極性有機溶媒及びジ
    メチルスルホキシドに可溶性であること、を特徴とする
    植物の病気及び植物の蓄積症を除去する方法。 2、種、基質及び植生に、S.グリセオビリディス菌株
    が懸濁液として添加されることを特徴とする請求項1記
    載の方法。 3、S.グリセオビリディス菌株を、少なくともおよそ
    10^3胞子/mlを含む懸濁液として添加することを
    特徴とする請求項1又は2記載の方法。 4、S.グリセオビリディス菌株を基質に対し最低1l
    d/m^2の割合で施与することを特徴とする請求項3
    記載の方法。 5、S.グリセオビリディス菌株を、植え付ける前にア
    クチノマイシート懸濁液に苗木の根を浸漬することによ
    り及び/若しくは植生にアクチノマイシート懸濁液で噴
    霧することにより添加することを特徴とする請求項1、
    2又は3記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115362857A (zh) * 2022-09-22 2022-11-22 浙江石原金牛化工有限公司 一种水稻青立枯病防治方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58185509A (ja) * 1982-03-30 1983-10-29 ケミラ・オイ 菌による植物病害の防除方法および新規なストレプトミセス属放線菌菌株

Patent Citations (1)

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