JPH0364519B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はラツトの唾液腺、殊に耳下腺から得ら
れる新規な歯牙体液輸送促進活性をもつペプチド
及びその製造方法に関する。 ウサギの視床下部抽出物を耳下腺摘出ラツトに
投与すると、歯牙の歯髄から象牙質造歯細胞細管
への体液輸送が認められなくなるが、該視床下部
抽出物をブタの耳下腺組織抽出物と共に投与する
と体液輸送が認められることは既に明らかにされ
ている。このことから、視床下部因子は耳下腺に
直接作用し、歯牙の歯髄から象牙質造歯細胞細管
への体液輸送の促進は耳下腺に依存すると考えら
れている。Steinmanらはカリエス誘発性物質と
ラツトに対する齲蝕症の発生についての研究を進
め、歯牙体液輸送を促進させる物質をブタ耳下腺
より分離し、分子量8100、アミノ酸組成がグリシ
ン46％、プロリン28％であり、且つ等電点PH7.5
で紫外部吸収をほとんどもたないタンパク質であ
ることを明らかにしている〔Endocrinology，
83、807（1986）；Endocrinology，106、1994
（1980）〕。さらに、Steinmanらはこの活性物質を
ラツトに投与すると、歯牙への栄養物の補給が向
上し、歯牙発育、歯構造強化などが促進され、齲
蝕発生率が抑制することも報告している。 本発明者はラツトの唾液腺、特に耳下腺にも、
ブタの場合と同様に、歯牙体液輸送を促進する作
用をもつ物質（以下「歯牙体液輸送促進物質」と
いう）が存在するであろうとの予想の下に、ラツ
トの耳下腺中に該物質が存在するかどうか研究を
行なつた結果、該物質の存在が確認され、その物
質の分離精製についてさらに研究を重ねた結果、
極めて高純度の歯牙体液輸送促進物質を単離でき
る方法を見い出し、その理化学点性質を解明する
に至つた。 本発明において単離された歯牙体液輸送促進物
質は、以下に示す如き理化学的性質を有するペプ
チドである。 (1) 性状：白色粉末 (2) アミノ酸組成： 【表】 す。
なお上記のアミノ酸組成は、供試ペプチドを
6N塩酸で110℃、24時間加水分解し、アミノ酸
自動分析計（樹脂：日立カスタム＃2611、ワン
カラム法）を用いて分析したものである。ただ
し、トリプトフアン（Trp）は200μｇのデンプ
ンを含む2.5N水酸化ナトリウムで110℃、20時
間加水分解して同様に求めた。 (3) Ｎ末端アミノ酸配列：Gly−Val−Ile−Ala
−Trp− Ｎ−末端アミノ酸配列の決定はGrayらの方
法〔Biochem.J.，89、379（1963）参照〕に従
つた。すなわち、Edman分解によりＮ末端か
ら１個アミノ酸をはずし、新しく生じた末端ア
ミノ酸をダンシル法により決定する。この操作
を順次繰り返し、Ｎ末端アミノ酸を決定した。 (4) Ｃ末端アミノ酸配列：−Aag−Lys−Asx−
Ser−Thr−Ala−Gly Ｃ末端アミノ酸配列は供試ペプチドをカルボ
キシペプチダーゼＹで分解して、ペプチドのＣ
末端からアミノ酸を１個ずつはがして順次その
アミノ酸の構造を決定するカルボキシペプチド
ダーゼ法〔J.Biochem.77、69（1975）参照〕に
よる分析によりＣ末端のアミノ酸配列を決定し
た。 (5) 分子量：約2200 本ペクチドの分子量は、８％エタノールを含
む0.2Nクエン酸ナトリウム緩衝液、PH3.2を溶
出液としてSephadex（登録商標）Ｇ−25
（Pharmacia Fine Chemicals社製）ゲル過
により測定した。そのときの溶出液量と分子量
の関係をプロツトしたグラフを第１図に示す。 (6) 紫外線吸収スペクトル：極大吸収波長
（λ_nax）＝278nｍ 上記極大吸収波長は、試料0.80mgを生理食塩
液１mlに溶解したものにつき、光路長１cmで、
島津210型分光光度計を用いて測定した値であ
る。 (7) 溶解性：水及び生理食塩液に可溶。アセトン
に不溶。 (8) 呈色反応：ニンヒドリン反応 陽性 ビユーレツト反応 陽性 坂口反応 陽性 (9) 分配係数（Kaυ値） ゲル過におけるゲル層と液層との間の分配
係数であり、下記式により算出される。 Kaυ＝Ve−Vo／Vt−Vo Vt＝ゲルベツドの総容積 Ve＝溶出液量 Vo＝ゲル粒子外部の溶媒量 ゲル過材としてSephadex（登録商標）Ｇ−
25（Pharmacia Fine Chemicals社製）を使用
し且つ溶出液としてPH7.2の0.05Mリン酸緩衝
液を用いた時の、本発明の活性ペプチドのKaυ
値は約0.44である。 前述したように、Steinmanらがブタの耳下腺
から抽出した歯牙体液輸送促進物質は、SDS−ポ
リアクリルアミドゲルのデイスク電気泳動法によ
り測定した分子量が8100、アミノ酸組成がグリシ
ン46％、プロリン28％であり、且つ等電点がPH
7.5で紫外線吸収スペクトルに極大吸収波長
（λ_nax）か存在しない物質であるが、本発明のペ
プチドの理化学的性質は、少なくとも分子量、ア
ミノ酸組成及び紫外部吸収特性がブタの耳下腺か
ら抽出された歯牙体液輸送促進物質と明らかに異
なつており、従来の文献に未載の新規な物質であ
ると考えられる。 なお、哺乳動物の唾液腺、特に耳下腺には唾液
腺ホルモンが含まれ、この唾液腺ホルモンはタン
パク質であり、硬組織の発育促進作用、間葉性組
織賦活作用、血清カルシウム低下作用、白血球増
加作用等の種々の優れた生理活性を有し、医薬と
して広範に使用されている。しかし、この唾液腺
ホルモンはラツト象牙質造歯細管への体液輸送に
対して何ら作用を示さないことを本発明者は確認
している。従つて、ラツト耳下腺に存在する歯牙
体液輸送促進物質は唾液腺ホルモンとは作用の上
からも異つた物質であることは明らかである。 すなわち、本発明のペプチド及び唾液腺ホルモ
ンの歯牙体液輸送促進活性を次の方法で測定し
た： 生後５週令のラツトに蛍光物質としてアクリフ
ラビン塩酸塩を体重100ｇに対して５mgの割合で
腹腔内投与した後、直ちに本発明のペプチド又は
唾液腺ホルモンを0.1mlの液量で静脈内投与し16
分後に断頭した。断頭後１分以内に下顎を摘出し
凍結させたミクロトームを用いて咬合面に垂直な
臼歯切断を調整し、蛍光顕微鏡下に象牙質造歯細
胞細管への蛍光物質の移行を観察した。その結果
移行が充分に行われたものを陽性（＋）、移行が
不充分または全く行われなかつたものを陰性
（−）とする。 ラツトの耳下腺より抽出した本発明の歯牙体液
輸送促進ペプチドと唾液腺ホルモンの歯牙への体
液輸送促進効果の比較結果を下記第１表に示す。 【表】 本発明の歯牙体液輸送促進物質はラツトの唾液
腺、例えば耳下腺を原料として以下に述べる工
程、すなわち、 (a) ラツトの唾液腺の水性抽出液をPH4.5〜5.5の
酸性にし、生ずる沈殿を除去する工程、 (b) 得られる上清を分子篩にかけて分子量が約
30000以上の成分を除去した後、再び分子篩に
かけて分子量が1000〜3500の画分を捕集する工
程、及び (c) 該画分を陽イオン交換及び二次元紙クロマ
トグラフイー・高圧電気泳動に付して分子量が
約2200の画分を捕集する工程 を経て製造することができる。 ラツトの唾液腺の腺体の水抽出はそれ自体公知
の方法により行なうことができる。例えば、ラツ
トの唾液腺から採取した新しい腺体を細かく切り
刻んだものに、約10倍量の冷却したアセトンを加
え、冷却しながら１時間撹拌した後過すること
により腺体を脱脂し、次に風乾及び減圧乾燥を順
次行ない、アセトン乾燥粉末を得る。このアセト
ン乾燥粉末に約10倍容量の水を加え、アルカリ例
えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水
素ナトリウム等によりPHを中性付近い（PH6.5〜
7.5）、好ましくはPH7.0に調整した後、撹拌しな
がら抽出を行なう。撹拌は一般に冷却下、好まし
くは０〜５℃において適宜防腐剤（例えばトルエ
ン）を加え、数時間、通常２〜３時間行なうのが
有利である。この撹拌懸濁液を遠心分離処理（例
えば10000rpmで20分間）に付し、水性抽出液を
分離する。 一方、残渣はそのまま廃棄することができ、或
いは必要に応じて、該残渣について上記と同じ抽
出操作を所望回数（通常はさらに１、２回）繰り
返し行なつてもよい。 残渣が除去された水性抽出液のPHを無機酸例え
ば塩酸により4.5〜5.5、好ましくは5.0に調整する
と沈殿が生ずるが、これを冷却下（好ましくは冷
蔵庫中；約０〜0.5℃に保持）に数時間乃至１日
静置して沈殿をさらに完結せしめることが望まし
い。 該沈殿を遠心分離（例えば10000rpmで15分間）
し、その上清液を分離回収する。 回収した上清液は、必要に応じて減圧濃縮等の
手段により適当な量、例えば約10分の１の量に濃
縮した後、限外過膜または限外過フアイバー
などの平板膜または中空繊維膜を用いる分子篩操
作に付す。限外過膜または限外過フアイバー
を用いる場合、分画操作は、分画分子量5000〜
50000、好ましくは約30000の限外過膜または限
外過フアイバーを用いる限外過によつて行な
うことができる。限外過膜としては、例えば、
Diaflo（登録商標）PM−30（保持限界：30000、
Amicon社製）などを用いることができ、また、
限外過フアイバーとしては、例えばHollow
Fiber HIP30（保持限界：30000、Amicon社製）
などを用いることができる。 分離は限外過膜を用いる場合、上記で得られ
た上清液を例えば、Diaflo PM−30を装填した
202型撹拌式セル（Amicon社製）に入れ、２
Kg／cm³の窒素ガスで加圧して過することにより
分画することができる。また、限外過フアイバ
ーを用いる場合は、上記で得られた上清液を例え
ば、DC４型限外過装置（Amicon社製）に装
填したHollow Fiber中を高速で循環させること
により、限外過膜を用いた場合と同様の画分を
得ることができる。 かくして、分画分子量約30000以上の成分が除
去された活性成分含有液を得ることができる。 このように得られた分画分子量約30000以下の
活性成分含有画分は適宜減圧濃縮し、Sephadex
（登録商標）Ｇ−10カラムで脱塩した後、再び減
圧濃縮する。次にこの濃縮物を水、塩類緩衝液、
有機溶媒及びこれ等の混合物などを溶出液として
Sephadex（登録商標）LH−20カラムクロマトグ
ラフイーで分画し、分画分子量が1000〜3500の活
性画分を捕集する。このようにして得られた活性
成分含有画分は陽イオン交換樹脂に吸着させた
後、活性部分の分離溶出を行なう。ここで使用し
うる陽イオン交換樹脂としてはスチレン−ジビニ
ルベンゼン系強酸性陽イオン交換樹脂、例えば日
立カスタムイオン交換樹脂2611、Bio Rad
Aminex（登録商標）Ａ−９などが挙げられる。
陽イオン交換樹脂を用いる上記活性成分含有画分
の吸着は、例えば、弱酸性の緩衝液、好ましくは
クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液又は酢酸緩衝液
に溶解した該活性成分含有画分を陽イオン交換樹
脂と接触させて目的物を吸着させた後、塩化ナト
リウム、塩化カリウムなどの無機塩を加えてイオ
ン濃度を高めた上記緩衝液、又は水酸化ナトリウ
ム、水酸化ナトリウムなどの強アルカリ性溶液を
用いて溶出させることによつて精製することがで
きる。 このようにして得られた活性溶出液画分は
Sephadex（登録商標）Ｇ−10カラムで脱塩した
後、二次元紙クロマトグラフイー・高圧電気泳
動法に付して分画することにより、さらに精製す
ることができる。二次元紙クロマトグラフイ
ー・高圧電気泳動法は紙を支持体として用い、
最初にクロマトグラフイーをついで高圧電気泳動
を行ない、一枚の紙上で二次元的に試料を展開
させることによりペプチドを分離する方法であ
り、いわゆるフインガープリント法と称するもの
である。この方法により分子量がほぼ同じであつ
てもアミノ酸配列の異なつたペプチドを相互に分
離することが可能となる。 第一次元としての紙クロマトグラフイーは通
常の方法に従い、上記活性溶出液を紙に添加し
てから展開溶媒で約20時間展開することにより行
なうことができる。展開は上昇法または下降法の
いずれも用いることができる。溶媒としては例え
ば水、メタノール、エタノールなどのアルコール
類、フエノール、ピリジン、酢酸エチル、アセト
ン、ジエチルエーテル、クロロホルム、ｎ−ヘキ
サンなどが単独でまたは混合して用いられる。ま
た、水と混和しないブタノールなどの溶媒に酢酸
ピリジンなどを混合した水溶液を飽和させて用い
ることもできる。この展開で種々の物質を相互に
分離することができる。 次に、第二次元としての高圧電気泳動は上記の
一次元的に展開された紙に対して、第一次元の
展開と直角の方向に電場をかけることにより、通
常の方法で実施することができる。高圧電気泳動
に用いる緩衝液としては例えば発揮性の緩衝液で
あるピリジン−酢酸−水系、PH４〜７などを用い
ることができ、これらの緩衝液は乾燥することに
より除くことができるので、紙から活性物質を
抽出する場合に極めて都合がよい。この高圧電気
泳動処理により得られた抽出液は、分画分子量
500の限外過膜、例えばYC05（Amicon社製）
Sephadex（登録商標）Ｇ−10などを用いたゲル
過、または分画分子量1000のチユーブ、例えばス
ペクトラポア（登録商標）７（Spectrum
Medical Industries社製）を用いた透析などの操
作に付し、分子量が約2200の画分を捕集し、適宜
脱塩したのち凍結乾燥することにより、目的とす
る歯牙体液輸送促進活性をもつペプチドを得るこ
とができる。 かくして得られる本発明の歯牙体液輸送促進活
性ペプチドは齲蝕の予防、治療に有用である。即
ち、齲蝕は微生物の作用により生じた歯垢中に、
同じく微生物の代謝物である乳酸が滞留すること
により酸腐蝕が進み、エナメル層のみならず象牙
質へ齲蝕が進行する。齲歯の発生に関する要因は
多岐にわたるが最終的に象牙質まで齲蝕された場
合においても象牙は第二象牙質を形成することに
より防御する能力を備えている。この際、象牙質
の機能的増殖において栄養源の供給は必須なもの
であり、歯牙体液輸送を亢進させる物質が第二象
牙質の形成に対して促進的に作用すると考えられ
る。 本発明に従う歯牙体液促進活性ペプチドをかか
る齲蝕防止剤または治療剤などとして用いるに
は、医薬製剤調製液（注射用蒸留水、生理食塩
液、燐酸緩衝液、グリシン緩衝液、ベロナール緩
衝液等）に本発明に従う歯牙体液促進活性ペプチ
ドを添加溶解させ、注射液とすることができる。
さらに、この注射液に成形性を高めるために補助
剤として例えば塩化ナトリウム、グリシン、乳
糖、マンニツト、ソルビツト、シヨ糖、水解でん
ぷん、デキストラン等の補助剤を加え、凍結乾燥
製剤とすることもできる。さらに、通常使用して
いる歯みがき剤に本発明に伴う歯牙体液輸送促進
性ペプチドを加え、齲蝕防止剤及び治療剤として
使用することもできる。 さらに、本ペプチドは歯牙のみならず、生体の
硬組織全般、特に骨化形成の促進を期待すること
ができる。 次に実施例により本発明をさらに説明する。 実施例 １ ラツト耳下腺100ｇをミンチし、１の冷却し
たアセトンを加え、冷却下に１時間撹拌後過
し、余分のアセトンを風乾及び減圧乾燥により除
去し、アセトン乾燥粉末を得た。このアセトン乾
燥粉末に１の水に加えて２時間撹拌抽出した
後、10000rpmで15分間遠心分離し、沈殿と上清
に分離した。沈殿に300mlの水を加えて抽出、遠
心分離を繰返し、得られた上清をさきの分と合わ
せ、1N塩酸を加えてPH5.0に調製した。 析出した沈殿を10000rpmで15分間遠心分離除
去し、次いで上清を1N水酸化ナトリウムでPH7.0
とした。この溶液を100mlになるまで減圧濃縮し、
202型撹拌式セル過装置（Amicon社製）を用
い、分画分子量30000の限外過膜PM−30
（Amicon社製）で過し、得られた過液を再
び減圧濃縮した。この濃縮液を0.05M酢酸緩衝
液、PH5.8で平衡化したSephadex（登録商標）Ｇ
−10カラム（1.5×90cm）で脱塩溶出した。この
溶出液を再び減圧濃縮してからエタノール−酢酸
−水（75：10：95）溶液で平衡化したSephadex
（登録商標）LH−20カラム（3.8×100cm）でゲル
過し、分画分子量1000〜3500の活性画分を集め
た。 次いで該活性画分を0.2Nクエン酸ナトリウム
緩衝液、PH3.25で平衡化した日立カスタム＃2611
カラム（0.9×55cm）に添加した後、0.2Nクエン
酸ナトリウム緩衝液、PH4.25及び1.2Nクエン酸ナ
トリウム緩衝液、PH5.28で順次洗浄し、不純物を
除去した。最後に、0.2N水酸化ナトリウムでカ
ラムから溶出し、活性溶出画分を集めた。 次に、この活性溶出画分を前記と同様に脱塩、
減圧濃縮した後、東洋紙No.50（42×45cm）に添
加し、下降法によりｎ−ブタノール−ピリジン−
酢酸−水（15：10：３：12）溶液を溶媒として20
時間展開した。次に、ピリジン−酢酸−水（10：
0.4：90）溶液を電極液として用い150ｍＡで90分
間電気泳動してから紙上の活性部分を抽出し
た。この活性抽出液を分画分子量500の限外過
膜YC05（Amicon社製）で脱塩した後凍結乾燥
し、目的とする歯牙体液輸送促進活性をもつペプ
チド0.45mgを得た。 本ペプチドはポリアクリルアミドゲルのデイス
ク電気泳動で単一バンドを示し、Sephadex（登録
商標）Ｇ−25を用いたゲル過により測定した分
子量は約2200、Edman分解によるＮ−末端のア
ミノ酸配列はGly−Val−Ile−Ala−Trp−であ
り、カルボキシペプチダーゼＹによるＣ−末端の
アミノ酸配列は−Arg−Lys−Asx−Ser−Thr−
Ala−Glyであつた。また、6N塩酸を用い110℃
で24時間加水分解した結果によるアミノ酸分析値
は下記に示す通りであつた。 アミノ酸組成（１分子当りの残基数）： Asx(2)、Thr(1)、Ser(1)、Glx(3)、Pro(1)、Gly
(3)、Ala(2)、Val(1)、Ile(1)、Leu(1)、Lys(1)、His
(1)、Arg(1)、Trp(1) 該精製標品はラツトに対して30nｇ／Kgi.υ.で歯
牙への体液輸送促進活性を示した。

【図面の簡単な説明】

第(1)図はSephadex（登録商標）Ｇ−25カラム
（0.9×156cm）を用いて測定した本発明のペプチ
ドの分子量を求めた図を表わし、縦軸は
SephadexG−25カラム（0.9×156cm）を用いた時
の本物質の溶出液量、横軸は分子量を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次のアミノ酸組成： Asx(2)、Thr(1)、Ser(1)、Glx(3)、Pro(1)、Gly
   (3)、Ala(2)、Val(1)、Ile(1)、Leu(1)、Lys(1)、His
   (1)、Arg(1)、Trp(1) ただし、カツコ内の数字は１分子当りのアミノ
   酸残基の数を表わす、 を有し、Ｎ末端アミノ酸配列がGly−Val−Ile−
   Ala−Trp−であり且つＣ末端アミノ酸配列が−
   Arg−Lys−Asx−Ser−Thr−Ala−Glyであり、
   ゲル過法により測定した分子量が約2200であ
   り、そして紫外線吸収スペクトルの極大吸収波長
   （λ_nax）が278nｍである歯牙体液輸送促進活性を
   もつペプチド。 ２ (a) ラツトの唾液腺の水性抽出液をPH4.5〜
   5.5の酸性にし、生ずる沈殿を除去する工程、 (b) 得られる上清を分子篩にかけて分子量が約
   30000以上の成分を除去した後、再び分子篩に
   かけて分子量が1000〜3500の画分を捕集する工
   程、及び (c) 該画分を陽イオン交換及び二次元紙クロマ
   トグラフイー・高圧電気泳動に付して分子量が
   約2200の画分を捕集する工程 からなることを特徴とする歯牙体液輸送促進活性
   をもつペプチドの製造方法。