JPH0367583A - 凍結した細胞を有する大規模発酵器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、哺乳動物細胞の極低温保存に関し、さらに詳
しくは、細胞がバイオリアクターの接種前に凍結して維
持されている、組織培養において哺乳動物細胞の使用に
関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：大規模発酵器
を哺乳動物細胞で接種する改良された方法が提供される
。組織培養フラスコおよび／またはローラーびん内で細
胞を１系列の規模拡大により凍結された細胞の１または
２以上のアンプルを使用する代わりに、細胞を発酵の接
種における予測する使用に先立って小型の発酵器中に接
種する。

細胞を濃縮し、はぼ５００ｒｎＱのアリコート（または
これより大きい）に細分し、そして極低温保存剤の溶液
と混合する。アリコートを特別に設計したフリーザーバ
ッグ内で液体窒素中で凍結する。

こうして、細胞は無限的に保持することができる。

発酵器の作業を開始するとき、細胞のバッグを単に融解
し、そして発酵器中に接種する。細胞は前置て発酵器の
培地に適合されているので、細胞の増殖および産生は接
種後はとんど直ちに開始する。

哺乳動物細胞は大規模でワクチン、モノクローナル抗体
、組み換えＤＮＡ産生物および他の生物学的物質の産生
のために培養される。多数の大規模産生糸は知られてい
る。これらは深い槽の発酵器、中空繊維、セラミックの
マトリックスまたは他の型のバイオリアクターを包含す
る。典型的には、哺乳動物細胞からの産生物の商業的産
生は、少なくとも５０ｆｆの有効体積を有するバイオリ
アクターにおいて多数の細胞の使用を必要とする。

１．０００ｆｆ以上の範囲の深い槽の発酵器は、商業的
産生に使用される。

生物学的物質の大規模産生に使用される哺乳動物細胞は
、典型的には、１ｒｒｌのアリコートに細分された２〜
６百万の細胞を含有するアングル中で凍結して貯蔵され
る。［参照、細胞系のためのＡＴＣＣ品質制御方法（Ａ
ＴＣＣＱｕａｌｉｔｙ　　Ｃｏｎｔｒｏｌ　　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　　ｆｏｒＣｅｌｌ　　Ｌｉｎｅｓ）、第１版、
１９６５年、Ｈａｙｉｉ］−これらのアンプルは、マス
ターｌａ！Ｉ！Ｉバンク（ＭＣＢ）および／または製造
業者の作業細胞バンク（ＭＷＣＢ）として貯蔵される、
凍結した細胞ストックを構成する。このようなＭＣＢま
たはＭＷＣＢの使用は、調節権威者により推奨されてい
る生物学的物質の産生に使用されるｍ胞系の特性決定に
おいて考慮するための指摘（Ｐ。

１ｎｔｓ　　ｔｏ　　Ｃｏｎ５ｉｄｅｒ　　ｉｎ　　ｔ
ｈｅ　　ＣｈａｒａＣ’ｔｅｒｉＺａｔｉＯｒｌ　　ｏ
ｆＣｅｌｌ　　Ｌｉｎｅｓ　　Ｕｓｅｄ　　ｔｏ　　Ｐ
ｒ。

ｄｕｃｅ　　ＢｉｏＪｏｇｉｃａｌｓ）（１９８７）、
０ｆｆｉｃｅ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　　ａｎｄ　　ＲｅｖｉｅｗｌＵ、Ｓ。

Ｆｏｏｄ　　ａｎｄ　　Ｄｒｕｇ　　Ａｄｍｉｎｉｓｔ
ｒ　ａ　ｔ　ｊ　Ｏｎ　ｏこれらの「考慮するための指
摘」は、規定された集団の二倍化レベル（ＰＤＬ）にお
ける哺乳動物細胞の培養の実施をさらに保証する。連続
的細胞系の場合において、ＭＣＢはクローニングすべき
である、すなわち、単細胞から誘導すべきである。アン
プルに低いＰＤＬで細胞を充填し、そして液体窒素中で
一１９６℃で貯蔵する。バイオリアクターの接種が必要
であるとき、アンプルを融解し、そして細胞を増殖する
。細胞の増殖に使用する方法は、特定の細胞系のための
要件に依存する。例えば、ある細胞系は固定依存性であ
り、これに対して他のは懸濁液中で増殖する；そしであ
る細胞は早期の増殖期において異常な栄養の要件を有す
る。増殖はまず細胞を融解し、そしてそれらを小さい組
織培養フラスコ中で増殖させることによって実施する。

７ラスコからの細胞を希釈し、そしてより大きい７ラス
コまたは２つの小さいフラスコ中に入れる；この方法を
反復して、大規模バイオリアクター中への接種に要求さ
れる数の細胞を得る。これは時間を消費する方法である
ので、連続的発酵を確保するための１つの方法は、細胞
を小規模の培養で絶えず保持し、そして汚染または他の
技術的失敗の時、バイオリアクターの再接種のためにそ
れらを常時保持することである。細胞を増殖するために
必要な時間ならびに小規模の培養に含まれるコストは、
１つのアリコートで産生合成の１つの接種のために十分
な細胞を凍結および常備貯蓄することによって大きく減
少することができるであろう。

哺乳動物細胞は、典型的には、適当な培地＋５〜ＩＯ％
（容量）のグリセａ−ルまたはＤＭＳＯを含有するアン
プルで細胞バンクに入れられる。

ＡＴＣＣはアンプルを１〜３１７分で一３０℃に冷却す
ることを推奨している。−３０℃において、アンプルは
−１５０＠０に急速にに冷却し、そして液体窒素に移す
。

アンプル中で培養した哺乳動物の細胞系の凍結のための
他の凍結速度および極低温保存剤は、知られている。参
照、クレベ（ｋｌｅｂｅ）ら、「培養した哺乳動物細胞
のための新しい極低温保存剤の同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ　　ｏｆＮｅｗ　　Ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃ
ｔｉｖｅ　　Ａｇｅｎｔｓ　　ｆｏｒ　　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅｄ　　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　　　　Ｃａ１ｌｓ）　　
、　　夏　ｎ　　　　Ｖｉｔｒｏ　　　　１９　（３）
：１６７−１７０　（１９８３）。ＤＭＳＯは最も普通
に使用されている極低温保存化合物である。ＤＭＳＯの
種々の使用の概説はＪ　ＡＭＡＳｅｐｔ、１７．１９８
２．２４８　（１１）：１３６９−−１３７１に記載さ
れている。

哺乳動物の細胞系の培養の分野以外の他の分野において
、極低温保存は使用されてきている。例えば、ラル（Ｒ
ａｉｌ）、ｒカラス化により極低温保存したマウス胚の
生存に影響を与える因子（Ｆａｃｔｏｒｓ　　Ａｆｆｅ
ｃｔｉｎｇ　　ｔｈｅ　　５ｕｒｂｉｂａｌ　　ｏｆ　
　Ｍｏｕｓｅ　　Ｅｍｂｒｉｏｓ　　Ｃｒｙｏｐｒｅｓ
ｅｒｖｅｄ　　ｂｙ　　Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
Ｊ、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　　２４：３８４−４０２
（１９８７）は、胚を脱水するガラス化ｓｉ中で冷却し
、次いで液体窒素中で貯蔵ことによって、８つのマウス
胚を保存すること記載している。米国特許第４．１５５
．３３１号（Ｌａｗｒｅｎｃｅら）は、急速に冷却速度
を使用する、エビの極低温保存を記載している。極低温
保存を使用し、そして材料は一７０℃においてか、ある
いは−２００℃程度に低い温度において貯蔵することが
できる。

ヒトの血小板の極低温保存は、また、引き続く治療学的
投与のためにこれらの細胞を貯蔵するために使用される
。スベクター（Ｓｐｅｃｔｏｒ）ら、「４または５パー
セントのＤＭＳＯを使用する２〜３℃において凍結しそ
して一８０℃において８か月間貯蔵した血小板の生存能
力おり機能（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　　ａｎｄ　　Ｆｕｎ
ｃｔｉ。

ｎ　　ｏｆ　　Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ　　Ｆｒｏｚｅｎａ
ｔ　　２　　ｔｏ　　３℃　Ｐｅｒ　　Ｍｉｎｕｔｅｗ
ｉｔｈ　　４　　ｏｒ　　５　　Ｐｅｒ　　ＣｅｎｔＤ
ＭＳＯａｎｄ　　５ｔｏｒｅｄ　　ａｔ　　−８Ｑ”Ｏ
ｆｏｒ　　Ｍｏｎｔｈｓ）Ｊ、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ
　　１７（１）：８−１４（１９７７）は、自己由来の
プラスミド中の８％のＤＭＳＯの５０ｍｌを添加し、そ
して２００ｃｍ”の表面積のバッグ中で一８０℃におい
て凍結した、５０ｍｌの血小板濃縮物の極低温保存を記
載している。タイラー（Ｔａｙｌｏｒ）、「血小板の極
低温保存：４つの方法の生体外の比較（ｃｒｙｏｐｒｅ
ｓｅｒｖａｔｏｎ　　ｏｆ　　Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ：ａ
ｎｉｎ　　ｖｉｔｒｏ　　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　　ｏ
ｆｆｏｕｒ　　ｍｅｔｈｏｄｓ）Ｊ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｐａｔｈ、３４：７１−７５　（１９８１）は、４つの
異なる極低温保存剤の溶液を記載している；５％のＤＭ
ＳＯは最も適当な溶液であったが、多くの血小板（〉５
０％）はこの溶液の使用で損失される。血小板はポリオ
レフィンの血小板の凍結バッグ中で、制御する速度の冷
却で、凍結し、そして液体窒素中で貯蔵する。シラファ
ー（Ｓｃｈｉｆｆｅｒ）ら、「血小板の極低温保存の臨
床的プログラム（Ａ　　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　Ｐｒｏｇ
ｒａｍ　　ｏｆ　　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　　Ｃｒｙｏｐｒ
ｅｓｅｒｖａｔｏｎ）Ｊ、Ｃｙｔａｐｈａｒｅｓｉｓ　
　ａｎｄ　　Ｐｌａｓｍａ　　Ｅｘｃｈａｎｇｅ：Ｃ１
１ｎｉｃａｌ　　Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）、沈澱、１
６５　１８０　（Ａｌａｎ　　Ｒ，Ｌｉ５ｓ。

Ｉｎｃ、１９８２）は、バルチモア・センター・リサー
チ・センター（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　　Ｃｅｎｔｅｒ　
　　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　　　Ｃｅｎｔｅｒ）ｊ二お
いて使用した血小板の極低温保存のプログラムを記載し
ている。４〜６単位の血小板（３〜４゜５ＸｌＯ”の血
小板）を濃縮し、５０ｍ＜２の血漿中に懸濁し、そして
２００ｍｆｆのポリオレフィンバッグに移し、これに５
０ｍ（２の１０％のＤＭＳｏ−自己由来の血漿を添加す
る。これらの単位は一８０℃において貯蔵する。−１２
０°Ｃにおける貯蔵は報告されている。血小板は、一般
に、ＤＭＳＯを極低温保存剤として使用して、−９０℃
〜−１２０℃において貯蔵する。

また、ヒトの単球は末梢血液から分離され、そして後の
注入のために一１９５℃において貯蔵されてきている。

単球の懸濁液の０．８ｍ（＋のアリコートは２０．５％
のＤＭＳｏ、１５．５％のアセタミド、１０％のポリプ
ロピレングリコールおよび６％のポリエチレングリコー
ルを含有するハングの均衡塩溶液中で凍結された。

ヒトの骨髄細胞の極低温保存は、また、文献に記載され
ている。イエーガール（Ｙｅａｇｅｒ）も、「４−ヒド
ロパーキシシクロホス７アミドによる生体外骨髄処置を
使用する、急性非リンパ性白血病の患者において自己由
来の骨髄の移植（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　　Ｂｏｎｅ　
　ＭａｒｒｏｗＴｒａｎｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　　ｉｎ
　　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　　　ｗｉｔｈ　　　Ａｃｕｔｅ
　　　ＮｏｎｌｙｍｐｈｏＬｉｃ　　　Ｌｅｕｋｅｍｉ
ａ、ＵｓｉｎｇＥｘ　　　Ｖｉｖｏ　　　Ｍａｒｒｏｗ
　　　Ｔｒｅａｔｉｍａｎｔ　　　ｗｉｔｈ　　　４−
Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｃｙｃ　　ｌｏｐｈｏｓｐｈａ
ｍｉｄｅ）Ｊ　　、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、３１５　
　（３）：１４１−１４７（１９８６）は、緩解の間に
集め、極低温保存し、そして移植前に４−ヒドロパーキ
シシクロホス７アミドで処置した骨髄を記載している。

４〜６ＸＩＯ＠の核化した骨髄細胞／　ｋ　ｇ体重を集
めた。核化したバフィーコートを分離し、そして自己由
来の血漿およびヘパリン添加した組織培地（ＴＣ１９９
）と混合して、２ＸＩＯ’細胞／　ｍ　Ｑの濃度を得た
。細胞をアルキル化剤で処理し、遠心し、４５％の血漿
、４５％の組織培養流体、および１０％のＤＭＳｏ中に
４Ｘ　１０６細胞／　ｍ　（１の濃度で再懸濁し、５０
ｍｌのアリコートの懸濁をポリオレフィンのバッグ中に
入れ、そして液体窒素中で凍結した。

ベウジェアン（Ｂｅｕｊｅａｎ）ら、「４０の極低温保
存した自己由来の骨髄の首尾よい注入（Ｓｕｃｃｅｓｓ
ｆｕｌ　　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　　ｏｆ４０　　Ｃｒｙｏ
ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　　Ａｕｔｏ菫ｏｇｏｕｓ　　Ｂｏ
ｎｅ−Ｍａｒｒｏｗ）Ｊ、ＢｉｏｍｅｄｉｎｅａｎｄＰ
ｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ、３８：３４８−３５２
　（１９８４）は、大量の骨髄を供与体／受容体から取
り出す、極低温保存のプロトコルを記載している。骨髄
をＴＣ１９９中の２０％のＤＭＳＯおよび１０％の合致
したヒト血清から威る極低温保存剤の溶液と混合する。

２００ｍｌのアリコートをポリオレフィンの凍結バッグ
に移し、そしてプログラミングした凍結のスケジュール
で一１９６℃に冷却する。

ドバイ（Ｄｏｖａｙ）ら、「技術的バイアス二大きい体
積における幹細胞の信頼指数であることからの冷却速度
の予防アンプルにおいて差（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　
　ｉｎ　　Ｃｏｏｌｉｎｇ　　Ｒａｔｅｓ　　Ｐｒｅｖ
ｅｎｔ　　Ａｍｐｏｕｌｅｓｆｒｏｍ　　Ｂｅｉｎｇ　
　ａ　　Ｒｅ１ｉａｂｌｅＩｎｄｅｘ　　　ｏｆ　　　
Ｓｔｅｍ　　　Ｃｅ１ｌ　　　Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖ
ａｔｉｏｎｓ　　　ｉｎ　　　Ｖｏｌｕｍｅｓ）Ｊ　　
、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　　　２３：２９６−３０１
　（１９８６）は、アンプル対バッグ中で骨髄の子孫細
胞（ｃＦＵ−ＧＭ）の生存を記載している。骨髄をＴＣ
１９９，２０％のＤＭＳＯおよび１０％の一致した血清
を含有する等しい体積の組織培養流体と混合した。凍結
は制御した速度で実施し、そしてバッグを液体窒素中で
貯蔵した。

柔軟なバッグ中で哺乳動物細胞を大規模に凍結し、そし
て商業的に価値ある細胞のタンパク質および抗体の産生
に使用すべきバイオリアクター（例えば、発酵器）の直
接の接種のために使用する方法を記載する。ローラーび
ん、７ラスコまたは発酵器からの細胞の懸濁液を遠心、
濾過または細胞の沈澱により濃縮し、そして極低温保存
剤のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で５〜１５容量
％の最終濃度で処理することができる。細胞を１００ｍ
ｌまたは５００ｍａの保存バッグの間に分配し、液体窒
素の蒸気中で凍結し、そして−７０℃（ドライアイス）
または−１９６℃（液体窒素）において貯蔵する。−７
０℃以下における少なくとも９か月の貯蔵は、細胞の劣
化なしに可能である。発酵器の運転のための細胞の接種
物は、フリーザーから柔軟なバッグを取り出し、そして
内容物を水浴中で３７℃において急速に融解することに
よって調製する。融解した懸濁液を発酵器の入口に接続
し、そして予備培養期間を必要としないで系中に直接注
入する。血液バッグ中の細胞は密度が高くかつ体積が大
きいために、１５１２の発酵器を単一の５００ｍｇのバ
ッグの内容物で接種し、そして発酵器中でｌＸｌ０’の
生存能力を有する細胞／　ｍ　Ｑの接種密度を得ること
ができる。組み換え柔軟な容器ＶＩＩＩ（ここおでｒＦ
８細胞」と呼ぶ）をつくる操作したＢＨＫ細胞のような
細胞の場合において、この出発密度は、産生モードで発
酵器を直ちに始動するために十分であるので、臨界的で
ある。大規模の細胞凍結技術により生成する利益の例は
、次の通りである：接種の規模拡大の排除による時間お
よび経費の実質的な節約；汚染および技術的機能障害に
より引き起こされる発酵器の損失からの急速な回復；発
酵器の接種物の均質性の増加二産生品質の接種物の貯蔵
能力の延長：および世界中の生産設備への高い品質の素
材の輸送が可能であること。

遺伝子的に修飾されたＢＨＫ細胞およびモノクローナル
抗体産生リンパ系を、５００ｍｇのアリコート”Ｃ’１
ＸｌＯ’　〜４．５ＸＩＯ’細胞／ｍｌの密度で凍結す
ることができる。細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳ
Ｏ）中で極低温保存し、そして制御した速度の凍結は不
必要である。本発明によれば、１５ｆｆより大きい発酵
器を多数の５００ｍｇのバッグによるか、あるいはより
大きいバッグにより接種することができる。無限の大き
さのバッグを使用することができるが、ただしバッグの
厚さはほぼ０−６ｃｍ〜０．８５ｃｍの間に維持する。

「はぼ」とは、厚さの±２０％の変動性が許容されうろ
ことが期待されることを意味する。

この技術の実施および価値は後述する発酵器の実験によ
り支持される。これらの実験により、凍結したバッグか
ら誘導された細胞の接種物は、よくないにしても、標準
のシード−トレイン（ｓｅｅｄ−ｔｒａｉｎ）法から誘
導された接種物と少なくとも同程度にすぐれることが示
された。細胞のバッグ技術を使用すると、Ｆ８細胞から
分泌さ′れた因子Ｖｌｌｆの有意の量は接種後３日程度
に短い期間の発酵で産生される。細胞増殖および生産性
のこの改良および他の改良は、凍結した細胞が発酵器に
適合した細胞の集団から誘導されるが、実験室の細胞系
から誘導されないという事実の結果である。細胞は凍結
したとき増殖および産生物の分泌の活性な状態にあり、
そしてすでに血清不含の状態にあった。融解した集団は
これらの望ましい特性のすべてを保持するように思われ
る。大規模の発酵器の細胞の集団の連続した適合および
選択は、現在大規模の凍結のアプローチのために可能で
あり、培養の生産性のそれ以上の改良および独特に特殊
化された発酵器の細胞系の開発を生ずることができる。

本発明の他の改良された面は、発酵器中への接種のとき
の細胞の直もの生産性である。接種はＤＭＳＯの使用を
包含する凍結の条件のために、高い生存能力（〉７０％
）を生ずる。ＤＭＳＯは発酵器中で１％ｖ　／　ｖより
小さい濃度に希釈される。

本発明の目的のために、次の定義を使用する：発酵器ま
たはバイオリアクターは、ローラーびんまたは組織培養
フラスコと反対に、それを通過する気体および栄養の制
御した流れのためのハードウェアーを含有する容器であ
る。発酵技術は種々の立体配置、例えば１、深い槽、中
空繊維、セラミックカートリッジ、ミクロキャリヤー、
マイクロカプセル化などにおいてよく知られている。

細胞密度は培養流体の１ｒ１２当たりの平均の生存可能
な細胞の数である。

永久増殖性細胞は、通常培養において有限の回数の分割
を行う一次細胞と反対に、無限の回数の分割を行うこと
ができる細胞である。永久増殖性細胞（細胞系）の例は
、次の通りである：　ＢＨＫ−２１細胞、ＣＨＯｍ胞、
ハイブリドーマ、ＥＢ■形質転換したリンパ球など。

生存能力はトリパンブルー色素の排除試験により測定す
る。

柔軟なフィルムは、０．０１０〜０．０９０ｍｍの厚さ
を有するプラスチックシート材料であると、ここにおい
て考える。

１１材料および方法 凍結に使用する細胞培養物 これらの実験において使用する細胞系は、組み換え因子
Ｖｌｌｌの産生に使用する特許売薬のＢＨＫ系統（Ｎａ
ｔｕｒｅ、３１２：３３０−３３７　（１９８４）、Ｅ
ＰＯ１６０４５７）および抗シュードモナス属（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ）モノクローナル抗体の産生のために
特許売薬の系統ＢＣであった。ＢＣ細胞はＥＢＶ形質転
換したヒトリンパ球から調製した。このような細胞を産
生する技術は米国特許第４．４４６．４６５号に記載さ
れている。培養はＭＷＣＢ材料から開始し、そして実験
は源材料から２１〜４８集団２倍レベル（ＰＤＬ）（１
６〜３２の継代培養）で細胞を使用して実施した。Ｆ８
細胞はローラーびんからか、あるいは因子Ｖｌｌｌの臨
床的産生において使用する発酵器から収穫した細胞懸濁
液から直接取った。

培地 すべての培地は、カッター−ベーケレイ（ｃｕｔｔｅ−
Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）サイトで産生された特許売薬の配合
物であった。ＢＣ細胞は血清不含ＭＯＡＢ完全培地中で
培養した。ローラーび、ん中でＦ８細胞は増殖培地（Ｇ
）に移し、これに対して発酵器の細胞は透析培地（ＤＭ
）と組み合わせて産生培地（ＰＭ）を使用した。ＭＯＡ
Ｂ培地は、ｌ：ｌの比の変性ダルベツコイーグル培地（
ＤＭＥＭ）／ハムＦ−１２培地（Ｆ　　１２）＋１０ｍ
ｇ／Ｑのインスリン、１１ｍｇ／Ｑのトランスフェリン
、５　ｍ　ｇ／Ｑのオレイン酸、１ｍｇ／＜２のコレス
テロールおよび１０ｍｆｆ／ｆｆのヒトアルブミンから
戊っていた。

ＧＭは、グルコース、チミジン、グリシン、ハイポキサ
ンチン、を含まない、ｌ：４の比のＤＭＥＭ／Ｆ−１２
、＋〇、１１０ｇ／ｆｆのビ）レビン酸ナトリウム、０
．７３０ｇ／（ｌのグルタミン、１５ミリモルのＨｅｐ
ｅｓ緩衝液、２ｇ／Ｑのマンノース、１．５ｍｇ／（２
のメトトレキセート、１．２ｇ／１２のＮａＨＣＯ，，
５０ｒｎ２／ｎの透析した胎児子ウシ血清および１０ｍ
ｇ／４２のインスリンから戊っていた。

ＰＭは、１：１の比のＤＭＥＭ／Ｆ−１２、＋Ｉｇ／（
ｌのグルコース、３ｇ／Ｑのマンノース、１．２ｍｇ／
ｆｆのエタノールアミン、１．４ｍｇ／Ｑのホスホエタ
ノールアミン、１ｍｇ／Ｑのｄ−ビオチン、１ｍｇ／ｆ
ｆのグルタチオン、５μモルのメルカプトエタノール、
２０ナノモルのＳｅＯ□、［１ＯＯＸ］　　１％のＭＥ
Ｍビタミン、［１００Ｘ］　　２％（７）ＭＥＭ７　ミ
／酸、　［１００Ｘ、］１％のＭＥＭ非必須アミノ酸、
５ミリモルのグルタミン、ｌ０ｍｇ／Ｑのインスリン、
１ｍｇ／Ｑのオレイン酸、０−　１　ｍｇ／Ｑのコレス
テロールおよび６０ｎｌ／ｆｆの５％のプラスマネート
ＰＰＰから戒っていた。

ＤＭは、ｉｌｌの比のＤＭＥＭ／Ｆ−１２、＋Ｉｇ／ｆ
ｆのグルコース、３ｇ／Ｑのマンノース、１．２ｍｇ／
７２のホスホエタノールアミン、１゜４ｍｇ／Ｑのｄ−
ビオチン、１ｍｇ／ａのグルタチオン、５μモルのメル
カプトエタノールナノモルのＳｅａ．、［１００Ｘ］１
％のＭＥＭビタミン、　［ｌＯＯＸ］２％のＭＥＭアミ
ノ酸、［１００Ｘ］　　１％のＭＥＭ非必須アミノ酸、
５ミリモルのグルタミン、３．０５ｇ／ｄのＭｇＣｌ，
、２ｇ／ＱのＮ　ａ　Ｈ　Ｃ　Ｏ　ｓから戊っていた。

極低温保存の媒質 選択する極低温保存剤は、ＰＭまたはＭＯＡＢ培地中の
１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍ
ａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏｍｐａｎｙ，　　ミゾ
リー州セントルイス）であった。Ｆ８細胞を使用すると
き、培地は２５〜５０％のプラスマネート（ｃｕｔｔｅ
ｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ　Ｉ　ｓ，カリ７オルニア州
バーケレイ）、５％の血漿タンパク質分画（ＰＰＰ）か
ら構成した。したがって、正味のＰＰＰの濃度はほぼ１
％〜２％であった。さらに、ある実験はＭＯＡＢ培地中
の１０％のグリセロール（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）を使用して
実施した。

培養容器および条件 ある細胞は８５０ｃｍ”ローラーびん（ＦａｌｃｏｎＳ
Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　　＆ｃｏ０、ニュ
ージャーシイ州すンコルンパーク）中で増殖した。使用
した１５Ｑの有効体積の発酵器は、ビルチス・カンパニ
ー（Ｖｉｒｔｉｓ　　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、）にューヨーク
州ガーディナー）によるか、あるいはチェマプ・インコ
ーホレーテッド（ｃｈｅｍａｐ　　Ｉｎｃ、、ＵＳＡ）
にュージャージイ州すウスプライフィールド）により作
られたものであった。ローラーびんはｐＨ６，８〜７．
２に維持し、そして毎週２回ｌ：２またはｌ：４のスプ
リット比で分割した。インキュベーションは密閉した容
器内で３７℃において実施した。Ｆ８培養物はｇｒｐｍ
の速度で回転した；ＢＣ細胞は４ｒｐｍで回転した。

極低温保存のための容器 プラスチックのアンプル（２ｍｌ）はコーニング・グラ
ス・ワークス（ｃｏｒｎｉｎｇ　　Ｇｌａｓｓ　　Ｗｏ
ｒｋｓ）にューヨーク州コーニング）から入手した。骨
髄凍結バッグ（１００ｍｆｆ）はステリコン・インコー
ホレーテッド（Ｓｔｅｒｉｃｏｎ　　Ｉｎｃ、）（イリ
ノイ州ブロードビュー）から入手した。さらに、液体窒
素の温度に耐えることができる５００ｍｆｆの凍結バッ
グは、ブラッド・バッグ・テクノロジーおよびブラッド
・バッグ・システムズ・リサーチのカッターの部（ｃｕ
ｔｔｅｒ’　　ｓ　　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ　　ｏｆ
Ｂｌｏｏｄ　　Ｂａｇ　　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　ａ
ｎｄ　　Ｂｌｏｏｄ　　Ｂａｇ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ　　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）と共同して作った。これらのバッグ
はＥＶＡから構成され、そして０．０２〜０゜０４ｍｍ
のフィルム厚さを有した。生存能力をもつ細胞の回収お
よび生存能力の比はステリコン骨髄バッグよりすぐれて
いた。

２、一般的手順 一般に、ローラーびんまたは発酵器からの健康な細胞懸
濁液をまず保持容器の３ａのスピンナーフラスコまたは
２０１２のポリグロピレンジャグの中に集めた。密度が
５Ｘ１０６より大きい細胞は、増殖培地：ＰＭまたはＭ
ＯＡＢ培地）でｌ：ｌに直ちに希釈して、引き続く処理
の間の栄養および前置酸性化°を得た。ｉｏ＋２までの
発酵器の懸濁液をこの方法で集めた。

次の一般的プロトコルが観察された： １１０−ラーびんまたは発酵器から細胞を集める。

２、細胞を希釈および撹拌のために保持容器中にポンピ
ングする。

３、装置および細胞を冷たい室（４°Ｃ）に入れるか、
あるいは水浴中で４°Ｃに冷却する。

４、細胞懸濁液を連続的遠心、中空繊維のカートリッジ
まｔ；はＩｇの沈澱を使用して濃縮する。

５、極低温保存剤の溶液を濃縮した細胞に添加する。

６、細胞懸濁液をバッグに分配する。

７、バッグを秤量および密閉し、そしてそれらを金属の
カセット内に入れる。

８、液体窒素の蒸気中でまたは機械的フリーザー中で一
７０’Ｏに凍結する。

９、必要となるまで貯蔵する。

早期の実験において、細胞を保持容器から直接取り、そ
して標準実験室の遠心機で濃縮する。このようにして処
理することができる細胞懸濁液の制限された体積のため
に、このアプローチは凍結の前に細胞懸濁液を濃縮する
中空繊維または連続的遠心がすぐれるために究極的に廃
棄した。これらの場合において、細胞の濃度および凍結
バッグ中への分配は４°Ｃにおいて実施した。

細胞の濃縮は貯蔵体積を減少し、そして発酵器の再接種
の方法を促進する。細胞の濃縮に最も有効な中空繊維の
ユニットはプラスチック（Ｐ　Ｉ　ａｓｍａｐｕｒ）Ｉ
カートリッジ（０，６μｍの孔大きさ）（Ｏｒｇａｎｏ
ｎ　　、Ｔｅｋｎｉｋａ　　Ｂ。

■１、オランダ国ポクステル）。使用した連続的カート
リッジは、ヘモネチクス・コーポレーション（Ｈａｅｍ
ｏｎｅｔｉｃｓ　　Ｃｏｒｐｏｒａｔ１ｏｎ）（マサチ
ュセッツ州プライドリー）。ヘモネチクスの細胞の分離
装置は文献中に前に報告された。この型の装置は米国特
許第４．２８５゜４６４号に一般的に説明されている。

これらの方法の１つを使用して、生存能力をもつ細胞の
数を１〜３ＸｌＯ’細胞／ｍｌに濃縮した。Ｆ８１１胞
について、ＭＯＡＢ培地またはＰＭのベース中の５０％
のＤＭＳＯおよび２５％のＰＰＰから成る濃縮した極低
温保存剤の溶液を、はぼ１００ｍｌ／分の速度で濃縮物
に注意して添加した。（１つのＦ８の実験において、ｌ
：ｌのＤＭＳＯ：　ＰＰＦを使用した。）ＢＣ細胞に使
用した極低温保存剤の溶液はＰＰＰを含有しなかった。

混合後、ＤＭＳＯおよびＰＰＰの最終濃度は、それぞれ
、１０％および５％であった。異なるＤＭＳＯのインキ
ュベージａン温度および時間を研究したが、４℃におい
てさえＤＭＳＯの細胞の浸透に対する有意のバリヤーは
存在しなように思われた。結局、極低温保存剤が細胞懸
濁液とよく混合したらすぐに、細胞濃縮物を凍結バッグ
に直ちに分配した。

種々の製造業者らからの異なる大きさの血液貯蔵バッグ
を使用した。液体窒素の温度における凍結および貯蔵の
ために、米国特許第４．４６８゜２２７号に記載されて
いるような１００ｍ＜２のステリコン骨髄バッグ（ＲＣ
−９１Ｆ）および特別に作った５００ｍｆｆのカッター
ＥＶＡバッグを使用した。−７０℃における短期間の凍
結および貯蔵のために、５００ｍａのステリコンの血小
板バッグ（ＲＣ−３）を使用した。カッターからのオー
トクレーブ処理可能な２００ｍ＜２の試料バッグ（製品
コード２Ｏ−１５２８）を使用して、分配工程の終わり
に３０〜５０ｍｌの細胞濃縮物を集めた。

この試料を計数して、生存能力をもつ細胞の回収の決定
に使用したベースラインのデータを得た。

電子目盛りを使用して、充填されるバッグ中で懸濁液の
体積を直接測定した（Ｉｇはバッグの充填について１ｍ
ｌに等しいと考えた）。

極低温保存剤を有する細胞のバッグは、種々の処理工程
の間、４°Ｃにほぼ１５〜３０分間維持した。それらを
インパルスヒーター（Ｓｔｅｒｉｃｏｎ）で密閉し、そ
して金属のカセット（Ｓ　ｔ　ｅｒｉｃｏｎ）内に入れ
た。細胞懸濁液の凍結は、カセットを液体窒素の蒸気中
に一夜水平に入れて達成した。プログラミングした単位
は１つの実験を除外して使用した。液体窒素の温度に耐
えることができるバッグを、金属のカセット中に水平に
入れ、そして機械的フリーザー（−７０〜−８０℃）の
棚の上に一夜配置しｔ；。すべてのカセットは使用まで
冷たい状態に連続的に維持した。

バッグは平らに配置してバッグの厚さがほぼ０゜６〜０
．９ｃｍになるようにすることが重要である。これは厚
い容器の中央における細胞への凍結の損傷を防止する。

３、細胞密度を増加する特別の手順 高い細胞密度（ＩＸＩＯ’の生存能力をもつ細胞／ｍｌ
以上）を達成することは、この技術の成功および実施に
対して必須である。また、非濃縮出発材料のため、それ
は主要な技術的の落とし穴の１つである。高い細胞密度
を達成する３つの方法を下に記載する。

第１の方法において、細胞を撹拌した槽の発酵器内で極
端に高い密度に増殖し、次いで極低温保存剤の溶液の添
加直後に収穫した。細胞の濃縮に他の装置は必要でない
。このような手順は次のように概説することができる： １１発発酵的懸濁液をほば３ＸＩＯ’細胞／ｍｌの生存
能力をもつ細胞密度に増殖させる。あるいは、発酵器の
懸濁液の冷却後の細胞の沈降により産生発酵器からの細
胞を濃縮する。

２、ＤＭＳＯ溶液を発酵器内の細胞懸濁液にゆっくり添
加する。調製のある発酵基糸をＤＭＳＯの添加前にほぼ
４°０に冷却した。

３、細胞懸濁液を逆にポンピングしそしてバッグに分配
する。

５４、秤量、密閉、凍結および貯蔵する。

現在の研究に使用した手順の詳細は、次の通りであった
：Ｆ８細胞を１５１２の発酵器内でＭＯＡＢ完全および
透析培地（実験ＦＲ１５）中で増殖させた。この発酵器
のための接種物は、それ自体前の凍結実験の間に作った
５００ｍｆｆのステリコンバッグ（ＰＲＩＯ−２）から
誘導した：これらの細胞は一７０℃で９９日間貯蔵した
後、新しい発酵器をｌ　Ｘ　１０”の生存能力をもつ細
胞／ｍｌで接種するために使用した。細胞は２．８Ｘｌ
Ｏ’の生存能力をもつ細胞／ｍｇ（９２％の生存能力）
に培養の１３日内に増殖し、次いで極低温保存のために
収穫した。次いで、発酵器中に存在する細胞懸濁液の１
５ｇを体積の考察のために１ｏｆｆに排出した。極低温
保存剤の溶液（２，５１２］　　（５０％のＤＭＳｏ、
２５％のＰＰＰ、ＭＯＡＢ完全培地）を９０”１３０ｍ
ｎ／分の速度で１０１２の懸濁液に直接添加し、そして
系のインペラーにより１５％のＤＭＳＯおよび５％のＰ
ＰＰの最終濃度に混合した。（発酵器の温度はこの手順
の間３７°Ｃに放置した。）ＤＭＳＯが添加されるとす
ぐに、ポンプを逆転し、モして５００ｍｌの血液バッグ
への分配を開始した。１５のバッグを充填し、秤量し、
ロッグ（ｌｏｇ）Ｌ、そして凍結した。

全体の手順は、ＤＭＳＯの添加から出発してバッグの凍
結までの処理時間に９８分を要した。細胞のバッグを融
解実験において接種物として使用するまで液体窒素中ｊ
こ貯蔵した。

第２方法において、発酵器の懸濁液は発酵器内または適
当な外部の容器内で重力の沈降により濃縮する。懸濁液
をまず４℃に冷却して細胞の代謝を低下し、そしてすべ
てのポンプおよびインペラーを停止する。細胞を重量に
より容器の底の区域に適当な時間の長さ、通常３０分〜
１時間沈降させ、そして細胞に欠乏する上澄み液を廃棄
する。

次いで、生ずる細胞濃縮物を極低温保存剤の溶液と混合
し、そして凍結バッグ中に分配する。

第３方法として、濾過によるか、あるいは細胞をそれら
の使用済みの培地から分離する他の物理学的方法により
、希薄の発酵器の懸濁液を濃縮することが必要であるこ
とがある。

４、凍結した細胞の培養物の再構成 凍結した細胞懸濁液を３７℃の水浴中の浸漬および撹拌
により急速に融解した。アンプルを液体窒素のフリーザ
ーから取り出した後水浴中に直接配置した；バッグの場
合において、金属のカセットをまずバッグの浸漬前にま
ず除去した。アンプルおよびバッグを２〜４分で融解し
、次いで注意して吸い取って乾燥した。バッグ内の懸濁
液をこの手順で操作して、形成することがある細胞の塊
を解離した。

バッグの出口部分のプラスチックのカバーを７０％のエ
タノールで拭い、そして乾燥した。次いで、調製物を層
状流れのフードに移し、そして取り付けられた魅菌の管
をもつ標準の血液バッグのスパイクを使用して出口部分
を開いた。細胞懸濁液を保持容器中に排出またはポンピ
ングし、そして完全に混合した。試料を細胞の計数およ
びｐＨの決定のために取った。いったん融解した細胞懸
濁液の生存能力をもつ細胞の密度が知られると、細胞接
種物を計算し、そしてローラーびんまたは発酵器中に入
れた。

所定の凍結実験の成功または失敗を、まず、生存能力を
もつ細胞の回収の決定により、すなわち、融解した細胞
懸濁液中に見いだされる生存能力をもつ細胞の数／凍結
した生存能力をもつ細胞の数／ｍｌの決定により推定し
た。パーセントとして表して、この量をここで生存能力
をもつ細胞の回収率％（ｖｃｒ％）と呼ぶ。凍結／融解
した懸濁液の量を、また、標準細胞の生存能力の決定に
より判定する。「生存能力比ｊは、日常的に、融解した
細胞の集団の生存能力％を細胞の凍結の時のもとの出発
集団のそれで割って計算した。最後に、ある場合におい
て、融解した細胞をフラスコまたはローラーびん内の培
養により試験した後、実際の発酵器の実験を実施した。

５、凍結に最適な細胞密度の決定 次の実験を実施して、細胞の生存能力を主に損失しない
で、極低温保存のために使用することができる最大細胞
密度を決定した。ＢＣ細胞の懸濁液を遠心により沈澱物
にして濃縮し、この沈澱物を使用してｌ系列の８つの沈
澱物の系統的２倍の希釈を表す２ｍ１ｌのアンプルを作
った。各希釈からの細胞を１０％のＤＭＳＯを含有する
培地中で凍結した。−７０°Ｃにおいて２６時間および
−１９６℃において３０時間貯蔵した後、アンプルを３
７℃の水浴中で絶えず撹拌しながら系統的に融解した。

各試料の融解時間はほぼ１０秒であった。

第２図に示す結果は、沈澱物から誘導したものを包含す
る融解した細胞懸濁液のすべてが高い生存能力を有する
ものであった。しかしながら、生存能力をもつ細胞の回
収率を検査すると、多くの生存能力をもつ細胞は集団か
ら完全に損失されていることが示された。生存能力をも
たない細胞（すなわち、トリパンブルーで暗色に着色さ
れる細胞）の実質的な増加は存在しないので、生存能力
をもつ細胞の損失は溶菌プロセスにより起こると思われ
た。この細胞の損失にかかわらず、きわめてすぐれた生
存能力をもつ細胞の回収率は３．２Ｘ１０７細胞／　ｍ
　Ｑ程度に高い密度で凍結した細胞懸濁液について得ら
れたく融解時の生存能力をもつ細胞の回収率−８４％、
または２．７Ｘ１０６ｍ胞／ｍ＜１）。凍結したアンプ
ルから誘導した細胞懸濁液が健康な継代培養を再び確立
することができることを確実にするために、フラスコの
培養物を各融解したアンプルから発生させた。きわめて
すぐれた継代培養物は１．３Ｘ１０６細胞／ｍｌ程度に
高い密度で凍結した細胞を使用して産生された。これら
の実験において、ＤＭＳＯは融解後除去しなかった。Ｄ
ＭＳＯは１．２％（１６９ミリモル）以上の濃度でフラ
スコ培養物中に存在するときにのみ、毒性作用を示した
。

凍結／融解実験をＦ８細胞の集団を使用して反復した。

ｌ系列の７つの２ｍｆｆのアンプルを遠心した細胞沈澱
物の２倍の希釈により作った。アンプルを１０％のＤＭ
ＳＯを含有するＭＯＡＢ培地中で７日間凍結した。融解
した細胞懸濁液からのデータにより、生存能力が７０〜
８５％の範囲であること、そして生存能力をもつ細胞の
回収率が７０％以上の範囲であること、すなわち、ＢＣ
細胞を使用して得られた結果に匹敵することが示された
。この系列においてほとんどの濃縮されたアンプルを４
．５ＸｌＯ’細胞／ｍｌの濃度で接種し、そして７３％
の回収割合を有し、７３％の生存能力で３．３Ｘ１０６
の生存能力をもつ細胞７ｍ（ｌを生じた。

７つのアンプルの二重反復の系列をＦ８細胞を使用して
発生させたが、極低温保存剤として１０％のグリセロー
ルを使用した。アンプルの大部分はほぼ８０％の融解し
た細胞の生存能力を有したが、凍結のために使用した密
度範囲の大部分にわたってわずかに４０〜５０％の生存
能力をもつ細胞の回収割合を有することを結果は示した
。これに対する例外は最も希釈したものでありそして、
驚くべきことには、最も濃縮した細胞の密度においてで
あった。例えば、３．５ＸＩＯ’細胞／ｍａで接種した
最も高い密度のアンプルは、８０％の回収率を有し、そ
して７７％の生存能力で２゜８ＸｌＯ’の生存能力をも
つ細胞／ｍｌを生じた。

このアンプルからの融解した細胞懸濁液の一部分を使用
して、培養対照のために８．４ＸＩＯ’生存能力をもつ
細胞／ｍｌの接種密度でローラーびんの培養物を接種し
た。これらのＦ８細胞を血清不合培地中で２回続代培養
し、そして８日で３゜１６の累積集団の２倍を達成した
。最終ローラーびん密度は８６％の生存能力で５．３Ｘ
１０６の生存能力をもつ細胞／ｍｌであった。グリセロ
ールの濃度は、第１ｍ代培養における０、０３％から第
２継代培養における０、０２％であった（全体の希釈フ
ァクター−極低温保存材料から５００×）。

最初の３つの実験からの結果に基づいて、ＤＭＳＯをす
べての引き続く実験について選択する極低温保存剤とし
て選んだ。さらに、３Ｘ１０６細胞／ｍｌは凍結懸濁液
中の標的細胞密度であることが決定された。

６、実施例 実施例１−１００ｒｒｌの骨髄バッグ中の実験凍結手順
の規模を拡大する第１の試みを、ステリコンからの１ｏ
ｏｒｒｌの骨髄凍結バッグを使用して行った。単一のバ
ッグを使用する４つの実験の結果を表！に要約する。

牲珪 ’ｖｃｒ％−生存能力をもつ細胞の回収率％。

２比＝融解した細胞対凍結した細胞のの生存能力の比 ３制御した速度の凍結装置をこの実験において使用して
、ここで表す２つのバッグの第１を凍結した。回収率お
よび生存能力の比は、制御速度の凍結でない液体窒素の
蒸気中で凍結したバッグについてよりわずかにすぐれて
いた。

使用した他の略号は次の通りである：貯蔵日数−液体窒
素中でまたは一７０℃において細胞を貯蔵しｔこ日の数
。

高い密度および高い体積の両者においてＢＣ細胞を凍結
しそして再構成する試みは成功した。表に示すＢＣ＠胞
を使用する３つの実験は、細胞を収集し、濃縮し、分配
し、そしてｔｚするある数の異なる技術を包含した。そ
れにもかかわらず、生存能力をもつ細胞の回収率および
生存能力の比はすべてきわめて高い。実験ＦＲ−７の場
合において、３．８ＸｌＯ’細胞／ｍ１！を凍結したと
き、１００％に近い回収割合が得られた。

ＭＯＡＢ細胞系をｌｏｏｍ（！に規模拡大する容易さと
対照的に、Ｆ８細胞の凍結は困難に直面した。実験ＦＲ
−６（表１）はわずかに２６％の回収率および０．２１
０の生存能力の比を生じた。

これは、凍結前の処理の間の細胞懸濁液中の非制御のｐ
ＨがｐＨ５，８に低下した結果であるように、思われた
。引き続く実験は、このようなｐＨの低下を防止する手
順、例えば、４℃におけるインキユベーシヨンおよび処
理工程の短縮を使用した。

実施例２−５２−５Ｏ０の血小板の凍結バッグ中の実験 この手順の規模拡大において次の工程は、５００ｍｌの
凍結容量を有する凍結バッグの使用であった。この時点
において、細胞の収集および濃縮の方法は、含まれる細
胞の数が大きいのために、重要となった。前の実験にお
いて成功した、中空繊維の膜のフィルターユニットは、
高い規模拡大において、詰まり大きい繊維の破断のため
に、２回破壊した。１つの実験（ＦＲ−１１）は成功し
たが、発生した懸濁液はフィルターの詰まりのために所
望のように密でなかった。

別のアプローチにおいて、高い速度の遠心装置（Ｈａｅ
ｍｏｎｅｔ　１ｃｓ）を使用した。これらの実験からの
データを表ＩＩに示す。

脚注 この実施例についての凍結および融解した細胞の集団に
ついて行った細胞の計数は、異なる個体により実施した
。

使用した略号 ｖｃｒ％−生存能力をもつ細胞の回収率％。

比−融解した細胞対凍結した細胞の生存能力の比貯蔵日
数−液体窒素中でまたは一７０℃において細胞を貯蔵し
た日の数。

１つの実験において、１００％のＤＭＳＯを遠心前に細
胞懸濁液に添加した。低い生存能力の凝集した細胞濃縮
物が生じた。次の２つの実験ＦＲ−１０．ＦＲ−１１は
、遠心工程後濃縮物について添加した３６〜５０％のＤ
ＭＳＯの使用をを包含した。生ずる生存能力をもつ細胞
の回収率および生存能力は比較的高かった。培養の試験
は実験ＰＲ−１４からの融解した細胞懸濁液について実
施した二ローラーびんをｌＸｌ０’生存能力をもつ細胞
／　ｍ　Ｑで接種し、そして３７℃においてＭＯＡＢ培
地中で増殖した。細胞は５日以内に３゜７の集団の２倍
および９０％の最終培養生存能力を遠戚した。

実施例３−発酵器の接種 ３つの１５ａの発酵器を融解した５００ｍ（１のバッグ
からの細胞で接種した。バッグは節２に記載されている
ように調製した。３つの実験の各々において、単一のバ
ッグを使用して８〜１２Ｑの発酵器の懸濁液をほぼｔｘ
ｔｏ’細胞／ｍ細胞７程Ｑた。実施例１および２におい
て、細胞のバッグを融解し、そしてスパイクを通した管
のラインを使用して細胞懸濁液を保持容５　Ｃ３Ｑのス
ピナーフラスコ）中にポンピングし、ここで細胞を追加
の完全培地でゆっくり希釈した。この希釈を行うとき特
別の注意を払って、融解し、希釈した細胞からＤＭＳＯ
が出ることによる浸透ショックを回避した。２段階の希
釈法を使用し／：：（１）５００ｍｆｆのＭＯＡＢ完全
培地を１０分かけて５００ｍｌの細胞に添加した；（２
）生ずる１０１００Ｏの懸濁液を第２の１０分の期間に
わたって追加の１０００ｍｆｆのＭＯＡＢ培地によりさ
らに希釈した。２ａの細胞を装置内で５分間再循環し、
そして試料を取り、そして計数した。接種物の大きさを
計算し、次いで発酵器を接種した。ｌＸｌ０６生存能力
をもつ細胞／ｍｌの接種密度を選択しＩ；。なぜなら、
Ｆ８細胞はＭＰ中でこの密度において増殖することがで
きることが知られているからである。融解から接種まで
の全体の接種手順は、５０分を要した。

第３の実験は、融解したバッグを使用する１５ａの直接
の接種を包含した。細胞の希釈は発酵器の容器それ自体
内で行った。この簡単なアプローチは、発酵器の産生条
件下の将来の研究のために適当であると思われた。接種
後、標準の発酵器の手順はすべての実験のバランスのた
めに使用した。

詳細は次の通りである： １１発発酵器実験Ｆ８７−ＦＲＩＩ 細胞のバッグＦＲ−１１−２　ＣＦ８ｍ胞、５００ｍ（
２）を−７０°Ｃで凍結し、その温度に２４時間維持し
、次いで３７℃において急速に融解した。

生ずる細胞懸濁液は７７％の生存能力で１．４×１０６
の生存能力をもつ細胞７ｍ（ｌを含有した。

細胞をＰＭで希釈し、そして８１２の接種懸濁液を有す
る１５ａのチェマプ（ｃｈ　ｅｍａ　ｐ）発酵器を８．
５Ｘ１０６の生存能力をもつ細胞／ｍｌの濃度で接種す
るために使用した。８ａの培養物中のＤＭＳＯの濃度は
０．５％（８８ミリモル）であった。われわれの知識に
よると、これは極低温保存した細胞濃縮物により直接接
種した最初の発酵器であった。細胞は第１日から２０日
の実験において対数増殖を示し、７．６Ｘ１０・の生存
能力をもつ＃１１１　／　ｍ　（ｌから６．３Ｘ１０６
の生存能力をもつ細胞／ｍｆｆの範囲の増殖は７０から
７０％までにおいて２０を越えて起こった。ｒＦ、ＶＩ
ＩＩ力価は対数的に増加した。

２、発酵器の実験８ｇ−Ｂｌ 細胞バッグＦＲＩＯ−２（Ｆ８細胞、５００　ｍｆｆ）
を−７０℃で凍結し、そしてその温度に９９日間維持し
た。３７℃で融解すると、生ずる細胞懸濁液は６９％の
生存能力で２．３ＸＩＯ’の生存能力をもつ細胞／ｍｌ
を含有した。細胞をＭＯＡＢ培地で希釈し、そして９．
８ＸｌＯ’の生存能力をもつ細胞／ｍｌｌの濃度で１２
２の接種懸濁を有する１５ａのビルチス（Ｖｉｒｔｉｓ
）を接種するために使用した。この初期の懸濁中のＤＭ
ＳＯ濃度は０．４２％（５９ミリモル）であった。４日
の培餐後、有効体積を１５Ｑに増加し、そして第１透析
槽を設置し、この時ＤＭＳＯの濃度を０．０３％（４，
５ミリモル）に平衡化した。細胞は第１日の培養から１
３日の実験において対数増殖を示し、ｌＸｌ０’の細胞
／　ｍ　（ｌから３．２×１０７の生存能力をもつ細胞
／ｍｌに増殖した。

生存能力は一般に８０〜９０％であり、ｒＦ。

Ｖｌｌｌ力価は第１２日を通して増加した。

３、発酵器の実験Ｆ８８−２ＭＷ 細胞バッグＦＲ１６−９（Ｆ８細胞、５００　＋ｎ１２
）を液体窒素中で凍結し、そして７日間貯蔵した。

３７℃で融解すると、細胞懸濁液は９２％の生存能力で
１．３ＸｌＯ’の生存能力をもつ細胞／１ｘ（１を含有
した。細胞をＰＭ培地を含有する１５１２のビルチス発
酵器中に直接排出した：生ずる接種物は８Ｘ１０”の生
存能力をもつ細胞／ｍｌの濃度で８ａの体積であった。

透析を発酵の開始時に使用し、こうして発酵器中のＤＭ
ＳＯの出発濃度は０．０３％（４，９ミリモル）であっ
た。実施した毎日の生存能力の大部分は９０％より大き
かった。ｒＦ、ＶＩＩＩ力価は第６日を通して増加しｔ
こ　。

上の発酵器の実験のすべての３つは、標準のシード−ト
レイン法により誘導される接種物の使用により得られる
もの、よりすぐれない場合であっても、それと同程度の
細胞の増殖、生存能力、および因子Ｖｌｌｌの生産性を
生皮した。バッグの手順は、産生細胞密度のより早い達
成および血清不含条件への細胞の予備適合のために、生
産性を加速したように思われた。

こうして、増殖および規模拡大時間の短縮のために、発
酵器の接種を容易にする手段および方法が提供された。

１５ｊ２の発酵器を１つの凍結したバッグで接種し、こ
れにより正常のシード−トレイン法を使用するとき含ま
れる努力およびコストを排除することができる。最適に
調製される細胞バッグは、合計１．５Ｘ１０”細胞ニツ
イテ、３ｘｌＯ１ｌｌ胞／ｍｌの濃度で５００ｍｇを含
有する。Ｆ８細胞）典型的なローラーびんの培養物は、
５００ｍｇの細胞を５ＸｌＯ’で、または合計２．５Ｘ
ｌＯ辱の細胞を含有する。こうして、単一の凍結した細
胞バッグは６０のローラーびんの細胞に等しいが、接種
にローラーびんを使用するとき拡張する労力を要する努
力を必要としない。接種法のこの簡素化は、また、接種
の間の汚染の機会を大きく減少する。

さらに、凍結した細胞バッグの使用は生産のスケジュー
ルの計画および維持を容易にする。汚染または他の技術
欠陥による発酵の容量の損失は、他のバッグの融解によ
り急速に補正することができる。新しい細胞の接種のた
めの待機時間のための実験室の効率の損失は存在しない
。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１１工程： （ａ）第１発酵器中で細胞を培養し、 （ｂ）工程（ａ）から細胞を少なくとも１００ｍｇのア
リコートで少なくともＩＯ’ｍ胞／ｍｌの密度において
分離し、 （ｃ）工程（ｂ）から細胞を極低温保存剤の溶液を含有
する柔軟な容器内で少なくとも−７０００に凍結し、そ
して （ｄ）工程（ｃ）からの細胞を第２発酵器中への接種の
ために融解し、前記細胞は少なくとも７０％の生存能力
を有する、 からなることを特徴とする、哺乳動物の細胞を培養する
方法。

２、前記細胞は永久増殖性である、上記第１項記載の方
法。

３、前記アリコートを分離し、案５００ｍｇのＥＶＡバ
ッバッで凍結する、上記第１項記載の方法Ｏ ４、前記凍結は一１９６℃までである、上記第１項記載
の方法。

５、第１発酵器は第２発酵器中で使用するのと同一培地
である、上記第１項記載の方法。

６、前記極低温保存剤を５０％以下のＤＭＳＯの希薄溶
液として添加する、上記Ｍ１項記載の方法。

７、前記極低温保存剤は１〜２％の血漿タンパク質の分
画をさらに含む、上記第６項記載の方法。

８、工程： （ａ）少なくとも１０６細胞／ｍｌ　、　５〜１５％の
ＤＭＳＯ，および組織培地を含有する、凍結した柔軟な
容器を調製し、 （ｂ）前記容器を必要となるまで一１９６℃に保持し、
そして （ｃ）前記発酵器を前記容器で接種し、これにより１０
６〜１０６ＪｆＢ胞／ｍｌの初期の発酵器密度を産生し
、接種のとき前記細胞の少なくとも７０％は生存能力を
もつ、 からなることを特徴とする、永久増殖性化哺乳動物の細
胞で発酵器を接種する方法。

９、前記接種は、前記ＤＭＳＯを１％ｖ／ｖより低く希
釈するために十分な量で培地を含有する発酵器中に接種
する工程を含む、上記第８項記載の方法。

１０、構成戊分： （ａ）少なくとも５００ｍｇの容量の柔軟なフィルムの
容器、 （ｂ）５〜１５％のＤＭＳＯの極低ｉｉ保存剤からなる
、前記容器中の凍結した組織培地、（ｃ）少なくとも１
０６細胞／ｍｌの密度でありかつ少なくとも７０％の生
存能力を有する、前記培地中の永久増殖性哺乳動物細胞
、 からなることを特徴とする、調製物品。

１１前記培地は血清を含有しない、上記第１Ｏ項記載の
物品。

１２、前記柔軟なフィルムはエチレン酢酸ビニルである
、上記第１０項記載の物品。

【図面の簡単な説明】

第１図は、先行技術と比較した、本発明の概略的表示で
ある。 第２図は、２ｍａのアンプル中でＢＣ細胞および１０％
のＤＭＳＯを使用する実験により決定した、凍結のため
に最適な細胞密度を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： （ａ）第１発酵器中で細胞を培養し、 （ｂ）工程（ａ）から細胞を少なくとも１００ｍｌのア
   リコートで少なくとも１０＾６細胞／ｍｌの密度におい
   て分離し、 （ｃ）工程（ｂ）から細胞を極低温保存剤の溶液を含有
   する柔軟な容器内で少なくとも−７０℃に凍結し、そし
   て （ｄ）工程（ｃ）からの細胞を第２発酵器中への接種の
   ために融解し、前記細胞は少なくとも７０％の生存能力
   を有する、 からなることを特徴とする、哺乳動物の細胞を培養する
   方法。 ２、工程： （ａ）少なくとも１０＾６細胞／ｍｌ、５〜１５％のＤ
   ＭＳＯ、および組織培地を含有する、凍結した柔軟な容
   器を調製し、 （ｂ）前記容器を必要となるまで−１９６℃に保持し、
   そして （ｃ）前記発酵器を前記容器で接種し、これにより１０
   ＾５〜１０＾７細胞／ｍｌの初期の発酵器密度を産生し
   、接種のとき前記細胞の少なくとも７０％は生存能力を
   もつ、 からなることを特徴とする、永久増殖性化哺乳動物の細
   胞で発酵器を接種する方法。 ３、構成成分： （ａ）少なくとも５００ｍｌの容量の柔軟なフィルムの
   容器、 （ｂ）５〜１５％のＤＭＳＯの極低温保存剤からなる、
   前記容器中の凍結した組織培地、 （ｃ）少なくとも１０＾６細胞／ｍｌの密度でありかつ
   少なくとも７０％の生存能力を有する、前記培地中の永
   久増殖性哺乳動物細胞、 からなることを特徴とする、調製物品。