JPH0366763A - 新規蛍光染料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な蛍光染料に関する。さらに詳細には１本
発明は核酸を優先的に染色する新規な蛍光染料に関する
。

血液によって運ばれる寄生中感染は１世界の多くの地域
においで大きなＵｉ士の問題を引き起こしている。これ
らの地域の多くは１生物学的サンプル（血液やその成分
等）中に存在する寄生中を検出するのに利用できる機器
、及びこのような機器を使いこなすことのできる熟練技
能者が不足している。こうした問題に対処するために、
正確で且つ簡単に読み取ることのできる結果を与えるあ
る特定の低コスト・低技能レベルの機器が開発されてい
る。ある１つのこのような機器は１ある比重を有するほ
ぼ円筒状の物体を収容した毛細管を含んでおり１血液ザ
ンブルが遠心分離によって分離されるときに、該物体が
複数の血球層のうちの１つの血球層中に浮遊するように
なっている。該物体は、寄生中を保有している血球が押
し込まれる毛細管中に薄い環状スペースを形成するよう
選択される。次いで毛細管に対し、この環状区域内に寄
生中が存在するかどうかを、顆微鏡を使用して調べる。

米国特許第４．１９０，３２８号明細書は、この方法を
利用した機器について開示している。本方法は、工業的
にはＱＢＣ”システム〔ベクトン・ディッキンソン・プ
ライマリ−・ケア・ダイアグノスティクス（Ｂｅｅｔｏ
ｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｐｒｉｍａｒｙ　ＣａｒｅＤ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　）にて実用されている。

しかしながら、ある与えられた血球中における寄生中の
存在を明確に表わすのに、染料を加えなければ、このよ
うな寄生中を検出するのが難しい。

というのが本方法の欠点である。寄生中は、ある特定の
宿主中において、いくつかの異なる発育段階を経て成長
する。各発育段階を識別するのは難しい場合が多く、あ
る程度の熟練が必要とされる６ある特定の段階が存在す
るかしないかによって感染の相対的程度又は相対的段階
がわかる。

米国特許第４，１９０．３２８号明細書においては、寄
生中の核酸を染色する膜透過性染料としてアクリジンオ
レンジが開示されている。しかしながら。

アクリジンオレンジは他の血球に対しても透過性があり
、従って核化した白血球をある程度染色する。このため
、臨床医が感染段階の識別に熟練していない場合、アク
リジンオレンジのような染料を使用すると７誤った随性
判断を下しやすい。

血液によって運ばれる寄生中を分析するための他の方法
がある０本方法は現場用には適用できないが、研究用に
は適用可能である。本方法は、フロー・サイトメーター
（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）及びチアゾールオレ
ンジのようなＩ！Ｑ透過性の核酸染料を使用してなる。

本方法については、マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）らによる
「号イトメトリー（Ｃｙ　ｔｏｎｅ　ｔｒｙ）　＋８：
５６８（１９８７）　Ｊに説明されている。

一般には本方法は、患者から全血サンプルを単離するこ
と、そして血球をチアゾールオレンジで染色することを
含む１次いで３染色した血球を。

ＦＡＣ５ｃａｎ　”　（ベクトン・ディッキンソン・イ
ミｊ。

ノサイトメトリー・システムズ（Ｂｅｃｔｏｒ＋　Ｄｔ
ｃｋｉｎｓｏｎＩｍＩｌ＋ｕｎｏｃｙｔｏｉ６ｔｒｙ　
Ｓｙｓｔｅｍｓ））等のフロー中サイトメーターに通す
。血球がフロー・サイトメーターを通過する際に１血球
は検知区域を実質的に１回に１つ通過するが、　このと
き励起波長の光（通常は、アルゴンレーザーからの波長
４８８ｎ−の光）によって各血球を調べる。各血球によ
って散乱された光及び各血球から発する蛍光を光検出器
のような検知手段によって検出し、そして検出された全
ての光信号に基づいて各血球を識別する。

前記文献中に説明されているように、血小板の染色が起
こると、核化した血球（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ　ｃｅｌｌ
ｓ）（未発達の赤血球と全段階の白血球）のバックグラ
ウンド染色が起こる。白血球の染色は血球分析に関して
“ゲートで制御する（ｇａｔｅｄ　ｏｕｔ）″ことがで
きるけれども、核化しまた赤血球と血小板の染色は“ゲ
ート制御°“することができず、従ってバックグラウン
ドの蛍光を与え、これが寄生中搬送血球の識別・６Ｉ　
ｔＪｌに影響を及ぼすことがある。

従って、上記したような方法を改良された仕方で実施す
るのに必要とされるものは、核化した赤血球・白血球及
び血小板を殆どもしくは全く染色することなく、血液に
よって運ばれる寄生中の核酸を優先的に染色するような
染料である。

本発明は、一般式 （式中、ＲはＣＨ，とＣＩｈＣＯＯ−からなる群から選
ばれ；Ｘ″　はハロゲンイオンのようなアニオン。

ＰＯ４’−、ＳＯ４”−１Ｊｏｇ　−、（：１０ａ　−
、ＮＯｘ　−、及びＮＯ，−等の無機イオン、並びに酢
酸イオン、グルコース−６−リン酸イオン、及びＤ−グ
ルクロン酸イオン等の有機イオンである）を有する核酸
染料を含んでなる。Ｒはそれぞれの位置において同じで
ある必要はない。

本染料は４８８ｎｍにて励起可能（４６０ｎｍにおいて
励起は最大）であり、核酸の存在下に４７０〜５５０ｎ
−の間（４７８ｎｍにて最大発光）で蛍光を発する０本
染料は、　　ＲＮＡ核酸とＤＮＡ核酸の両方を選択的に
染色する。

本発明は、核酸を優先的に染色する新規な蛍光染料を含
んでなる。本蛍光染料は４８８ｒ＋ｍにて励起可能であ
り、　４７８ｎｍにて最大発光を呈する。　ＲＮＡが存
在すると、染料の蛍光は７．０００倍にも増大する０本
染料の量子収率は約０．４である。

本染料は、第■表に記載の方法に従って合成した。特に
明記しない限り１本明細書にて使用している化合物は、
全てアルドリッチケミカル社から市販されているもので
ある。中間体２と３は、ネイマン（Ｎｅｉｍａｎ）らに
よるｒｌｓｒａｅｌ　Ｊ、　Ｃｈｅｗ、　３：１６１（
１９６５）　Ｊに記載の方法を若干変えて合成した。中
間体４は、ブルーカー（Ｂｒｏｏｋａｒ）　らによるｒ
３゜Ａ（Ｃｈｅｓ＋、　Ｓｏｃ、、　６７：１８８９（
１９４５）　Ｊに記載の方法に従って合成した。

融点は、トーツス・ツーバー（Ｔｈｏｍａｓ　Ｈｏｏｖ
ｅｒ）毛管融点装置により測定した。　ＮＭＩ！スペク
トルはＩＢＭ　ＭＰ−２００ＳＹを使用して求め、化学
シフトはテトラメチルシランを内部標準として求めた。

逆相イオン対によるＨＰＬＣ分析は、以下に記載の条件
にて。

ブラウンリー（Ｂｒｏｗｎｉｅｓ）シアノ　４　、５　
Ｘ　２２０＋１１１カラムを使用して、フォトダイオー
ドアレー検出器（ｐｈｏｔｏ　ｄｉｏｄｅ　ａｒｒａｙ
　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）検出器（−２００〜６００ｎｍ
）を備えたウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）８６０２ポン
プシステムにより行った：５０−のトリエチルアンモニ
ウムアセテートを水と混合して得られる溶液（ｐＨ６，
５）中に５分間初期保持し１次いで５０ｍＭのトリエチ
ルアンモニウムアセテートに対して、アセトニトリル中
にて１時間で直線状勾配になるようにした。デューク大
学の質量分析装置により。

高分解の質量スペクトルを得た。

星土盗 工 ｕｔ−１ ３−　チル−６−メチルチオ　ブ１ン（２）の企底 ３ｇの６−（メチルチオ）プリン（１）　、　３．７ｇ
のＰ−）ルエンスルホン酸メチル、及び６ｍｌのジメチ
ルホルムア主ドを丸底フラスコ中に仕込んだ。

本混合物が透明黄色の溶液となるまで８本部合物を油浴
中にて１１０℃で２．５時間加熱した。

冷却後、溶液に２０ｍ１の水を加え１次いでエーテルで
抽出（２０ａｌ　Ｘ　３　）　して未反応の出発原料を
除去した０合わせたエーテル抽出液を２０ｍ１の水で逆
抽出し、水相を２０ｍ　ｌのエーテルで洗浄し１　そし
てこの水相を最初の水溶液と合わせた０次いで、　ＫＯ
Ｈを加えることによって本溶液を塩基性（ｐＨ１３）に
した、数分後、溶液から白色結晶固体が析出・沈澱した
０本固体を濾過し、水で洗浄し、そして風乾した。この
白色結晶は３−メチル−６−（メチルチオ）プリン（２
）であることが確認された。

０．８０ｇの３−メチル−６−（メチルチ′オ）プリン
（２）と０．９５ｇのＰ−１−ルエンスルホン酸メチル
を丸底フラスコ中に仕込んだ。本混合物を油浴中１００
　’Ｃで短時間加熱した。この均質溶液を冷却し。

アセトンとエーテルで洗浄した。洗浄後１反応混合物か
ら非晶質の白色固体が生成した。有機洗浄液を合わせた
ところ、白色結晶質固体が生成した。

この結晶質固体（３）を上記の非晶質固体と合わせ。

精製することな（ＦＯＲ−１の合成に使用した。

金属製撹拌棒と還流冷却器を備えた丸底フラスコ中に、
　４．８ｇのヨウ化メチルと５ｇの２−メチルベンゾチ
アゾールを仕込んだ１氷温合物を油浴中８０°Ｃで１６
時間加熱した。ピンク色を帯びた白色固体（４）を冷却
し、破砕し、アセトンで洗浄し、そして濾過した。

拐＋Ｒ−１の合成 １を磁撹拌捧と還流冷却器を備えた丸底フラスコ中に、
　１．２８ｇのヨウ化２．３−ジメチルベンゾチアゾリ
ウム（４）１　杓１．５０ｇ（４，４ｎ＋Ｍ）の粗製３
．７−シメチルー６−（メチルチオ）ブリニウム・Ｐ−
）ルエンスルホネート（３）　、　２０ｍ１のメタノー
ル１及び０．５ｍｌのトリエチルアミンを仕込んだ０米
温合物を約４５分間還流すると、黄色固体を含有した赤
色溶液が得られた０米温合物を冷却し、濾過し５そして
メタノールとエーテルで洗浄すると１黄橙色の固体が得
られ１本物質は という（１４造式を有する３−メチル−２−（（３，７
’−ジメチル−６−プリニリデン）−メチル〕−ベンゾ
チアゾリウム（ＰＵＲ−１）であることが確認された。

ＰｕＲ−１は本発明の染料の好ましい実施態様であり次
のような特性を有する：　ｍｐ−３４０〜：Ｌｉ５　’
Ｃ；　ｎｍｒ（ＣＤｘＯＤ）　　６３．９７（ｓ、　３
１（Ｌ　３．９９（ｓ、　３Ｈ）、　４．２７（ｓ３１
１）、　６．５６（ｓ、　ｌ１ｌ）、　７．３９（ｔ、
　ＩＩＩ）、　７．５７（ｄ、　１Ｂ）。

７．８０（ｄ、　ｌｔｌ＞、　８．０４（ｄ、　ＩＩＩ
）、　８．５４（ｓ、　１ｔｌ）、及び８．８５（Ｓ、
　ＸＩ（）；　　ＨＰＬＣ（核成分に対する保持時間３
０分）、Ｕν□、−４４８ｎ訓Ｃ＋ＪＩＪｏｓＳｏ＋Ｉ
ｏｌ（Ｍ”　）に対する高分解ＦＡＢ−旧計算値−３１
０．１１２６．実測値−３１０，１１３６゜ ヨウ化２．３−ジメチルベンゾチアゾリウムの代わりに
２，３−ジメチルベンゾチアゾリウムｐ−トルエンスル
ホネートを使用することによって。

ＰＵＲ−ＬのＰ４ルエンスルボン酸塩を合成することが
できる。　２００ＭＨｚのＮＭＩＩ分光法によれば、　
Ｐ［ＩＲ−１のｐ−トルエンスルホン酸塩は１次のよう
な特性を有する：　（ＣＤ３０Ｄ）　　δ８．６６（ｓ
、　ＩＨ）；　８．３１（３，１８）；　７．９−７．
２（ａ＋、　８１（）；　６．５５（ｓ、　ＩＨ）：　
４．２８（ｓ、　３Ｂ）；４．０３（ｓ、　３Ｈ）；　
３．９８（ｓ、　３Ｂ）；　２．３０（ｓ、　３Ｈ）　
。

他の塩形Ｂ物は１　ヨウ化物の形からアご、オン交換法
によって作製することができる。以下に簡単に説明する
。ブラウンリー・アクアボアー・アニオン（Ｂｒｏｗｎ
ｌｅｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　Ａｎｉｏｎ）　ｉ０１０Ｘ
２５０　）；ラムを通して、　　２．０ｍｌ／ｍｉｎ、
にて溶離剤をポンプ送りした。約１０Ｏｎ＋１の水でカ
ラムをフラッシュしそして交換すべきアニオンのナトリ
ウム塩の１．０Ｍ溶液１０ｍ１で平衡状態にした。　　
２００ａｌの水を使用して、カラムから過剰の緩衝液を
フラッシュした。

染料のヨウ化物塩をカラムに注入し、水とアセトニトリ
ルとの１：ｌ溶液でｆｆ１Ｍした。

このような方法を使用して、　ＰＵＲ−１の塩をいくつ
か作製した（第■表）。

本方法によって形成されるＰＵＲ−１のＰＯ４３−形態
物及びｓｏ、ト形態物は、　ＰＵ［１−１のヨウ化形態
物より溶解性が高いことがわかった。従って２分析のた
めに血液又は他の血液成分が加えられる毛細管を被覆す
る場合には、ヨウ化形態物よりこれらの形態物を使用す
るのが望ましい。

さらに、　ＰＵＲ−１のヨウ化形態物の溶解性は、窒素
に結合しているメチル基のいずれか又は全てをＣＬＣＯ
Ｏ−に置き換えることによって改良される。

このことは、化合物３０合戒心おいてｐ−トルエンスル
ホン酸メチルの代わりにブロモ酢酸を使用することによ
って達成することができる。

第１図においては、　ＰＵＲ−１の１）−）ルエンスル
ホン酸塩をメタノール中に溶解して１ｍＭ溶液を調製し
た０本溶液を、リン酸塩により緩衝された塩類（“ＰＢ
Ｓ”）の溶液にて２　Ｘｌ０−’Ｈの濃度に、又は１曽
ｇ／ｍｌの濃度のＲＮＡ（トルライースト、シグマケく
カル社）を含有したＰＢＳの溶液にて２　Ｘｌ０−’Ｈ
の濃度に希釈した。　ｌ？Ｎ＾が存在しない場合の最大
吸光度は４４８ｎ＊（ｅ　−６，３Ｘ１０’Ｍ−’ｃｍ
−’）であり、　ＲＮＡが存在する場合の最大吸光度は
４５９ｎｒａ＜　ｔ　−６，０Ｘ１０’Ｈ−’ｃｍ−’
であった。

第２図においては、　ＰＵＲ−１をＰＢＳ中に溶解して
１００μＨの濃度の溶液を調製した。３Ｉｌｌのキュベ
ツトに２．９７ｍ１のＰＢＳ　と３０−１のＰＵＲ−１
溶液を加えた。

本溶液の蛍光発光を４６０ｎｍの励起波長を使用して測
定した。　ＲＮＡが存在しない場合は、いかなる蛍光も
観察されなかった。別のキャベツトに２．９７ｍ１のＰ
ＢＳ、　ＲＩＪＡｉ液（ｂ＋ｇ／ｓＬ　０．３０ｍ１＞
、及び３０１！／ＩのＰＵＲ−１溶液を加えた。上述し
たように蛍光発光を測定した。　４７８ｎ−の最大吸光
度にてブロードな発光曲線が得られ１子収率は約０．４
であった。

本明細書に記載の全ての文献及び特許出願は。

本発明が関する当業界の通常の技術レベルを示している
。それぞれの文献又は特許出願が特定的に及び個別的に
参照の形で引用されているとしても。

全ての文献及び特許出願をそれと同じ程度に参照の形で
ここに引用する。

特許請求のｍＷに規定されている本発明の精神と範囲を
逸脱することなく本発明に対して多くの変形が可能であ
ることは、３技術者には明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、　ＰＵＲ−１のヨウ化物塩の溶液に対しＲＮ
Ａが存在する場合としない場合について、波長（問）に
関して吸光度をプロットしたものである。 第２図は、　ＰＵＲ−１のｐ−トルエンスルホン酸塩の
溶液に対し、　ＲＮＡが存在する場合としない場合につ
いて、波長に関して蛍光をプロットしたものである。 （外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＲはＣＨ＿３とＣＨ＿２ＣＯＯ＾−からなる群
   から選ばれ、Ｘ＾−はアニオンであり、そしてｎは整数
   である）で表わされる化合物。 ２、前記アニオンがハロゲンイオンである、請求項１記
   載の化合物。 ３、前記アニオンがＰＯ＿４＾３＾−、ＳＯ＿４＾２＾
   −、ＩＯ＿４＾−、ＣｌＯ＿４＾−、ＮＯ＿３＾−、及
   びＮＯ＿２＾−からなる群から選ばれる、請求項１記載
   の化合物。４、前記アニオンが酢酸イオン、グルコース
   −６−リン酸イオン、及びＤ−グルクロン酸イオンから
   なる群から選ばれる、請求項１記載の化合物。 ５、Ｘ＾−がＩ＾−であり、ＲがＣＨ＿３である、請求
   項２記載の化合物。 ６、ＲがＣＨ＿３であり、Ｘ＾−がＰＯ＿４＾３＾−又
   はＳＯ＿４＾２＾−である、請求項３記載の化合物。 ７、生物学的サンプルを請求項１記載の化合物と接触さ
   せることを含む、前記サンプル中の核酸を染色する方法
   。 ８、前記サンプルが血液又はその成分である、請求項７
   記載の方法。 ９、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる化合物。