JPH0361491A - ＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの生産方法 - Google Patents
ＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの生産方法Info
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- JPH0361491A JPH0361491A JP2115010A JP11501090A JPH0361491A JP H0361491 A JPH0361491 A JP H0361491A JP 2115010 A JP2115010 A JP 2115010A JP 11501090 A JP11501090 A JP 11501090A JP H0361491 A JPH0361491 A JP H0361491A
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- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
見旦曵遣遣
本発明は、Ｘｎａ ！制限エンドヌクレアーゼ及び修飾
メチラーゼのためのクローンと、該クローンから前記酵
素を生産する方法とに関する一０制限エンドヌクレアー
ゼは細菌中に天然に存在する種類の酵素である。制限エ
ンじヌクレアーゼを細菌の他の夾雑物質から精製すると
、それらは実験室において、ＤＮＡ分子を正確な断片に
切断するために使用することができる。この特性によっ
てＤＮＡ分子を唯一に同定したり構成遺伝子に断片化す
ることが可能となる。制限エンドヌクレアーゼは最近の
遺伝子研究において不可欠なツールであることは明らか
である。制限エンドヌクレアーゼは、それによって遺伝
子工学及び遺伝子解析が実施される生化学的な「はさみ
」である。
メチラーゼのためのクローンと、該クローンから前記酵
素を生産する方法とに関する一０制限エンドヌクレアー
ゼは細菌中に天然に存在する種類の酵素である。制限エ
ンじヌクレアーゼを細菌の他の夾雑物質から精製すると
、それらは実験室において、ＤＮＡ分子を正確な断片に
切断するために使用することができる。この特性によっ
てＤＮＡ分子を唯一に同定したり構成遺伝子に断片化す
ることが可能となる。制限エンドヌクレアーゼは最近の
遺伝子研究において不可欠なツールであることは明らか
である。制限エンドヌクレアーゼは、それによって遺伝
子工学及び遺伝子解析が実施される生化学的な「はさみ
」である。
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿ったヌクレ
オチドの特定の配列（「認識配列」〉を認識しそこに結
合することにより作用する。−旦結合したならば、制限
エンドヌクレアーゼは分子を配列内または配列の片側で
切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識
配列に対してＭｆＫＪ性を示す、これまでに調査された
極めて多数の細菌において、１００種以上の異なる制限
エンドヌクレアーゼが同定されている。
オチドの特定の配列（「認識配列」〉を認識しそこに結
合することにより作用する。−旦結合したならば、制限
エンドヌクレアーゼは分子を配列内または配列の片側で
切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識
配列に対してＭｆＫＪ性を示す、これまでに調査された
極めて多数の細菌において、１００種以上の異なる制限
エンドヌクレアーゼが同定されている。
細菌は、穏当たり多くともたった数種の制限エンドヌク
レアーゼしか有さない傾向にある。エンドヌクレアーゼ
は典型的にはそれらが誘導された細菌に従って命名され
る。即ち、Ｈａｅｍｏ ｈｉｌｕｓｍ種は例えばＨａｅ
Ｉ 、Ｈａｅ Ｉｔ及びＨａｅ ＩＩ［と称される３
種の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これら
の酵素はそれぞれ配列（＾Ｔ）ＧＧＣＣ（八Ｔ）ＰｕＧ
ＣＧＣＰｙ及びｃｃｃｃを認識及び切断する。他方で、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ１３は唯一種
の酵素ＥｃｏＲｌを合成し、この酵素は配列Ｇ＾＾ＴＴ
Ｃを認識する。
レアーゼしか有さない傾向にある。エンドヌクレアーゼ
は典型的にはそれらが誘導された細菌に従って命名され
る。即ち、Ｈａｅｍｏ ｈｉｌｕｓｍ種は例えばＨａｅ
Ｉ 、Ｈａｅ Ｉｔ及びＨａｅ ＩＩ［と称される３
種の異なる制限エンドヌクレアーゼを合成する。これら
の酵素はそれぞれ配列（＾Ｔ）ＧＧＣＣ（八Ｔ）ＰｕＧ
ＣＧＣＰｙ及びｃｃｃｃを認識及び切断する。他方で、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＹ１３は唯一種
の酵素ＥｃｏＲｌを合成し、この酵素は配列Ｇ＾＾ＴＴ
Ｃを認識する。
理論に制約されたくはないが、実際のところ制限エンド
ヌクレアーゼはｌｔｇ菌細胞の繁栄において保護の役割
を演じていると考えられいる。制限エンドヌクレアーゼ
は細菌に、そうでなければ細菌を破壊したり細菌に寄生
するであろうウィルス及びプラスミドのような外来ＤＮ
Ａ分子による感染に対する耐性を与える。制限エンドヌ
クレアーゼは、長大な感染ＤＮＡ分子を走査し、それら
を認識配列が存在するごとに切断することにより耐性を
与える。破壊が行われると感染遺伝子の多くは不能とな
り、ＤＮＡをエンドヌクレアーゼによる更なる分解に対
して感受性にする。
ヌクレアーゼはｌｔｇ菌細胞の繁栄において保護の役割
を演じていると考えられいる。制限エンドヌクレアーゼ
は細菌に、そうでなければ細菌を破壊したり細菌に寄生
するであろうウィルス及びプラスミドのような外来ＤＮ
Ａ分子による感染に対する耐性を与える。制限エンドヌ
クレアーゼは、長大な感染ＤＮＡ分子を走査し、それら
を認識配列が存在するごとに切断することにより耐性を
与える。破壊が行われると感染遺伝子の多くは不能とな
り、ＤＮＡをエンドヌクレアーゼによる更なる分解に対
して感受性にする。
細菌保護系の第２の因子は修飾メチラーゼである。この
酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、細菌が
それ自体のＤＮＡを外来の感染ＤＮＡから保護及び区別
できる手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制
限エンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認
識しそれに結合するが、ＤＮＡを切断するのではなくて
、メチル基を付加することにより配列内のヌクレオチド
の一方または他方を化学的に修飾する。メチル化される
と、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって
結合も切断もされなくなる。細菌細胞のＤＮＡはその修
飾メチラーゼの活性によって常に充分に修飾されており
、従って内在制限エンドヌクレアーゼの存在に対しては
完全に非感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識
及び攻撃に感受性を示すのは、未修飾の、従って同定可
能の外来ＤＮＡのみである。
酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であり、細菌が
それ自体のＤＮＡを外来の感染ＤＮＡから保護及び区別
できる手段を提供する。修飾メチラーゼは、対応する制
限エンドヌクレアーゼと同じヌクレオチド認識配列を認
識しそれに結合するが、ＤＮＡを切断するのではなくて
、メチル基を付加することにより配列内のヌクレオチド
の一方または他方を化学的に修飾する。メチル化される
と、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって
結合も切断もされなくなる。細菌細胞のＤＮＡはその修
飾メチラーゼの活性によって常に充分に修飾されており
、従って内在制限エンドヌクレアーゼの存在に対しては
完全に非感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識
及び攻撃に感受性を示すのは、未修飾の、従って同定可
能の外来ＤＮＡのみである。
遺伝子工学技術の出現によって今や遺伝子をクローニン
グし、タンパク質及びタンパク質がコードする酵素を通
常の精製技術によって得られるよりも大量に生産するこ
とが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
ーンを単離する上で鍵となるのは、錯体「ライブラリー
」、即ち「ショットガン」方法によって誘導されたクロ
ーンの集団内にかかる遺伝子が１０−３〜１０−４の頻
度で存在する場合に、それらを同定する単純で且つ信頼
性のある方法を開発することである。この方法は好まし
くは、大多数の不要なりローンを分解し、希少な所望の
クローンを残すような選択性を有するべきである。
グし、タンパク質及びタンパク質がコードする酵素を通
常の精製技術によって得られるよりも大量に生産するこ
とが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクロ
ーンを単離する上で鍵となるのは、錯体「ライブラリー
」、即ち「ショットガン」方法によって誘導されたクロ
ーンの集団内にかかる遺伝子が１０−３〜１０−４の頻
度で存在する場合に、それらを同定する単純で且つ信頼
性のある方法を開発することである。この方法は好まし
くは、大多数の不要なりローンを分解し、希少な所望の
クローンを残すような選択性を有するべきである。
タイプ■制限−修飾系のクローニングは益々多くなされ
ている。第１のクローン化系は制限エンドヌクレアーゼ
クローンを同定または選択する手段としてバクテリオフ
ァージ感染を使用した（ＥｃｏＲＩ［：Ｋｏｓｙｋｈら
、Ｍｏ１ｅａ、ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ １７８，７１７−
７１９（１９８０）、ＨｈａＩＩ ：Ｍａｎｎら、Ｇｅ
ｎｅ ３，９７−１１２（１９７８）並びにＰｓｔ ｌ
：Ｗａｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓ
ｃｉ、 ７８．１５０３−１５０７（１９８１））、細
菌中に制限−修飾系が存在すると細菌はバクテリオファ
ージによる感染に対して耐性を示すことができるので、
クローン化制限−修飾遺伝子を担う細胞は原則として、
ファージに暴露されたライブラリーから生存体として選
択的に単離することができる。しかしながらこの方法は
値に限界があり、特にクローン化制限−′修飾遺伝子は
、選択的生存を与えるのに充分なファージ耐性を常に発
現するわけではないことが判っている。
ている。第１のクローン化系は制限エンドヌクレアーゼ
クローンを同定または選択する手段としてバクテリオフ
ァージ感染を使用した（ＥｃｏＲＩ［：Ｋｏｓｙｋｈら
、Ｍｏ１ｅａ、ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ １７８，７１７−
７１９（１９８０）、ＨｈａＩＩ ：Ｍａｎｎら、Ｇｅ
ｎｅ ３，９７−１１２（１９７８）並びにＰｓｔ ｌ
：Ｗａｌｄｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓ
ｃｉ、 ７８．１５０３−１５０７（１９８１））、細
菌中に制限−修飾系が存在すると細菌はバクテリオファ
ージによる感染に対して耐性を示すことができるので、
クローン化制限−修飾遺伝子を担う細胞は原則として、
ファージに暴露されたライブラリーから生存体として選
択的に単離することができる。しかしながらこの方法は
値に限界があり、特にクローン化制限−′修飾遺伝子は
、選択的生存を与えるのに充分なファージ耐性を常に発
現するわけではないことが判っている。
別のクローニング方法は、当初からプラスミドを担うこ
とを特徴とする系をＥ、ｃｏｌｉクローニングプラスミ
ドへ移入すること含む（ＥｃｏＲＶ ：Ｂｏｕｇｕｅｌ
ｅｒｅｔら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄ、Ｒｅｓ、 １２．
３６５９−３８７６（１９８４）、ＰａｅＲ７：Ｇ ｉ
ｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ 、 Ｐｒｏｃ 、Ｎａ
ｔ ｌ 。
とを特徴とする系をＥ、ｃｏｌｉクローニングプラスミ
ドへ移入すること含む（ＥｃｏＲＶ ：Ｂｏｕｇｕｅｌ
ｅｒｅｔら、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄ、Ｒｅｓ、 １２．
３６５９−３８７６（１９８４）、ＰａｅＲ７：Ｇ ｉ
ｎｇｅｒａｓ及びＢｒｏｏｋｓ 、 Ｐｒｏｃ 、Ｎａ
ｔ ｌ 。
＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾８０，４０２−４０６（１９
８３）、Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ、Ｇｅｎｅ １
９，３５５−３５９（１９８２）並びにＰｖｕＵ：Ｂｌ
ｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １６
４，５０１−５０９（１９８５））。
８３）、Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ及びＲｏｙ、Ｇｅｎｅ １
９，３５５−３５９（１９８２）並びにＰｖｕＵ：Ｂｌ
ｕｍｅｎｔｈａｌら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １６
４，５０１−５０９（１９８５））。
第３の方法は徐々に多くの系をクローニングするために
使用されるもので、活性メチラーゼ遺伝子を選択するこ
とを含む〈例えばＢｓｕＲＩ ：Ｋ１５ｓら。
使用されるもので、活性メチラーゼ遺伝子を選択するこ
とを含む〈例えばＢｓｕＲＩ ：Ｋ１５ｓら。
Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄ、Ｒｅｓ、 １３．６４０３−６４
２１（１９８５）及びＴａｑ（：５ｌａｔｋｏら、Ｎｕ
ｃｌ、＾ｃｉｄ、Ｒｅｓ、 １５．９７８１−９７９
６（１９８７）Ｉｔ照）。制限及び修飾遺伝子は密接に
関連する傾向にあるので、両遺伝子を含むクローンは、
ただ−方の遺伝子に対して選択することにより単離され
得ることが多い。メチル化活性に対する選択は常に完全
な制限−修飾系を与えるとは限らないが、その代わりに
メチラーゼ遺伝子のみを与えることがある（ＢｓｐＲＩ
：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら、Ｇｅｎｅ １０，２１９−
２２５（１９８０）、Ｂｃｎ ｌ ：Ｊａｎｕｌａｉｔ
ｉｓら、Ｇｅｎｅ ２０，１９７−２０４＜１９８２）
、ＢｓｕＲＩ：Ｋ１５ｓ及びＢａ１ｄａｕｆ、Ｇｅｎｅ
２１，１１１−１１９（１９８３）並びにＭｓｐ ｌ
Ｊａｌｄｅｒら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
２１（１９８５）及びＴａｑ（：５ｌａｔｋｏら、Ｎｕ
ｃｌ、＾ｃｉｄ、Ｒｅｓ、 １５．９７８１−９７９
６（１９８７）Ｉｔ照）。制限及び修飾遺伝子は密接に
関連する傾向にあるので、両遺伝子を含むクローンは、
ただ−方の遺伝子に対して選択することにより単離され
得ることが多い。メチル化活性に対する選択は常に完全
な制限−修飾系を与えるとは限らないが、その代わりに
メチラーゼ遺伝子のみを与えることがある（ＢｓｐＲＩ
：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら、Ｇｅｎｅ １０，２１９−
２２５（１９８０）、Ｂｃｎ ｌ ：Ｊａｎｕｌａｉｔ
ｉｓら、Ｇｅｎｅ ２０，１９７−２０４＜１９８２）
、ＢｓｕＲＩ：Ｋ１５ｓ及びＢａ１ｄａｕｆ、Ｇｅｎｅ
２１，１１１−１１９（１９８３）並びにＭｓｐ ｌ
Ｊａｌｄｅｒら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
２５８．１２３５−１２４１（１９８３））。制限−修
飾系のクローニングに関する全般的考察は例えばＬｕｎ
ｎｅｎら、Ｇｅｎｅ７４．２５−３２（１９８８）及び
Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ、Ｇ、、Ｇｅｎｅ ７４，２８１−２
８９（１９８８）を参照されたい。
飾系のクローニングに関する全般的考察は例えばＬｕｎ
ｎｅｎら、Ｇｅｎｅ７４．２５−３２（１９８８）及び
Ｗｉｌｓｏｎ、Ｇ、Ｇ、、Ｇｅｎｅ ７４，２８１−２
８９（１９８８）を参照されたい。
制限−修飾遺伝子をクローニングする上での潜在的な障
害は、エンドヌクレアーゼ遺伝子をまだ修飾によって保
護されていない宿主に導入することにある。もしメチラ
ーゼ遺伝子とエンドヌクレーゼ遺伝子とを単一のクロー
ンとして一緒に導入するならば、エンドヌクレアーゼが
宿主ＤＮＡを切断する機会を有する前にメチラーゼは宿
主ＤＮＡを保護するように修飾せねばならない、従って
このような場合には、まずメチラーゼ遺伝子を、次いで
エンドヌクレアーゼ遺伝子を順次クローニングすること
のみが可能であろう。
害は、エンドヌクレアーゼ遺伝子をまだ修飾によって保
護されていない宿主に導入することにある。もしメチラ
ーゼ遺伝子とエンドヌクレーゼ遺伝子とを単一のクロー
ンとして一緒に導入するならば、エンドヌクレアーゼが
宿主ＤＮＡを切断する機会を有する前にメチラーゼは宿
主ＤＮＡを保護するように修飾せねばならない、従って
このような場合には、まずメチラーゼ遺伝子を、次いで
エンドヌクレアーゼ遺伝子を順次クローニングすること
のみが可能であろう。
Ｅ、ｃｏｌｉにおいて系をクローニングする別の障害は
、別種のメチラーゼ遺伝子をクローニングする方法にお
いて判明した。（クローニングに通常使用されるものを
含む）多くのＥ、ｃｏｌ ｉ株は、メチル化シトシンを
含むＤＮへの導入に耐性を示す系を有する（Ｒａｌｅｉ
ｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、＾ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、。
、別種のメチラーゼ遺伝子をクローニングする方法にお
いて判明した。（クローニングに通常使用されるものを
含む）多くのＥ、ｃｏｌ ｉ株は、メチル化シトシンを
含むＤＮへの導入に耐性を示す系を有する（Ｒａｌｅｉ
ｇｈ及びＷｉｌｓｏｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、＾ｃａ
ｄ、ｓｃｉ、。
ＵＳ八へ３．９０７０−９０７４（１９８６）） 、単
独であろうと対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒
であろうと、かかるＥ、ｃｏｌｉ株内にシトシン特異的
メチラーゼ遺伝子をクローニングすることは極めて難し
い。従ってかかる遺伝子をクローニングするためには、
かかる系が欠失しているＥ、ｃｏｌｉ突然変異株を使用
することが必要である。
独であろうと対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒
であろうと、かかるＥ、ｃｏｌｉ株内にシトシン特異的
メチラーゼ遺伝子をクローニングすることは極めて難し
い。従ってかかる遺伝子をクローニングするためには、
かかる系が欠失しているＥ、ｃｏｌｉ突然変異株を使用
することが必要である。
精製した制限エンドヌクレアーゼ及び、これ程ではない
が修飾メチラーゼは、実験室においてＤＮＡを特性化及
び再構成するための有効なツールであるので、組換えＤ
ＮＡ技術によってかかる酵素を大量に合成する細菌株を
得て市販しようとする発意が生まれる。このような株は
、精製作業を単純化し、更に市販に有効な量で生産する
手段を提供することから有効であろう。
が修飾メチラーゼは、実験室においてＤＮＡを特性化及
び再構成するための有効なツールであるので、組換えＤ
ＮＡ技術によってかかる酵素を大量に合成する細菌株を
得て市販しようとする発意が生まれる。このような株は
、精製作業を単純化し、更に市販に有効な量で生産する
手段を提供することから有効であろう。
え凱立盟１
本発明は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｎａｌｖａｃａｅ
ｒｕｍ（＾ＴＣＣ９９２４）から誘導されるＸｍａ ｌ
制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ（Ｅｎｄｏ
ｗ、Ｓ、＾、及びＲｏｂｅｒｔｓ 。
ｒｕｍ（＾ＴＣＣ９９２４）から誘導されるＸｍａ ｌ
制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼ（Ｅｎｄｏ
ｗ、Ｓ、＾、及びＲｏｂｅｒｔｓ 。
Ｒ，Ｊ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 １１２，５２１−
５２９（１９７７））に対する遺伝子を含むクローンと
、かかる酵素の生産方法とを提供する。特に本発明の方
法は、制限エンドヌクレアーゼＸｌｌ、Ｉｌｌち［）Ｎ
＾配列５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’を認識し、Ｃ１とＣ３
との間を切断して５′末端に４ヌクレオチドを突出した
まま残す酵素を発現するクローンに関する〈上記Ｅｎｄ
ｏｕ＋らの文献を参照のこと。
５２９（１９７７））に対する遺伝子を含むクローンと
、かかる酵素の生産方法とを提供する。特に本発明の方
法は、制限エンドヌクレアーゼＸｌｌ、Ｉｌｌち［）Ｎ
＾配列５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’を認識し、Ｃ１とＣ３
との間を切断して５′末端に４ヌクレオチドを突出した
まま残す酵素を発現するクローンに関する〈上記Ｅｎｄ
ｏｕ＋らの文献を参照のこと。
尚この文献の開示内容は参照により本明細書に包含され
るものとする）。本発明に従って生産されるＸｎ＋ａ
ｌ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、通常
の方法で生産されたＸｍａ ｌ産物中に通常見られる夾
雑物は含有しない。
るものとする）。本発明に従って生産されるＸｎ＋ａ
ｌ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、通常
の方法で生産されたＸｍａ ｌ産物中に通常見られる夾
雑物は含有しない。
Ｘｍａ ｌ酵素に対する遺伝子をクローニングする好ま
しい方法は、Ｘ、 ｍａｌｖａｃａｅｒｕｍ由来のＤＮ
Ａを含むライブラリーを形成し、Ｘｎａ Ｉ修飾メチラ
ーゼをコードするＤＮＡを含むクローンを単離し、この
なかからスクリーニングして更にＸｍａ ｌ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含むものを同定することからなる
。
しい方法は、Ｘ、 ｍａｌｖａｃａｅｒｕｍ由来のＤＮ
Ａを含むライブラリーを形成し、Ｘｎａ Ｉ修飾メチラ
ーゼをコードするＤＮＡを含むクローンを単離し、この
なかからスクリーニングして更にＸｍａ ｌ制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子を含むものを同定することからなる
。
免咀立且Ａ
本発明は、Ｘｍａ Ｉ制限及び修飾遺伝子のクローンと
、かかるクローンから生産される制限エンドヌクレアー
ゼＸｌｌ１ａＩとに関する。Ｘｍａ ｌ ’ｉｌｌ伝子
は、Ｘｍａｌ（ＩＩ飾メチラーゼ遺伝子を含有及び発現
するとして選択された所定のクローンが、更にＸｍａ
Ｉ制限遺伝子も含有することを利用する方法によってク
ローン化されることが好ましい。かかるクローンのＤＮ
Ａは、Ｘｍａ ｌ制限エンドヌクレアーゼ及びＳｍａ
ｌ制限エンドヌクレアーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ消化
に耐性を示す（Ｓｍａ ｌ制限エンドヌクレアーゼはＸ
ｍａ ｌのアイソシゾマーである）。この消化に対する
耐性により、Ｘｍａｌメチラーゼ及び制限エンドヌクレ
アーゼをコードするクローンを選択的に単離する手段が
可能となる。
、かかるクローンから生産される制限エンドヌクレアー
ゼＸｌｌ１ａＩとに関する。Ｘｍａ ｌ ’ｉｌｌ伝子
は、Ｘｍａｌ（ＩＩ飾メチラーゼ遺伝子を含有及び発現
するとして選択された所定のクローンが、更にＸｍａ
Ｉ制限遺伝子も含有することを利用する方法によってク
ローン化されることが好ましい。かかるクローンのＤＮ
Ａは、Ｘｍａ ｌ制限エンドヌクレアーゼ及びＳｍａ
ｌ制限エンドヌクレアーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ消化
に耐性を示す（Ｓｍａ ｌ制限エンドヌクレアーゼはＸ
ｍａ ｌのアイソシゾマーである）。この消化に対する
耐性により、Ｘｍａｌメチラーゼ及び制限エンドヌクレ
アーゼをコードするクローンを選択的に単離する手段が
可能となる。
ｘＴＩｌａ■制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子を好まし
くクローニングし発現する本明細書に記載の方法を第１
図を用いて説明する。この方法は以下のステップを含む
。
くクローニングし発現する本明細書に記載の方法を第１
図を用いて説明する。この方法は以下のステップを含む
。
（１） Ｘ、 ｍａｌｖａｃａｅｒｕｎ（＾ＴＣＣ９
９２４）の成長及び溶菌のステップであって、Ｘ、 ｍ
ａｌｖａｃａｅｒｕｍをＥｎｄｏｗらにより記載の方法
に従って増殖させて溶解する。
９２４）の成長及び溶菌のステップであって、Ｘ、 ｍ
ａｌｖａｃａｅｒｕｍをＥｎｄｏｗらにより記載の方法
に従って増殖させて溶解する。
（２） Ｘ、 ｍａｌｖａｃａｅｒｕｍのＤＮＡを、
フェノール及びクロロホルム抽出し、透析し、イソプロ
パツールにより沈澱するような標準的な方法により精製
する。
フェノール及びクロロホルム抽出し、透析し、イソプロ
パツールにより沈澱するような標準的な方法により精製
する。
（３） ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ旧ｎｄＩ［
［、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲｌのいずれかを用いて一部
消化する。
［、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲｌのいずれかを用いて一部
消化する。
（４）消化したＤＮＡを、Ｂａｗｌ Ｉ 、Ｈｉｎｄｌ
ｌｌまたはＥｃｏＲ１部位を含むｐＢＲ３２２誘導体の
ようなりローニングベクターに連結する。Ｘ〜ａｔクロ
ーンはクローニングベクターとしてｐＫＬ１９−２を使
用して得られた。
ｌｌまたはＥｃｏＲ１部位を含むｐＢＲ３２２誘導体の
ようなりローニングベクターに連結する。Ｘ〜ａｔクロ
ーンはクローニングベクターとしてｐＫＬ１９−２を使
用して得られた。
ｐＫＬ１９−２は、ｓｂｐリン酸化リンカ−ｄ（ｐｃｃ
ｃｃＧＧＧＧ）を使用し、ヌクレオチド１５６３及び１
５８２にあるＤｒａ Ｉ部位間のＤＮＡを置き換える、
第２のＸｍａ Ｉ ／Ｓｍａ １部位が挿入されたｐＵ
ｃ１９である（ｐＫＬ１９−２の試料は＾ＴＣＣ番号６
７９９７で＾ＴＣＣに寄託されている）、得られた混合
体を使用し、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＲＲＩ（＾ＴＣＣ３１３４
３）のような適当な宿主を形質転換する。
ｃｃＧＧＧＧ）を使用し、ヌクレオチド１５６３及び１
５８２にあるＤｒａ Ｉ部位間のＤＮＡを置き換える、
第２のＸｍａ Ｉ ／Ｓｍａ １部位が挿入されたｐＵ
ｃ１９である（ｐＫＬ１９−２の試料は＾ＴＣＣ番号６
７９９７で＾ＴＣＣに寄託されている）、得られた混合
体を使用し、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＲＲＩ（＾ＴＣＣ３１３４
３）のような適当な宿主を形質転換する。
（５） ＤＮＡ／、ｉｌｌ胞混合体を、アンピリジン
のごとき形質転換細胞に対して選択的な抗生物質培地上
に移植する（ｐｌａｔｅｄ）。インキュベーション後、
形質転換した細胞コロニーを合わせて単一の培養に回収
して初代細胞ライブラリーを形成する。
のごとき形質転換細胞に対して選択的な抗生物質培地上
に移植する（ｐｌａｔｅｄ）。インキュベーション後、
形質転換した細胞コロニーを合わせて単一の培養に回収
して初代細胞ライブラリーを形成する。
〈６〉 組換えプラスミド全部を初代細胞ライブラリ
ーから精製し、初代プラスミドライブラリーを形成する
。
ーから精製し、初代プラスミドライブラリーを形成する
。
（７） 次いでプラスミドライブラリーを、Ｓｅｒｒ
ａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ細胞から調製されたＳｍ
ａ ｌ制限エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏｗら〉を用い
、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換ク
ロマトグラフィーのごとき標準的なタンパク質精製方法
によって完全にｉｎ ｖｉｔｒｏ消化する。Ｘｍａｌ−
メチル化ＤＮＡは、Ｘｍａ Ｉ及びＳｍａ ｌ制限エン
ドヌクレアーゼのいずれによる消化にも耐性を示す、消
化は、メチラーゼを含有しない未修飾のクローンの選択
的破壊を惹起し、この結果Ｘｍａ Ｉメチラーゼを担う
クローンの相対頻度が増大することになる。Ｓｎａ ｌ
制限エンドヌクレアーゼはＸｍａ Ｉと同じ配列を認識
するが、配列５’−ＣＣＣＧにＧ−３’のＧ３及びＧ３
間を切断してプラント末端を残す。切断されてブラント
末端を有する分子は形質転換の際に環状をとりにくくな
り、従って初代ライブラリーのＳ＋＊ａ ■消化は恐ら
（、Ｘｍａｌ消化よりも修飾分子に対してより選択的に
行われる。
ａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ細胞から調製されたＳｍ
ａ ｌ制限エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｄｏｗら〉を用い
、アフィニティークロマトグラフィー及びイオン交換ク
ロマトグラフィーのごとき標準的なタンパク質精製方法
によって完全にｉｎ ｖｉｔｒｏ消化する。Ｘｍａｌ−
メチル化ＤＮＡは、Ｘｍａ Ｉ及びＳｍａ ｌ制限エン
ドヌクレアーゼのいずれによる消化にも耐性を示す、消
化は、メチラーゼを含有しない未修飾のクローンの選択
的破壊を惹起し、この結果Ｘｍａ Ｉメチラーゼを担う
クローンの相対頻度が増大することになる。Ｓｎａ ｌ
制限エンドヌクレアーゼはＸｍａ Ｉと同じ配列を認識
するが、配列５’−ＣＣＣＧにＧ−３’のＧ３及びＧ３
間を切断してプラント末端を残す。切断されてブラント
末端を有する分子は形質転換の際に環状をとりにくくな
り、従って初代ライブラリーのＳ＋＊ａ ■消化は恐ら
（、Ｘｍａｌ消化よりも修飾分子に対してより選択的に
行われる。
（８〉 消化されたプラスミドライブラリーＤＮＡを
Ｅ。
Ｅ。
ｃｏｌｉ株ＲＲＩのごとき適当な宿主内に形質転換し戻
し、抗生物質プレート上に移植すことにより形質転換し
たコロニーを再度得る。コロニーを採取し、それらのＤ
ＮＡのＸｍａ Ｉ修飾遺伝子の存在について以下の方法
で解析する。即ち、クローンが担うプラスミドＤＮＡを
精製し、Ｘｍａ ｌ制限エンドヌクレアーゼを用いてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏインキュベートし、Ｘｍａ Ｉによる消
化に対して耐性を示すか決定する。更にクローンの全細
胞ＤＮＡ（染色体及びプラスミド〉を精製し、Ｘ＋ａａ
ｌ制限エンドヌクレアーゼを用いてインキュベートす
る。ＸｍａＩメチラーゼ遺伝子を担うクローンのＤＮＡ
は修飾されているべきであり、プラスミドＤＮＡ及び全
ＤＨへのいずれも実質的にまたは完全に消化に対して耐
性を示すと判明するべきである。
し、抗生物質プレート上に移植すことにより形質転換し
たコロニーを再度得る。コロニーを採取し、それらのＤ
ＮＡのＸｍａ Ｉ修飾遺伝子の存在について以下の方法
で解析する。即ち、クローンが担うプラスミドＤＮＡを
精製し、Ｘｍａ ｌ制限エンドヌクレアーゼを用いてｉ
ｎ ｖｉｔｒｏインキュベートし、Ｘｍａ Ｉによる消
化に対して耐性を示すか決定する。更にクローンの全細
胞ＤＮＡ（染色体及びプラスミド〉を精製し、Ｘ＋ａａ
ｌ制限エンドヌクレアーゼを用いてインキュベートす
る。ＸｍａＩメチラーゼ遺伝子を担うクローンのＤＮＡ
は修飾されているべきであり、プラスミドＤＮＡ及び全
ＤＨへのいずれも実質的にまたは完全に消化に対して耐
性を示すと判明するべきである。
（９） Ｘｍａ ｒ制限エンドヌクレアーゼを担うク
ローンを、ステップ８でＸ＋＋ａ Ｉメチラーゼ遺伝子
を担うと同定されたクローンの粗抽出物を調製し、この
抽出物のＸｍａ ｌ制限エンドヌクレアーゼ活性につい
て解析することにより同定する。
ローンを、ステップ８でＸ＋＋ａ Ｉメチラーゼ遺伝子
を担うと同定されたクローンの粗抽出物を調製し、この
抽出物のＸｍａ ｌ制限エンドヌクレアーゼ活性につい
て解析することにより同定する。
＜１０） Ｘｍａ Ｉ制限エンドヌクレアーゼは、Ｘ
ｍａ ｌ制限及び修飾遺伝子を担うクローンから、アン
ピシリンを含有する富養培地において発酵器内で増殖さ
せることにより生産することができる０次いで細胞を遠
心分離により回収し、音波処理によって破壊し、Ｘｍａ
ｌ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を
生産する。
ｍａ ｌ制限及び修飾遺伝子を担うクローンから、アン
ピシリンを含有する富養培地において発酵器内で増殖さ
せることにより生産することができる０次いで細胞を遠
心分離により回収し、音波処理によって破壊し、Ｘｍａ
ｌ制限エンドヌクレアーゼ活性を含む粗細胞抽出物を
生産する。
（１１） Ｘｍａ Ｉ制限エンドヌクレアーゼを含む
粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィー及
びイオン交換クロマトグラフィーのごとき標準的なタン
パク質精製方法により精製する。
粗細胞抽出物を、アフィニティークロマトグラフィー及
びイオン交換クロマトグラフィーのごとき標準的なタン
パク質精製方法により精製する。
上記概要を示した各ステップは本発明を実施する上での
好ましい態様を表しているが、当業者には上記方法は公
知の方法に従って変更し得ることは明らかであろう。
好ましい態様を表しているが、当業者には上記方法は公
知の方法に従って変更し得ることは明らかであろう。
以下に実用化に好ましい実施例を与えて本発明の実施態
様を説明する。この実施例は説明のためのものであり、
本発明は、付随の特許請求の範囲に記載の外にはこの実
施例に制限されないことを理解されたい。
様を説明する。この実施例は説明のためのものであり、
本発明は、付随の特許請求の範囲に記載の外にはこの実
施例に制限されないことを理解されたい。
１
（１）ＤＮＡ精製： Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａ
ｌｖａｃａｅｒｕｍ（＾ＴＣＣ９９２４）のＤＮＡを調
製するために、凍結細胞５ｇを２５％スクロース、５０
ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０２０−中に氷上で１時間
かけて溶かし、０．２５Ｍ ＥＤ丁＾、ｐＨ８１０ｍ１
を加え、次いでリゾチームＩＯＢ／ｍＺを含有する０、
２５Ｍ Ｔｒｉｓ。
ｌｖａｃａｅｒｕｍ（＾ＴＣＣ９９２４）のＤＮＡを調
製するために、凍結細胞５ｇを２５％スクロース、５０
ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０２０−中に氷上で１時間
かけて溶かし、０．２５Ｍ ＥＤ丁＾、ｐＨ８１０ｍ１
を加え、次いでリゾチームＩＯＢ／ｍＺを含有する０、
２５Ｍ Ｔｒｉｓ。
ｐＨ８，０６−を加えた。この懸濁液を氷上で２時間イ
ンキュベートした。細胞を溶解するために、溶解用ミッ
クス（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ、６２ｍＭＥＤＴ＾、ｐＨ５，０）２４ｓＮと１０
％ＳＯＳ ５ｍｌとを加えた。試料を、まず（０，５Ｍ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０を用いて予め平衡させておいた
）フェノール７０１１１１を用いて、次いでクロロホル
ム６０−を用いて抽出した。エマルジョンを１０ｋ ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離し、粘性のある上層を回収し、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１＋ＨＤＥＴ＾、ｐＨ８，０に対
して２４時間透析した＜＊清液は４リツトルずつ４回交
換した）、次いで透析した溶液をＲＮａｓｅを用いて３
７℃で１時間消化して最終濃度１００Ｂ／ｍｆとした。
ンキュベートした。細胞を溶解するために、溶解用ミッ
クス（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ、６２ｍＭＥＤＴ＾、ｐＨ５，０）２４ｓＮと１０
％ＳＯＳ ５ｍｌとを加えた。試料を、まず（０，５Ｍ
Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，０を用いて予め平衡させておいた
）フェノール７０１１１１を用いて、次いでクロロホル
ム６０−を用いて抽出した。エマルジョンを１０ｋ ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離し、粘性のある上層を回収し、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１＋ＨＤＥＴ＾、ｐＨ８，０に対
して２４時間透析した＜＊清液は４リツトルずつ４回交
換した）、次いで透析した溶液をＲＮａｓｅを用いて３
７℃で１時間消化して最終濃度１００Ｂ／ｍｆとした。
次いで、最終濃度０．４ＨとなるまでＮａＣ１を加える
ことによりＤＮＡを得て、０．５５容積のイソプロピル
アルコールで上層を形成し、相を合わせて混合すること
によりＤＮＡをガラス棒上に巻き付けた０次いでＤＮＡ
を１Ｏｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐＨ８，
０中に再度懸濁し、４℃で保存した。
ことによりＤＮＡを得て、０．５５容積のイソプロピル
アルコールで上層を形成し、相を合わせて混合すること
によりＤＮＡをガラス棒上に巻き付けた０次いでＤＮＡ
を１Ｏｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐＨ８，
０中に再度懸濁し、４℃で保存した。
（２）ＤＮＡ消化： 精製したＤＮＡの一部をＨｉｎｄ
Ｉ［［を用いて切断した。ＤＮＡを、５０ｎ＋Ｍ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ７，５，１００ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ Ｍ
ｙＣｆ２，１０ｓＮ ２−メルカプトエタノール中で濃
度１００ｍｇ／ｍ１にまで希釈し、ＤＮＡｌｌ１１Ｆ当
たりＨｉｎｃｌ［［４，０単位を第１の試験管に加え、
次いで第２の試験管に移して旧ｎｄｆ１２．ｏ単位／μ
ｇを得るというように、１つ前の酵素の量の半分を受容
することを順次繰り返した。 ＩＩＮ八を３７℃で１時
消化し、次いで１０分間かけて７２℃にまで加熱するこ
とにより消化を停止した。適度であるが不完全な消化を
示した試験管をクローニングのための一部消化断片源と
して選択した（これらは、０．５単位／同、０．２５単
位／１１ｇ、０．１単位／同、０．０５単位／同及び０
．０ｚ単位／μｇの試験管であった。５つの溶液を合わ
せて混合し、以下のように使用した〉。
Ｉ［［を用いて切断した。ＤＮＡを、５０ｎ＋Ｍ Ｔｒ
ｉｓ ｐＨ７，５，１００ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ Ｍ
ｙＣｆ２，１０ｓＮ ２−メルカプトエタノール中で濃
度１００ｍｇ／ｍ１にまで希釈し、ＤＮＡｌｌ１１Ｆ当
たりＨｉｎｃｌ［［４，０単位を第１の試験管に加え、
次いで第２の試験管に移して旧ｎｄｆ１２．ｏ単位／μ
ｇを得るというように、１つ前の酵素の量の半分を受容
することを順次繰り返した。 ＩＩＮ八を３７℃で１時
消化し、次いで１０分間かけて７２℃にまで加熱するこ
とにより消化を停止した。適度であるが不完全な消化を
示した試験管をクローニングのための一部消化断片源と
して選択した（これらは、０．５単位／同、０．２５単
位／１１ｇ、０．１単位／同、０．０５単位／同及び０
．０ｚ単位／μｇの試験管であった。５つの溶液を合わ
せて混合し、以下のように使用した〉。
（３）連結： 消化したＤＮＡをｐＫＬ１９−２に以下
のように連結した。即ち、ＨｉｎｄＩ［で消化したＸ、
ｍａｌｖａｃａｅｒｔ＋ｍＤＮＡ（６０，Ｎ）６．０
．ｇを、１Ｉｉｎｄｌｌ［で切断し脱リン酸化したｐＫ
Ｌ１９−２（７，５，Ｚ）３．０．ｇと混合した。ＩＯ
Ｘ連結ミックス（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５，
１００ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１００ｍＭＤＴＴ、５ｍＭ＾
ＴＰ）２０．ｆを加え、更に滅菌蒸留水１１２．５１１
１を加えて最終容積ｚｏｏｔ＋ｚとした。Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ７．５μｌを加え、この混合物を１７°Ｃで４
時間インキュベートし、クロロホルム１０μｅを加える
ことにより滅菌した。連結ＤＮＡ約１２５．ｌを使用し
てＥ、ｃｏｌｉ株ＲＲＩを以下のように形質転換した。
のように連結した。即ち、ＨｉｎｄＩ［で消化したＸ、
ｍａｌｖａｃａｅｒｔ＋ｍＤＮＡ（６０，Ｎ）６．０
．ｇを、１Ｉｉｎｄｌｌ［で切断し脱リン酸化したｐＫ
Ｌ１９−２（７，５，Ｚ）３．０．ｇと混合した。ＩＯ
Ｘ連結ミックス（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５，
１００ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、１００ｍＭＤＴＴ、５ｍＭ＾
ＴＰ）２０．ｆを加え、更に滅菌蒸留水１１２．５１１
１を加えて最終容積ｚｏｏｔ＋ｚとした。Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ７．５μｌを加え、この混合物を１７°Ｃで４
時間インキュベートし、クロロホルム１０μｅを加える
ことにより滅菌した。連結ＤＮＡ約１２５．ｌを使用し
てＥ、ｃｏｌｉ株ＲＲＩを以下のように形質転換した。
即ち、ＤＮＡをＳＳＣ／Ｃａ（ｔ’ｚ（５０ｍＭ Ｎａ
Ｃ１，５ｍＭ Ｈａ、、クエン酸塩、６７ｍＭＣａＣ１
２）１．００と氷上で混合し、氷温のコンビテン） Ｅ
、ｃｏｌｉ ＲＲＩ（ｈｓｄ Ｒ−Ｍ＼＾ＴＣＣ寄託番
号３１３４３）細胞２．０−を加えた。４２℃で５分間
インキュベートした後、ルリアブロス（ミックス）８−
を加えることにより希釈し、３７℃で４時間インキュベ
ートした。
Ｃ１，５ｍＭ Ｈａ、、クエン酸塩、６７ｍＭＣａＣ１
２）１．００と氷上で混合し、氷温のコンビテン） Ｅ
、ｃｏｌｉ ＲＲＩ（ｈｓｄ Ｒ−Ｍ＼＾ＴＣＣ寄託番
号３１３４３）細胞２．０−を加えた。４２℃で５分間
インキュベートした後、ルリアブロス（ミックス）８−
を加えることにより希釈し、３７℃で４時間インキュベ
ートした。
（４ン 初代細胞ライブラリー二形質転換細胞培液を
簡単に遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞をミックス１
．Ｏｎ＋Ｎ中に再度懸濁した１画分２００．１をアンピ
シリン１００μｇ７ｍｌを含むルリア寒天（Ｌ寒天）プ
レート上に移植した。３７℃で一晩インキユベートした
後、各プレートにｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５，１
０ｎＭ ＨｇＣｌ２２．５−を注ぎ、形質転換したコロ
ニーを合わせて掻き取り、プールして初代細胞ライブラ
リーを形成した。
簡単に遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞をミックス１
．Ｏｎ＋Ｎ中に再度懸濁した１画分２００．１をアンピ
シリン１００μｇ７ｍｌを含むルリア寒天（Ｌ寒天）プ
レート上に移植した。３７℃で一晩インキユベートした
後、各プレートにｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５，１
０ｎＭ ＨｇＣｌ２２．５−を注ぎ、形質転換したコロ
ニーを合わせて掻き取り、プールして初代細胞ライブラ
リーを形成した。
（５）初代プラスミドライブラリー二 初代プラスミド
ライブラリーを以下のように調製した。即ち、初代細胞
ライブラリー２．５ｍｌをアンピシリン１００μｇ／ｒ
ｓ１を含有するしブロス５００ｍ１中に接種し、この培
養液を３７℃で一晩振盪し、次いで４０００ｒｐｍで５
分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、細胞ベレットを室
温の２５％スクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，
０１０−中に再度懸濁させ、０．２５８ ＥＤＴ＾、ｐ
Ｈ８，０５−を加え、次いでリゾチームＩＯＢ／ｍ１を
含有する０、２５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８，０３ｍｌを加え
た。この溶液を氷上に１時間放置し、次いで溶解用ミッ
クスく１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，５０論Ｍ Ｔｒｉ
ｓ、ｐＨ８，０，６７信Ｍ ＥＤＴ＾）１２−を勢いよ
くピペットで入れ、細胞懸濁液を静かに渦形成して溶解
した。溶解後、混合物を５０−プラスチック遠心分離管
に移し、１７０００ｒｐｍ、４℃で４５分間回転させた
。上澄みをピペットを用いて取り除いた。固体Ｃ５Ｃｊ
！ ２０．０ｙｎを測って５０−ねじ蓋付きプラスチッ
ク試験管内に入れ、上澄み２２．０ＩＦＩ１１を試験管
内にピペットで移し、混合した。この混合物にエチジウ
ムプロミド溶液＜１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，ｏ、１
ｍＭ ＥＤＴ＾。
ライブラリーを以下のように調製した。即ち、初代細胞
ライブラリー２．５ｍｌをアンピシリン１００μｇ／ｒ
ｓ１を含有するしブロス５００ｍ１中に接種し、この培
養液を３７℃で一晩振盪し、次いで４０００ｒｐｍで５
分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、細胞ベレットを室
温の２５％スクロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８，
０１０−中に再度懸濁させ、０．２５８ ＥＤＴ＾、ｐ
Ｈ８，０５−を加え、次いでリゾチームＩＯＢ／ｍ１を
含有する０、２５ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８，０３ｍｌを加え
た。この溶液を氷上に１時間放置し、次いで溶解用ミッ
クスく１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，５０論Ｍ Ｔｒｉ
ｓ、ｐＨ８，０，６７信Ｍ ＥＤＴ＾）１２−を勢いよ
くピペットで入れ、細胞懸濁液を静かに渦形成して溶解
した。溶解後、混合物を５０−プラスチック遠心分離管
に移し、１７０００ｒｐｍ、４℃で４５分間回転させた
。上澄みをピペットを用いて取り除いた。固体Ｃ５Ｃｊ
！ ２０．０ｙｎを測って５０−ねじ蓋付きプラスチッ
ク試験管内に入れ、上澄み２２．０ＩＦＩ１１を試験管
内にピペットで移し、混合した。この混合物にエチジウ
ムプロミド溶液＜１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８，ｏ、１
ｍＭ ＥＤＴ＾。
１１００ｎ ＮａＣｊ！中にエチジウムプロミド５ｎ＋
ｇ／−を溶解したもの）１．０ｍｊ！を加えた。この溶
液を２つの５７８インチ×３インチのポリ゛アロマー遠
心分離管に移し、密封した。これらの試験管をＢｅｃｋ
ＩＩａｎ Ｔｉ７０ローターにおいて４４０００ｒｐｍ
、 １７℃で４２時間回転させた。プラスミドを回収
するために、試験管に紫外線を照射し、メスで先端部を
穿孔し、２つのＤＮＡ蛍光バンドの下側を注射器で回収
した。各試験管から得た下側のバンドをねし蓋付きガラ
ス管内に一緒に入れ、氷温の水飽和Ｎ−ブタノールを同
量用いて４回抽出することによりエチジウムプロミドを
除去した。
ｇ／−を溶解したもの）１．０ｍｊ！を加えた。この溶
液を２つの５７８インチ×３インチのポリ゛アロマー遠
心分離管に移し、密封した。これらの試験管をＢｅｃｋ
ＩＩａｎ Ｔｉ７０ローターにおいて４４０００ｒｐｍ
、 １７℃で４２時間回転させた。プラスミドを回収
するために、試験管に紫外線を照射し、メスで先端部を
穿孔し、２つのＤＮＡ蛍光バンドの下側を注射器で回収
した。各試験管から得た下側のバンドをねし蓋付きガラ
ス管内に一緒に入れ、氷温の水飽和Ｎ−ブタノールを同
量用いて４回抽出することによりエチジウムプロミドを
除去した。
抽出した溶液を透析管に移し、ＤＮＡ［漬液（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５，１ｍＭ ＥＤＴ＾）を４回替え
て２４時間透析した。透析したＤＮＡ溶液を予め重量を
測定しである５０ｍ１滅菌遠心分離管に移し、その容積
を測定した。 ５８ ＮａＣ１を最終濃度０．４Ｍにな
るまで加え、次いで２容積のイソプロパツールを加えて
混合した。
Ｔｒｉｓ ｐＨ７，５，１ｍＭ ＥＤＴ＾）を４回替え
て２４時間透析した。透析したＤＮＡ溶液を予め重量を
測定しである５０ｍ１滅菌遠心分離管に移し、その容積
を測定した。 ５８ ＮａＣ１を最終濃度０．４Ｍにな
るまで加え、次いで２容積のイソプロパツールを加えて
混合した。
この溶液を一２０℃で一晩保存し、ＤＮＡを沈澱させた
。沈澱後、この溶液を１５００Ｏｒｐｍ、 ０℃で１５
分間回転させ、上澄みを廃棄した。試験管を試験管台に
放置して１５分間空気乾燥し、次いでＤＮＡベレットを
ＤＮＡ１ｌ ｆｉ液５００μｌ中に溶解し、−２０℃で
保存した。このように調製したプラスミドライブラリー
のＤＮＡ濃度は１００〜２００μｇ７ｍｌであることが
判った。
。沈澱後、この溶液を１５００Ｏｒｐｍ、 ０℃で１５
分間回転させ、上澄みを廃棄した。試験管を試験管台に
放置して１５分間空気乾燥し、次いでＤＮＡベレットを
ＤＮＡ１ｌ ｆｉ液５００μｌ中に溶解し、−２０℃で
保存した。このように調製したプラスミドライブラリー
のＤＮＡ濃度は１００〜２００μｇ７ｍｌであることが
判った。
（６）プラスミドブールの消化： 初代プラスミドプー
ルを消化し、Ｘｍａ ｌメチラーゼを含まないクローン
を以下のように破壊した。即ち、Ｓｍａｌ消化［’ｆ液
（６＋Ｍ Ｔｒｉｓ・ＥＩＪ、ｐＨ８，０，６ｍＭ Ｈ
ｇＣｌ２．６ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２０ｎ
＋Ｍ ＫＣＮ）９０ｐｌ中のプラスミドライブラリー０
．５．ｇをＳｍａ （制限酵素２０単位（２１１１）を
用いて２５℃で２時間インキュベートした。
ルを消化し、Ｘｍａ ｌメチラーゼを含まないクローン
を以下のように破壊した。即ち、Ｓｍａｌ消化［’ｆ液
（６＋Ｍ Ｔｒｉｓ・ＥＩＪ、ｐＨ８，０，６ｍＭ Ｈ
ｇＣｌ２．６ｍＭ ２−メルカプトエタノール、２０ｎ
＋Ｍ ＫＣＮ）９０ｐｌ中のプラスミドライブラリー０
．５．ｇをＳｍａ （制限酵素２０単位（２１１１）を
用いて２５℃で２時間インキュベートした。
消化したＤＮＡをクロロホルム抽出及びミクロ遠心分Ｍ
（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ） （、た。
（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ） （、た。
（７）形質転換： 前記試験管内の試料１２２．５μｌ
を使用し、コンピテントＥ、ｃｏｌｉ ＲＲＩ ２００
−を形成転換した。細胞／ＤＮＤＮＡ物を、アンピシリ
ン１００１ＪＦｌ／ｌ１１１を含むし寒天プレート上に
移植した。３７℃で一晩インキユベートした後、このプ
レートを調査した。
を使用し、コンピテントＥ、ｃｏｌｉ ＲＲＩ ２００
−を形成転換した。細胞／ＤＮＤＮＡ物を、アンピシリ
ン１００１ＪＦｌ／ｌ１１１を含むし寒天プレート上に
移植した。３７℃で一晩インキユベートした後、このプ
レートを調査した。
Ｓａ＋ａ ｉを用いたプラスミドライブラリーの消化は
、ｌＯ４より大きいファクターで形質転換の数を減少し
たことが判った。プレートから個々のコロニーを採取し
、各々をアンピシリンを含有するＬプロス１〇−中に接
種し、小培養液を調製し、アンピシリンを含有するし寒
天プレート上に画線培養してマスターストックを調製し
た。
、ｌＯ４より大きいファクターで形質転換の数を減少し
たことが判った。プレートから個々のコロニーを採取し
、各々をアンピシリンを含有するＬプロス１〇−中に接
種し、小培養液を調製し、アンピシリンを含有するし寒
天プレート上に画線培養してマスターストックを調製し
た。
（８）生存個体の解析： ステップ８で得られた生存コ
ロニー２９個を１〇−培養液に増殖しくステップ７）、
それらが担うプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ及びＤｏ
ｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、
７．１５１３（１９７９））を一部変更した以下のプラ
スミド小体（ｐｌａｓｍｉｄ ｍ１ｎｉｐｒｅｐ）精製
方法により調製した。
ロニー２９個を１〇−培養液に増殖しくステップ７）、
それらが担うプラスミドを、Ｂｉｒｎｂｏｉｎ及びＤｏ
ｌｙの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、
７．１５１３（１９７９））を一部変更した以下のプラ
スミド小体（ｐｌａｓｍｉｄ ｍ１ｎｉｐｒｅｐ）精製
方法により調製した。
ブースミ゛ハ ・ ： 各培養液を８０００ｒｐｍで
５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞ベレットを、
リボチーム１ｍｙ／ａ１を含有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ
、１０ｍＭ ＥＤＴ＾、５０ｍＭグルコース、ｐｎｓ、
ｏ ｔ、ｏ−中に再度懸濁した。室温で１０分後、０．
２Ｍ ＮａＯＨ，１％５ＤＳ２．０−を各試験管に加え
、試験管を振盪して細胞を溶解し、次いで氷上に置いた
。−旦溶液が透明になったら、３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ４，８１，５＋＊ｌをそれぞれに加えて振盪した。形
成された沈澱物を１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間回
転させた。各上澄みを、イソプロパツール３ｉｆｆｉを
含む遠心分−離管に注入し混合した。室温でＩＯ分後、
試験管を１５０００ｒｐｍで１０分間回転させ、沈澱し
た核酸をベレット状にした。
５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞ベレットを、
リボチーム１ｍｙ／ａ１を含有する２５ｍＭ Ｔｒｉｓ
、１０ｍＭ ＥＤＴ＾、５０ｍＭグルコース、ｐｎｓ、
ｏ ｔ、ｏ−中に再度懸濁した。室温で１０分後、０．
２Ｍ ＮａＯＨ，１％５ＤＳ２．０−を各試験管に加え
、試験管を振盪して細胞を溶解し、次いで氷上に置いた
。−旦溶液が透明になったら、３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐ
Ｈ４，８１，５＋＊ｌをそれぞれに加えて振盪した。形
成された沈澱物を１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間回
転させた。各上澄みを、イソプロパツール３ｉｆｆｉを
含む遠心分−離管に注入し混合した。室温でＩＯ分後、
試験管を１５０００ｒｐｍで１０分間回転させ、沈澱し
た核酸をベレット状にした。
上澄みを廃棄し、ベレットを室温で３０分間空気乾燥し
た。−旦乾燥したならば、ベレットを１０＋＊ＭＴｒｉ
ｓ、 １ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐｌ（８，０８５００中に再
度懸濁した。
た。−旦乾燥したならば、ベレットを１０＋＊ＭＴｒｉ
ｓ、 １ｍＭ ＥＤＴ＾、ｐｌ（８，０８５００中に再
度懸濁した。
５Ｍ ＮａＣ１７５μｌをそれぞれに加え、この溶液を
イン１０パノール５７ｈｆを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試
験管に移し、室温で１０分間再度沈澱させた。次いで試
験管をミクロ遠心分離器内で４５秒間回転させ、上澄み
を廃棄し、ベレットを空気乾燥した。次いでベレットを
、ＲＮａｓｅ １１００ｕ／ｍ１を含有する１０ｍＭ
ｔｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴ＾、ｐＨ８，０５００ｕｊ！中
に溶解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを
消化した。５８ ＮａＱｉ’ ５０ｐＮ、次いでインプ
ロパツール３５０．１を加えることによりＤＮＡをもう
一度沈澱させた。室温で１０分後、ＤＮＡを４５秒間遠
心分離によって回転させ、上澄みを廃棄し、ベレットを
、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＤＥＴ＾、ｐＨ８，０
１５０ｕＮの最終溶液中に溶解した。次いでプラスミド
小体をＸｍａ ｌを用いて消化することにより解析した
。
イン１０パノール５７ｈｆを含むＥｐｐｅｎｄｏｒｆ試
験管に移し、室温で１０分間再度沈澱させた。次いで試
験管をミクロ遠心分離器内で４５秒間回転させ、上澄み
を廃棄し、ベレットを空気乾燥した。次いでベレットを
、ＲＮａｓｅ １１００ｕ／ｍ１を含有する１０ｍＭ
ｔｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴ＾、ｐＨ８，０５００ｕｊ！中
に溶解し、３７℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを
消化した。５８ ＮａＱｉ’ ５０ｐＮ、次いでインプ
ロパツール３５０．１を加えることによりＤＮＡをもう
一度沈澱させた。室温で１０分後、ＤＮＡを４５秒間遠
心分離によって回転させ、上澄みを廃棄し、ベレットを
、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＤＥＴ＾、ｐＨ８，０
１５０ｕＮの最終溶液中に溶解した。次いでプラスミド
小体をＸｍａ ｌを用いて消化することにより解析した
。
（９）Ｘｍａ Ｉメチラーゼ遺伝子クローン： 解析し
た１７個のプラスミドは、Ｘｍａ Ｉ制限酵素による消
化に充分な耐性を示すことが判った。クローンは長さ約
１０．３ｋｂの旧ｎｄｌ［断片を１つ有したく第３図参
照）。これらのプラスミドは同一であることが判り、次
いでＸｍａ Ｉ修飾メチラーゼ遺伝子のみでなく Ｘｎ
＋ａ ｌ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も担うことが判
った。
た１７個のプラスミドは、Ｘｍａ Ｉ制限酵素による消
化に充分な耐性を示すことが判った。クローンは長さ約
１０．３ｋｂの旧ｎｄｌ［断片を１つ有したく第３図参
照）。これらのプラスミドは同一であることが判り、次
いでＸｍａ Ｉ修飾メチラーゼ遺伝子のみでなく Ｘｎ
＋ａ ｌ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も担うことが判
った。
（１０）Ｘｍａ Ｉ制限遺伝子クローン： 上記（ステ
ップ９ ）Ｘ＋ｓａ Ｉ修飾メチラーゼ遺伝子を担うと
して同定されたプラスミドの１つをｐＫＬＸｍａ Ｉ
ＲＭ １０２−２と表記し、これはＸｍａ ｌ制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を担うことが判った。これは、プ
ラスミドが形質転換によって移入されたＥ、ｃｏｌｉ株
に８０２（＾ＴＣＣ３３５２６）から調製された抽出物
の制限エンドヌクレアーゼの罰ｄ工旺解析によって立証
された。
ップ９ ）Ｘ＋ｓａ Ｉ修飾メチラーゼ遺伝子を担うと
して同定されたプラスミドの１つをｐＫＬＸｍａ Ｉ
ＲＭ １０２−２と表記し、これはＸｍａ ｌ制限エン
ドヌクレアーゼ遺伝子を担うことが判った。これは、プ
ラスミドが形質転換によって移入されたＥ、ｃｏｌｉ株
に８０２（＾ＴＣＣ３３５２６）から調製された抽出物
の制限エンドヌクレアーゼの罰ｄ工旺解析によって立証
された。
エンドヌ レアーゼ ： エンドヌクレアーゼ活性を
解析するために、２種類の溶液を調製した。即ち、（ｉ
）ＩＯＸ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐｉ（７，５，１００ｍＭ ＭｙＣＬ、１０
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ Ｎａ
１Ｊ’）と、（ｉｉ）消化反応ミックス（Ｈｉｎｄｌｌ
［消化λＤＮＡ（５００ｐｇ／ｍｆ）５ｈｆ。
解析するために、２種類の溶液を調製した。即ち、（ｉ
）ＩＯＸ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ、ｐｉ（７，５，１００ｍＭ ＭｙＣＬ、１０
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５００ｍＭ Ｎａ
１Ｊ’）と、（ｉｉ）消化反応ミックス（Ｈｉｎｄｌｌ
［消化λＤＮＡ（５００ｐｇ／ｍｆ）５ｈｆ。
１０Ｘ制限エンドヌクレアーゼ緩衝液５５ｕＮ。
ＤＮＡ ５０μｍ？／ｍ１を得るような蒸留水４４０Ｉ
ＪＯとである。
ＪＯとである。
細胞抽出物を以下のように調製した。即ち、クローン培
養液１００ｎ＋１を、アンピシリン１００ｕｙ／ｍ１を
含有するしブロス中で３７℃で一晩増殖させ、細胞を４
０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによりベレット
状にした。上澄みを廃棄し、ベレットを音波処理緩衝液
（５０ｍＭ ＫＰＯ＜、ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＯＮＥ
、０．１ｍＭ ＥＤＴ＾）３ｍｉ’中に再度懸濁した。
養液１００ｎ＋１を、アンピシリン１００ｕｙ／ｍ１を
含有するしブロス中で３７℃で一晩増殖させ、細胞を４
０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによりベレット
状にした。上澄みを廃棄し、ベレットを音波処理緩衝液
（５０ｍＭ ＫＰＯ＜、ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＯＮＥ
、０．１ｍＭ ＥＤＴ＾）３ｍｉ’中に再度懸濁した。
リゾチーム１０ｍｇ／−を含有する音波処理ＭＷＩ液０
．３−を加え、この懸濁液を渦形成し、氷上に１時間放
置した。試料１−をＥ＋］ｐｅｎｄｏｒｆ試験管に移し
、静かに音波処理しながら途中で１０秒間ずつ３回激し
く振盪して細胞を破壊した。試験管をミクロ遠心分離機
内で５分間回転させ、上澄みを細胞抽出物として使用し
た。抽出物を分析するために、消化反応ミックスを５本
の試験管に、第１の試験管には１５０．ｆｆ、残りの４
本の試験管にはそれぞれ１００ＩＪｌずつ分配した。第
１の試験管には抽出物７．５，１を加えて混合し、この
第１の試験管から４７．５ｐＮを取り出して第２の試験
管に移入して混合する等を繰り返した。即ち、第１の試
験管はＤＮＡＩＩＪｇ当たり抽出物１．０μｌを受容し
、第２の試験管は０．３ｕｆ／ｐｇを受容し、第３の試
験管はＯ，ｂ＋Ｕｕｙを受容する等となった。各々が１
００、Ｎを含む試験管を３７℃で１時間インキュベート
し、次いで各々の試料２０μｌをゲル電気泳動によって
分析した。抽出物の力価は１−当たり約ｌＸｌ０’単位
であることが判り、これは細胞１ｇ当たりｘＩＩｌａＩ
制限エンドヌクレアーゼ約１〜２Ｘ１０Ｓ単位に相当す
る（第４図参照）。
．３−を加え、この懸濁液を渦形成し、氷上に１時間放
置した。試料１−をＥ＋］ｐｅｎｄｏｒｆ試験管に移し
、静かに音波処理しながら途中で１０秒間ずつ３回激し
く振盪して細胞を破壊した。試験管をミクロ遠心分離機
内で５分間回転させ、上澄みを細胞抽出物として使用し
た。抽出物を分析するために、消化反応ミックスを５本
の試験管に、第１の試験管には１５０．ｆｆ、残りの４
本の試験管にはそれぞれ１００ＩＪｌずつ分配した。第
１の試験管には抽出物７．５，１を加えて混合し、この
第１の試験管から４７．５ｐＮを取り出して第２の試験
管に移入して混合する等を繰り返した。即ち、第１の試
験管はＤＮＡＩＩＪｇ当たり抽出物１．０μｌを受容し
、第２の試験管は０．３ｕｆ／ｐｇを受容し、第３の試
験管はＯ，ｂ＋Ｕｕｙを受容する等となった。各々が１
００、Ｎを含む試験管を３７℃で１時間インキュベート
し、次いで各々の試料２０μｌをゲル電気泳動によって
分析した。抽出物の力価は１−当たり約ｌＸｌ０’単位
であることが判り、これは細胞１ｇ当たりｘＩＩｌａＩ
制限エンドヌクレアーゼ約１〜２Ｘ１０Ｓ単位に相当す
る（第４図参照）。
・第１図はＸｍａ ｌ制限エンドヌクレアーゼをクロー
ニング及び生産するためのスキームを説明する図、第２
図は第２のＸｍａ Ｉ ／Ｓｍａ １部位を含むｐＵｃ
１９クローニングベクター誘導体ｐＫＬ１９−２の制限
マツプの図、第３図はＸｍａ ｆ制限エンドヌクレアー
ゼ及び修飾メチラーゼをコードする１０．３ｋｂのＨｉ
ｎｄｌｌ挿入断片の制限マツプの図並びに第４図はｐＫ
ＬＸｎａＩＲＭ１０２−２の粗抽出物から得られるＸｍ
ａ ｒ制限エンＦＩＧ、 ２ （ＥｃｏＲ１／Ｐｖｕｌ＋１１ Ａ７ｗＮｌ １２１７
ニング及び生産するためのスキームを説明する図、第２
図は第２のＸｍａ Ｉ ／Ｓｍａ １部位を含むｐＵｃ
１９クローニングベクター誘導体ｐＫＬ１９−２の制限
マツプの図、第３図はＸｍａ ｆ制限エンドヌクレアー
ゼ及び修飾メチラーゼをコードする１０．３ｋｂのＨｉ
ｎｄｌｌ挿入断片の制限マツプの図並びに第４図はｐＫ
ＬＸｎａＩＲＭ１０２−２の粗抽出物から得られるＸｍ
ａ ｒ制限エンＦＩＧ、 ２ （ＥｃｏＲ１／Ｐｖｕｌ＋１１ Ａ７ｗＮｌ １２１７
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）Ｘｍａ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むクロ
ーニングベクター。 （２）請求項１に記載のクローニングベクターを含む形
質転換宿主。 （３）Ｘｍａ遺伝子を￥Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ￥￥ｍ
ａｌｖａｃａｅｒｕｍ￥（ＡＴＣＣ９９２４）から切り
出しする請求項１に記載のクローニングベクター。 （４）Ｘｍａ修飾遺伝子を含むクローニングベクター。 （５）請求項４に記載のクローニングベクターを含む形
質転換宿主。 （６）（ａ）￥Ｘ．￥￥ｍａｌｖａｃａｅｒｕｍ￥由来
のＤＮＡからライブラリーを形成し、 （ｂ）Ｘｍａ修飾遺伝子を含むクローンを単離し、 （ｃ）前記修飾遺伝子を含むクローンをスクリーニング
し、ＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むクロ
ーンを単離することからなるＸｍａＩ制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子のクローニング方法。 （７）前記ライブラリーを、 （ａ）￥Ｘ．￥￥ｍａｌｖａｃａｅｒｕｍ￥由来のＤＮ
Ａを精製するステップ、 （ｂ）精製ＤＮＡを消化してＤＮＡ断片を形成するステ
ップ、 （ｃ）前記断片をクローニングベクター内に連結するス
テップ、 （ｄ）宿主細胞をステップ（ｃ）のクローニングベクタ
ーを用いて形質転換して細胞ライブラリーを形成するス
テップ、及び （ｅ）前記細胞ライブラリーから組換えベクターを精製
してプラスミドライブラリーを形成するステップによつ
て形成する請求項６に記載の方法。 （８ 前記クローニングベクターがｐＫＬ１９−２であ
る請求項７に記載の方法。 （９）前記宿主細胞が、ｈｓｄＲ＾−である￥Ｅ．ｃｏ
ｌｉ￥株である請求項７に記載の方法。 （１０）前記ＸｍａＩ修飾遺伝子を含むクローンを、前
記プラスミドライブラリーをＳｍａＩを用いて消化して
消化プールを形成し、この消化プールを用いて宿主細胞
を形質転換し、修飾遺伝子を含むクローンを選択するこ
とにより単離する請求項７に記載の方法。 （１１）（ａ）￥Ｘ．￥￥ｍａｌｖａｃａｅｒｕｍ￥由
来のＤＮＡを精製するステップ、（ｂ）精製ＤＮＡを適
当な制限エンドヌクレアーゼを用いて消化してＤＮＡ断
片を形成するステップ、 （ｃ）前記断片をクローニングベクター内に連結してＤ
ＮＡ混合体を形成するステップ、（ｄ）宿主細胞をステ
ップ（ｃ）のＤＮＡ混合体を用いて形質転換してライブ
ラリーを形成するステップ、 （ｅ）ＸｍａＩ修飾メチラーゼ遺伝子を含むクローンを
単離するステップ、 （ｆ）ＸｍａＩ修飾メチラーゼ遺伝子を含むクローンを
スクリーニングし、更にＸｍａＩ制限エンドヌクレアー
ゼ遺伝子を含むクローンを単離するステップ、 （ｇ）ステップ（ｆ）のクローンを含む宿主細胞を培養
するステップ、及び （ｈ）培地からＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼを回収
するステップ を含むＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼの生産方法。 （１２）前記クローニングベクターがプラスミドまたは
ウィルスＤＮＡ分子である請求項１１に記載の方法 （１３）前記プラスミドがｐＫＬ１９−２である請求項
１２に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/344,268 US5002882A (en) | 1989-04-27 | 1989-04-27 | Method for producing the XmaI restriction endonuclease and methylase |
| US344,268 | 1989-04-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0361491A true JPH0361491A (ja) | 1991-03-18 |
| JP2952003B2 JP2952003B2 (ja) | 1999-09-20 |
Family
ID=23349779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2115010A Expired - Lifetime JP2952003B2 (ja) | 1989-04-27 | 1990-04-27 | ＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの生産方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5002882A (ja) |
| EP (1) | EP0395367B1 (ja) |
| JP (1) | JP2952003B2 (ja) |
| DE (2) | DE69032630T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06261749A (ja) * | 1992-02-10 | 1994-09-20 | Becton Dickinson & Co | 制限酵素用万能緩衝液 |
Families Citing this family (82)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5192676A (en) * | 1991-02-05 | 1993-03-09 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, asci, obtainable from arthrobacter species and a process for producing the same |
| US5200337A (en) * | 1991-10-25 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Type ii restriction endonuclease, apo i, obtainable from arthrobacter protophormiae and a process for producing the same |
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| US5248605A (en) * | 1992-12-07 | 1993-09-28 | Life Technologies, Inc. | Cloning and expressing restriction endonucleases from haemophilus |
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| WO1996007803A1 (en) * | 1994-09-08 | 1996-03-14 | Non-Compact, Inc. | System for mounting building panels |
| EP2565267A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-03-06 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
| WO2010127186A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Prognosys Biosciences, Inc. | Nucleic acid constructs and methods of use |
| AU2011237729B2 (en) | 2010-04-05 | 2014-04-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
| US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
| EP2694709B1 (en) | 2011-04-08 | 2016-09-14 | Prognosys Biosciences, Inc. | Peptide constructs and assay systems |
| GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| US9593365B2 (en) | 2012-10-17 | 2017-03-14 | Spatial Transcriptions Ab | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
| EP2972366B1 (en) | 2013-03-15 | 2020-06-17 | Prognosys Biosciences, Inc. | Methods for detecting peptide/mhc/tcr binding |
| DK3013983T3 (da) | 2013-06-25 | 2023-03-06 | Prognosys Biosciences Inc | Spatialt kodede biologiske assays ved brug af en mikrofluidisk anordning |
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| CN120425026A (zh) | 2015-04-10 | 2025-08-05 | 十程基因技术瑞典公司 | 生物样本的空间区别、多重核酸分析 |
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| US12529094B2 (en) | 2018-12-10 | 2026-01-20 | 10X Genomics, Inc. | Imaging system hardware |
| US20220290217A1 (en) | 2018-12-10 | 2022-09-15 | 10X Genomics, Inc. | Resolving spatial arrays using deconvolution |
| US11649485B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-05-16 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
| US11926867B2 (en) | 2019-01-06 | 2024-03-12 | 10X Genomics, Inc. | Generating capture probes for spatial analysis |
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| WO2021092433A2 (en) | 2019-11-08 | 2021-05-14 | 10X Genomics, Inc. | Enhancing specificity of analyte binding |
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| EP4081777B1 (en) | 2019-12-23 | 2026-02-18 | 10X Genomics, Inc. | Reversible fixing reagents and methods of use thereof |
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| US12076701B2 (en) | 2020-01-31 | 2024-09-03 | 10X Genomics, Inc. | Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics |
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