JPH0361492A - パッケージング欠陥ｈｉｖプロウイルス、細胞系及びその使用 - Google Patents
パッケージング欠陥ｈｉｖプロウイルス、細胞系及びその使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、包装欠陥（ｐａｃｋａｇｉＢ ｄｅｆｅｃｔ
ｉｖｅ）Ｉ（ＩＶプロウィルスを含むベクター、）ＩＩ
Ｖ包装欠陥細胞系を作製するためのかかるベクターの使
用、及び得られた細胞系の使用に係る。より好ましくは
、ＨＩＶプロウィルスがＨＩＶ−１プロウイルスである
。
ｉｖｅ）Ｉ（ＩＶプロウィルスを含むベクター、）ＩＩ
Ｖ包装欠陥細胞系を作製するためのかかるベクターの使
用、及び得られた細胞系の使用に係る。より好ましくは
、ＨＩＶプロウィルスがＨＩＶ−１プロウイルスである
。
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
、Ｌ＾■またはＩ（ＴＬＶ−Ｉ［Ｉ ／ＬＡＶとも呼ば
れる）は後天性免疫不全症候群（エイズ（ＡＩＤＳ））
及び類縁疾患の病因物質である［Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏ
ｕｓｓｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８〜８７１
（１９８３） ；Ｇａｌ ｌｏ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２
２４：５００−５０３（１９８４）；Ｌｅｖｙ等、５ｃ
ｉｅｎｃｅ ２２５：８４０−８４２（１９８４）；Ｐ
ｏｐｏｖｉｃ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２±：４９７〜５
００ （１９８４） ：５ａｒｎＨａｄｈａｒａｎ等、
５ｃｉｅｎｃｅ ２２４：５０６〜５０８；５ｉｅＨａ
１等、Ｎ、 Ｅｎ １． Ｊ。
、Ｌ＾■またはＩ（ＴＬＶ−Ｉ［Ｉ ／ＬＡＶとも呼ば
れる）は後天性免疫不全症候群（エイズ（ＡＩＤＳ））
及び類縁疾患の病因物質である［Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏ
ｕｓｓｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８〜８７１
（１９８３） ；Ｇａｌ ｌｏ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２
２４：５００−５０３（１９８４）；Ｌｅｖｙ等、５ｃ
ｉｅｎｃｅ ２２５：８４０−８４２（１９８４）；Ｐ
ｏｐｏｖｉｃ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２±：４９７〜５
００ （１９８４） ：５ａｒｎＨａｄｈａｒａｎ等、
５ｃｉｅｎｃｅ ２２４：５０６〜５０８；５ｉｅＨａ
１等、Ｎ、 Ｅｎ １． Ｊ。
Ｈｅｄ、 ３０５：１４３９”１４４４（１９８１））
。この疾患の特徴は、長い無症候期間後に免疫系及び中
枢神経系に進行性の変性を生じることである。ウィルス
の研究の結果から該ウィルスの複製が高度に調節されて
いることが判明し、組織培養ではＣＤ４陽性ヘルパ−Ｔ
リンパ球サブセットへの潜伏性及び溶解性感染がともに
生じる（Ｚａｇｕｒｙ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：８
５０〜８５３（１９８６））。また、感染患者において
はウィルスの発現が免疫応答を回避するように調節され
ると考えられる。ｎｘｙ−ｉの調節及びゲノム構成の分
子論的研究から、該ウィルスが多数の遺伝子をコードし
ていることが判明した（Ｒａｔｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ
３１３：２７７〜２８４ （１９８５） ； ５ａｎ
ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ２２７
：４Ｂ４〜４９２（１９８５） ：Ｍｕｅｓｉｎｇ等、
Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４５０〜４５７（１９８５）
：Ｈａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ等、廁月−４０：９〜１７（
１９８５））。
。この疾患の特徴は、長い無症候期間後に免疫系及び中
枢神経系に進行性の変性を生じることである。ウィルス
の研究の結果から該ウィルスの複製が高度に調節されて
いることが判明し、組織培養ではＣＤ４陽性ヘルパ−Ｔ
リンパ球サブセットへの潜伏性及び溶解性感染がともに
生じる（Ｚａｇｕｒｙ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：８
５０〜８５３（１９８６））。また、感染患者において
はウィルスの発現が免疫応答を回避するように調節され
ると考えられる。ｎｘｙ−ｉの調節及びゲノム構成の分
子論的研究から、該ウィルスが多数の遺伝子をコードし
ていることが判明した（Ｒａｔｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ
３１３：２７７〜２８４ （１９８５） ； ５ａｎ
ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ２２７
：４Ｂ４〜４９２（１９８５） ：Ｍｕｅｓｉｎｇ等、
Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４５０〜４５７（１９８５）
：Ｈａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ等、廁月−４０：９〜１７（
１９８５））。
典型的な分類によればレトロウィルスは、３つの亜科、
即ちオンコウイルス、スブーマウイルス及びレンチウィ
ルスのいずれかに所属する。オンコウイルスの感染は典
型的には悪性疾患を随伴する。これらのウィルスは典型
的には、約８，０００〜ｉｏ、ｏｏｏのヌクレオチドか
ら戒りむ工、鰭±及び斐ヱ遺伝子とＬＴＲ（ｌｏｎｇ
ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列とを包含するプ
ラス鎖の１本ｇＲＮ＾ゲノムを含む、いくつかのオンコ
ウイルスは腫瘍遺伝子を含む、スプーマウイルスは組織
培養で泡沫状：Ｓ胞変性を誘発するが、ｉｎ ｖｉｖｏ
では病原性でないと一般に考えられている。レンチウィ
ルスによる感染は一般に緩慢であり、長い潜伏期間後に
慢性の衰弱性疾患を発病させる。これらのウィルスは、
む工、回生及びｅｎｖ遺伝子に加えて、更に調節機能を
有する多数の遺伝子を有する。
即ちオンコウイルス、スブーマウイルス及びレンチウィ
ルスのいずれかに所属する。オンコウイルスの感染は典
型的には悪性疾患を随伴する。これらのウィルスは典型
的には、約８，０００〜ｉｏ、ｏｏｏのヌクレオチドか
ら戒りむ工、鰭±及び斐ヱ遺伝子とＬＴＲ（ｌｏｎｇ
ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列とを包含するプ
ラス鎖の１本ｇＲＮ＾ゲノムを含む、いくつかのオンコ
ウイルスは腫瘍遺伝子を含む、スプーマウイルスは組織
培養で泡沫状：Ｓ胞変性を誘発するが、ｉｎ ｖｉｖｏ
では病原性でないと一般に考えられている。レンチウィ
ルスによる感染は一般に緩慢であり、長い潜伏期間後に
慢性の衰弱性疾患を発病させる。これらのウィルスは、
む工、回生及びｅｎｖ遺伝子に加えて、更に調節機能を
有する多数の遺伝子を有する。
ヒト免疫不全ウィルス（Ｈｍはレンチウィルスとして分
類されている。その理由は、感染が緩慢でありまたレン
チウィルスに共通の構造的特性を有するからて゛ある（
Ｉｌｎａｓｅ、八、 Ｔ、、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１
３０〜１３６（１９８６）参照〕。
類されている。その理由は、感染が緩慢でありまたレン
チウィルスに共通の構造的特性を有するからて゛ある（
Ｉｌｎａｓｅ、八、 Ｔ、、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１
３０〜１３６（１９８６）参照〕。
ＩＩＶ４ウィルスはその他のレトロウィルスと共通の１
４−１とロエ及び卸ヱ遺伝子を有するＣｔｌａｓｅｌｔ
ｉｎｅ。
４−１とロエ及び卸ヱ遺伝子を有するＣｔｌａｓｅｌｔ
ｉｎｅ。
Ｗ、 八、、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒ 八ｃｑｕｉｒｅ
ｄ Ｉｍｍｕｎｅ ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄ
ｒｏｍｅ、１：２１７〜２４０（１９８８）：ｌ。ｕｒ
ｖ−ｔｃｉまた、更にウィルス複製を調節する遺伝子を
有する。ＨＩＶｌゲノムは、す工、すり、 ｔａ工、ｒ
ｅｖ 、■！及びＵエタンバク質をコードしている（Ｈ
ａｓｅｌｔｉｎｅ、 ＬＡｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒ
Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃ
ｙ Ｓｙｎｄ−ｒｏｍｅ、Ｊｔ１１Ｌ〕、更に、ＨＩＶ
のＬＴＲは、組込み、転写及びポリアデニル化に重要な
ｃｉｓ作用（ｃｉｓ−ａｃｔｉＢ）配列を含む、付加的
な杉１作用シグナルは、新しいＨＩＶ遺伝子産物のいく
つかによってＨＩＶ配列の調節を可能にする（Ｈａｓｅ
ｌｔｉｎｅ、 Ｈ，Ａ、、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ八へｑ
ｕｉｒｅｃｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃ
ｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ＋ 正［ＪＬ；５ｏｄｒｏｓｋ
ｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：１５４９〜１５５３
（１９８６）；へｒｙａ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２９：
６９〜７３（１９８５）：５ｏｄｒｏｓｋｉ等、５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２２７：１７１〜１７３（１９８５）；５ｏ
ｄｒｏｓｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅｕ上：４１２〜４１７（
１９８６） ；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ等、廁旦−４６：８０
７〜８１７（１９８６） Ｊｏｎｇ−Ｓｔａａｌ等、Ａ
ＩＤＳ Ｒｅｓ 、 ａｎｄ ｔｌｕｍａｎＲｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ ３：３３〜３９（１９８７）：これら
の文献の記載内容はすべて本明細書に含まれるものとす
る〕。
ｄ Ｉｍｍｕｎｅ ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄ
ｒｏｍｅ、１：２１７〜２４０（１９８８）：ｌ。ｕｒ
ｖ−ｔｃｉまた、更にウィルス複製を調節する遺伝子を
有する。ＨＩＶｌゲノムは、す工、すり、 ｔａ工、ｒ
ｅｖ 、■！及びＵエタンバク質をコードしている（Ｈ
ａｓｅｌｔｉｎｅ、 ＬＡｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｒ
Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃ
ｙ Ｓｙｎｄ−ｒｏｍｅ、Ｊｔ１１Ｌ〕、更に、ＨＩＶ
のＬＴＲは、組込み、転写及びポリアデニル化に重要な
ｃｉｓ作用（ｃｉｓ−ａｃｔｉＢ）配列を含む、付加的
な杉１作用シグナルは、新しいＨＩＶ遺伝子産物のいく
つかによってＨＩＶ配列の調節を可能にする（Ｈａｓｅ
ｌｔｉｎｅ、 Ｈ，Ａ、、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ八へｑ
ｕｉｒｅｃｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃ
ｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ＋ 正［ＪＬ；５ｏｄｒｏｓｋ
ｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：１５４９〜１５５３
（１９８６）；へｒｙａ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２９：
６９〜７３（１９８５）：５ｏｄｒｏｓｋｉ等、５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２２７：１７１〜１７３（１９８５）；５ｏ
ｄｒｏｓｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅｕ上：４１２〜４１７（
１９８６） ；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ等、廁旦−４６：８０
７〜８１７（１９８６） Ｊｏｎｇ−Ｓｔａａｌ等、Ａ
ＩＤＳ Ｒｅｓ 、 ａｎｄ ｔｌｕｍａｎＲｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ ３：３３〜３９（１９８７）：これら
の文献の記載内容はすべて本明細書に含まれるものとす
る〕。
今日までに配列決定された種々のＨＩＶ−１菌株中では
、５′主要スプライス供与部位と四４伝子開始コドンど
の間の領域は高度に保存されている（Ｍｙｅｒｓ、 Ｇ
−等、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏ ａｎｄ
Ｂｉｏ−吐り山上、（１９８８））。
、５′主要スプライス供与部位と四４伝子開始コドンど
の間の領域は高度に保存されている（Ｍｙｅｒｓ、 Ｇ
−等、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏ ａｎｄ
Ｂｉｏ−吐り山上、（１９８８））。
これらの遺伝子の多くは、ウィルスのライフサイクルに
必要な産物をコードする０例えば、肋０゜遺伝子は、Ｈ
ＩＶ複製及び遺伝子発現に重要な１４ｋＤのタンパク質
をコードする（Ｒｏｓｅｎ、 Ｃ，＾１等、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１９：５５５〜５５９（１９８６）；５ｏｄｒｏ
ｓｋｉ、 Ｊ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７：１７１〜
１７３（１９８５） ：＾ｒｙａ等、５ｃｉｅｎｃｅ２
２９ ： 札炙： Ｓ ｏ ｄ ｒ ｏ ｓ ｋ ｉ等
、５ｃｉｅｎｃｅ ２２９：ｆｉ；Ｄａｙｔｏｎ。
必要な産物をコードする０例えば、肋０゜遺伝子は、Ｈ
ＩＶ複製及び遺伝子発現に重要な１４ｋＤのタンパク質
をコードする（Ｒｏｓｅｎ、 Ｃ，＾１等、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３１９：５５５〜５５９（１９８６）；５ｏｄｒｏ
ｓｋｉ、 Ｊ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２７：１７１〜
１７３（１９８５） ：＾ｒｙａ等、５ｃｉｅｎｃｅ２
２９ ： 札炙： Ｓ ｏ ｄ ｒ ｏ ｓ ｋ ｉ等
、５ｃｉｅｎｃｅ ２２９：ｆｉ；Ｄａｙｔｏｎ。
＾６等、廁旦？吐：９４１〜９４７（１９８６） 、こ
れらの文献の記載内容はすべて本明細書に含まれるもの
とする〕。
れらの文献の記載内容はすべて本明細書に含まれるもの
とする〕。
複製に必要な別の遺伝子はｒｅｖ遺伝子である（Ｓｏｄ
−ｒ ｏ−ｓ ｋ ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：４１
２〜４１７（１９８６）；この文献の記載内容は本明細
書に含まれるものとする〕。
−ｒ ｏ−ｓ ｋ ｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：４１
２〜４１７（１９８６）；この文献の記載内容は本明細
書に含まれるものとする〕。
いくつかのオンコウイルスにおいては、５’ ＬＴＲと
ロエ遺伝子開始コドンとの間に存在する０王作用配列が
ウィルスＲＮへをビリオンに有効に包装するために必要
であることが知見された（Ｂｅｎｄｅｒ、 Ｍ、へ１等
、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ ６１：１６３９〜１６４６（１９
８７）；Ｋａｔｚ、Ｒ。
ロエ遺伝子開始コドンとの間に存在する０王作用配列が
ウィルスＲＮへをビリオンに有効に包装するために必要
であることが知見された（Ｂｅｎｄｅｒ、 Ｍ、へ１等
、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ ６１：１６３９〜１６４６（１９
８７）；Ｋａｔｚ、Ｒ。
へ１等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ ５９：１８：３〜１６７（
１９８６）；Ｍａｎｎ、 Ｒ，等、廁旦−３３：１５３
−１５９（１９８３）；Ｐｕｇａｔｓｃｈ、 Ｔ、等、
Ｖｉｒ。
１９８６）；Ｍａｎｎ、 Ｒ，等、廁旦−３３：１５３
−１５９（１９８３）；Ｐｕｇａｔｓｃｈ、 Ｔ、等、
Ｖｉｒ。
Ｌ９ＪＬＬ １２８：５０５〜５１１（１９８３）Ｊｌ
ａｔａｎａｂｅ、 Ｓ、等、Ｐｒｏｃ 。
ａｔａｎａｂｅ、 Ｓ、等、Ｐｒｏｃ 。
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ７９：５９８６〜５
９９０（１９８３）；Ｅｇｌｉｔｉｓ。
９９０（１９８３）；Ｅｇｌｉｔｉｓ。
Ｈ９Δ１等、１面ユニ４Ｉ四ユ生謹■工６：６０８〜６
１４（１９８Ｂ）、これらの文献の記載内容は本明細書
に含まれるものとする〕、これらの配列に加えて、■工
遺伝子と部分的に重複する配列が、Ｍｏ１ｏｎｅｙマウ
スの白血病ウィルスにおいてウィルスＲＮ＾のキャプシ
ド封入効率に寄与することが知見された〔＾ｄａｍ、
Ｍ、＾１等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６２：３８０２〜３
８０６（１９８８））、レンチウィルスＲＮ＾（例えば
ＨＩＶ ＲＮ八）をビリオン粒子に包装するために必要
なシグナルはまだ同定されていない。
１４（１９８Ｂ）、これらの文献の記載内容は本明細書
に含まれるものとする〕、これらの配列に加えて、■工
遺伝子と部分的に重複する配列が、Ｍｏ１ｏｎｅｙマウ
スの白血病ウィルスにおいてウィルスＲＮ＾のキャプシ
ド封入効率に寄与することが知見された〔＾ｄａｍ、
Ｍ、＾１等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６２：３８０２〜３
８０６（１９８８））、レンチウィルスＲＮ＾（例えば
ＨＩＶ ＲＮ八）をビリオン粒子に包装するために必要
なシグナルはまだ同定されていない。
ＨＩＶ−１を解明するために多くの研究が費やされたが
、このレトロウィルスのライフサイクルは完全には解明
されていない。
、このレトロウィルスのライフサイクルは完全には解明
されていない。
更に、このウィルスに対するワクチンを開発する研究も
多数行なわれているが、成功の報告はいまだ皆無である
。その理由の１つは、ウィルスの活性な抗原性部分の保
存の欠如にあり、いま１つは、ウィルスタンパク質及び
／または失活ウィルス粒子の機能的に重要な領域の免疫
原性が弱いことにある。
多数行なわれているが、成功の報告はいまだ皆無である
。その理由の１つは、ウィルスの活性な抗原性部分の保
存の欠如にあり、いま１つは、ウィルスタンパク質及び
／または失活ウィルス粒子の機能的に重要な領域の免疫
原性が弱いことにある。
従って、ＨＩＶタンパク質を産生できるプロウィルスで
あり同時゛に、ウィルスＲＮＡがビリオンに包装される
ことができないために致死性でないプロウィルスを開発
することは極めて重要である。この包装欠陥プロウィル
スベクターの使用によって、ウィルスの包装メカニズム
の研究、及び該包装メカニズムを妨害する戦略の開発の
ために有用な包装欠陥側胞系の作製が可能であろう。か
かる包装欠損（ｎｅｇａｔｉｖｅ）プロウィルスによっ
て産生されるビリオンの重要性は、ワクチンとして使用
できること、また所望の遺伝子を哺乳類細胞に有効に導
入する系としても使用できることである。
あり同時゛に、ウィルスＲＮＡがビリオンに包装される
ことができないために致死性でないプロウィルスを開発
することは極めて重要である。この包装欠陥プロウィル
スベクターの使用によって、ウィルスの包装メカニズム
の研究、及び該包装メカニズムを妨害する戦略の開発の
ために有用な包装欠陥側胞系の作製が可能であろう。か
かる包装欠損（ｎｅｇａｔｉｖｅ）プロウィルスによっ
て産生されるビリオンの重要性は、ワクチンとして使用
できること、また所望の遺伝子を哺乳類細胞に有効に導
入する系としても使用できることである。
免吐へ漿匙
発明者等は、機能性＋＋１Ｖ遺伝子産物を発現するＨＩ
Ｖゲノムに対応する十分な数のヌクレオチド配列（ＨＩ
Ｖヌクレオチド）を含むが、ＨＩＶゲノムの５゛主要ス
プライス供与部位とＦｉＡＬ遺伝子開始コドンとの間の
ヌクレオチドに対応する、ウィルスＲＮ＾をビリオンに
有効に包装するための十分な数のヌクレオチド（ＨＩＶ
包装配列）を含まないベクターの開発に成功した。好ま
しくはこのＨＩＶ包装配列は、５゛主要スプライス供与
部位とｕ主遺伝子開始コドンとの間の領域に対応する。
Ｖゲノムに対応する十分な数のヌクレオチド配列（ＨＩ
Ｖヌクレオチド）を含むが、ＨＩＶゲノムの５゛主要ス
プライス供与部位とＦｉＡＬ遺伝子開始コドンとの間の
ヌクレオチドに対応する、ウィルスＲＮ＾をビリオンに
有効に包装するための十分な数のヌクレオチド（ＨＩＶ
包装配列）を含まないベクターの開発に成功した。好ま
しくはこのＨＩＶ包装配列は、５゛主要スプライス供与
部位とｕ主遺伝子開始コドンとの間の領域に対応する。
より好ましくはこの配列は、５゛主要スプライス供与部
位の直ぐ下流からＬ４−開始コトンの約１４塩基上流ま
でのセグメンｌ−に対応する。この配列の１つの具体例
は、配列昌＾ＡＡＴＴＴＴＧＡＣＴへＧＣＧＧへを有す
る１９塩基から成るセグメントである。
位の直ぐ下流からＬ４−開始コトンの約１４塩基上流ま
でのセグメンｌ−に対応する。この配列の１つの具体例
は、配列昌＾ＡＡＴＴＴＴＧＡＣＴへＧＣＧＧへを有す
る１９塩基から成るセグメントである。
このベクターを使用し、予め選択された細胞系を形質転
換させるとＨＩＶ包装欠陥細胞系が得られる。好ましく
は、細胞系を形質転換するために少なくとも２つのベク
ターを用いる。これらのベクターは両者を合わせるとＨ
ＩＶＩＬ！ｉ、Ｌ凰びｅｎｖ産物を発現するために必要
なＨＩＶヌクレオチドを含むが、各ベクター単独では上
記の３つの産生物全部を発現するために必要なヌクレオ
チドを含まない。更に、各ベクターは、ＨＩＶゲノムの
５″主要スプライス供与部位と０１遺伝子との間のヌク
レオチドに対応する、ＨＩＶ ＲＮ八を有効に包装する
ための十分な数のヌクレオチドを含まない、各ベクター
が異なるマーカー遺伝子を含むのが好ましい。
換させるとＨＩＶ包装欠陥細胞系が得られる。好ましく
は、細胞系を形質転換するために少なくとも２つのベク
ターを用いる。これらのベクターは両者を合わせるとＨ
ＩＶＩＬ！ｉ、Ｌ凰びｅｎｖ産物を発現するために必要
なＨＩＶヌクレオチドを含むが、各ベクター単独では上
記の３つの産生物全部を発現するために必要なヌクレオ
チドを含まない。更に、各ベクターは、ＨＩＶゲノムの
５″主要スプライス供与部位と０１遺伝子との間のヌク
レオチドに対応する、ＨＩＶ ＲＮ八を有効に包装する
ための十分な数のヌクレオチドを含まない、各ベクター
が異なるマーカー遺伝子を含むのが好ましい。
形質転換された細胞系は、）ＩＩＶビリオンを発現する
であろうが、これらのビリオン内にＩ（ｒＶ ＲＮＡを
包装することはできないだろう。従ってこれらのビリオ
ンは、抗体を産生するために使用でき、ワクチンとして
またはＨＩＶに感染し得る別の細胞系に所望の遺伝子産
物を移入する手段として使用され得る。
であろうが、これらのビリオン内にＩ（ｒＶ ＲＮＡを
包装することはできないだろう。従ってこれらのビリオ
ンは、抗体を産生するために使用でき、ワクチンとして
またはＨＩＶに感染し得る別の細胞系に所望の遺伝子産
物を移入する手段として使用され得る。
象礼欠糺覧
発明者等は、ＨＩＶ包装欠陥ベクター及び細胞系の作製
が可能であることを知見した。発明者等は、１（ＩＶウ
ィルスの５°主要スプライス供与部位とｍ遺伝子開始コ
ドンとの間の領域が、）ＩＩＶ ＲＮＡをビリオンに包
装するために必要な配列を含んでいることを知見した。
が可能であることを知見した。発明者等は、１（ＩＶウ
ィルスの５°主要スプライス供与部位とｍ遺伝子開始コ
ドンとの間の領域が、）ＩＩＶ ＲＮＡをビリオンに包
装するために必要な配列を含んでいることを知見した。
従って、所望のＨ■■産物を発現するための十分な数の
ＨＩＶゲノム由来のヌクレオチドに対応するヌクレオチ
ド配列を含むが、５′主要スプライス供与部位とｍ遺伝
子開始コドンとの間の領域に対応する、ＨＩＶ ＲＮＡ
を有効に包装するための十分な数のヌクレオチドを含ま
ない包装欠陥１（ＩＶプロウィルスを含むベクターを作
製することが可能である。
ＨＩＶゲノム由来のヌクレオチドに対応するヌクレオチ
ド配列を含むが、５′主要スプライス供与部位とｍ遺伝
子開始コドンとの間の領域に対応する、ＨＩＶ ＲＮＡ
を有効に包装するための十分な数のヌクレオチドを含ま
ない包装欠陥１（ＩＶプロウィルスを含むベクターを作
製することが可能である。
これらの配列は好ましくは、ＨＩＶ−１、）ＩＩＶ−２
及びサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）に対応する（Ｒａ
ｔｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３、ｆｉ； Ｓ ａ
ｎ ｃ ｈ ｅ ｚ −Ｐ ｅ ｓ ｃ ａ ｄ ｏ
ｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ２２７、前ＬＩＬ； Ｍ ｕ ｅ
ｓ ｉ ｎ ｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３、前二［；
Ｈａ ｉ ｎ −１１ｏ ｂ ｓ ｏ ｎ等、罰旦？
没、１ｉＪ１；Ｇｕｙａｄｅｒ、 Ｍ、等、Ｎａｔｕｒ
ｅ３２６ ：６６２〜６６９（１９８７） ；Ｃｈａｋ
ｒａｂａｒｔｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５４３〜５
４７（１９８７）；Ｈｉｒｓｃｈ、 Ｖ、等、Ｃｅ１１
４９：３０７〜３１９（１９８７） ；これらの文献の
記載内容はすべて本明細書に含まれるものとする〕。
及びサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）に対応する（Ｒａ
ｔｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３、ｆｉ； Ｓ ａ
ｎ ｃ ｈ ｅ ｚ −Ｐ ｅ ｓ ｃ ａ ｄ ｏ
ｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ２２７、前ＬＩＬ； Ｍ ｕ ｅ
ｓ ｉ ｎ ｇ等、Ｎａｔｕｒｅ ３１３、前二［；
Ｈａ ｉ ｎ −１１ｏ ｂ ｓ ｏ ｎ等、罰旦？
没、１ｉＪ１；Ｇｕｙａｄｅｒ、 Ｍ、等、Ｎａｔｕｒ
ｅ３２６ ：６６２〜６６９（１９８７） ；Ｃｈａｋ
ｒａｂａｒｔｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５４３〜５
４７（１９８７）；Ｈｉｒｓｃｈ、 Ｖ、等、Ｃｅ１１
４９：３０７〜３１９（１９８７） ；これらの文献の
記載内容はすべて本明細書に含まれるものとする〕。
好ましくはベクターは、５°主要スプライス供与部位の
直ぐ下流にあり且つｕ主遺伝子開始コドンの直ぐ上流に
あるセグメントに対応するＨＴＶ包装配列を含まない。
直ぐ下流にあり且つｕ主遺伝子開始コドンの直ぐ上流に
あるセグメントに対応するＨＴＶ包装配列を含まない。
典型的には、ベクターがむ工開始コドンの上流約１４塩
基から２塩基までの範囲、例えば上流約１４塩基または
５塩基のヌクレオチドを含みなからも依然として包装欠
損であった。１つの実施態様ではベクターが、５°主要
スプライス供与部位の約９塩基下流から始まり■工開始
コドンの約１４塩基上流まで続くヌクレオチド配列を含
まない、残存すべき塩基の数は大幅に違っていてもよい
０例えばＨＩＶ−１の■９塩基対の欠失即ち配列＾＾＾
ＡＡＴＴＴＴにＡＣＴＡＧＣＧＧ＾の欠失は十分に包装
能力を喪失させるが（第１図参照）、この領域のより小
さい欠失でさえも包装効果を喪失させる。実際、この領
域の約５塩基の小さい欠失が包装能力を除去できると予
測される。従って、当業者は本発明の開示に基づいて特
定の欠失のサイズを容易に決定できる。
基から２塩基までの範囲、例えば上流約１４塩基または
５塩基のヌクレオチドを含みなからも依然として包装欠
損であった。１つの実施態様ではベクターが、５°主要
スプライス供与部位の約９塩基下流から始まり■工開始
コドンの約１４塩基上流まで続くヌクレオチド配列を含
まない、残存すべき塩基の数は大幅に違っていてもよい
０例えばＨＩＶ−１の■９塩基対の欠失即ち配列＾＾＾
ＡＡＴＴＴＴにＡＣＴＡＧＣＧＧ＾の欠失は十分に包装
能力を喪失させるが（第１図参照）、この領域のより小
さい欠失でさえも包装効果を喪失させる。実際、この領
域の約５塩基の小さい欠失が包装能力を除去できると予
測される。従って、当業者は本発明の開示に基づいて特
定の欠失のサイズを容易に決定できる。
ベクターは、機能性ＨＩＶ遺伝子産物を発現させるＨＩ
Ｖゲノムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオ
チドを含むＨＩＶヌクレオチドセグメントを含んでいな
ければならないが、前記のごとく５′主要スプライス供
与部位と１ｍ！４ｍ遺伝子開始コドンとの間の領域に対
応する、ウィルスＲＮ＾をビリオンに有効に包装するた
めの十分な数のヌクレオチドを含んでいてはならない。
Ｖゲノムのヌクレオチドに対応する十分な数のヌクレオ
チドを含むＨＩＶヌクレオチドセグメントを含んでいな
ければならないが、前記のごとく５′主要スプライス供
与部位と１ｍ！４ｍ遺伝子開始コドンとの間の領域に対
応する、ウィルスＲＮ＾をビリオンに有効に包装するた
めの十分な数のヌクレオチドを含んでいてはならない。
これらのベクターを使用してＨＩＶ包装欠陥細胞系を樹
立するために、かかる細胞系が感染性ＨＩＶを全く産生
しないのが好ましい。これらの包装欠陥ベクターによっ
て形質転換された細胞系は、細胞が包装欠陥であるため
感染力が弱いが、ある種のＲＤ八は依然としてビリオン
に包装され得る。従って、ＨＩＶヌクレオチドセグメン
トが全ＨＩＶゲノムに対応せず、その結果として、ウィ
ルスＲＮＡがビリオンに包装されても包装されたものが
複製コンピテントウィルスにならないのが好ましい。
立するために、かかる細胞系が感染性ＨＩＶを全く産生
しないのが好ましい。これらの包装欠陥ベクターによっ
て形質転換された細胞系は、細胞が包装欠陥であるため
感染力が弱いが、ある種のＲＤ八は依然としてビリオン
に包装され得る。従って、ＨＩＶヌクレオチドセグメン
トが全ＨＩＶゲノムに対応せず、その結果として、ウィ
ルスＲＮＡがビリオンに包装されても包装されたものが
複製コンピテントウィルスにならないのが好ましい。
好ましくは、各々がＨＩＶゲノムの異なる部分を含みウ
ィルス包装に必要な配列を含まない２つ以上の異なるベ
クターを作製する。次いで、各ベクターを細胞にコトラ
ンスフエクトすると、細胞は全部のＨＩＶ構造タンパク
質を発現しビリオンを産生ずるであろう。１つの好まし
い実施態様では、ベクターがＨＩＶ ＬＴＲに対応する
配列を含まないがプロモーター領域及び／または別のゲ
ノムのポリアデニル化配列に対応する配列を含むであろ
う。
ィルス包装に必要な配列を含まない２つ以上の異なるベ
クターを作製する。次いで、各ベクターを細胞にコトラ
ンスフエクトすると、細胞は全部のＨＩＶ構造タンパク
質を発現しビリオンを産生ずるであろう。１つの好まし
い実施態様では、ベクターがＨＩＶ ＬＴＲに対応する
配列を含まないがプロモーター領域及び／または別のゲ
ノムのポリアデニル化配列に対応する配列を含むであろ
う。
特定のプロモーター及びポリアデニル化配列の選択は特
定宿主細胞に基づいて容易に決定され得る。
定宿主細胞に基づいて容易に決定され得る。
１つの好ましい実施態様では、１つのベクターが斐ヱの
上流にＨＩＶタンパク質を発現させ得る配列を含み、第
２のベクターが残りのタンパク質を発現させ得る配列を
含む０例えば１つのベクターが、辻−始コトンの上流か
ら蜆４伝配列列までの５′側の多くの遺伝子産物（５’
−ｍｏｓｔ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を発現させ
るのに十分な数のヌクレオチドに対応するＨＩＶヌクレ
オチドセグメントを含み、他方のベクターが、む工遺伝
子配列の下流に存在し機能性斐ヱ遺伝子配列を含む十分
な数のヌクレオチドに対応するＨＩＶヌクレオチドセグ
メントを含む。
上流にＨＩＶタンパク質を発現させ得る配列を含み、第
２のベクターが残りのタンパク質を発現させ得る配列を
含む０例えば１つのベクターが、辻−始コトンの上流か
ら蜆４伝配列列までの５′側の多くの遺伝子産物（５’
−ｍｏｓｔ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を発現させ
るのに十分な数のヌクレオチドに対応するＨＩＶヌクレ
オチドセグメントを含み、他方のベクターが、む工遺伝
子配列の下流に存在し機能性斐ヱ遺伝子配列を含む十分
な数のヌクレオチドに対応するＨＩＶヌクレオチドセグ
メントを含む。
本明細書の開示に基づいて当業者は、これらのウィルス
中の既知の制限エンドヌクレアーゼ部位を利用し、これ
らのベクターをＨＩＶゲノムの発表された配列から化学
的に合成するかまたは多くの入手可能なＨＩＶプロウィ
ルスから誘導し得る。
中の既知の制限エンドヌクレアーゼ部位を利用し、これ
らのベクターをＨＩＶゲノムの発表された配列から化学
的に合成するかまたは多くの入手可能なＨＩＶプロウィ
ルスから誘導し得る。
好ましくは、各ベクターに異なるマーカー遺伝子を付加
してもよい、即ち、これらの異なるベクターを予め選択
した細胞系にコトランスフェクトし、両方のマーカーを
含む細胞を捜し出すことによって２つのベクターでコト
ランスフェクトされた細胞系を作製してもよい。かかる
細胞は全てのＨＩＶタンパク質を産生し得る。しかしな
から、ビリオンは産生されるであろうが、全ウィルス配
列に対応するＩＩＮＡはこれらのビリオンに包装されな
いであろう、必要に応じて３つ以上のベクター、例えば
むニーとり一ベクターとりヱベクターとｖｉｕ■エベク
ターとを使用することも可能である。
してもよい、即ち、これらの異なるベクターを予め選択
した細胞系にコトランスフェクトし、両方のマーカーを
含む細胞を捜し出すことによって２つのベクターでコト
ランスフェクトされた細胞系を作製してもよい。かかる
細胞は全てのＨＩＶタンパク質を産生し得る。しかしな
から、ビリオンは産生されるであろうが、全ウィルス配
列に対応するＩＩＮＡはこれらのビリオンに包装されな
いであろう、必要に応じて３つ以上のベクター、例えば
むニーとり一ベクターとりヱベクターとｖｉｕ■エベク
ターとを使用することも可能である。
概していかなる細胞系の使用も可能であるが、好ましく
は哺乳類細胞系、例えばＣＶ−１、Ｈｅ１ａ、Ｒａｊｉ
、ＲＤ、 ＳＩ’１４８０またはＣＩＯ細胞系を使用す
る。
は哺乳類細胞系、例えばＣＶ−１、Ｈｅ１ａ、Ｒａｊｉ
、ＲＤ、 ＳＩ’１４８０またはＣＩＯ細胞系を使用す
る。
ウィルス性細胞産生物の産生量を増加するために５’
ＬＴＲ以外のプロモーターを使用してもよい。
ＬＴＲ以外のプロモーターを使用してもよい。
例えば５’ ＬＴＲに代えて、特定細胞系中でそのコン
トロール下に遺伝子を優先的に発現させるプロモーター
を使用する０例えば、ａｙ−ｉまたはＨｅ１ａ＃胞中で
遺伝子を発現させるにはＣＭＶプロモーターの使用が好
ましいであろう、当業者は、使用される特定の宿主細胞
系に基づいて、使用する特定プロモーターを容易に決定
し得る。
トロール下に遺伝子を優先的に発現させるプロモーター
を使用する０例えば、ａｙ−ｉまたはＨｅ１ａ＃胞中で
遺伝子を発現させるにはＣＭＶプロモーターの使用が好
ましいであろう、当業者は、使用される特定の宿主細胞
系に基づいて、使用する特定プロモーターを容易に決定
し得る。
また、ウィルス性細胞産生物のレベルを増加させるため
に、ＨＩＶ ＬＴＲ及び／またはプロモーターを増強す
るエンハンサ−配列をベクターに付加してもよい、当業
者は宿主細胞系に基づい゛Ｃ特定のエンハンサ−配列を
容易に決定し得る。
に、ＨＩＶ ＬＴＲ及び／またはプロモーターを増強す
るエンハンサ−配列をベクターに付加してもよい、当業
者は宿主細胞系に基づい゛Ｃ特定のエンハンサ−配列を
容易に決定し得る。
ヘルペスウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスのエンハンサ−タ
ンパク質のごとくウィルス産物のレベルを増進するため
にＨＩＶ ＬＴＲに作用するウィルス性エンハンサ−タ
ンパク質または細胞性トランスアクチベーションタンパ
ク質を発現するベクターを付加することも可能である。
ンパク質のごとくウィルス産物のレベルを増進するため
にＨＩＶ ＬＴＲに作用するウィルス性エンハンサ−タ
ンパク質または細胞性トランスアクチベーションタンパ
ク質を発現するベクターを付加することも可能である。
細胞性トランスアクチベーションタンパク質の例は、Ｎ
Ｆ ｘ−Ｂ、ＵＶ光反応性因子及び当業者に公知のその
他のＴ細胞活性化因子である。
Ｆ ｘ−Ｂ、ＵＶ光反応性因子及び当業者に公知のその
他のＴ細胞活性化因子である。
集合させると完全ＨｒＶゲノムを含むようになる一連の
ベクターを使用して、ビリオンがＨＩＶ ＲＮＡを含ま
ないことを除いてはＨＩＶビリオンに等しいビリオンを
産生ずる細胞系を作製できる。ビリオンはこれらの細胞
から容易に得られる。Ｓえば、細胞を培養し上清を採集
する。所望の用途次第では、ビリオン含有上清を使用し
てもよく、またはこれらのビリオンを標準法で上清から
分離してもよい。典型的には、勾配遠心、濾過等で分離
する。
ベクターを使用して、ビリオンがＨＩＶ ＲＮＡを含ま
ないことを除いてはＨＩＶビリオンに等しいビリオンを
産生ずる細胞系を作製できる。ビリオンはこれらの細胞
から容易に得られる。Ｓえば、細胞を培養し上清を採集
する。所望の用途次第では、ビリオン含有上清を使用し
てもよく、またはこれらのビリオンを標準法で上清から
分離してもよい。典型的には、勾配遠心、濾過等で分離
する。
これらの弱毒化されたビリオンはワクチンの製造に極め
て有用である。これらのビリオンはＨＩＶビリオンに対
する抗原性応答を生じさせるために使用でき、また、こ
れらのビリオンの内部がウィルスＲＮ＾を含まないこと
以外はこれらのビリオンは実際の■ＩＶビリオンと同じ
であるので、製造されるワクチンは特に有効である。
て有用である。これらのビリオンはＨＩＶビリオンに対
する抗原性応答を生じさせるために使用でき、また、こ
れらのビリオンの内部がウィルスＲＮ＾を含まないこと
以外はこれらのビリオンは実際の■ＩＶビリオンと同じ
であるので、製造されるワクチンは特に有効である。
これらのビリオンはまた、ビリオンに対する抗体を増産
するために使用でき、得られた抗体を種々の目的、例え
ば、ビリオンのスクリーニング、ビリオンに対する標的
系の開発、等に使用できる。
するために使用でき、得られた抗体を種々の目的、例え
ば、ビリオンのスクリーニング、ビリオンに対する標的
系の開発、等に使用できる。
更に、これらのＨＩＶ包装欠陥細胞系は、所望遺伝子、
例えば異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎ
ｅ）を哺乳類細胞に導入する手段として極めて有用であ
る。
例えば異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎ
ｅ）を哺乳類細胞に導入する手段として極めて有用であ
る。
これらのビリオンは、ＨＩＶによって感染され得る標的
細胞に所望の遺伝子配列を包装するための極めて有効な
手段として使用され得る。このためには、ＨＩｖウィル
スの包装ヌクレオチド（ＨＩＶ包装領域〉に対応する十
分な数のヌクレオチドを含むヌクレオチドセグメントと
所定の遺伝子とを含むベクターを調製し、前記包装配列
と前記所定の遺伝子とを、包装、逆転写、組込み及び遺
伝子発現のための十分な数のＨＩＶ ＬＴＲ由来の配列
に対応する配列と結合させる。使用される包装領域は好
ましくは、少なくとも５′主要スプライス供与部位とｍ
開始コドンの直ぐ上流との間の領域に対応し、より好ま
しくは、５゛主要スプライス供与部位と１＋遺伝子のＢ
ａ１１部位との間の領域に対応する。このベクターを使
用してＨＩＶ包装欠陥細胞の１つをトランスフェクトす
ると、このベクターに由来のヌクレオチド配列がビリオ
ンに包装されるであろう。これらの「包装されたＨＩＶ
、遺伝子は、ＨＩＶによって感染され得る細胞の標的と
なり得る。この形質転換方法は現行の方法よりもはるか
に効率がよいと期待される。更に、遺伝子を適当に選択
することによって、ＨＩＶの感染方法をモニターするこ
とも可能である。
細胞に所望の遺伝子配列を包装するための極めて有効な
手段として使用され得る。このためには、ＨＩｖウィル
スの包装ヌクレオチド（ＨＩＶ包装領域〉に対応する十
分な数のヌクレオチドを含むヌクレオチドセグメントと
所定の遺伝子とを含むベクターを調製し、前記包装配列
と前記所定の遺伝子とを、包装、逆転写、組込み及び遺
伝子発現のための十分な数のＨＩＶ ＬＴＲ由来の配列
に対応する配列と結合させる。使用される包装領域は好
ましくは、少なくとも５′主要スプライス供与部位とｍ
開始コドンの直ぐ上流との間の領域に対応し、より好ま
しくは、５゛主要スプライス供与部位と１＋遺伝子のＢ
ａ１１部位との間の領域に対応する。このベクターを使
用してＨＩＶ包装欠陥細胞の１つをトランスフェクトす
ると、このベクターに由来のヌクレオチド配列がビリオ
ンに包装されるであろう。これらの「包装されたＨＩＶ
、遺伝子は、ＨＩＶによって感染され得る細胞の標的と
なり得る。この形質転換方法は現行の方法よりもはるか
に効率がよいと期待される。更に、遺伝子を適当に選択
することによって、ＨＩＶの感染方法をモニターするこ
とも可能である。
更に、これらのＨＩＶ包装欠陥細胞系は、ｉｎ ｖｉｖ
。
。
及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方の系でＨＩＶのライフサイ
クルの種ｑの時期を研究するために使用され得る。
クルの種ｑの時期を研究するために使用され得る。
その理由は細胞がＨＩｖＭｊ胞性タンパク質を発現する
がＲＮＡを包装しないからである。
がＲＮＡを包装しないからである。
本発明を実施例に基づいてより詳細に以下に説明する。
これらの実施例は本発明の理解を助けるために提示され
たものであり、本発明の範囲がこの実施例に限定される
と解釈してはならない。
たものであり、本発明の範囲がこの実施例に限定される
と解釈してはならない。
ＨＩＶ−１５’ ＬＴＲトＬ！Ｊ１遺伝子トノ間の領域
を第１図に示す、第１図は、後述するベクターｐＨＸＢ
Ａ Ｐｉ中の５′主要スプライス供与部位（ＳＤ）及び
欠失部位を示す、この領域の１９ｂｐの欠失は、Ｆｉｓ
ｈｅｒ、＾、Ｇ。
を第１図に示す、第１図は、後述するベクターｐＨＸＢ
Ａ Ｐｉ中の５′主要スプライス供与部位（ＳＤ）及び
欠失部位を示す、この領域の１９ｂｐの欠失は、Ｆｉｓ
ｈｅｒ、＾、Ｇ。
等、Ｎａｔｕｒｅ ３１６：２６２〜２６５（１９８５
）のプラスミドｐＨＸＢｃ２に含まれる感染性１１１Ｖ
−１プロウイルスクローン中で作製されたものである。
）のプラスミドｐＨＸＢｃ２に含まれる感染性１１１Ｖ
−１プロウイルスクローン中で作製されたものである。
このプラスミドはまた、ＣＯ５−１細胞中で有効な遺伝
子発現を行なわせるＳＶ４０起源の複製を有する。 Ｋ
ｕｎｋｅｌ、 Ｔ、 Ａ、笠、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚ ｍｏｌｏ １５４：３６７〜３８２（１９８
７）に記載のごとき特定部位の突然変異誘発によって突
然変異を誘発し、ＤＮＡ配列決定によってその配列を確
認した（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
子発現を行なわせるＳＶ４０起源の複製を有する。 Ｋ
ｕｎｋｅｌ、 Ｔ、 Ａ、笠、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚ ｍｏｌｏ １５４：３６７〜３８２（１９８
７）に記載のごとき特定部位の突然変異誘発によって突
然変異を誘発し、ＤＮＡ配列決定によってその配列を確
認した（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
７４：５４６３〜５４６７（１９７７））。突然変異し
たプラスミドをｐＨＸＩ３ΔＰ１ト命名した。
たプラスミドをｐＨＸＩ３ΔＰ１ト命名した。
ウィルスタンパク質発現及びビリオン産生に対する突然
変異の効果を鑑定するために、ＤＥＡＥ−デキストラン
法（Ｌｏｐａｔａ等、Ｎｕｃ ｌ 、＾ａｉｄｓ Ｒｅ
ｓ、 １２：５７０７〜５７１７（１９８４） ：Ｑｕ
ｅｅｎ ＆ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、 Ｃｅ旦−３３ニア
４１〜７４８（１９８３）；５ｏｄｒｏｓｋｉ 、 Ｊ
、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：１５４９〜１５５３（
１９８６） 、これらの文献の記載内容は本明細書に含
まれるものとする〕によってｃｏｓ−を細胞にプラスミ
ドｐ！（ＸＢｃ２及びｐ ＩＩ Ｘ ＢΔＰ１をトラン
スフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に
、３ＳＳ−システィンで放射性標識したＣ０５−ＩＨＩ
胞の溶解液と上清とを１９５０１工イズ患者血清で沈降
させた（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ、 Ｊ、等、５ｃｉｅｎｃｅ
２３１、糺座〕、細胞溶解液中で検出されたウィルス
タンパク質の総レベルは、野性型ＨＸＢｃ２を含むベク
ター及び■ＩＶ包装欠陥ＨＸＢΔＰ１を含むベクターの
双方で同等であった。第２Ａ図を参照されたい、第２Ａ
図は、１９５０１患者血清による３ｓＳ標識ウイルスタ
ンパク質の免疫沈降を、ＤＮＡによるトランスフェクシ
ョンなしくレーンｌ及び４〉、または１０μｇのｐＨＸ
Ｂｃ２でトランスフェクション（レーン２及び５）もし
くは１０μｇのｐＨＸＢΔＰ１でトランスフェクション
（レーン３及び６）を行なったＣＯ５−１細胞の溶解液
（レーン１〜３）または上清（レーン４〜６〉で測定し
た結果を示す。
変異の効果を鑑定するために、ＤＥＡＥ−デキストラン
法（Ｌｏｐａｔａ等、Ｎｕｃ ｌ 、＾ａｉｄｓ Ｒｅ
ｓ、 １２：５７０７〜５７１７（１９８４） ：Ｑｕ
ｅｅｎ ＆ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、 Ｃｅ旦−３３ニア
４１〜７４８（１９８３）；５ｏｄｒｏｓｋｉ 、 Ｊ
、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３１：１５４９〜１５５３（
１９８６） 、これらの文献の記載内容は本明細書に含
まれるものとする〕によってｃｏｓ−を細胞にプラスミ
ドｐ！（ＸＢｃ２及びｐ ＩＩ Ｘ ＢΔＰ１をトラン
スフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に
、３ＳＳ−システィンで放射性標識したＣ０５−ＩＨＩ
胞の溶解液と上清とを１９５０１工イズ患者血清で沈降
させた（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ、 Ｊ、等、５ｃｉｅｎｃｅ
２３１、糺座〕、細胞溶解液中で検出されたウィルス
タンパク質の総レベルは、野性型ＨＸＢｃ２を含むベク
ター及び■ＩＶ包装欠陥ＨＸＢΔＰ１を含むベクターの
双方で同等であった。第２Ａ図を参照されたい、第２Ａ
図は、１９５０１患者血清による３ｓＳ標識ウイルスタ
ンパク質の免疫沈降を、ＤＮＡによるトランスフェクシ
ョンなしくレーンｌ及び４〉、または１０μｇのｐＨＸ
Ｂｃ２でトランスフェクション（レーン２及び５）もし
くは１０μｇのｐＨＸＢΔＰ１でトランスフェクション
（レーン３及び６）を行なったＣＯ５−１細胞の溶解液
（レーン１〜３）または上清（レーン４〜６〉で測定し
た結果を示す。
細胞溶解液中で検出されたウィルスタンパク質の総レベ
ルはｐＨＸＢｃ２またはｐＨＸＢΔＰ１でトランスフェ
クトされた細胞の両方で同等であった。ＣＯ５−１ａｌ
胞の上清から沈降したウィルスタンパク質の総レベルは
ｐＨＸＢΔＰ１のほうがｐＨＸＢｃ２よりもやや低かっ
た。 ｐＨＸＢΔＰ１でトランスフェクトされたＣＯ５
−１４ｊｌ胞の上清中で測定された逆転写酵素（ＲＴ）
活性の量は、ｐ）ＩχＢｅ２ベクターでトランスフェク
トされた細胞の上清中で測定された量の６０％であった
（データ示さず）、 ｐＨＸＢΔＰ１でトランスフェク
トされたｃｏｓ−ｉ細胞をトランスフェクションの４８
時間後に固定して電子顕微鏡で観察した。正常ＨＩＶ−
１形態をもち出芽形（ｂｕｄｄｉｎｇ ｆｏｒｍ）を含
むウィルス粒子が観察された。第２Ｂ図はｐ）ＩＸＢＡ
ＰＩでトランスフェクトされたＣＯ５−１細胞の電子顕
微鏡写真を示す。
ルはｐＨＸＢｃ２またはｐＨＸＢΔＰ１でトランスフェ
クトされた細胞の両方で同等であった。ＣＯ５−１ａｌ
胞の上清から沈降したウィルスタンパク質の総レベルは
ｐＨＸＢΔＰ１のほうがｐＨＸＢｃ２よりもやや低かっ
た。 ｐＨＸＢΔＰ１でトランスフェクトされたＣＯ５
−１４ｊｌ胞の上清中で測定された逆転写酵素（ＲＴ）
活性の量は、ｐ）ＩχＢｅ２ベクターでトランスフェク
トされた細胞の上清中で測定された量の６０％であった
（データ示さず）、 ｐＨＸＢΔＰ１でトランスフェク
トされたｃｏｓ−ｉ細胞をトランスフェクションの４８
時間後に固定して電子顕微鏡で観察した。正常ＨＩＶ−
１形態をもち出芽形（ｂｕｄｄｉｎｇ ｆｏｒｍ）を含
むウィルス粒子が観察された。第２Ｂ図はｐ）ＩＸＢＡ
ＰＩでトランスフェクトされたＣＯ５−１細胞の電子顕
微鏡写真を示す。
ウィルス粒子は正常旧ソ−ｌ形態を有する。
１１１Ｖ−１複製に対するｐＨＸＢΔＰｉの突然変異の
効果を鑑定するために、ｐＨＸＢｃ２及びｐＨＸＢΔＰ
１でトランスフェクトされたｃｏｓ−ｔｍ胞からの上清
をｐ過（０，２μ〉し、ＲＴを測定した０等量のＲＴ活
性を含む突然変異ウィルス及び野性型ウィルスの上清を
ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球に添加した。２日おきに培
地を交換しなからＪｕｒｋａｔ培養物を疑似（ｍｏｃｋ
）感染培養物と共に維持した。所定の時期にＪｕｒｋａ
ｔ細胞のアリコートを採取して標識し、１９５０１工イ
ズ患者の血清で免疫沈降させてＨＩＶ−１タンパク質の
発現を鑑定した。第３図は、ＣＯ５−１４ａ胞から得ら
れた上清に接触したＪｕｒｋａｔ Ｔ、１（ｔｌ胞の標
識ウィルスタンパク質の免疫沈降を、ＣＯ５−１４１１
胞を疑似（＋１ｌｏｃｋ）トランスフェクトした場合（
レーン１．４．７．１０．１３及び１６）、ｐｔｒχＢ
ｅ２でトランスフェクトした場合（レーン２．５．８．
１１．１４及び１７〉またはｐｎＸＢΔＰ１でトランス
フェクトした場合（レーン３．６．９．１２．１５及び
１８）の夫々についてＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の溶解物（
レーン１〜３．７〜９及び１３〜１５）または上清（レ
ーン４〜６．１０〜１２及び１６〜１８）で測定した結
果である。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、感染の７日後（レーン
１〜６）、１４日後（レーン７〜１２）及び２１日ｆ＆
（１３〜１８）に検査した。 ｐ）ＩＸＢＡＰＩに接触
したＪｕｒｋａｔ培養物は、野性型ウィルスｐＨＸＢｃ
２に接触した培養物に比較してウィルスタンパク質産生
の顕著な遅れ及びレベルの低下を示した。従って、ｐＨ
Ｘ［ｌΔＰ１でトランスフェクトされたヒトＴリンパ球
中のウィルス複製は、ｐＨＸＢｃ２によって１〜ランス
フエク１〜された細胞に比較して有意に弱められている
ことが判明した。
効果を鑑定するために、ｐＨＸＢｃ２及びｐＨＸＢΔＰ
１でトランスフェクトされたｃｏｓ−ｔｍ胞からの上清
をｐ過（０，２μ〉し、ＲＴを測定した０等量のＲＴ活
性を含む突然変異ウィルス及び野性型ウィルスの上清を
ＪｕｒｋａｔヒトＴリンパ球に添加した。２日おきに培
地を交換しなからＪｕｒｋａｔ培養物を疑似（ｍｏｃｋ
）感染培養物と共に維持した。所定の時期にＪｕｒｋａ
ｔ細胞のアリコートを採取して標識し、１９５０１工イ
ズ患者の血清で免疫沈降させてＨＩＶ−１タンパク質の
発現を鑑定した。第３図は、ＣＯ５−１４ａ胞から得ら
れた上清に接触したＪｕｒｋａｔ Ｔ、１（ｔｌ胞の標
識ウィルスタンパク質の免疫沈降を、ＣＯ５−１４１１
胞を疑似（＋１ｌｏｃｋ）トランスフェクトした場合（
レーン１．４．７．１０．１３及び１６）、ｐｔｒχＢ
ｅ２でトランスフェクトした場合（レーン２．５．８．
１１．１４及び１７〉またはｐｎＸＢΔＰ１でトランス
フェクトした場合（レーン３．６．９．１２．１５及び
１８）の夫々についてＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の溶解物（
レーン１〜３．７〜９及び１３〜１５）または上清（レ
ーン４〜６．１０〜１２及び１６〜１８）で測定した結
果である。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、感染の７日後（レーン
１〜６）、１４日後（レーン７〜１２）及び２１日ｆ＆
（１３〜１８）に検査した。 ｐ）ＩＸＢＡＰＩに接触
したＪｕｒｋａｔ培養物は、野性型ウィルスｐＨＸＢｃ
２に接触した培養物に比較してウィルスタンパク質産生
の顕著な遅れ及びレベルの低下を示した。従って、ｐＨ
Ｘ［ｌΔＰ１でトランスフェクトされたヒトＴリンパ球
中のウィルス複製は、ｐＨＸＢｃ２によって１〜ランス
フエク１〜された細胞に比較して有意に弱められている
ことが判明した。
上記培養物からの上清を０．２μフイルターで沢過し、
１２０００Ｘ９で２０℃で１時間遠心することによって
均等量の逆転写酵素活性をペレット化した。バナジルリ
ボヌクレオチドの存在下にＮＰ４０によってウィルスベ
レットを溶解し、種々の希釈度のウィルスをニトロセル
ロースフィルターにドツトプロトした。ドツトプロット
する前にいくつかのサンプルを水酸化ナトリウム（５Ｍ
、６０℃で１５分間〉で処理した。 Ｍａｎｉａｔｉｓ
、 Ｔ、等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃ
ｏ１ｄ ５ｐｒｉｎＦｉｌ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ（１９８２）、によって記載された方法で、フ
ィルターを、ＨＩＶ−１のムエ逍伝子−及び牡ヱ遺伝子
の配列から成るＤＮＡプローブとハイブリダイズし、洗
浄し、オートラジオグラフにかけた。野性型ＨＸＢｃ２
ウィルスの場合、１００ＯＲＴ単位の濾過上清のプロッ
ト後にＲＮＡに特有のシグナルが検出された。 ）ＩＸ
ＢΔＰＩの場合、５Ｘ １０’ＲＴ単位を有する上清か
らもシグナルが検出できなかった。第４図は、Ｊｕｒｋ
ａｔ培養物の濾過上清のプロット後のＲＮ八へツトプロ
ットを、水酸化ナトリウム非処理（カラム１）及び処理
（カラム２）の場合の夫々ニツイて示す、上清は、５Ｘ
１０’ｃｐｍのＨＸＢΔＰｉ（Ａ列）、５Ｘ １０’
ｃｐｍの）ｌＸＢｃ２（Ｂ列〉、Ｉ Ｘ １０’ｃｐｍ
ＨＸＢｃ２（Ｃ列）のＲＴ活性を含んでいた。にれらの
結果は、本発明の包装欠陥ウィルスベクターでトランス
フェクトされた細胞においてウィルス特異的ＲＮ＾がビ
リオンに包装される効率は、野性型ウィルスの２％未満
であることを示す。
１２０００Ｘ９で２０℃で１時間遠心することによって
均等量の逆転写酵素活性をペレット化した。バナジルリ
ボヌクレオチドの存在下にＮＰ４０によってウィルスベ
レットを溶解し、種々の希釈度のウィルスをニトロセル
ロースフィルターにドツトプロトした。ドツトプロット
する前にいくつかのサンプルを水酸化ナトリウム（５Ｍ
、６０℃で１５分間〉で処理した。 Ｍａｎｉａｔｉｓ
、 Ｔ、等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃ
ｏ１ｄ ５ｐｒｉｎＦｉｌ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ（１９８２）、によって記載された方法で、フ
ィルターを、ＨＩＶ−１のムエ逍伝子−及び牡ヱ遺伝子
の配列から成るＤＮＡプローブとハイブリダイズし、洗
浄し、オートラジオグラフにかけた。野性型ＨＸＢｃ２
ウィルスの場合、１００ＯＲＴ単位の濾過上清のプロッ
ト後にＲＮＡに特有のシグナルが検出された。 ）ＩＸ
ＢΔＰＩの場合、５Ｘ １０’ＲＴ単位を有する上清か
らもシグナルが検出できなかった。第４図は、Ｊｕｒｋ
ａｔ培養物の濾過上清のプロット後のＲＮ八へツトプロ
ットを、水酸化ナトリウム非処理（カラム１）及び処理
（カラム２）の場合の夫々ニツイて示す、上清は、５Ｘ
１０’ｃｐｍのＨＸＢΔＰｉ（Ａ列）、５Ｘ １０’
ｃｐｍの）ｌＸＢｃ２（Ｂ列〉、Ｉ Ｘ １０’ｃｐｍ
ＨＸＢｃ２（Ｃ列）のＲＴ活性を含んでいた。にれらの
結果は、本発明の包装欠陥ウィルスベクターでトランス
フェクトされた細胞においてウィルス特異的ＲＮ＾がビ
リオンに包装される効率は、野性型ウィルスの２％未満
であることを示す。
これらの結果は、ウィルスＲＮＡをビリオンに包装する
ためにはＨＩＶ−１の５’ ｔ、ＴＲとｏ工遺伝子との
間の領域が重要であることを示す、この領域の突然変異
はトランスフェクション後のタンパク質及びビリオン粒
子を産生ずるプロウィルスの能力に対して最小の影響を
示すが、ビリオンＲＮ＾のレベルを顕著に低下させてヒ
トＣＤ４陽性リンパ球細胞系におけるウィルス複製を弱
める。 ）ＩＩＶ−１は培養されたＣＤ４陽性細胞中で
無細胞伝達または細胞間伝達によって複製される。後者
は感染細胞と非感染細胞との接触を含む（Ｆｉｓｈｅｒ
、＾、Ｇ、笠、Ｎａｔｕｒｅ３１６：２６２〜２６５（
１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ、 Ｊ、等、５ｃｉｅｎ
ｃｅ２３１：１５４９〜１５５３（１９８Ｂ）；５ｔｒ
ｅｂｅｌ、 Ｋ、等、Ｎａｔｕｒｅ３２８ ニア２８〜
７３０ （１９８７）：］。
ためにはＨＩＶ−１の５’ ｔ、ＴＲとｏ工遺伝子との
間の領域が重要であることを示す、この領域の突然変異
はトランスフェクション後のタンパク質及びビリオン粒
子を産生ずるプロウィルスの能力に対して最小の影響を
示すが、ビリオンＲＮ＾のレベルを顕著に低下させてヒ
トＣＤ４陽性リンパ球細胞系におけるウィルス複製を弱
める。 ）ＩＩＶ−１は培養されたＣＤ４陽性細胞中で
無細胞伝達または細胞間伝達によって複製される。後者
は感染細胞と非感染細胞との接触を含む（Ｆｉｓｈｅｒ
、＾、Ｇ、笠、Ｎａｔｕｒｅ３１６：２６２〜２６５（
１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ、 Ｊ、等、５ｃｉｅｎ
ｃｅ２３１：１５４９〜１５５３（１９８Ｂ）；５ｔｒ
ｅｂｅｌ、 Ｋ、等、Ｎａｔｕｒｅ３２８ ニア２８〜
７３０ （１９８７）：］。
以上の開示に基づき、記載の実施例の多数の変更が本発
明の範囲内で可能であること、本発明の範囲及び思想は
特許請求の範囲のみによって限定されることは当業者に
容易に理解されよう。
明の範囲内で可能であること、本発明の範囲及び思想は
特許請求の範囲のみによって限定されることは当業者に
容易に理解されよう。
第１図は、本発明の１つの実施態様であるベクターｐＨ
ＸＢΔＰ１中の、ＨＩＶ−１ゲノムノ５°ＬＴＲカらｇ
ａｇ開始コドンまでの５°主要スプライス供与部位（Ｓ
Ｄ）及び欠失部位を示す概略図、第２ａ図は、ＣＯ５−
１ａ胞からの３５Ｓ標識ウイルスタンパク質のエイズ患
者血清による免疫沈降を示すオートラジオグラム、第２
ｂ図はｐＨＸＢΔＰ１でＣＯＳ〜１ｍ胞にトランスフェ
クトされた正常１１１Ｖ−１形態のビリオン粒子を示す
電子顕′Ｉｒｉ鏡写真、第３図は、トランスフェクトま
たは疑似（ｎ＋ｏｃｋ） ）ランスフエクトされたＣＯ
５−１細胞の上清に接触したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の溶
解液または上清からの標識ウィルスタンパク質の免疫沈
降を示すオートラジオグラム、第４図４ｆＲＮ＾ドツト
プロツトテストである。
ＸＢΔＰ１中の、ＨＩＶ−１ゲノムノ５°ＬＴＲカらｇ
ａｇ開始コドンまでの５°主要スプライス供与部位（Ｓ
Ｄ）及び欠失部位を示す概略図、第２ａ図は、ＣＯ５−
１ａ胞からの３５Ｓ標識ウイルスタンパク質のエイズ患
者血清による免疫沈降を示すオートラジオグラム、第２
ｂ図はｐＨＸＢΔＰ１でＣＯＳ〜１ｍ胞にトランスフェ
クトされた正常１１１Ｖ−１形態のビリオン粒子を示す
電子顕′Ｉｒｉ鏡写真、第３図は、トランスフェクトま
たは疑似（ｎ＋ｏｃｋ） ）ランスフエクトされたＣＯ
５−１細胞の上清に接触したＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の溶
解液または上清からの標識ウィルスタンパク質の免疫沈
降を示すオートラジオグラム、第４図４ｆＲＮ＾ドツト
プロツトテストである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）ＨＩＶゲノムに対応する、機能性ＨＩＶタンパク
質を発現するための十分な数のヌクレオチド即ちＨＩＶ
ヌクレオチドを含むが、ＨＩＶゲノムの５′主要スプラ
イス供与部位と￥ｇａｇ￥遺伝子との間のヌクレオチド
に対応する、ＨＩＶＲＮＡを有効に包装するための十分
な数のヌクレオチド即ちＨＩＶ包装ヌクレオチドを含ま
ないこと、及び、 （ｂ）ＨＩＶヌクレオチドの上流にプロモーターを含む
ことを特徴とするベクター。 （２）プロモーターがＨＩＶＬＴＲであることを特徴と
する請求項１に記載のベクター。（３）プロモーターが
、特定細胞中で遺伝子産物を優先的に発現させるプロモ
ーターであることを特徴とする請求項１に記載のベクタ
ー。 （４）プロモーターがＣＭＶプロモーターであることを
特徴とする請求項３に記載のベクター。 （５）ベクターに含まれないＨＩＶ包装ヌクレオチドが
、５′主要スプライス供与部位の下流から￥ｇａｇ￥遺
伝子開始コドンの約５塩基上流までのヌクレオチド配列
であることを特徴とする請求項１に記載のベクター。 （６）ベクターに含まれないＨＩＶ包装ヌクレオチドが
、５′主要スプライス供与部位の約９塩基下流から￥ｇ
ａｇ￥遺伝子開始コドンの約１４塩基上流までのヌクレ
オチド配列であることを特徴とする請求項１に記載のベ
クター。 （７）ベクターに含まれないＨＩＶ包装ヌクレオチドが
、配列ＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＣＣＣＡである
ことを特徴とする請求項１に記載のベクター。 （８）ＨＩＶゲノムが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳ
ＩＶから成るグループから選択されることを特徴とする
請求項１に記載のベクター。 （９）ＨＩＶゲノムがＨＩＶ−１ゲノムであることを特
徴とする請求項１に記載のベクター。 （１０）ＨＩＶゲノムがＨＩＶ−１ゲノムであることを
特徴とする請求項７に記載のベクター。 （１１）請求項１に記載のベクターによって形質転換さ
れた予め選択された細胞系を含むことを特徴とするＨＩ
Ｖ包装欠陥細胞系。 （１２）（ａ）予め選択された細胞系を少なくとも１つ
の請求項１に記載のベクターで形質転換させることを包
含するＨＩＶ包装欠陥細胞系の製造方法。 （１３）予め選択された細胞系が哺乳類細胞であること
を特徴とする請求項１２に記載の方法。 （１４）少なくとも２つのベクターによって細胞を形質
転換させる段階を含み、前記２つのベクターは集合的に
、機能性ＨＩＶ、￥ｇａｇ￥、￥ｐｏｌ￥、￥ｅｎｖ￥
及び調節産物を発現させるためのＨＩＶヌクレオチドを
含むが、各ベクター単独ではＨＩＶ￥ｇａｇ￥、￥ｐｏ
ｌ￥、￥ｅｎｖ￥及び調節産物の全部を発現させるため
のＨＩＶヌクレオチドを含まないこと、及び、前記ベク
ターが、ＨＩＶゲノムの５′主要スプライス供与部位と
￥ｇａｇ￥遺伝子との間のヌクレオチドに対応する、Ｈ
ＩＶＲＮＡを有効に包装するための十分な数のヌクレオ
チ ドを含まないことを特徴とする請求項１２に記載の方法
。 （１５）細胞を２つのベクターによって形質転換させ、
１つのベクターが￥ｇａｇ￥開始コドンの直ぐ上流から
￥ｅｎｖ￥遺伝子配列の直ぐ上流までのヌクレオチド配
列を含み、第２のベクター￥ｇａｇ￥遺伝子配列の下流
に機能性￥ｅｎｖ￥配列を含むヌクレオチド配列を含む
ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。 （１６）各ベクターが異なるマーカー遺伝子配列を含む
ことを特徴とする請求項１４に記載の方法。 （１７）請求項１４の方法で形質転換された安定な細胞
系。 （１８）請求項１７に記載の細胞系を培養し、細胞系か
ら産生されたビリオンを採集し、所定の動物またはヒト
宿主にビリオンを注射してビリオンに対する抗体を増産
することを特徴とする抗ＨＩＶ抗体の製造方法。 （１９）請求項１７に記載の細胞系を培養し、ワクチン
として使用するために細胞系から産生されたビリオンを
採集することを特徴とするＨＩＶワクチンの製造方法。 （２０）（ａ）ＨＩＶＲＮＡを包装するための十分な数
のヌクレオチド即ちＨＩＶ包装配列に対応するヌクレオ
チド配列の下流に予め選択された遺伝子に対応するヌク
レオチド配列を含むベクターを請求項１７に記載の細胞
系にトランスフェクションする段階を含み、前記ベクタ
ー中では、ＨＩＶ包装配列によって包装されるべきＨＩ
ＶＬＴＲに対応する十分な数のヌクレオチド即ちＨＩＶ
ＬＴＲ配列が、前記予め選択された遺伝子及び前記ＨＩ
Ｖ包装配列の双方に結合されており、ＨＩＶ包装配列と
ＨＩＶＬＴＲ配列とがＨＩＶヌクレオチドと同じＨＩＶ
ゲノムに対応しており、更に、 （ｂ）段階（ａ）で形質転換された細胞系を培養し、（
ｃ）段階（ｂ）の細胞系から産生されたビリオンを採集
し、 （ｄ）段階（ｃ）で得られたビリオンを所定の標的哺乳
類細胞と接触させることを特徴とする遺伝子を哺乳類細
胞に移入する方法。 （２１）ＨＩＶ包装配列のヌクレオチドが、５′主要ス
プライス供与部位から￥ｇａｇ￥遺伝子のＢａｌＩ部位
までのヌクレオチドであり、ＨＩＶＬＴＲ配列が完全な
ＨＩＶＬＴＲに対応することを特徴とする請求項２０に
記載の方法。 （２２）標的哺乳類細胞が組織培養で増殖されることを
特徴とする請求項２０に記載の方法。 （２３）標的哺乳類細胞がヒトまたは動物宿主に局在し
ていることを特徴とする請求項２０に記載の方
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30766489A | 1989-02-06 | 1989-02-06 | |
| US307664 | 1989-02-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0361492A true JPH0361492A (ja) | 1991-03-18 |
| JP3140757B2 JP3140757B2 (ja) | 2001-03-05 |
Family
ID=23190695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02025911A Expired - Lifetime JP3140757B2 (ja) | 1989-02-06 | 1990-02-05 | パッケージング欠陥ｈｉｖプロウイルス、細胞系及びその使用 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0386882B1 (ja) |
| JP (1) | JP3140757B2 (ja) |
| AT (1) | ATE111529T1 (ja) |
| CA (1) | CA2009403C (ja) |
| DE (1) | DE69012379T2 (ja) |
| DK (1) | DK0386882T3 (ja) |
| ES (1) | ES2063914T3 (ja) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5716826A (en) * | 1988-03-21 | 1998-02-10 | Chiron Viagene, Inc. | Recombinant retroviruses |
| US5591624A (en) * | 1988-03-21 | 1997-01-07 | Chiron Viagene, Inc. | Retroviral packaging cell lines |
| DE69032841T2 (de) * | 1989-01-23 | 1999-05-12 | Chiron Corp., Emeryville, Calif. | Rekombinante zellen für therapien von infektionen und hyperprolieferative störungen und deren herstellung |
| EP0487587A1 (en) * | 1989-08-18 | 1992-06-03 | Chiron Corporation | Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells |
| GB8923123D0 (en) * | 1989-10-13 | 1989-11-29 | Connaught Lab | A vaccine for human immunodeficiency virus |
| EP0496794A1 (en) * | 1989-10-16 | 1992-08-05 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Non-infectious hiv-1 particles and uses therefor |
| US5861282A (en) * | 1989-10-16 | 1999-01-19 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Non-infectious HIV particles and uses therefor |
| CA2068713A1 (en) * | 1989-11-20 | 1991-05-21 | Omar K. Haffar | Non-replicating recombinant-made retroviral particles used as antiviral agents and immunogens |
| CA2092195C (en) * | 1990-09-21 | 2000-04-18 | Douglas J. Jolly | Retroviral packaging cell line |
| JP3895366B2 (ja) | 1990-09-25 | 2007-03-22 | キャンタブ ファーマシューティカルズ リサーチ リミティド | ウィルス ワクチン |
| US5837261A (en) * | 1990-09-25 | 1998-11-17 | Cantab Pharmaceuticals Research Limited | Viral vaccines |
| US7374768B1 (en) | 1990-09-25 | 2008-05-20 | Xenova Research Limited | Viral vaccines |
| GB9107631D0 (en) * | 1991-04-10 | 1991-05-29 | British Bio Technology | Proteinaceous particles |
| CN1062601C (zh) * | 1992-03-24 | 2001-02-28 | 剑桥药物研究有限公司 | 病毒疫苗 |
| US7223411B1 (en) | 1992-07-31 | 2007-05-29 | Dana-Farber Cancer Institute | Herpesvirus replication defective mutants |
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