JPH0361480A - アフィニティーマトリックスからの細胞の解離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、細胞−レセプターアフィニティー複合体から
生存細胞を解離する方法に関する。

（従来の技術） 現在、骨髄移ｔｉ！　（ＢＭＴ）は再生不良性貧血や白
血病の重要な治療法であり、このＢＭＴ戦略は他の悪性
疾患および遺伝病における使用効果について熱心に研究
されている。骨髄移植は２つの方法、すなわち同種異系
（遺伝学的に異なる提供者からの骨髄を使用）および自
系（切除療法に先立って凍結保存した自己由来の骨髄を
使用）の方法が開発されている。両方とも原理的には高
用量の化学療法および／または放射線療法、それに続く
輸液による骨髄の再集団化に基づいている。

同種異系ＢＭＴの使用可能性は、幹細胞集団のみの移植
が不可能であるために、明らかに移植細胞集団中のＴリ
ンパ球が関与する移植片対宿主反応による症状（ｇｒａ
ｆｔ　ｖｓ、　ｈｏｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ：　Ｇ　Ｖ　
ＨＤ　）により制限されている。また、Ｇ　Ｖ　ＨＤの
危険性は同種異系ＢＭＴを致命的な病気にだけ使用する
ように、その場合でもＨＬＡ適合提供者（通常、兄弟姉
妹）のいる患者にのみ使用するように限定している。自
系ＢＭＴは同種異系移植に伴う諸問題の多くを回避する
ことができる。しかしながら、自系ＢＭＴでは、病気の
再発を防ぐために、病気にかかった細胞集団（例、隠れ
た腫瘍細胞）を含まない望ましい細胞集団のみを再導入
することが必要である。

同種異系および自系の両方のＢＭＴに伴う諸問題は、移
植物として精製された幹細胞集団を使用するこεにより
軽減される。これらの精製集団はポジティブ選択（希望
する細胞だけを集める）またはネガティブ選択（望まし
くない細胞を除く）により骨髄細胞懸濁体から得ること
ができ、そして特定の細胞をアフィニティー物質で捕捉
する技法がよく発達している（Ｗｉｇｚｅｌ、　ｅｔ　
ａｌｌ１９６９）。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、、１５二４７；　　Ｗｙｓ
ｏｃｋｉ、　　　ｅｔ　　ａｌ、（１９７８）。

ｅｔ　ａｌ、（１９８０）、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　Ｍｅｔｈ、　、　３２：２８５；　　Ｍｕｌｌｅｒ−
５ｉｅｂｕｒｇ、　　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、Ｃｅ
１１．４４：６５３）。

成熟した分化細胞に固有の抗原に対するモノクローナル
抗体は、望ましくない細胞を除くために（すなわち、同
種異系または自系骨髄移植物からＴ細胞または悪性細胞
を除去するために）いろいろな“ネガティブ選択戦格に
おいて用いられている（Ｇｅｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ
、　Ｎ、　Ｃ１１，（１９８８）　８０：１５４−９；
Ｇｅｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　”Ｐｒｏｃ、ｏｆ　１ｓｔ
　Ｉｎｔ、Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎＢｏｎｅ　Ｍａｒｒ
ｏｗ　Ｐｕｒｇｉｎｇ”、Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔ
ｒａｎｓｐｌ、。

５ｕｐｐ、２．　Ｌｏｎｄｏｎ、　ＭａｃＭｉｌｌａｎ
、　１９８７）　ｏモノクローナル抗体および免疫磁性
微小球を用いるネガティブ選択によるヒト造血細胞の効
果的な精製が報告されているが、この方法は多数のモノ
クローナル抗体を使用し、従って臨床使用に際してポジ
ティブ選択よりも費用が余計にかかる（Ｇｒｉｆｆｉｎ
、　ｅｔａｌｌ、Ｂｌｏｏｄ、　　　６３二９０４（１
９８４）；　　Ｋａｎｎｏｕｒａｋｉｓ、　　　ｅｔ　
　ａｌ、　、Ｗｖｎ　　ｌｂ−＋ｎ＋ｔｎｌｎ＋ｙｖ　
　　＋Ｒ１＋ｎＱ−４１＋１９／＋ＱＲ７”ｌ）　−＋
ＭＱの研究はモノクローナル抗体処理後の標的細胞レベ
ルが１〜２桁減少することを報じている。これは同種異
系移植においてＧＶＨＤを防ぐのに必要な十分量のＴリ
ンパ球の減少とは言えず、さらにそれは１０６〜１０９
個の悪性細胞が患者の骨髄中に存在しうる自系骨髄移植
においても明らかに不十分である。

正常な骨髄幹細胞のポジティブ選択は骨髄移植治療のた
めのもう１つの方法である。この方法は、ヒトリンパ造
血前駆細胞を選択的に認識するモノクローナル抗体（例
えば、ＣＤ３４糖蛋白抗原のエピトープを認識する抗Ｍ
Ｙ１０モノクローナル抗体）を使用する。ＣＤ３４抗原
を発現する細胞には、本質的にすべての単能性および多
能性ヒト造血コロニー形成細胞［プレコロニー形成単位
（ｐｒｅ−ＣＦＵ）およびコロニー形成単位−芽細胞（
ＣＦＵ−Ｂｌａｓｔ）を含む］並びに非常に初期の段階
のＢリンパ系細胞が含まれるが、成熟Ｂ細胞、Ｔ細胞、
ＮＫ細胞、単球、顆粒球、血小板、または赤血球６８０
号明細書を参照されたい。

ＭＹ１０陽性細胞集団中のＣＦＵの収率は、４−ヒドロ
ベルオキシシクロホスファミド（骨髄の移植能を奪うこ
となく骨髄移植物から悪性細胞を“パージする”シクロ
ホスファミド中間代謝物である）で骨髄移植物を処理し
た後に観察されるＣＦＵの回収率０．１〜２３％よりも
はるかに高い（Ｙｅａｇｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８
６）、　Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、、　３１５：１４１
）。また、ＣＤ３４モノクロ一ナル抗体を利用するポジ
ティブ選択は、骨髄または血液から希な前駆細胞を単離
する際に、ネガティブ選択よりも一層（長期にわたって
）ＢＭＴに利用可能であり、白血病以外の病気の治療に
おいて特異性、容易性、コストのような利点をもたらす
と考えられる。

最近、Ｂｅｒｅｎｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、
　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

電ｅｔｈ、、　９１：１１−１９は、モノクローナル抗
体カラムを用いるクラス■抗原陽性またはＣＤ３４陽性
細胞の骨髄からの大規模ポジティブ選択法を開示した。

予備結果は分離したヒト骨髄試料に対するｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ　ＣＦ　Ｕ検定、および霊長類を用いた実際のｉｎ
　ｖｉｖｏ　ＢＭＴ実験に基づいていた（　Ｂｅｒｅｎ
ｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、（１９８８）、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ
、Ｉｎｖｅｓｔ、、　８１：９５１−９６０）。霊長類
を用いた実験は、ヒトと霊長類とがＭＹ１０糖蛋白の一
部のエピトープを共有するので、実施可能であった。

骨髄細胞はカラムを通過する骨髄の遅いパーコレーショ
ンにより生ずる高い細胞密度で非特異的に集合する傾向
がある。この遅いパーコレーションは細胞表面抗原に対
するモノクローナル抗体の結合活性が比較的低いために
やむを得ず必要となり、そのためにこの研究は高親和性
のアビジン−ビオチン相互作用を利用した。骨髄細胞は
初めにモノクローナル抗体で標識し、次にビオチン標識
抗マウスＩｇで標識した。アビジンを被覆した巨視的ア
ガロースビーズのカラムを通してパーコレーションを行
うと、抗原陽性細胞は高い流速でさえもカラムに結合し
た。カラムを洗って未結合細胞を除いた後、カラム内容
物の激しいピペッティングにより結合細胞をビーズから
物理的に解離させた。この解離方法は、全部の細胞−抗
体複合体（すなわち、抗体被覆した細胞）を最終細胞懸
濁体から取り除くことを保証するものではない。

ＭＹ１０陽性細胞のポジティブ選択の改良技術を利用す
ることができ、この改良法は骨髄細胞を多数の試薬（Ｃ
Ｄ３４モノクロ一ナル抗体、ビオチニル化ポリクローナ
ル抗マウス抗体、アビジン結合マクロビーズ）で処理す
る必要がない。細胞に対する非特異的結合活性の低い磁
性微小球が、（所望抗体の吸着のために）非被覆形また
は抗マウスＩｇ被覆形のいずれかで市販されている。細
胞の閉じ込めは単分散微小球の使用により一層簡単に避
けることができ、この免疫磁性微小球技術は、例えばＧ
ａｕｄｅｒｎａｃｋ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、、　９０：１７９　（１９８６）　ｌ：：お
イテ、ポジティブ選択に効果的であることが分かった。

ＢＭＴの最も望ましい細胞懸濁体は細胞：レセプター複
合体を実質的に含まないものであるだろう。従って、い
ったんポジティブ選択した細胞を非選択細胞から分離し
たら、いかにしてそれらをアフィニティーマトリックス
から解離させるかという問題が依然として残っている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は、細胞の生存能力および機能を保持する
アフィニティーマトリックスに結合した細胞の解離方法
を提供することである。

また、本発明の目的は、ポジティブ選択した細胞を、生
存能力のある機能的な状態のままで、それらを選択する
のに用いたレセプターから解離する方法を提供すること
である。

本発明の別の目的は、すべての外来蛋白（特に、ＣＤ３
４抗原に対する抗体）を実質的に含まない、ＣＤ３４表
面抗原により特徴づけられる生存能力のある機能的な骨
髄細胞の回収方法を提供することである。

これらの目的および他の目的はここに記載する発明の実
施により達成しつる。

本発明はポジティブ選択した細胞を生存能力のある機能
的な状態で解離する方法から成り、その場合アフィニテ
ィー精製に利用される特定のレセプター−リガンド相方
作用に関与したリガンドがそのリガンドに特異的な１種
またはそれ以上の分解酵素により選択的に攻撃される。

選択的攻撃の正確なタイプは、問題の細胞に無毒性・無
害でありかつ限られた数の細胞表面構造に作用する酵素
の選択により制御できる。アフィニティーマトリックス
上のレセプターよりもむしろ細胞表面“リガンド”を攻
撃することによって、細胞は幾分かの露出された膜分子
のほんの小さな傷を犠牲にして、それらの表面を覆った
“外来物質”から解放される。その結果得られる細胞懸
濁体は実質的にレセプター物質を含まない。レセプター
担持細胞はいくつかのｉｎ　ｖｉｔｒｏ方法・手順には
適しているかも知れないが、ｉｌ　ｖｉｖｏ方法（特に
、治療を目的とした方法）では、これらのレセプターは
非常に有害でありうる。

本発明は、１つの実施態様において、ＣＤ３４陽性骨髄
細胞を単離するために抗ＭＹ１０および免疫磁性微小球
を利用しかつ単離したＣＤ３４陽性細胞から微小球を解
離するために酵素を使用する、“幹細胞”のポンチイブ
選択法を意図している。ＭＹ１０陽性細胞からの免疫磁
性微小球の再現性のある酵素切断は、その調製物をパパ
インまたはキモパパインで短時間処理することにより達
成できる。キモパパイン処理はヒトコロニー形成細胞ま
たはラット幹細胞に検出しうる損傷を与えない。ＣＤ３
４陽性モノクロ一ナル抗体被覆微小球を使用すると、こ
の免疫磁性微小球技法はアビジン−ビオチン系よりも工
程数が少なくてすむ。

（課題を解決するための手段） 本発明は細胞表面に特異的に結合したレセプターからの
細胞の解離を目的としている。本発明によって意図され
る細胞は動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞であり、そ
の場合細胞は、それらの表面に、表面リガンド−特定レ
セプターの結合部位を１つまたはそれ以上含む分子−が
存在することにより特徴づけられる。これらのリガンド
は本発明によって意図される細胞型に固有のものであり
、本発明の目的にとって望ましくない他の細胞型には存
在しないものである。この目的は最適には患者に選択し
た細胞のサブ集団を投与することを含む治療を目的とし
ている。適当な細胞型には、血液または骨髄からの幹細
胞、ホルモン分泌細胞、特定の型のリンパ球、ＬＡＫ細
胞、および当分野で知られた他の細胞型が含まれる。サ
ブ集団の選択はレセプターと特定の表面リガンドとを結
合させることから成っている。

レセプターが結合する特定の細胞表面リガンドは炭水化
物、蛋白、脂質、および複合分子であり、例えば、限定
するものではないが、よく知られた細胞表面抗原、細胞
膜蛋白、および細胞表面糖脂質や糖蛋白の炭水化物部分
である。本発明によって意図されるレセプターには、細
胞表面抗原に特異的な抗体、細胞表面糖脂質や糖蛋白の
炭水化物部分に特異的なＬツクチン、および細胞表面リ
ガンドに結合する他の蛋白が含まれるが、これらに限定
されない。レセプターは天然のままの状態であっても、
その後池の結合成分に結合されてもよく、また、それら
は蛍光標識や不溶性支持体マトリックスのような他の成
分に共有結合で結合されていてもよい。不溶性支持体マ
トリックスとして使用できる物質は当分野でよく知られ
ており、蛋白、炭水化物、ポリスチレン、ポリアクリル
アミド、磁性材料などが含まれる。支持体の形状は当分
野でいろいろ知られており、平面、ビーズ、微小球など
であり得る。

細胞−レセプター複合体は当分野でよく知られており、
本発明の実施においては広く解釈される。

それらは細胞の生存能力を維持するのに適しかつ細胞−
レセプター結合を妨害しない媒体中で細胞とレセプター
とを、結合を起こさせるのに十分な時間、インキュベー
トすることによりつくられる。

これらの細胞−レセプター複合体は、レセプター分子ま
たは細胞−レセプター複合体の性質に基づいた分離技術
を用いて、レセプター分子に結合していない他の細胞か
ら分離される。分離技術の例としては蛍光活性化細胞選
別またはフローサイトメトリー（この場合のレセプター
は蛍光標識抗体である）、アビジン−アフィニティーカ
ラム（この場合のレセプターはビオチン標識抗体である
）、および磁性分離（この場合のレセプターは免疫磁性
徴小球上の抗マウスＩｇＧと反応するネズミ抗体である
）が含まれる。細胞−レセプター複合体の分離は、その
複合体を得るために使用した分離技術に関係なく、本発
明の意図の範囲内である。

細胞−レセプター複合体を分離した後、細胞は分解酵素
で処理することにより複合体から解離される。その際、
酵素は細胞集団の生存力または機能を実質的に低下させ
ることなく、レセプターと結合している細胞表面リガン
ドを特異的に分解する。この酵素はカルボヒドラーゼ、
プロテアーゼおよびリパーゼより成る群から選ばれ、通
常細胞表面リガンドの既知化学に基づいて選ばれる。プ
ロテアーゼは細胞表面蛋白および糖蛋白抗原に対して使
用され、そして特定のカルボヒドラーゼは細胞表面糖脂
質および糖蛋白に対して使用される。

例を挙げると、シアル酸含有表面炭水化物に作用するノ
イラミニダーゼ；Ｎ−グリカナーゼ、〇−グリカナーゼ
、エンド−グリコシダーゼＦ１エンドーグリコシダーゼ
Ｈのようなグリコシダーゼ類；ペプシン、パパイン、キ
モパパイン、キモトリプシンのようなプロテアーゼ類；
並びにホスホリパーゼＣおよびＤである。また、対象の
リガンドを分解することが経験的に認められている酵素
、あるいは細胞：レセプター複合体からレセプターを解
離することが経験的に分かっている酵素も使用できる。

選ばれた酵素の有効性は次の方法によって簡単に確かめ
ることができる。最初に、対象の細胞を含む細胞集団と
選ばれた酵素（または候補酵素類）とを、細胞の生存力
を低下させることなく酵素（類）の活性を高める条件下
でインキュベートする。

インキュベーション後、細胞を洗って酵素を除き、レセ
プターと結合する細胞の能力について調べる。

酵素で処理した細胞は生存力についても調べる。

酵素処理が生存力を低下させずにレセプター結合を破壊
したならば、その酵素は適当な候補者であるだろう。

本発明方法で用いる酵素の適合性は、細胞とレセプター
とをインキュベートシ、続いて酵素で処理することによ
り確かめることができる。その後細胞を洗って酵素とレ
セプターを除き、そして細胞の生存力について調べる。

細胞がレセプターから解離されしかも生存力を保持する
ならば、その酵素選択の適合性が確認されたことになる
。当分野で通常の知識を有する者はこの方法を適用して
、よく知られた、性状決定のなされた、多くの細胞−レ
セプター複合体からの細胞の解離に適する酵素を選択す
ることが可能である。

本発明の実施においては、未結合細胞を実質的に含まな
い細胞−レセプター複合体と所定の酵素とを、特定の細
胞型の懸濁に適する媒体中で、細胞の生存力を最大限に
高める穏やかな温度・撹拌条件下にてインキュベートす
る。当業者にとっては、これらの条件は細胞の分離およ
び細胞−レセプター複合体の製造の際に用いる条件から
明らかであるだろう。インキュベーションは細胞表面か
ら全部のレセプターが実質的に解離するに足る時間にわ
たって続けられる。酵素は細胞表面リガンドの分解につ
いての日常試験の結果に基づいて選ぶことができる。酵
素の用量を増したり、温度を高めたりすると、インキュ
ベーション時間の短縮が可能である。インキュベーショ
ン時間、温度および酵素用量は解離された細胞の生存力
を最大限にするように最適化しつる。この最適化は当分
野での通常の知識の範囲内で常法により行われる。

酵素処理後、細胞は酵素とレセプターを除去すべく洗浄
され、そして細胞集団が適当な懸濁媒体中に回収される
。レセプター結合および分離に先立ってもとの細胞集団
を回収するために用いた洗浄法はこの段階にも適してい
る。酵素処理・洗浄後の細胞集団は、ポジティブ選択さ
れた細胞型から成っており、外来の抗原物質を実質的に
含まない。従って、それはとりわけ治療用途に適してい
る。

本発明の特定の実施態様では、ＣＤ３４抗原を保有する
細胞がポジティブ選択され、これにより細胞表面に外来
レセプターをもたない骨髄移植用の細胞集団がもたらさ
れる。この細胞集団はリンパ造血前駆細胞型を含むが、
成熟Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、顆粒球、血小板
および赤血球のような成熟細胞を含まず、また悪性細胞
も含まない。本発明方法は初めに、ＣＤ３４陽性のレセ
プター結合細胞集団を抗ＭＹ１０抗体に結合するそれら
の能力に基づいて選択することが必要である。

抗ＭＹ１０抗体に結合した前記集団の調製法は米国特許
第４，７１４，６８０号明細書に教示されており、参照
によりここに引用するものとする。

この種の細胞集団を得るための好適な方法は、抗ＭＹ１
０モノクローナル抗体を使って免疫磁性微小球に細胞を
結合させ、その後微小球結合細胞を磁場をかけた適所に
保持し、その間に未結合細胞を洗い流すことから成って
いる。

代表的な方法では、標準技法を用いて、フィコール精製
を行ってまたは行わずに、骨髄からバッフィコート（ｂ
ｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）細胞を採取し、それらをＧｉｂｃ
ｏ　ＴＣ１９９（好ましくは、０．２５％ヒト血清アル
ブミン（ＨＳ　Ａ）を含む）のような適当な組織培養基
中に５Ｘ１０’〜１０８細胞／ｍｌで懸濁させる。抗Ｍ
Ｙ１０モノクローナル抗体は、別の実験により調べて、
この抗体で細胞を標識するのに必要な量より過剰に加え
る。好適な抗体はハイブリドーマ細胞系列ＡＴＣＣＨＢ
−８４８３（米国特許第４．７１４，６８０号明細書に
おいて同定）が産生ずるモノクローナル抗体により同定
されるエピトープと複合体を形成するであろう。

細胞と抗体は穏やかに撹拌しなから０〜４０℃（好まし
くは約４°Ｃ）で１０〜１２０分（好ましくは２０〜３
０分）インキュベートする。インキュベージコン後、細
胞は同一の組織培養基を使って遠心により１回以上洗浄
する。その後、抗体処理細胞はＩｇＧ被覆磁性微小球（
この場合のｉｇＧは細胞被覆に用いた抗ＭＹ１０モノク
ローナル抗体の種型１ｇに特有のものである）と、一般
に細胞あたり０．　５〜４個の微小球を用いて、混合す
る。

インキュベーション条件は抗ＭＹ１０とのインキュベー
ションについて示した条件と同じである。インキュベー
ション後、微小球と微小球結合細胞は強力な磁場によっ
てインキュベーション容器中に保持し、一方未結合細胞
は洗浄により除去する。

適当な洗浄プロトコールは１０倍容量の組織培養基を用
いる３回洗浄であるだろう。

磁性微小球に結合した細胞の所望集団を得るためのそれ
ほど好適でない別の方法は、モノクローナル抗ＭＹ１０
抗体で被覆した磁性微小球を作製し、これらの微小球と
最初の骨髄単離物とを上記のインキュベーション条件下
で直接インキュベートすることを含んでいる。この別法
は処理段階が少なくてすむが、コロニー形成細胞の回収
率が低いだろう。

目的とする細胞は酵素（好ましくはキモパパイン）で処
理すると磁性微小球から解離される。適当なキモパパイ
ン調製物はどれも使用できる。腰椎根病（ｌｕｍｂａｒ
　ｄｉｓｃ　ｄｉｓｅａｓｅ）の治療用に開発された治
療製剤が特に適している。細胞結合微小球は５０〜５０
０単位のキモパパイン／１０７細胞で処理される（１単
位はベンゾイルアルギニン−ｐ−ニトロアニリドから１
ピコモル／秒のｐ−ニトロアニリンを加水分解する）。

この処理は適当な培養基（好ましくはＴＣ１９９）中で
、５〜２４０分間（好ましくは５〜４５分間）、４〜４
Ｏ℃（好ましくは３０〜３７℃）、５Ｘ１０’〜１０”
／ｍｌの細胞密度において行われる。インキュベーショ
ン後、磁性微小球を密度に基づいて分離するか、または
磁場によって捕獲して、細胞をデカントする。好ましく
は、細胞集団はその後組織培養基での遠心洗浄により残
留酵素を除去する。得られた細胞集団は特に骨髄移植に
有用である。

本発明の細胞集団は幹細胞移植のような治療法に、また
は当業者には自明である他の治療法に使用することがで
きる。例えば、この種の細胞集団は骨髄移植を必要とす
る哺乳動物患者に、患者の造血・免疫系を再生するに足
る量で、静脈内に直接投与される。正確な有効量は当業
者が容易に決定でき、もちろんこの療法で治療しようと
する症状に左右されるであろう。しかしながら、多くの
用途では、吸引された骨髄０．５〜ｌｌ中に存在する幹
細胞の数と大体同じ数の幹細胞を含む量で十分であるだ
ろう。

以下の実施例は本発明の特定の実施態様を例示するため
に提供するものである。これらの実施例は例示のみのた
めに提供され、本発明の範囲を制限するものではない。

（実施例） 例Ｉ ＫＧ１ａ細胞の抗原発現に対する蛋白分解酵素処理の影
響 キモパパインが細胞からエピトープを切断するかどうか
を調べるために、キモパパインの作用をＫＧ１ａヒト白
血病細胞系列で試験した。抗ＭＹ１０モノクローナル抗
体で被覆した、または被覆しないＫＧ１ａ細胞はキモパ
パイン（２００ｕｎｉｔ／ｍｌ　ＴＣ１９９，３７℃、
１０分）で処理し、洗浄し、その後モノクローナル抗体
で染色した。

キモパパイン処理はＫＧｌａｍｌからの抗ＭＹ１０抗体
およびＭＹ１０エピトープのほぼ完全な分離をもたらし
た。対照として処理した他の細胞表面抗原、トランスフ
ェリンレセプターおよびＣＤ４５Ｒエピトープは、減っ
てはいたが、まだＫＧ１ａ細胞において検出できた。

例２ 効果的なキモパパイン処理はヒト造血コロニ形成細胞に
有毒であるとは思われなかった。骨髄単核細胞（ＭＭＣ
）のバッフィコート調製物はＴＣ１９９（添加剤不含）
で洗浄し、その後２００ｕｎｉｔ／ｍｌのキモパパイン
（または対照媒体）を用いて３７℃で１０〜３０分間処
理した（１０７有核細胞／ｍｌ　　ＴＣ１９９）。キモ
パパイン処理骨髄細胞の初期生存細胞数もコロニー形成
能も対照と有意に異ならなかった（表１）。

表１ １０７個のバソフィコート骨髄ａｍは２００ｕｒ＋ｆｔ
／ｍｌのキモパパインを含むＴＣ１９９培養基１■１中
で１０分または３０分インキュベートし、ベレット化し
、その後コロニー形成検定のために同−容量中に懸濁さ
せた。

キモパパイン 処理時間（分） なし ０ ０ コロニー数／１０’培養細胞 ＣＦＣ−ＧＭ　　ＢＦＵ−Ｅ １３１　　　　　１０５ １１４　　　　　１１４ １０９　　　　　１０９ 対照的に、ＭＭＣをパパイン（条件：０．０２６ｍｇ／
ｍｌのパパイン、９０分のインキュベーション）で処理
した場合、初期の機能的なコロニー形成細胞の１０％が
回収された。トリプシンは造血コロニー形成細胞に有毒
であることが分かった。

例３ この実験では、初めに細胞を抗ＭＹ１０とインキュベー
トシ、次にヒツジ抗マウスＩ　ｇＧ、被覆磁性微小球と
インキュベートする“間接的”方法を利用した。１０’
個のＫＧ、１ａ細胞またはＭＭＣ（１０’／ｍｌ　　１
％ヒト血清アルフミン［Ｈ８Ａ］および２０ｍｇ／ｌゲ
ンタマイシンを含むＴＣ１９９培養基）は、非希釈ＭＹ
１０ハイブリドーマ上清（標識のために抗体過剰の状態
となるように前もって決定した量）と、血液学揺動一回
転混合機を使って４℃で３０分間インキュベートした。

その後、細胞はゲンタマイシンおよび０．　２５％Ｈ３
Ａを含む水冷ＴＣ１９９と遠心（２５０Ｘｇ、１０分）
することにより２回洗浄した。

モノクローナル抗体処理ＫＧ１ａ細胞またはＭＭＣ（ゲ
ンタマイシンおよび１％Ｈ８Ａを含むＴＣ１９９１ｍｌ
中）は、ねじぶた式チューブ中で抗マウスＩ　ｇＧ、被
覆（Ｄｙｎａｌ　Ｃｏｒｐ、からのダイナビーズＭ−４
５０）磁性微小球と、一般的にＯ２５〜４微小球／ＫＧ
１ａ細胞または／ＭＭＣの比で、混合した。微小球−細
胞混合物は穏やかにポルテックス混合し、血液学揺動一
回転混合機を使って４°Ｃで３０分間インキュベートし
た。インキュベーション後、細胞は微小球と微小球結合
細胞をチューブの壁面に保持する強力磁石を使って分離
し、その間に未結合細胞をチューブから流出させた。こ
のやり方で微小球／細胞複合体は添加剤を含まないＴＣ
１９９１０ｍ１で３回洗浄した。

ＭＹ１０陽性およびＭＹ１０陰性骨髄細胞画分は、位相
差顕微鏡を使って、ロゼツトおよび遊離細胞の存在につ
いて調べ、以下に記載する分析のために取っておいた。

フィコール−ハイバク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ
）精製した低密度ＭＭＣ細胞を用いると、微小球ｚＭＭ
Ｃ比０．５：１はＣＤ３４陰性細胞画分から造血コロニ
ー形成細胞の９０％を消失させることが判明した。

例４ 蛋白分解酵素を用いるＫＧ１ａ細胞からの微小球の解離 広範囲のパパイン濃度にわたる１〜３時間のパパイン処
理を用いて、ＫＧ１ａ細胞から免疫微小球を解離させる
一連の実験を行った。これらの条件下でのパパイン処理
（濃度０．０２６ｍｇ／ｍＩ）は本質的にＫＧ　１　ａ
細胞からの微小球の１００％解離をもたらし、その際の
生存細胞回収率は８４〜９３％であった。これと対照的
に、ジスバーゼ（ｄｙｓｐａｓｅ　；　Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）は抗ＭＹ１０によってＫＧ
１ａ細胞に結合した免疫磁性微小球を解離させるのに効
果的でなかった。トリプシンは、骨髄コロニー形成細胞
に対するその毒性のために、ＫＧ１ａ細胞から微小球を
解離させる効力について試験しなかった。

パパインに代わるものとして、ＭＹ１０／微小球／細胞
複合体はキモパパイン（商標名Ｃｈｙｍｏｄｉａｃｔｉ
ｎ、Ｆｌｉｎｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｂｏｏｔ
ｓ　Ｃｏ、　［ＵＳＡ］。

Ｌｉｎｃｏｌｎｓｈｉｒｅ、　ＩＬ）で処理した。これ
らの実験は、キモパパインが広範囲の濃度およびインキ
ュベーション時間にわたってＫＧ１ａ細胞から免疫磁性
微小球を解離させるのに効果的であることを示した。５
つの実験において、ＫＧ１ａ細胞（免疫磁性微小球に抗
ＭＹ１０を介して結合したもの）を２００　ｕｎｉｔ／
ｍｌのキモパパインにより３７℃で１０分間処理すると
、生存ＫＧ１ａ細胞の回収率は９０〜１０９％（平均１
００％）であった＝４５分間の処理ではほんのわずかに
毒性が強まった。

例５ 骨髄からのＭＹ１０陽性細胞の単離 Ｍ　Ｙ　１　’Ｏ陽性細胞は例３に従って抗ＭＹ１０お
よび免疫磁性微小球を使って単離しく０．５微小球／有
核細胞）、例４に従ってキモパパインにより微小球から
ＭＹ１０陽性細胞を分離した（２０Ｑ　ｕｎｉｔ／ｍ１
．　３７℃、１０分）。得られた細胞集団は、出発細胞
調製物が１〜３％の芽細胞を含むのに対して、通常５０
〜９０％の芽細胞を含んでいた。夾雑物として含まれる
主な細胞型は有核赤血球であった。リンパ球や顆粒球は
通常／し数存在していた。ＭＹ１０陽性細胞は芽および
初期リンパ様形態をもつことが以前に示された。

例６ 単離したＭＹ１０陽性骨髄細胞の光散乱特性フローサイ
トメトリーにおいて、ＣＤ３４陽性リンパ造血細胞はＢ
ＬＡＳＴ　（芽）”および“ＬＹＭＰＨ（リンパ）”窓
の特徴を示す光散乱特性を有する。

これと一致して、例５の免疫磁性微小球で濃縮したＭＹ
１０陽性細胞集団は、主として“ＢＬＡＳＴ”および“
ＬＹＭＰＨ″光散乱特性をもつ細胞を含んでいた。“Ｂ
ＬＡＳＴ”窓に入る細胞の比率は、非分離骨髄細胞では
１０％より少ない細胞がこのタイプの光散乱を示すが、
ＭＹ１０陽性細胞画分は通常“ＢＬＡＳＴ”窓に６０〜
７０％の細胞が入るので、とりわけ多くの情報をもたら
した。

例７ 単離したＭＹ１０陽性細胞の細胞表面抗原例５の新たに
単離した細胞画分はＭＹＩＱおよび他の細胞膜抗原の発
現について試験した。ＭＹｌ　旧会伍１■附Ｔ而本写ｌ
→　　非Ａ）φ艙モジに右シＩル占＾１　プ　　蔦小球
の手法により抗ＭＹ１０被覆細胞の効率のよい結合を示
す、検出可能なＭＹ１０を発現する細胞が（約９０％）
取り除かれた。“ＭＹ１０陽性”細胞画分中の大部分の
細胞は、抗ＭＹ１０への再露出後、（間接的免疫蛍光法
により）抗ＭＹ１０モノクローナル抗体と結合しなかっ
た。

特に重要なこととして、ＣＤ３４糖蛋白の他のエピトー
プはキモパパイン処理に抵抗を示すことが分かった。従
って、選択した細胞集団中のＣＤ３４陽性細胞の直接計
数は、これらのキモパパイン耐性ＣＤ３４エピトープに
対して誘導されたモノクローナル抗体を使うことにより
可能であった。

その他の細胞表面抗原もキモパパイン処理後にまだ検出
できることが見いだされた：これらにはＨＬＡ−ＤＲ１
ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２
０およびＣＤ４５が含まれる。

ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ５エピトープの保有はＭＹ１
０陽性細胞画分中の残留Ｔ細胞の監視を可能にする。

例８ 単離したＭＹ１０陽性骨髄細胞の造血コロニー形成能 免疫磁性微小球を使って得られた例５のＭＹ１０陽性細
胞画分は、ＣＦＣ−ＧＭ　（２３〜４１倍）およびＢＦ
Ｕ−Ｅ　（２１〜３１倍）に富んでおり、ＭＹ１０陽性
細胞画分中のこれらのコロニー形成細胞の回収率は１１
〜４５％であった。対応して、ＭＹ１０陰性細胞画分で
はコロニー形成細胞が減っていた。

この単離方法が回収細胞のコロニー形成能を低下させな
いことを確かめるために、この単離方法を別の選択方法
（パンニング：　ｐａｉｎｉｎｇ）と平行して行った。

２つの方法により得られたほぼ同一の結果（表２）は、
微小球とのインキュベーションおよびキモパパイン処理
後に、ＭＹ１０陽性細胞が優れたコロニー形成能を保持
することを示している。

表２ パンニング 非分離　ＭＹ１０−ＭＹＩＱ　＋ 微小球 ＭＹ１０−１１Ｙ１０＋ 実験１ 生存細胞 回収率（％） コロニー／１０５ 細胞：　ＣＦＣ−Ｇｌｌ ＢＦＵ−Ｅ ００ ５ ２．１ ２ ２．５ １５９　　　４３　　　３７４（１１１４１９０９５１
０１６１００１９７５ 実験２ 生存細胞 回収率（％） コロニー／１０５ 細胞：　ＣＦＣ−ＧＭ ＦＬＩ−Ｅ 混合 ００ ６ １．６ ８ １．４ ３（１５９３１２０００４３１０７５０１３０７０４３
８０１３２８８０ ００６２５２３７５ 例９ 骨髄バッフィコートからのＭＹ１０陽性細胞の単離 骨髄細胞のバッフィコート調製物（フィコール−ハイバ
ク調製物ではない）に対してこの単離方法を試みた。骨
髄バッフィコートからＭＹ１０陽性細胞画分を単離する
ことができた。これは実質的に、芽細胞形態をもちかつ
ＭＹ１０陽性細胞に特徴的な光散乱を示す細胞、および
造血コロニー形成細胞に富んでいた。しかしながら、Ｍ
Ｙ１０陽性細胞を効率よく単離するためには１〜４微小
球／有核細胞の比を用いることが必要であった。

こうして、フィコール精製細胞の場合は、この単離方法
に対して０．５微小球／有核細胞の比を必要とするにす
ぎないので、ＭＭＣの単離にはフィコール−ハイバク勾
配を使用することに決定した。

例１０ 正常ラット骨髄細胞のキモパパイン処理ラット骨髄細胞
は例２のようにしてキモパパインまたは対照媒体で処理
した。この処理は細胞の生存能力に有意な影響を及ぼさ
なかった（トリパンブルー色素排除法）。さらに、ラッ
トコロニーり検出されなかった。

例１１ 表３は、致死量を照射した同系ラットに、移植に対して
細胞数が限定的であるように選ばれた細胞用量を、骨髄
移植物として注入した後の、造血をうながす例１０の処
理済みラット骨髄細胞の能力を示す。実験１および２で
はラットにつき１００万および５００万個の細胞を使用
し、実験３ではラットにつき２００万および５００万個
の細胞を使用した。骨髄移植を受けなかった動物（全身
照射のみ）はすべて照射後１２〜１４日目に死亡した。

これらの動物は死の前に青白さが目立ち、死体解剖の際
に骨髄の細胞が極端に減少していた。

対照的に、５００万個の処理細胞または対照細胞を移植
した場合は、全部の動物が生存していた。

２００万個の出発細胞（キモパパイン処理または模擬処
理前の細胞カウント数に基づく）のより限定的な細胞用
量では、一部の動物が死亡したが、はとんど全部の動物
は照射対照を越えて数日間座きていた：生存数は処理群
対対照群において同一であった。これらの動物の死体解
剖は初期骨髄移植を暗示し、細胞減少骨髄内に同一であ
るとみなしうる造血細胞が存在していた。同様の結果が
１００万出発細胞／照射ラットの用量を用いて得られた
。キモパパインと骨髄細胞とのインキュベーション時間
を１０分から３０分に延長しても、これらの照射ラット
において造血をうながす処理細胞の能力は低下しなかっ
た。

表　　３ 処理　　　　処理　　　移植 （模擬または　　時間　　細胞用量 生存日数 （個々のラフト） 全■ 生存数 １２．１２　　　１３．１３ ６０＋、６０＋　　　５０＋、５０＋ １３、１４ キモパパイン １５、２１ １３、１３ ４モノＶ（イン ２５＋、２５＋　　　２／４ ２２、２５＋ ２５＋、２５＋　　　３／４ キモパパイン ６０４、６０＋ ５０＋、　５０＋ ２５４、２５＋ ２５４．２５＋　　　８／８ １モＩＣＩ＋イン ２５＋、２５＋　　　４７４ ２３、２５＋ ２５＋、２５＋　　　３／４ キモＮくイン ２５＋　２５＋　　　４／４ ２５＋、　２５＋ 例１２ 骨髄からのＣＤ３４陽性細胞の大規模分離骨髄は例３お
よび例４に記載したように処理した。ただし、フィコー
ル処理・洗浄段階のためにＣ０ＢＥ　　２９９１プロセ
ツシングユニツトを使用し、インキュベーションを表面
積７５ｃｍ”の組織培養フラスコ内で行った。用いたＭ
Ｙ１０モノクローナル抗体の量、微小球：細胞比、およ
びキモパパインの濃度は先の例と同じであった。２つの
別々の分離実験からの分離細胞のサイトスピン（ｃｙｔ
ｏｓｐｉｎ）に対して手動１０〇−細胞識別を実施した
（表４）。手動識別はその迅速性ゆえに細胞集団の純度
の速やかな評価に役立つ。

最終分離集団に含まれる細胞型の最も得る所の多い特性
決定は、細胞表面マーカーについての直接および間接免
疫蛍光検定法の使用によりもたらされた。細胞表面マー
カーに対して誘導されたモノクローナル抗体の大部分は
、分離の際に使用したキモパパインにより損傷または破
壊を受けていかいエピトープをＦＦａするーモノクロー
→−ルＭＹ１０により認識されるエピトープは、キモパ
パイン処理後、完全なままで存在しないが、ＣＤ３４糖
蛋白の他の抗原決定基は完全なままで残っている。ＴＵ
Ｋ３モノクローナル抗体はこの種の決定基の１つと反応
し、従って最終分離集団に含まれるＣＤ３４陽性細胞の
直接計数を可能にする。ＴＵＫ３抗体のサンプルはＢａ
ｒｂａｒａ　Ｕｃｈａｎｓｋａ−Ｚｉｅｇｌｅｒ博士（
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｕｒ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅ
ｌｌｅＩｍｕｎｏｌｏｇｉｅ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ
ｔ　Ｍａｒｂｕｒｇ、　Ｄｅｕｔｓｃｈ−ｈａｕｓｓｔ
ｒａｓｓｅ　１．　Ｄ−３５５０Ｍａｒｂｕｒｇ、　Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）から提供された。分離１では、９５％の
細胞がＴＵＫ３と反応したが、分離２では４３％が標識
されたにすぎなかった。

いろいろな他のモノクローナル抗体を使用して、最終分
離集団中に存在するＣＤ３４陽性細胞以外の細胞を同定
できる。抗白血球ＦＩＴＣ（ＣＤ４５）十抗Ｌｅｕ　Ｍ
３　　ＰＥ　（ＣＤ１４）試薬（ＬｅｕｃｏＧＡＴＥ、
　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎイムノサイトメト
リーシステム）は有核ＲＢＣ，ｌ１ｉｔ熟リンパ球、お
よび単球の同定を可能にする。抗Ｌｅｕｌ（ＣＤ５）お
よび抗Ｌｅｕ４　（ＣＤ３）はＴ細胞を同定するために
使用され、一方抗Ｌｅｕ１２　（ＣＤＩ９）および抗Ｌ
ｅｕ１６　（ＣＤ２０）はＢ細胞マーカーとして使用さ
れる。顆粒球はＣＤ１５に対して誘導されたモノクロー
ナル抗体により標識される。これらの抗体の使用により
得られた情報を分析して、細胞表面マーカーによる細胞
分布を得た（表４）。

表４ 分離したＣＤ３４陽性細胞集団の組成 分離１ 非細胞 有＠ＲＢＣ リンパ球 顆粒球 ５ ０８５ ３．５ 分１Ｉｔ２ 非細胞 有核ＲＢＣ リンパ球 顆粒球 例１３ 分離した骨髄細胞の光散乱特性 例１２の分離において得られた３つの細胞集団：１）非
分離フィコール処理細胞；２）微小球に結合せず、従っ
てＭＹ１０陽性細胞が取り除かれた細胞；および３）細
胞−微小球複合体のキモパパイン処理後に分離された、
ＭＹ１０陽性細胞を含む細胞；についての前方対側方散
乱をプロットした。ＭＹ１０陽性細胞は“ＢＬＡＳＴ”
および“ＬＹＭＰｌ’！”窓の特徴を示す光散乱特性を
有する。これらの窓のそれぞれに存在する各細胞集団の
パーセントを表５に示す。分離ｌおよび分ｌ！ｌ１２の
両方において、非分離細胞とＭＹ１０除去細胞は同様の
光散乱特性を示し、３つの窓において類似した細胞分布
を有する。予測されたように、分離細胞は主として“Ｌ
ＹＭＰＨ”および“ＢＬＡＳＴ”窓に存在し、その場合
“ＢＬＡＳＴ″窓における細胞のパーセントの顕著な増
加はとりわけＭＹ１０陽性細胞の濃縮を示すものである
。

分離２では、細胞表面マーカーにより測定して、約４３
％の細胞がＣＤ３４陽性細胞であるにすぎなかった（例
１２参照）。主な夾雑細胞型の有核赤血球およびリンパ
球も’ＬＹＭＰＩＩ”窓の特徴を示す光散乱特性をもつ
傾向があり、一部が“ＢＬＡＳＴ”窓にこぼれ出る。従
って、光散乱は顆粒球・単球の除去および“ＢＬＡＳＴ
“窓に存在する細胞（主にＣＤ３４陽性細胞）の濃縮を
示すのに最も有用である。

表５ 非分離　　　　１１Ｙ１０除去　　　　分離分子ｉｌ リンパ球 非細胞 顆粒球 分離２ リンパ球 非細胞 顆粒球 例１４ 造血コロニー形成能 例１２で得られた最終ＣＤ３４陽性細胞画分は、出発細
胞集団およびＭＹ１０除去細胞集団と比べたときのコロ
ニー形成細胞の濃縮について試験した。コロニー形成デ
ータを表６に示す。

表６ 細胞画分のコロニー形成能 非分離 非結合細胞 分離細胞 生存細胞 回収率（％） コロニー／１０５ 細胞　　　ＣＦＣ−ＧＭ　　３７０ ＢＦＵ−Ｅ　　　１８６ １４日　非細胞　５．８ ００ ９ ０．７６ ２００ ９５０ ４７．５ 分離２ 生存細胞 回収率（％） コロニー／１０５ 細胞：　　　　ＣＦＣ−ＧＭ　　１４３ＢＦＵ−Ｅ　　
　７５ ００ ０ ２．３６ ８６２５ ４２５ 両方の分離において、最終細胞画分は高度に濃縮された
コロニー形成細胞を含んでいた。この検定系における精
製ＭＹ１０細胞は通常５０００〜１００００コロニー／
１０５培養細胞を生じさせる。従って、コロニーを形成
するＣＤ３４陽性細胞の機能は、キモパパイン処理を含
む分離方法によって損なわれないと考えられる。さらに
、コロニー形成細胞は非結合、ＭＹ１０除去細胞画分中
にほとんど残っていなかった。

（外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞表面リガンドに特異的なレセプターに結合した
   細胞を解離する方法であって： 該レセプター結合細胞を、レセプターが結合しているリ
   ガンドに特異的な１種またはそれ以上の分解酵素で処理
   し；前記レセプターから生存細胞を分離する；ことから
   成る方法。２、レセプターは不溶性のアフィニティーマ
   トリックスである、請求項１記載の方法。 ３、マトリックスは免疫磁性微小球から成る、請求項２
   記載の方法。 ４、レセプターは蛍光標識抗体である、請求項１記載の
   方法。 ５、レセプターはＭＹ１０抗原に特異的である、請求項
   １記載の方法。 ６、分解酵素はキモパパインである、請求項５記載の方
   法。 ７、分解酵素が、細胞表面糖脂質および細胞表面糖蛋白
   より成る群の一員である細胞表面成分の炭水化物部分に
   特異的である、請求項１記載の方法。 ８、ＣＤ３４陽性細胞の精製方法であって：ａ）骨髄細
   胞を、ＭＹ１０抗原に特異的な モノクローナル抗体から成るアフィニティー物質で処理
   し； ｂ）抗体に結合した細胞を未結合細胞から分離し； ｃ）該抗体結合細胞を、該細胞から抗ＭＹ１０を解離し
   うる分解酵素で処理し； ｄ）酵素処理により解離された細胞から非細胞物質を分
   離する； ことから成る方法。 ９、酵素はキモパパインである、請求項８記載の方法。 １０、請求項８記載の方法により得られる細胞集団。 １１、請求項１０記載の細胞を動物に投与することから
   成る骨髄移植方法。