JPH0361487A - 豚流行性肺炎マイコプラズマの検出方法 - Google Patents
豚流行性肺炎マイコプラズマの検出方法Info
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- JPH0361487A JPH0361487A JP1198475A JP19847589A JPH0361487A JP H0361487 A JPH0361487 A JP H0361487A JP 1198475 A JP1198475 A JP 1198475A JP 19847589 A JP19847589 A JP 19847589A JP H0361487 A JPH0361487 A JP H0361487A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は豚流行性肺炎原因菌マイコプラズマ・ハイオニ
ュウモニエの検出方法に関する。
ュウモニエの検出方法に関する。
豚流行性肺炎（豚マイコプラズマ肺炎Ｍｙｃｏｐｌａｓ
ｍａＰｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｏｆ ５ｗ１ｎｅ＋以下ｒ
ＭＰｓＪという）はマイコプラズマ・ハイオニュウモニ
エ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
） （以下、ｒＭ、ｈｐＪという）という微生物により
惹起される。本店は慢性経過を取るのが特徴で、死亡率
は低い。しかしながら罹患率は極めて高く、飼料効率の
低下等、養豚産業に与えている経済的損失は美大なもの
となっている。
ｍａＰｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｏｆ ５ｗ１ｎｅ＋以下ｒ
ＭＰｓＪという）はマイコプラズマ・ハイオニュウモニ
エ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
） （以下、ｒＭ、ｈｐＪという）という微生物により
惹起される。本店は慢性経過を取るのが特徴で、死亡率
は低い。しかしながら罹患率は極めて高く、飼料効率の
低下等、養豚産業に与えている経済的損失は美大なもの
となっている。
農林水産省の調査によると現在日本の層場に出荷される
豚の半数以上が本店による肺病変を有しており、はぼ全
国的に蔓延していることが明らかにされている。
豚の半数以上が本店による肺病変を有しており、はぼ全
国的に蔓延していることが明らかにされている。
ＭＰＳの診断法に関しては補体結合反応、ＢＬＩＳＡ法
等による血清診断法、あるいは肺病変の肉眼所見による
方法が報告されている。また、病巣からＭ、ｈｐを分離
する方法もあるが、Ｍ、ｈｐは栄養要求性が厳しく人工
培地での発育には長期間が必要である。このため、従来
Ｍｐ ｓ ｇ染豚からＭ、ｈｐを分離し同定するまでに
少なくとも２週間から１ケ月程度必要であった。
等による血清診断法、あるいは肺病変の肉眼所見による
方法が報告されている。また、病巣からＭ、ｈｐを分離
する方法もあるが、Ｍ、ｈｐは栄養要求性が厳しく人工
培地での発育には長期間が必要である。このため、従来
Ｍｐ ｓ ｇ染豚からＭ、ｈｐを分離し同定するまでに
少なくとも２週間から１ケ月程度必要であった。
本発明の目的は、病巣からＭ、ｈｐを短期間で検出する
方法を提供することである。
方法を提供することである。
本発明の目的は以下の式（Ｉ）、（ｎ）、（Ｉ）、（Ｉ
Ｖ）または（Ｖ）で示される塩基配列のヌクレオチド、
これらをその一部として含む組換えＤＮＡ。
Ｖ）または（Ｖ）で示される塩基配列のヌクレオチド、
これらをその一部として含む組換えＤＮＡ。
あるいはこれらをその一部として含む合ａＤＮＡをＤＮ
Ａプローブとして用いたＤＮＡハイブリダイゼーション
法により達成される。
Ａプローブとして用いたＤＮＡハイブリダイゼーション
法により達成される。
ししＩｊＬＴＡＡＬＵ’１
Ｕｉ’ｌｔＡ’ｌ’ＡＡ’１ｒ
ＵＴＡＴＴＴＴＧ（：［’
以下、本発明の詳細な説明する。
リボゾームＲＮＡ （以下ｒ ｒＲＮＡ」という）は１
菌体当り１万コピー以上存在し、検出感度の面では非常
に有効であると考えられる。しかし、ｒ ＲＮ Ａは生
物の進化の過程において比較的よく保存されたものの一
つであることから抗原遺伝子と比較して特異性が低い。
菌体当り１万コピー以上存在し、検出感度の面では非常
に有効であると考えられる。しかし、ｒ ＲＮ Ａは生
物の進化の過程において比較的よく保存されたものの一
つであることから抗原遺伝子と比較して特異性が低い。
たとえば大腸菌、と枯草菌では７０＝８０％相同性があ
ると言われている。
ると言われている。
ところでＭ、ｈｐのｒＲＮＡについては、西独のグルー
プが１６５ｒＲＮＡの塩基配列を決定している〔Ｃ，Ｔ
ａ５ｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５１１５、３９１８（１９８７） ”Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ１６Ｓ
ｒＲＮＡ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ” ：ｌ 。本発明者は、このデータを
用い、現在までにすでに決定されている他種生物の１６
ＳｒＲＮＡの塩基配列と比較してＭ、ｈｐ １６Ｓ ｒ
ＲＮＡに特有な領域を検索した。
プが１６５ｒＲＮＡの塩基配列を決定している〔Ｃ，Ｔ
ａ５ｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ、 Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅ５１１５、３９１８（１９８７） ”Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ５ｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ１６Ｓ
ｒＲＮＡ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ” ：ｌ 。本発明者は、このデータを
用い、現在までにすでに決定されている他種生物の１６
ＳｒＲＮＡの塩基配列と比較してＭ、ｈｐ １６Ｓ ｒ
ＲＮＡに特有な領域を検索した。
その結果、Ｍ、ｈｐに特異的と考えられる数個の領域を
発見し、その領域からＤＮＡプローブとして有用と考え
られるオリゴヌクレオチドを選定し、これを化学合成し
、ＤＮＡプローブとしてＩＶｌｈｐの検出を行ったとこ
ろ、極めて高感度でＭ、ｈｐを検出しうろことを見出し
、本発明を完成するに至った。
発見し、その領域からＤＮＡプローブとして有用と考え
られるオリゴヌクレオチドを選定し、これを化学合成し
、ＤＮＡプローブとしてＩＶｌｈｐの検出を行ったとこ
ろ、極めて高感度でＭ、ｈｐを検出しうろことを見出し
、本発明を完成するに至った。
（、へ） Ｍ、 ｈｐ １６ Ｓ ｒＲＮＡにおけ
る特異領域の検索 ＪＯＩＳ−ＦのＧｅｎ １３ａｎｋ及びＥＭＢＬＤＮＡ
データベースを用い現在までに報告されている各種生物
の１６３ｒＲＮＡの塩基配列を検索した。
る特異領域の検索 ＪＯＩＳ−ＦのＧｅｎ １３ａｎｋ及びＥＭＢＬＤＮＡ
データベースを用い現在までに報告されている各種生物
の１６３ｒＲＮＡの塩基配列を検索した。
得られた塩基配列すべてと、第１図に示したＩｖｆ、ｈ
ｐ １６ Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列とを、遺伝子解析
用パソコン・ソフトウェアＧＥＮＩＡＳ （三井情報開
発）を用いて比較した。
ｐ １６ Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列とを、遺伝子解析
用パソコン・ソフトウェアＧＥＮＩＡＳ （三井情報開
発）を用いて比較した。
その結果、第１図において、塩基Ｎｏ、 １８０〜２４
０．５９０〜６８０．９９０−１０４０の３ケ所がＭ、
ｈｐ特異領域として考えられることがわかった。
０．５９０〜６８０．９９０−１０４０の３ケ所がＭ、
ｈｐ特異領域として考えられることがわかった。
（Ｂ） オリゴヌクレオチドの合成
法に、ＤＮＡプローブとして有用と考えられる、化学合
成すべきオリゴヌクレオチドを、以下の点に注意して決
定した。
成すべきオリゴヌクレオチドを、以下の点に注意して決
定した。
〔１）分子内で高次構造をとらないこと。
（２） １６ＳｒＲＮＡの他の領域と相同性をもたな
いこと。
いこと。
（３）分子内にくり返し構造をもたないこと。
（４）塩基の組成比が極端にかたよらないこと。
このような条件を満たし、ＤＮＡプローブとして適当と
考えられる３０塩基長のオリゴヌクレオチド２種類（プ
ローブ１及び２）を台底した。プローブ１及び２の塩基
配列は前記式（ＩＶ）及び（Ｖ）により表わされる。な
お、このオリゴヌクレオチドは１６Ｓ ｒＲＮＡの逆相
補鎖である。すなわち、プローブ１はＭ、ｈｐ １６５
ｒＲＮＡの塩基Ｎｏ、 ２０３〜２３２、またプロー
ブ２は塩基Ｎｏ、 ６１０〜６３９の逆相補鎖にあたる
。
考えられる３０塩基長のオリゴヌクレオチド２種類（プ
ローブ１及び２）を台底した。プローブ１及び２の塩基
配列は前記式（ＩＶ）及び（Ｖ）により表わされる。な
お、このオリゴヌクレオチドは１６Ｓ ｒＲＮＡの逆相
補鎖である。すなわち、プローブ１はＭ、ｈｐ １６５
ｒＲＮＡの塩基Ｎｏ、 ２０３〜２３２、またプロー
ブ２は塩基Ｎｏ、 ６１０〜６３９の逆相補鎖にあたる
。
（Ｃ）”Ｐ標識合成オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ
プローブ法によるＭ、ｈｐの検出合成オリゴヌクレオチ
ドの５′末端を３２ｐで標識し、Ｍ、ｈｐのＤＮＡプロ
ーブ法による検出を試みた。
プローブ法によるＭ、ｈｐの検出合成オリゴヌクレオチ
ドの５′末端を３２ｐで標識し、Ｍ、ｈｐのＤＮＡプロ
ーブ法による検出を試みた。
１） ” Ｐ標識合成オリゴヌクレオチドの調製Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ及びｒｒ−”Ｐｌ ＡＴＰを用
い、台底オリゴヌクレオチドの５′末端をリン酸化する
ことにより３２ｐｇ識を行った。得られたオリゴヌクレ
オチドの比放射活性は約４ Ｘ １０’ ｃ、ｐ、ｍ、
／ｐｍｏｌｅであった。
リヌクレオチドキナーゼ及びｒｒ−”Ｐｌ ＡＴＰを用
い、台底オリゴヌクレオチドの５′末端をリン酸化する
ことにより３２ｐｇ識を行った。得られたオリゴヌクレ
オチドの比放射活性は約４ Ｘ １０’ ｃ、ｐ、ｍ、
／ｐｍｏｌｅであった。
２）ＤＮＡプローブ法
上記プローブはｒＲＮＡに結合するものであす、シかも
オリゴヌクレオチドプローブであることから、−船釣な
ハイブリダイゼーションの条件ではうまく反応がおこら
ない。
オリゴヌクレオチドプローブであることから、−船釣な
ハイブリダイゼーションの条件ではうまく反応がおこら
ない。
そこで培養液の処理法、ハイブリダイゼーションの方法
、メンブレンの選択等、種々の条件検討を行った。
、メンブレンの選択等、種々の条件検討を行った。
その結果、次に示すような方法が適当であることが明ら
かとなった。
かとなった。
被検液１００μｌに２０％ジチオスレイトール又は２０
％Ｎ−アセチル−Ｌ−システィン１００μｌを加え、３
７℃、３０分処理し、溶菌させる。
％Ｎ−アセチル−Ｌ−システィン１００μｌを加え、３
７℃、３０分処理し、溶菌させる。
この処理により溶菌のほか、豚の鼻汁等の粘度の高い試
料を低粘度化できる。この試料をメンブレン（ゲルマン
社製バイオトレースＲＰ等）上にスポットする。８０℃
で２時間乾燥後、６０℃のプレハイブリダイゼーション
溶液（： ５ Ｘ５ＳＣ（０，１５ＭＮａＣ１，０，０
１５Ｍクエン酸ナトリウム〉、５ ｘＤｅｎｈａｌｄｔ
’ Ｓ溶液（０，０２％ＢＳＡ、０．０２％ポリビニル
ピロリドン、０．０２％フィコール）、０．２％５ＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）、２００μｇ／ｍｌ酵母ｔ
ＲＮ Ａ ：］に１時間浸漬する。続いて６０℃のハ
イブリダイゼーション溶液〔ブレハイブリダイゼーショ
ン溶液に２ ×１０ｇｃ、ｐ、ｍ、 ７１０ｍＩ！の３
２Ｐ標ｍオリゴヌクレオチドを加えたもの〕に２時間浸
漬する。
料を低粘度化できる。この試料をメンブレン（ゲルマン
社製バイオトレースＲＰ等）上にスポットする。８０℃
で２時間乾燥後、６０℃のプレハイブリダイゼーション
溶液（： ５ Ｘ５ＳＣ（０，１５ＭＮａＣ１，０，０
１５Ｍクエン酸ナトリウム〉、５ ｘＤｅｎｈａｌｄｔ
’ Ｓ溶液（０，０２％ＢＳＡ、０．０２％ポリビニル
ピロリドン、０．０２％フィコール）、０．２％５ＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）、２００μｇ／ｍｌ酵母ｔ
ＲＮ Ａ ：］に１時間浸漬する。続いて６０℃のハ
イブリダイゼーション溶液〔ブレハイブリダイゼーショ
ン溶液に２ ×１０ｇｃ、ｐ、ｍ、 ７１０ｍＩ！の３
２Ｐ標ｍオリゴヌクレオチドを加えたもの〕に２時間浸
漬する。
６０℃の５ｘＳＳＣ−０，２％ＳＤＳ溶液で２分間づつ
、２回洗浄し、風乾後、Ｘ線フィルム及び増感スクリー
ンを用いて、−７０℃で１６時間オートラジオグラフィ
ーを行う。
、２回洗浄し、風乾後、Ｘ線フィルム及び増感スクリー
ンを用いて、−７０℃で１６時間オートラジオグラフィ
ーを行う。
Ｍ、ｈｐとＭ、ｈｒ （Ｍｙｃｏｐｌａｓ＋ｎａ ｈｙ
ｏｒｈｉｎｉｓ）を２日間培養したものを原液とし、こ
の原液を試料１、その５．１０．５０．１００及び１０
００倍希釈液をそれぞれ試料２．３．４．５及び６とし
、その各１００μｍについて、上記方法にしたがって、
プローブ１及び２を用いてＭ、ｈｐの検出を行った。結
果を第２図に示す。（ハ）はプローブ１とプローブ２の
量をそれぞれＩ Ｘ １０６ｃ、ｐ、ｍ、／ １０−使
用したときの結果を示す。（イ）、（ロ）、（ハ）いず
れのばあいにも、１０００倍希釈液においてＭ、ｈｐを
検出することができた。Ｍ、ｈｐの培養原液の菌数は１
０６〜１０’ ｃｆｕ ／ｍ１．であリ、したがって１
０２〜１０’個の菌数で十分検出できることがわかる。
ｏｒｈｉｎｉｓ）を２日間培養したものを原液とし、こ
の原液を試料１、その５．１０．５０．１００及び１０
００倍希釈液をそれぞれ試料２．３．４．５及び６とし
、その各１００μｍについて、上記方法にしたがって、
プローブ１及び２を用いてＭ、ｈｐの検出を行った。結
果を第２図に示す。（ハ）はプローブ１とプローブ２の
量をそれぞれＩ Ｘ １０６ｃ、ｐ、ｍ、／ １０−使
用したときの結果を示す。（イ）、（ロ）、（ハ）いず
れのばあいにも、１０００倍希釈液においてＭ、ｈｐを
検出することができた。Ｍ、ｈｐの培養原液の菌数は１
０６〜１０’ ｃｆｕ ／ｍ１．であリ、したがって１
０２〜１０’個の菌数で十分検出できることがわかる。
またＭ、ｈｐに最も近縁のＭ、 ｈｒについては培養
原液でも全く反応しなかった。
原液でも全く反応しなかった。
また２種類のオリゴヌクレオチドは共にＭ、ｈｐに対す
る特異性があり、両者の混合により、さらに検出感度を
上げることができる。
る特異性があり、両者の混合により、さらに検出感度を
上げることができる。
本発明のＤＮＡをプローブとして用いるＭ、ｈｐの検出
法は、通常の分離検出法と比較して短時間（約２日）で
行うことができる。さらに、サンプルをジチオスレイト
ール又はＮ−アセチル−Ｌ−ンステイン処理するばあい
には、粘度の高い鼻汁等のサンプルについても適用可能
である。
法は、通常の分離検出法と比較して短時間（約２日）で
行うことができる。さらに、サンプルをジチオスレイト
ール又はＮ−アセチル−Ｌ−ンステイン処理するばあい
には、粘度の高い鼻汁等のサンプルについても適用可能
である。
Ｍ、ｈｐ感染豚の鼻汁には１０’ 〜１０’ ｃｆｕ／
−のＭ、ｈｐが存在すると考えられているので鼻汁試料
を用いてＭ、ｈｐ感染豚の直接診断も可能である。
−のＭ、ｈｐが存在すると考えられているので鼻汁試料
を用いてＭ、ｈｐ感染豚の直接診断も可能である。
第１図は、Ｍ、ｈｐの１６ＳｒＲＮＡの全塩基配列を示
す。 第２図は、 本発明のプローブ１及び２を用いて 行ったＭ。 ｈｐ 検出試験の結果を示す。
す。 第２図は、 本発明のプローブ１及び２を用いて 行ったＭ。 ｈｐ 検出試験の結果を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）下記の式（ I ）〜（Ｖ）からなる群から選ばれ
るヌクレオチド塩基配列を有するＤＮＡ。 （ I ） ＣＣＣＣＡＴＴＴＣ＾１Ｔ＾０ＴＧＧＴＧＡＡＧＣ＾２
Ｔ＾０ＴＧＡＡＧＧＣＴＣ＾３Ｃ＾０ＴＴＴＧＡＡＴＡ
Ａ＾４Ａ＾０ＡＡＴＴＣＡＴＧＣ＾５Ａ＾０ＡＡＴＴＴ
ＴＴＡＴ＾６Ｃ＾０Ａ（II） ＣＣＧＣＴＡＡＣＣ＾１Ｔ＾０ＣＴＴＣＡＴＡＡＴ＾２
Ｔ＾０ＣＴＡＴＴＴＴＧＣ＾３Ｃ＾０ＡＧＴＡＴＣＴＡ
Ａ＾４Ａ＾０ＧＣＧＧＡＣＴＡＡ＾５Ａ＾０ＧＴＴＧＡ
ＧＣＴＴ＾６Ｔ＾０ＡＧＣＡＴＴＴＡＡ＾７Ｃ＾０ＴＴ
ＴＡＡＡＣＴＴ＾８Ａ＾０ＡＣＡＡＡＡＡＡＣ＾９Ｃ＾
０Ｔ（III） ＧＴＧＡＴＣＴＣＧ＾１Ｔ＾０ＴＡＧＣＣＴＣＧＧ＾２
Ｃ＾０ＴＡＴＡＴＣＴＣＴ＾３Ａ＾０ＴＡＧＴＴＴＴＧ
Ｃ＾４Ｇ＾０ＡＧＡＡＴＧＴＣＡ＾５Ａ＾０Ｇ（IV） ＣＴＴＧＧＴＧＡＡ＾１Ｇ＾０ＣＴＴＧＡＡＧＧＣ＾２
Ｔ＾０ＣＣＴＴＴＧＡＡＴ＾３Ａ＾０（Ｖ） ＣＧＧＡＣＴＡＡＡ＾１Ｇ＾０ＴＴＧＡＧＣＴＴＴ＾２
Ａ＾０ＧＣＡＴＴＴＡＡＣ＾３＾０Ｔ（２）請求項（１
）記載のヌクレオチド塩基配列をその一部として含む組
換えＤＮＡ。 （３）請求項（１）記載のヌクレオチド塩基配列をその
一部として含む合成ＤＮＡ。 （４）請求項（１）、（２）、及び（３）のいずれか１
項記載のヌクレオチド塩基配列を含むＤＮＡをプローブ
として用いて、ＤＮＡハイブリダイゼーション法により
豚流行性肺炎マイコプラズマ（マイコプラズマ・ハイオ
ニュウモニエ）を検出する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1198475A JPH0361487A (ja) | 1989-07-31 | 1989-07-31 | 豚流行性肺炎マイコプラズマの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1198475A JPH0361487A (ja) | 1989-07-31 | 1989-07-31 | 豚流行性肺炎マイコプラズマの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0361487A true JPH0361487A (ja) | 1991-03-18 |
Family
ID=16391728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1198475A Pending JPH0361487A (ja) | 1989-07-31 | 1989-07-31 | 豚流行性肺炎マイコプラズマの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0361487A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1327070C (zh) * | 2001-09-18 | 2007-07-18 | 福伸工业株式会社 | 布帛处理装置 |
| US7361746B2 (en) | 1999-12-15 | 2008-04-22 | Gen-Probe Incorporated | Methods and compositions for detection of Mycobacterium avium complex species |
-
1989
- 1989-07-31 JP JP1198475A patent/JPH0361487A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7361746B2 (en) | 1999-12-15 | 2008-04-22 | Gen-Probe Incorporated | Methods and compositions for detection of Mycobacterium avium complex species |
| CN1327070C (zh) * | 2001-09-18 | 2007-07-18 | 福伸工业株式会社 | 布帛处理装置 |
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