JPH0365650A - ジヒドロキシアデニンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野り 本発明は、２．８−ジヒドロキシアデニン（以下２．８
−ＤＨＡと記す）の免疫化学的測定法に関する。

［従来技術］ ２．８−Ｄ）（Ａは、アデニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（以下ＡＰＲＴと記す）欠損症の患者に検出
される。

このＡＰＲＴの遺伝子は、ヒトの１６番染色体の長腕部
に位置しており、プリン代謝をつかさどることが知られ
ている。

ＡＰＲＴ欠損症の患者は、体内で生じたアデニンをこの
酵素でアデニル酸に代謝できないために、キサンチンオ
キシダーゼにより８−ヒドロキシアデニンを経由して生
じる２、８−ＤＭＡが体内に蓄積される。この２．８−
ＤＨＡの過剰な体内蓄積は、腎障害の原因となる。ＡＰ
ＲＴ欠損症では、軽症では反復性の尿路結石をおこし、
泌尿器管系の感染症や血尿等を引き起こす、また、重症
になると透析や腎移植を必要とする腎不全に至る。早期
の診断は、食事療法などにより重篤な状態を避けること
ができる。従って、この２．８−ＤＨＡの測定は、腎障
害あるいは腎感染症の原因を診断することや治療法を選
択する上できわめて重要と考えられる。この２．８−Ｄ
ＭＡを定量するの方法は、従来、高速液体クロマトグラ
フィー法（Ｐａｅｄｉａｔｒ、　Ｐａｅｄｏｌ、　Ｖｏ
ｌ、　１５．２３３．１９８０参照）やイソタコフオー
レシス法　（Ｐｕｒｉｎｅ　ｌＪｅｔａｂｏｌｉｓｍｉ
ｎ　Ｍａｎ　ＩＩ、７６Ｂ、　Ｐｌｅｎｕｍ　　Ｐｒｅ
ｓｓ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、　３０４゜１９７７参
照）が知られている。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、これらの方法は、操作が煩雑であった。

このため、検体を迅速かつ大量に測定するのには不向き
であり、ルーチン検査に供する事はできなかった。

［問題点を解決するための手段］ 本発明の発明者らはこれらの問題を解決するため、鋭意
努力し、２．８−ＤＮＡ誘導体のタンパク質結合物を免
疫原とし、動物に免疫した結果、この２．８−ＤＨＡに
特異的な抗体を得ることができた。これを用いることに
より、高感度でがっ迅速、簡便な免疫化学的測定法を開
発することができ、本発明を完成するに至ったものであ
る０本発明における測定対象は、検体に含まれる２、８
−ＤＨＡである。検体の種類は限定されないが、例えば
血漿、血清、尿、結石の抽出液などである。

まず、本発明に用いる材料の入手あるいはその製造方法
は、以下の通りである。

２．８−ＤＮＡ誘導体のタンパク質結合物の調製 ２．８−ＤＮＡ誘導体のタンパク質結合物は、一般式 ％式％） 式中、Ａはタンパクであり、ｎは２〜１２である。）で
表わされ、以下の如き反応に従い製造することができる
。

１ Ｒ−ＱＣ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ　　（１１）　　＋　　２
．８−Ｄ）Ｉ＾゛Ａ−Ｃ−（ＣＩｌｇ）ｎ−（２，８−
ＤＨＡ）　　　　　（Ｖｌ　）（式中２．８−Ｄ）Ｉ＾
°とは、６位のアミノ基が保護された２、８−ＤＨＡを
示し、ＸはＩ、　　Ｂｒ、又はＣ１であり、Ｒは保護基
を示す、） 「工程Ｉｌ 本工程は、６位のアミノ基を例えばベンゾイル基あるい
はジメトキシトリフェニル基（ＤＭＴＰ）などで保護し
た２、８−ＤＨＡをＮａＨのようなアルカリで処理した
後、前記化合物（ＩＩＩ）を反応させることにより、３
．　７．　９位のいずれかにＲ−ＯＣＯ−（ＣＨａ）ｎ
が導入された前期化合物（ＩＶ）を製造することができ
る。各々の化合物は、分離して工程１１に使用してもそ
のまま使用しても何等差し支えない、モノクローナル抗
体を作製する場合は、交差反応性を避けるため、好まし
くは分離精製して工程１１に使用するものである。

尚、本行程により原料である６佼のアミノ基を保護した
２、８−ＤＭＡを調整する際、使用できる保護基として
は、核酸合成法及びペプチド合成法で一般的に用いられ
る保護基を使用することができる（１゛ヌクレオシド・
ヌクレオチドの台底」、（丸善、１９７７年）あるいは
「ペプチド合成」、（丸善、１９７７年参照）。

［工程ＩＩ　］ 本工程は、２種類の保護基を除去することを目的として
おり、酢酸存在下ＨＢｒで処理することにより室温で容
易に反応を行うことができる。

［工程■］ 本工程は、前記工程ＩＴで得られた前記化合物（Ｖ）で
表わされる化合物を所謂ペプチド合成における活性化エ
ステル法あるいは水溶性カルボジイミドによる縮合法に
よりタンパクのアミノ基と結合するものである（カルボ
ン酸誘導体のタンパクとの結合法は、例えば、酵素免疫
測定法（蛋白核酸酵素別冊Ｎｏ、３１．ｐ４７参照）、
縮合の条件としては弱酸性（ｐＨ５，５程度）で水溶液
中に前記一般式（Ｖ）で表わされる化合物と０．　１〜
１０ｍｇ／ｍｌに調製したタンパク溶液を混合し、水溶
性カルボジイミドを加え、室温（２０℃〜２５℃）１〜
５時間反応させ、透析もしくは脱塩にて未反応の前記化
合物（Ｖ）を除去し、免疫原（Ｖｌ）を得るものである
。

本発明に用いることができるタンパクとしては、分子量
５０００以上のものであればなんでも良く、例えば、ア
ルブミン、ヘモシアニン、ＩｇＧ等であり、タンパクの
代わりにポリリジンなどの合成高分子も使用することが
できるものである。

抗体の調製 抗体の製造方法としては、前記方法により精製された前
記一般式（Ｖｌ）で表わされる免疫原をウサギ、山羊、
馬、モルモット、ニワトリなどの溢血動物に体重１ｋｇ
あたり０．　３〜２ｍｇを１〜数回背中皮下、フットパ
ット、大腿筋などにアジュバントとともに注射し、得ら
れた血清は必要に応じて精製し、当該抗体を得るもので
ある。逆受は身凝集反応や二抗体沈降ＲＩＡ法、二抗体
ＥＬＩＳＡ競争反応法などを本方法により実施するにあ
たっては、血清を精製せずにそのまま希釈して用いるこ
ともできる。

ポリクローナル抗体は、類似化合物に対して交差反応性
を有する抗体が含まれることがあるので、好ましくは、
類似化合物例えば、アデニンを結合させた樹脂に血清を
通し、交差反応抗体を吸収させるものである。

また、モノクローナル抗体を取得する方法は、既に多く
の底置に開示されている（例えば、　「モノクローナル
抗体とがん」、■サイエンスフォーラム社、１９８５参
照）、一般的には、前記の結合物（Ｖｌ　）をアジュバ
ントとともに注射し抗体価が高くなった状態で牌臓を摘
出し、その牌細胞をポリエチレングリコールによりマウ
スミエローマ細胞と融合させ、その細胞より当該抗体を
産生ずるクローンをモノクローン細胞として増殖させ、
マウス腹腔中あるいは培養液中で大量細胞培養すること
により、製造することができる（「モノクローナル抗体
とガン」、■サイエンスフォーラム社、１９８５年参照
）。

本発明は免疫化学的測定法により２．　８−ＤＨＡを測
定するものである。

本発明における免疫化学的測定法とは、放射免疫測定法
、酵素免疫測定法、免疫比濁法、免疫凝集法であり、こ
れらのいづれの方法を採用しても２．８−ＤＨＡの定量
を充分行なうことができる。

本発明で測定される２、８−ＤＨＡは分子量１６７の低
分子ハプテンであり、標識を用いる免疫化学測定法では
競争法により定量する。直接法においては、マイクロタ
イタープレートやポリスチレンビーズに本発明で得られ
た抗体を０．００１〜０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で４℃−
夜装置し固定化し、生理食塩水で洗浄し２％ＢＳＡ溶液
でポストコートし、固定化抗体を得るものである。

本発明における酵素免疫測定法では該固定化抗体に前記
化合物（Ｖ）と酵素を化学的に結合させた醇素標１！２
．８−ＤＨＡと２．８−ＤＭＡを含む検体とを競合的に
反応さるものである。実施の際の反応温度は４℃〜４０
℃であり、好ましくは２５〜３８℃である。洗浄後、固
定化抗体に結合した酵素結合２．８−ＤＨＡの量を測定
することにより検体の２．８−ＤＨＡの量を定量するこ
とができる、一方、間接法においては、同相に当該抗体
に対するアロ抗体を固定化する方法であり、溶液中で当
該抗体と酵素標識２．８−ＤＨＡ及び検体を競争的に反
応させ、これをアロ抗体固定化固相と反応させるもので
ある。ここで用いることのできる酵素は、パーオキシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ
、グルコースオキシダーゼなどである。この際、基質は
、用いる酵素に適したものを用いることは言うまでもな
い０例えば、ＡＢ和、ルミノール−８２０２（パーオキ
シダーゼ用）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メチ
ルウンベリフェリルホスフェート（アルカリホスファタ
ーゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−０−ガラクトース
、メチルウンベリフェリル−β−０−ガラクトース（β
−ガラクトシダーゼ用）などを挙げることができる。酵
素反応させ、測定は４℃〜４０℃で加温　しながらレー
ト法あるいは１分〜１８時間反応させ生じた発色、蛍光
あるいは、発光の測定により行なうものである。

また、本発明の免疫化学的測定法の放射免疫測定法は上
記酵素標識のかわりに１２５工などの放射同位元素を標
識し、行なうものである０本方法実施の際の測定操作は
前記酵素免疫測定法の場合と全く同じである。

一般的には１／４インチのポリスチレンビーズや直径１
ｃｍのポリスチレンチューブに得られた特異的な抗体あ
るいはＫＬＨ等に結合させた２、８−ＤＭＡを結合させ
た固相をｉｌｌ！Ｌ、使用するものである。例えば、カ
ルボキシメチル化された同相の場合、０．　１〜１ｍｇ
の抗体溶液（ｐＨ５〜７）に水溶性カルボジイミドを加
え１〜５時間反応させることより調製される。また抗体
あるいは２．８−ＤＨＡの放射標識は、既に市販されて
いるポルトンハンター試薬により容易に調製することが
でき、例えば、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶
かした抗体溶液にこのポルトンハンター試薬を加え１〜
２時間後にＧ−２５の脱塩カラム等を用いて未反応のポ
ルトンハンター試薬を除去するのみで調製することがで
きる。この他、クロラミンＴ法やヨードジエン法などを
採用することにより容易に１２ｓｉの放射標識を行なう
ことができる。

免疫反応を行なうにあたっては、先に述べた抗体固定固
相にサンプルおよび放射標識された２゜８−ＤＨＡを加
え、４℃〜４０′ｃ好ましくは２０〜３８℃で１〜１８
時間反応させるものである。

この後生理食塩水あるいは蒸留水で洗浄を行い、その放
射活性を計測する。また抗原固定化固相を用いる場合は
サンプルおよび放射標識された抗体２．８−ＤＨＡを加
え、４℃〜４０℃好ましくは２０〜３８℃で１〜１８時
間反応させ、生理食塩水あるいは蒸留水で洗浄を行い、
その放射能を計測するものである。測定にはシンチレー
ションカウンターを使用するものである。

また本発明には、イソルミノールやアクリジンエステル
などをラベルした化学発光測定法、フルオレッセインや
ローダミンをラベルした蛍光免疫測定法で行なうことも
できる。この際ラベル体の標識は活性化エステル法やイ
ソチアネート法を採用することにより容易に行なうこと
ができる（「酵素免疫測定法」　医学書院、第３版、１
９８７年参照）。

また、本発明の免疫化学的測定法の凝集免疫法では抗２
．８−ＤＭＡを血球や人工粒子（例えばラテックス、ゼ
ラチン粒子）に結合させ、２．８−ＤＨＡとＫＬＨの様
な高分子の結合物と検体の抗原とを競争的に反応させ生
じた凝集像によりそのその濃度を判定するものである。

血球や粒子への抗体の結合はタンニン酸処理法やゲルタ
ールアルデヒド法により行なうことができる（「免疫学
入門Ｊ　（学会出版センター　１９８１年参照）。

その反応は、９６穴のタイタープレートに抗体感作血球
（０，５％〜２．５％）と高分子の結合物と検体の抗原
とを競争的に反応させ、室温で１〜５時間放置すること
により行い、生じた血球や粒子の凝集像をパターンアナ
ライザーや目視で判定するものである。

更に、本発明の免疫化学的測定法の免疫比濁法は前述の
凝集免疫法で示した凝集を光学的散乱により測定するも
のである０例えば、波長を５５０ｎｍにセットした分光
光度計に抗体感作粒子と高分子化抗原とサンプルを混和
し直ちにその吸光度変化を測定することにより行なうこ
とができる。

［作用］ 本発明は、ヒト血清、結石、あるいは尿に含まれる２、
８−ジヒドロキシアデニンが特異的抗体を用いて測定さ
れる。

以下に具体的な実施例を述べる。

［実施例］ １　免疫原の合成 実施例１．１ ６．６−ジベンゾイル−２，８−ジヒドロキシアデニン
の合或 ジヒドロキアデニン２．０ｇをピリジン２０ｍ１に懸濁
し、水冷下ベンゾイルクロライド５．６ｍｌを加え、１
００℃で６時間攪拌した。

メタノール２ｍｌ添加して反応を止め、飽和炭酸水素ナ
トリウム水溶液を３０ｍ１加え、クロロホルムで３回抽
出した。このクロロボルム溶液を留去し、残さをエタノ
ールに溶かし、「遇して結晶化し、目的の６，６−ベン
ゾイル２．８−ジヒドロキシアデニン６６０ｍｇを得た
。　　（Ｒｆ値０．５・　ＣＨＣ１３：　　Ｈ２０＝９
：　　１　）実施例１．２ ９−プロピオン酸−２，８−Ｄ）ＩＡの合成１．１で得
られた６、６−ジベンゾイル−２，８−ジヒドロキシア
デニン４７０ｍｇをジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳ
Ｏと記す）８ｍｌに溶かし、６０％ＮａＨ１５０ｍｇを
攪拌しながら加えた０次に、１０分間放置後、３−ブロ
ムプロピオン酸ベンジルエステル４３０ｍｇを加え６０
から８０℃で１日攪拌した後、メタノール２ｍｌを添加
し反応を停止させ、反応液をクロロホルム１００ｍ　ｌ
で抽出した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去
しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（フコ−ゲルＣ
２０００；　　１４．５ｇ、和光純薬社製）を行い、精
製した。この精製物２００ｍｇを潰アンモニア水２ｍｌ
に溶かし、室温に２日間放置した。減圧下溶媒を留去後
、希塩酸水溶液２ｍｌでｐＨを２．６に調整し、室温で
１時間放置した。溶媒留去後、ジメチルホルムアミド１
ｍｌで溶かし、この液を予めジメチルホルムアミドで平
衡化したセファデックス２０のカラム（１ｘ３０ｃｍ）
にチャージし精製した。目的の９−プロピオン酸−２，
８−ＤＨＡはボイド付近に溶出され以下の実験に用いた
。

実施例１．３ ９−カプロン酸−２，８−ＤＨＡの合成１．２と同様に
３−ブロムプロピオン酸ベンジルエステルのかわりに５
−ブロムカプロン酸ベンジルエステル５．０ｇを用いて
合或し、目的の９−カプロン酸−６−ジメトキフェニル
トリチル化２．８−ＤＨＡ３．２ｇを得た。

実施例１．４ 免疫原１（ヘモシアニン（ＫＬＨ）と９−プロピンオン
ｉ！１ｔ−６−２．８−ＤＨＡとの結合物）の作製 かぶとかに由来のヘモシアニン（ＫＬＨ、シグマ社製）
５ｍｇを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６，５に溶かしこれ
に１．２で作製した９−プロピオン＊−２．８−ＤＭＡ
、１ｍｇを添加し攪拌下に水溶性カルボジイミド１ｍｇ
を加え２時間攪拌した。この反応液を予め２０ｍＭリン
酸ｌＩ衝化生理食塩水、ｐＨ７，０（以下ＰＢＳと記す
〉で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムにチャー
ジし溶出しＫＬＨと９−プロピンオン酸−２゜８−ＤＭ
Ａとの結合物４ｍｇを得た。

実施例１．５ 免疫［２＋ヘモシアニン（ＫＬＨ）と９−カプロン酸−
２，８−ＤＭＡとの結合物）の作製実施例１．４と同様
に行い９−プロピンオン酸−２，８−ＤＨＡのかわりに
９−カプロン酸−２゜８−ＤＨＡｌ、５ｍｇを使用した
。

２、抗体の調製 実施例２．１ 抗ＤＨＡモルモット抗体の調製 実施例　１．４で調製したジヒドロキシアデニンのヘモ
シアニン結合物２ｍｇを含む１ｍｌのＰＢＳを１ｍｌの
フロイント完全アジュバントと混合し、モルモットの皮
下に注射した。更に３週間後、上記結合物を同様に注射
した。その１力月後に同量の免疫原をフットバットに注
射した。最後の注射の１週間後に全採血し、抗血清を得
た。

実施例２．２ 抗ＤＨＡモルモ・ント抗体の調製 実施例１．５で調製したジヒドロキシアデニンのヘモシ
アニン結合物０．６ｍｇを含む０．１ｍｌのＰＢＳを０
．１ｍｌのフロイント完全アジュバントと混合し、マウ
スの腹腔内に注射した。２週間後に同量の免疫原を注射
した。更に２週問おきに２回免疫した。ｆｉ後の免疫か
ら１週間後に牌臓を摘出し、無菌的に得られたこの牌臓
細胞をマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とポリエチレ
ングリ−コールの存在下で融合させ、バイプリドーマ細
胞を得た。これを増殖させた後、限界希釈法によりジヒ
ドロキシアデニンにたいする抗体を産生ずるモノクロー
ン細胞を確立した。この細胞をマウス腹腔内で増殖させ
、モノクローナル抗体を含む腹水を得た。

３、標識物の調製 実施例３．１ ２．８−ＤＨＡとパーオキシダーゼとの結合物の調製 ホースラディシュバーオキシダーゼ（以下ＰＯＤと記す
、ベーリンガー社）５ｍｇを１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ
６，５に溶かしこれに１．２で作製した９−プロピオン
酸−２，８−ＤＨＡ、１ｍｇを添加し攪拌下に水溶性カ
ルボジイミド１ｍｇを加え２時間攪拌した。この反応液
を予めＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ−２５カラ
ムにチャージし溶出しＰＯＤと９−プロピンオン酸−２
，８−ＤＭＡとの結合物４ｍｇを得た。

実施例３．２ ２．８−ＤＭＡのＩｆｉｉｌｌｌｌ１体の調製＋ｔｓ■
標議アルブミン０．１ｍｇ（ウシアルブミンとＩｔｓ■
結合ポルトンハンター試薬との反応により調製）を１０
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ６，５に溶かしこれに１−２で作
製した９−プロピオン酸−２，８−ＤＨＡ、１ｍｇを添
加し攪拌下に水溶性カルボジイミド１ｍｇを加え２時間
攪拌した。この反応液を予めＰＢＳで平衡化したセファ
デックスＧ−２５カラムにチャージし溶出し１Ｉｔｌｉ
ｌ［ｌｌアルブミンと９−プロピンオン酸−２，８−Ｄ
ＭＡとの結合物０．０８ｍｇを得た。

４、抗原の測定 実施例４．１ ＥＬＩ　ＳＡ法による２、８−ＤＨＡの測走抗モルモッ
トＩｇＧ　山羊１　ｇＧ　（ＤＡＫＯ社製）ＰＢＳ溶液
（１０μｇ／ｍｌ）を９６穴のマイクロプレート（ＣＯ
ＡＳＴＥＲ社製）に５０μｍ７穴ずつ分注し、４℃で一
夜放置した。このマイクロプレートを生理食塩水で２回
洗浄した後、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液２００μｌを
多穴に分注し、４℃にて一夜放置した。以後の洗浄は全
て０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで行なった。

実施例２．１で得られた抗２．８−ＤＨＡモルモット血
清を２％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で２５０００倍に希釈しこ
の５０μｌを、洗浄したこのプレートに分注した。室温
で１時間放置し、３回洗浄した。

次に、検体あるいはスタンダード抗原、２５μ！および
実施例３．１で調製された２、８−ＤＨＡとＰＯＤとの
結合物２５μｌ　（５０００倍希釈）を加え室温で１時
間反応させた。３回の洗浄の後、０、　１％のＡＢＴＳ
と１ｍＭのＨ２Ｏ２を含む基質液１００μｌを多穴に分
注し、室温で３０分反応させた後、タイターチックマル
チレコーダーを用いて４１５ｎｍにおける吸光度を測定
した０図１にその定量曲線を示す。

実施例４．２ 放射免疫測定法による２、８−Ｄ）ＩＡの測定実施例２
．２で得られた抗２．８−ＤＭＡ抗マウスモノクローナ
ル抗体を含む腹水を硫安沈澱によりＩｇＧ分画とし更に
ゲル濾過によりモノクローナル抗体Ｇを得た。このＩｇ
ＧをＰＢＳ溶液（１０μｇ／ｍ　ｌ　）に直径１７４イ
ンチのポリスチレンビーズ１０００個を完全に浸し、４
℃で一夜放置した。このポリスチレンビーズを生理食塩
水で２回洗浄した後、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液に浸
し、４℃にて一夜放置した。以後の洗浄は全て生理食塩
水で行なった。このビーズを試験管にとり、検体あるい
はスタンダード抗原、２０μｌおよび実施例３，２で調
製された２、８−ＤＨＡの目２Ｓ■標識体４００．ｔ１
１（希釈して　０．　１μＣ１とした）を加え、室温で
反応させた。１時間後、洗浄を３回行い、シンチレーシ
ョンカウンターでこのビーズの放射量を計測した。その
時の定量曲線を図２に示す。

実施例４．３ ニワトリ赤血球をＰＢＳで３回洗浄した。この４ｍｌ溶
液にタンニン酸溶液（０，０２５ｍｇ／ｍｌＰＢｓ）２
０ｍｌを加え３７℃、６０分加温した。ＰＢＳで３回洗
浄し、この４ｍｌ溶液に抗２．８−ＤＭＡマウス抗体（
２ｍｇ／ｍ１ＰＢｓ）１０ｍ　ｌを加え３７℃、３時間
加温した。ＰＢＳで３回洗浄し１％ヤギ証清を含むＰＢ
ＳにｗＡ？１ｉｌシ１％血球溶液とした。検体もしくは
スタンダードを９６穴のタイタープレートに２ＸＮ希釈
で高分子の結合物とともに加え（２５μｍ）、抗体感作
血球く１％）２５μｌを各ウェルに添加した。攬はん後
、３時間室温に放置しその凝集像を判定した。

希釈倍率と１ｉ集パターン １／８　１／１６１／３２１／６４１／１２８１／２５
８２、８−ＩＩＨＡ 原液１１００ｎ／ｍｌ　−−−−±＋ Ｏｎｇ／量１＋　＋＋＋＋＋ 実施例４．４ ５μｍのラテックス粒子５０μ１（１０％溶液）と実施
例２．２で得られた抗２，８−ＤＨＡモノクローナルＩ
ｇＧのＰＢＳ溶液（５００μｇ／ｍ１）１０００μｌを
混和し、室温で一夜攪拌した。この液を１００１０００
０ｒｐ分遠心し上清を除去しＰ　Ｂ　８４　ｍ　ｌで分
散させ１００１００００ｒｐ分遠心し洗浄した。この操
作を３回繰り返し、ｆｋ後に２％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に
分散させた。この分散粒子５００μｍに実施例１．３で
調製したＫＬＨ−２，８−ＤＨＡ溶液５００μｌと抗原
を含む検体もしくは標準２．８−ＤＭＡ５０μｌを混和
し５分後の波長５５０ｎｍの吸光度変化を調べた０図３
はその抗原濃度と吸光度変化を示す。

１発明のｑｈ巣］ 本法に従えばＡＰＲＴ欠損症の患者の血清、結石あるい
は尿に含まれる２、８−ジヒドロキシアデニンを高感度
かつ迅速に検出され、大量に検体を短時間に測定できる
。

【図面の簡単な説明】

図１はＥＬＩ　ＳＡ法による２、８−ＤＭＡの定量曲線
であり、図２はＦｕＡ法による２、　　８−ＤＨＡの定
量曲線であり、図３はラテックス粒子を用いる２、８−
Ｄ）（Ａの定量曲線である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）２，８−ジヒドロキシアデニン（以下２，８−Ｄ
   ＨＡと記す）に対する抗体を用いる２，８−ＤＨＡの免
   疫化学的測定法。
2. （２）抗２，８−ＤＨＡ抗体がモノクローナル抗体であ
   る請求項（１）記載の方法。
3. （３）抗２，８−ＤＨＡ抗体がポリクローナル抗体であ
   る請求項（１）記載の方法。
4. （４）モノクローナル抗体がマウスモノクローナル抗体
   である請求項（２）記載の方法
5. （５）免疫化学的測定法が酵素免疫測定法である請求項
   （１）記載の方法。
6. （６）免疫化学的測定法が放射免疫測定法である請求項
   （１）記載の方法。
7. （７）免疫化学的測定法が免疫凝集測定法である請求項
   （１）記載の方法。
8. （８）免疫化学的測定法が免疫比濁測定法である請求項
   （１）記載の方法。