JPH0368501A - 凍結保存前の細胞の蘇生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、超低温での貯蔵のため凍結保存しようとする
細胞または組織を蘇生させる（ｒｅｖｉｔａｌｉｚｅ）
方法に関する。よって、代謝エネルギー状態および組織
または細胞の機能が保存され、そしてその後の解凍およ
び移植時に最大にされる。

より詳しくは、本明細書中に記載される方法は、解凍時
の細胞生存力および機能力の増加をもたらす。この蘇生
方法後に凍結保存された組織は、本明細書中に記載の蘇
生方法を使用しないで凍結保存された組織よりも、移植
のための非常に高品質の組織である。

〔従来の技術、および発明が解決しようとする課題〕

現在の医療技術は、受容者の組織の先天性の、病気誘導
性のまたは変性の不全を修正するために幾つかの異なる
タイプの移植用組織の使用を可能にする。幾つかの例と
して、同種異系移植片ヒト心臓弁、静脈、角膜、骨髄等
を含む。研究者らは、新鮮な組織が老化または死組織よ
りも改善された性能を与えることに一般に意見が一致し
ている。

ヒトの組織は生体外では短期間、例えば普通２〜３日未
満、生存可能である。この限られた期間の貯蔵は、受容
者と提供者との最良な適合を確かめる際の複雑さ（例え
ば、移植片の相対サイズ、ヒト白血球抗原およびＡＢＯ
血液型のような要因）、並びに病原体について組織をテ
ストするのに要する時間のために、はとんどの組織タイ
プに通常不適当である。結果として、入手できる提供組
織の多くが、時間オーバーによる細胞生存力の相当な低
下のために使用されない。それらの欠点は、組織の生存
可能な凍結保存および超低温貯蔵により回避することが
できる。

細胞および組織の超低温貯蔵は、１９４９年Ｐｏ１ｇｅ
。

Ｓｒｓ　ｉ　ｔｈおよびＰａｒｋｓによる、グリセロー
ルを用いて凍結による損傷から細胞を保護できるという
発見後に可能になった。低温生物学の出現と共に、医学
および生物学分野の研究者らは、凍結された提供細胞ま
たは組織の生存力を維持するためのより優れた方法を捜
し求めている。

細胞および細胞集合体を凍結する幾つかの方法が報告さ
れている。例えば、米国特許第３．３０３．６６２号は
、凍結過程において凍結保護剤を使用する細胞保護方法
を開示している。

凍結保存された移植可能組織の性能は、解凍時の該組織
の生存力と直接相互関係がある。組織の細胞生存力の評
価を提供する１つのパラメーターは、細胞の一般的代謝
エネルギー状態である。移植された細胞が受容者中で重
要な役割を果たすためには、それらの細胞が鍵となるエ
ネルギー依存性過程を行なうのに十分な代謝能力を持た
なければならない。例えば、細胞代謝エネルギーに依存
するそのような過程の１つは、タンパク質の生を戒であ
る。また本質的には、細胞、組織または器官のどんな機
能でも細胞の代謝から誘導されるエネルギーに結局依存
している。

解凍後、代謝的または機能的に抑制される細胞は、受容
者中への移植のショックに耐えるのに十分には回復する
ことができず、従って生き残ることはできない。

細胞の代謝エネルギー状態を低下させそしてエネルギー
依存性機能を抑制し得る凍結保存のためのヒト組織の取
扱いにおいて幾つかの段階がある。

死亡と組織の取得との間の時間（温虚血）および取得か
ら凍結保存までの時間（冷虚血）が最も影響がある。延
長された温および／または冷虚血は、激しく代謝的およ
び機能的に抑制される細胞を生じる。

凍結保存それ自体が細胞のエネルギーおよび代謝能力を
低下させ、そしてエネルギー依存性機能を少なくとも最
小に低下させるらしい。よって、温虚血および冷虚血に
より誘導される一時的な代謝損傷および機能の低下から
細胞が本質的に完全に回復するように、移植後の組織生
存力を維持する方法および取得後の組織中の細胞を蘇生
させる方法に長年に渡る要望がある。従って、本発明は
、大きく改善された生存力に対する長期に渡る要求を満
たし、解凍および移植時の凍結保存細胞の機能力を最大
にする。加えて、蘇生細胞は凍結保存の硬直に一層耐え
ることができる。

組織はすぐに輸送のため湿性氷上の溶液、例えば組織培
養培地、乳酸加リンガー溶液、塩類溶液またはコリンズ
溶液中に入れられる。それらの溶液中に含まれる化合物
の濃度、組織を維持する時間、および組織を輸送する温
度は色々に異なることができる。それらの変化の総合作
用のため、並びに温虚血および冷虚血の時間の変化のた
め、ある与えられたＭｉ織についての代謝および機能の
抑制の程度を予想することは難しい。本発明の１つの重
要な特徴は、代謝および機能の抑制の程度が大きく異な
る場合でも、本発明の方法が代謝状態を改善し、よって
移植時の組織の機能する能力を改善することである。

従って、本発明の目的は、凍結保存前に細胞または組織
を蘇生せしめる方法を提供することである。

本発明の別の目的は、解凍時の細胞生存力および機能力
を増強せしめる方法を提供することである。

本発明の別の目的は、解凍および移植時に凍結保存組織
または細胞が生き残りそして機能する能力を改善する方
法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、凍結保存用の移植可能組織の
調製において必要であるかもしれない他の操作、例えば
抗生物質滅菌に付随して使用され得る細胞蘇生方法を提
供することである。

上記および他の本発明の目的、特徴並びに利点は、実施
態様の具体的説明および特許請求の範囲の参照後に明ら
かになるであろう。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、凍結保存前に栄養培地中に細胞を置きそして
細胞の蘇生を最適にするのに効果的な温度および時間で
前記細胞をインキュベートすることを含んで威る。

〔具体的説明〕

本発明の組織または細胞の蘇生方法は、解凍時の増加さ
れた細胞生存力および機能的能力を保証する。様々な期
間の温虚血および冷虚血への暴露により代謝的または機
能的に抑制されている組織を、それらの虚血により誘導
される損傷からの回復を促進するようにして処理する。

提供者の死亡直後にＭｉ織を取り出すことは通常実施不
可能であり、また取得の直後に組織を凍結保存すること
も通常不可能であるので、生存可能な凍結保存のために
ヒト組織を処理する際の温および／または冷虚血期間は
避けられない。凍結保存前に組織を処理することによる
本発明の方法は、組織の代謝エネルギー状態および機能
力が回復することを保証する。

本明細書中で使用する「蘇生」という用語は、凍結保存
前に細胞または組織を処理することにより達成される、
凍結保存後の細胞またはＭｉ織の代謝過程およびエネル
ギー依存性機能の回復または最適化を意味する。組織お
よび細胞の機能は最終的には細胞の代謝に依存する。よ
って、移植成功率を最大にするためには移植時の細胞／
組織生存力および機能力が最適化される。本明細書中で
使用する蘇生の測定は特定の代謝作用または経路に限定
されず、そして代謝活性または組織もしくは細胞機能の
どんな尺度でも使用することができる。

例えば、タンパク質合或、血管収縮、神経伝導、筋収縮
、放射性前駆体の取込み、放射性または蛍光性代謝物生
成、並びに代謝エネルギーに依存する代謝活性または過
程の他の尺度を評価することができる。

本明纒書中に記載の方法は、移植しようとする細胞およ
び組織並びに器官に適用され、そして移植可能組織の特
定の形に限定されない。例としては、骨髄細胞、鍵、靭
帯、島細胞、線維芽細胞、角膜、血管、心臓、肝臓、胚
等が含まれる。本明細書中に記載の移植可能材料につい
て言及する時の「細胞」、「組織」および「器官」とい
う用語は、最も一般的な意味で使用され、そして複数の
細胞、組織、器官等を言及するために交換できるように
使用される。

実験室での受理の際、より抜きの組織が他の不要な組織
から切り離され、そして培地への十分な酸素供給を考慮
した容器中の適当な組織培養培地中に置かれる。組織お
よび培地は、試料を凍結保存し、解凍し、そして移植を
必要とする患者中への移植のために調製した後の細胞ま
たは組織の生存力を最適化または最大化するのに効果的
な時間および効果的な温度においてインキュベーターま
たは振盪水浴中に置かれる。

本発明を実施する際に多数の組織および／または細胞培
養培地が好結果で使用され得る。平衡組織培養培地また
は単純なリン酸塩緩衝化塩溶液（グルコースのような栄
養素が補足されている）などの培地は大部分の組織タイ
プに使用できる。

加えて、タンパク質懸濁液、例えば血清または人工血清
等が培地中に存在していてもよい。

蘇生は、組織を回復させ、それにより移植の効率を最大
にするのに効果的である時間および温度において行われ
る。

蘇生に必要な処理時間は約５分〜約２４時間の範囲で異
なることができるが、好ましい時間は約３０分〜９時間
である。最も好ましい蘇生処理時間は約６時間である。

組織を処理する温度は約２７℃〜約４２”Ｃの範囲であ
るが、約３５゛Ｃ〜約４０℃が好ましい。蘇生の最適温
度は３７℃である。

蘇生操作に続いて、標準法に従って、選ばれた溶液中で
、そして所望により各々の与えられた組織にとって最適
であることが示されている凍結保護剤の存在下において
、組織が凍結保存される。

凍結された組織は超低温（例えば液体窒素中１９６℃）
で貯蔵される。解凍および希釈段階は、典型的には、与
えられた組織にとって最適であることが示されているも
のである。凍結保存前に組織を蘇生せしめることにより
得られる代謝的および機能的利点（未蘇生組織と比較し
た）は、解凍および希釈段階後も維持されるであろう。

本発明の利点の１つは、その後の凍結保存方法にかかわ
らず、凍結前の組織の処理が解凍時に改善された組織の
質（未蘇生の組織と比較して）をもたらすことである。

次の特定例は、凍結保存前のヒト心臓弁組織の蘇生に適
用する時の本発明の方法、並びに解凍および希釈後の代
謝的および機能的利点の維持を説明する。しかしながら
、上述したように、これらの技術は全ての移植可能な組
織に適用できることは認識されよう。本明細書中の技術
からの様々な変形は当業者にとって明らかであり、従っ
て本発明は特定の代表例に限定されない。

奥−土 心臓をそのまま調達し、実験室まで輸送した。

輸送のための調製において、３５０ｄの乳酸加リンガー
溶液、塩類溶液またはコリンズ溶液の入った無菌腸袋に
各々の心臓を入れた。この袋をプラスチックバンドまた
はさい帯で固定し、そして第二の腸袋に入れ、これを同
様に固定した。このようにして二重に袋づめされた心臓
を、プラスチック容器中に入れ、蓋をした。次にこの容
器を第三の無菌腸袋に入れ、そして湿性氷の入った発泡
スチロール輸送容器に入れた。受理時に、大動脈および
／または肺動脈の弁を切開し、モしてもとの輸送溶液に
入れた。

弁は４　”Ｃで４〜７２時間貯蔵した。この貯蔵期間の
後、弁尖頭を切開し、そして各々の尖頭を２等分した。

弁尖頭半片を無菌組織培養試験管中のダルベツコ改良イ
ーグル培地（“ＤＭＥＭ”）　（低グルコース、１０％
ウシ胎児血清含有）中に入れ、氷上で保存した。各尖頭
の半分は氷上のこの溶液中に残した。尖頭のもう半分を
、同一溶液を含むが３７℃に温められている無菌組織培
養試験管に移した。それらの尖頭半片を含む無菌試験管
を３７゛ｃの定温器に入れた。６時間後、全ての尖頭半
片を細胞の生存力および機能性についてアッセイした。

尖頭細胞による２−デオキシグルコース−６リン酸中へ
の（’Ｕ−２−デオキシグルコースの取込みを測定した
。このアッセイは、細胞膜の完全性、膜内外グルコース
輸送タンパク質の機能力、ヘキソキナニゼ酵素の完全性
および細胞の一般的エネルギー状態を決定する。２−デ
オキシグルコースがリン酸化されるのにＡＴＰが必要で
あるので、前記の最後のパラメーターが重要である。

尖頭半片を約２　ｍｉｌの無菌のハンクス溶液中に室温
で３〜５分間置いた。次に、１０μｃｉ／ｄの〔３Ｈ］
−２−デオキシグルコースを含む０．５−のハンクス溶
液（３７’Ｃの熱ブロツク中）に移した。３０分間のイ
ンキュベーション後、尖頭半片を約１０威の水冷ハンク
ス溶液に即座に移した。溶液をピペットで吸引除去し、
別の１０ｆｆｉｊ！のハンクス溶液を添加した。細胞外
の２−デオキシグルコースを除去しそしてリン酸化され
ない細胞内の２−デオキシグルコースを洗い出すこの洗
浄操作を更に４回繰り返した。次いで尖頭半片を０．５
　ｄの１ＭＮａＯＨ中に入れ、６０℃で３０分間インキ
ュベートした。次に超音波処理により組織をホモジナイ
ズし、そして得られたホモジネートを卓上エッベンドル
フ遠心機中で１０分間遠心した。得られた上清中の１分
あたりの崩壊（“〔３旧−〇ＰＭ”〉を液体シンチレー
ションカウンターにより測定した。全ての（３Ｈ）　−
ＤＰ？’１値を、上清中に存在するタンパク質の量につ
いて標準化した。その結果を表Ａに示す。

表−Δ ３７℃での６時間のインキュベーションを与えた尖頭半
片による２−デオキシグルコースの取込み（ＤＰＭ／■
タンパク質）と４℃で６時間維持された尖頭半片による
取込みとの比較。

１３８．４３１　　　　　３１Ｂ、７４２　　　　　　
　２３０１３２．５６８　　　　　３６４，１２３　　
　　　　　　２７４２６１．６９５　　　　　３０２．
１９２　　　　　　　　１１５２５８．９８３　　　　
　４３０．８１９　　　　　　　　１６６表−Δ（続き
） １９７．８７６　　　　　４５１，１９３　　　　　　
　　２２８２０２．５１Ｂ　　　　　　３１８，１７９
　　　　　　　１５７１１６．４５２　　　　　１４４
，７６０　　　　　　　　１２４１０９．２７４　　　
　　３０７．１８４　　　　　　　２８１上のデータは
、４℃でインキュベートした組織と比較して３７℃での
インキュベーションにより組織を蘇生すると、細胞生存
力および機能力に約２倍の改善が見られることを証明す
る。この差は第１図のＡ点に示されている。そのような
結果は、３７℃での虚血後蘇生が虚血により誘導される
一時的な代謝損傷および付随の細胞機能の抑制からの細
胞の回復をもたらすことを示す。従って、該データは、
３７℃での蘇生が代謝エネルギー状態および細胞の機能
を著しく改善し、よって新鮮なヒト心臓の弁尖頭の総体
的な質を著しく改善することを示す。

奥−１ 例１に記載のようにして心臓の弁尖頭半片を調製し、そ
して４℃または３７℃でインキュベートした。次いで本
質的には米国特許出願第０００．０９５号（この出願は
、１９９０年２月２日米国特許第４．８９０，４５７号
のもとにＲｏｂｅｒｔ　ＮｃＮａｌｌｙら他３名に特許
証が発行された）明細書に記載された方法により、それ
らの尖頭半片を凍結保存した。凍結された尖頭を一１９
６℃で少なくとも１６時間貯蔵した。

尖頭を解凍し、そして前記特許出願明細書中に記載のよ
うにして凍結保護剤を希釈した。解凍および希釈の直後
に、例１に記載のようにして尖頭半片を２−デオキシグ
ルコースの取込みについてアッセイした。その結果を表
Ｂに示す。

表−」− ３７″Ｃでの６時間のインキュベーションを与えた尖頭
半片と４℃での６時間のインキュベーションを与えた尖
頭半片とによる２−デオキシグルコースの取込み（ＤＰ
Ｍ／■タンパク質）害の比較。インキュベーション後、
全ての尖頭を凍結保存し、解凍し、希釈し、そしてすぐ
にアッセイした。

、表−」−（続き） １６．０５２　　　　　１７，１３０　　　　　　　１
０７５１９３　　　　　　１８．９５１　　　　　　　
３６５１７．３２０　　　　　２９，４８２　　　　　
　　　１７０２４８９　　　　　　２０　、５３３　　
　　　　　８２５２７．２８１　　　　　　７０，３７
２３４．２１９　　　　　１１８．６Ｂ２３３．９４４
　　　　　　８６，４３９１．３２，４４７　　　　　
１８５．８Ｂ７８２．６０４　　　　　３２０，９５３
１６２．６２３　　　　　２０１．０１３３０００　　
　　　　　９４９３ ３９４９　　　　　　１？、２１５ ３９９０　　　　　　１４．３６６ １３．９７５　　　　　２８．８８８ １４．９６０　　　　　３８．０１６ ５８ ４７ ５５ ４０ ８９ ２４ １６ ３６ ６０ ０７ ５４ 上のデータは、凍結保存前の３７℃での６時間のインキ
ュベーションによる組織の蘇生が、組織に４℃での凍結
保存前インキュベーションを与えた時に認められたもの
より約３倍大きい細胞生存力および機能力をもたらすこ
とを証明している。この差は第１図の点Ｂにおいて図示
されている。３７゛Ｃでの蘇生は、虚血により誘導され
た一時的な代謝損傷および機能の抑制からの細胞の回復
を導き、そして凍結保存および解凍後も改善された代謝
状態および機能力が維持される。従って３７℃での蘇生
は、代謝エネルギー状態を著しく改善し、よって凍結保
存されそして解凍された組織の総体的ｑ質を著しく改善
する。

樵−１ 例２に記載したようにしてヒト心臓の弁尖頭を処理した
。ただし、解凍および希釈後、全ての尖頭半片をＩ）Ｍ
Ｅ？Ｉ　（低グルコース１０％ウシ胎児血清含有）中に
置き、３７℃での６時間の解凍後インキュベーションを
与えた。このインキュベーション期間の後、例１に記載
のようにして尖頭半片を２−デオキシグルコースの取込
みについてアッセイした。その結果を表Ｃに示す。

盈−旦 ３７℃での６時間のインキュベーションを与えた組織と
４℃での６時間のインキュベーションを与えた組織とに
よる２−デオキシグルコースの取込み（ＤＰＭ／■タン
パク質）の比較。インキュベーション後、全ての尖頭を
凍結保存し、解凍し、希釈し、そして３７℃での６時間
の解凍後インキュベーションを与えた。このインキュベ
ーション後、尖頭半片を２−デオキシグルコースの取込
みについてアッセイした。

１０９．００９　　　　　１７１，９６３７９．６７６
　　　　　１０３．０５Ｂ１４８．９３７　　　　　１
？６，０３４１２７．７Ｂ７　　　　　４５９．８７３
１５０．３０２　　　　　２３９．９０６１１９．１５
０　　　　　２２４．７５１Ｘ±５Ｅ＝１８６±３３％ 上のデータは、組織に３７゛Ｃでの６時間の解凍後イン
キュベーションを与えた後でさえも、３７℃での凍結保
存前インキュベーションによる組織の蘇生が、組織に４
℃での凍結保存前インキュベーションを与えた時に認め
られるよりも約２倍大きい細胞生存力をもたらすことを
示す。この差は第１図の点Ｃにおいて図示されている。

そのような結果は、３７℃での虚血後蘇生が虚血により
誘導された一時的な代謝損傷および機能の抑制からの細
胞の回復を導くこと、並びに改善された代謝状態および
機能力が凍結保存、解凍およびインキュベーション後も
維持されることを示す。このように該データは、３７゛
Ｃでの蘇生が代謝エネルギー状態および機能力を著しく
改善し、よって凍結保存されそして解凍された組織の総
体的な質を著しく改善することを指摘している。更に、
それらの結果は、蘇生された組織が移植後の最初の６時
間の間は未蘇生組織を上回る著しい利点を有するだろう
ことを示す。

セＬ−（ ヒト心臓の弁尖頭を例２に記載のようにして処理した。

ただし、解凍および希釈後、全ての尖頭半片をＤＭＥ？
Ｉ　（低グルコース１０％ウシ胎児血清含有）中に入れ
、モして３７℃での１６時間の解凍後インキュベーショ
ンを与えた。このインキュベーション期間の後、尖頭半
片を例１に記載のようにして２−デオキシグルコースの
取込みについてアッセイした。結果を表りに示す。

表−旦 ３７℃で６時間インキュベーションした尖頭半片と４℃
で６時間インキュベーションした尖頭半片とによる２−
デオキシグルコースの取込み（ＤＰＭ／■タンパク質）
の比較。インキュベーション後、全ての尖頭半片を凍結
保存し、解凍し、希釈し、そして３７℃での１６時間の
解凍後インキュベーションを与えた。このインキュベー
ションの後、尖頭半片を２−デオキシグルコースの取込
みについてアッセイした。

３５．９８８　　　　　１１２．０２５　　　　　　　
３１１７２．３１３　　　　　８８．０４３　　　　　
　　１２２処理の組織を上回るそれらの機能的利点を維
持していることを示す。この差は第１表のＤ点において
図示されている。

明−ｉ ヒト心臓の弁尖頭を例２に記載のようにして処理した。

ただし、３７℃での３時間の凍結保存前インキュベーシ
ョンと４℃での３時間のインキュベーションとを比較し
た。その結果を表Ｅに示す。

表−旦 ３７℃での３時間のインキュベーションを与えた尖頭半
片と４℃での３時間のインキュベーションを与えた尖頭
半片とによる２−デオキシグルコースの取込み（ＤＰＭ
／■タンパク質）の比較。インキュベージジン後、全て
の尖頭半片を凍結保存し、解凍し、希釈し、そしてすぐ
にアッセイした。

ｘ＋５Ｅ＝１９８±４７％ 上記の結果は、蘇生された心臓弁尖頭が３７℃での１６
時６凍後インキユベーシゴン後でさえも未１９．８３９ １８．８７３ ３４．１７２　　　　　　　１７２ ３３　１６９　　　　　　　　１７６ 遣二−ヒ（続き） ４４，８７２　　　　　５４，１３０　　　　　　　１
２１５８．４９６　　　　　５６，５０９　　　　　　
　　９７５７．２７０　　　　　６１．４９９　　　　
　　　１０７上のデータは、凍結保存前の３７℃での３
時間のインキュベーションによる組織の蘇生が、組織に
４℃での凍結保存前インキュベーションを与えた時に認
められるよりも約１．５倍大きい細胞生存力をもたらす
ことを示す。そのような結果は、３時間はどの短い時間
で達成できる３７℃での虚血後蘇生が、虚血により誘導
された一時的な代謝損傷および機能の抑制からの細胞の
回復を導くこと、並びに改善された代謝状態および機能
力が凍結保存および解凍後も維持されることを示す。こ
のように、３７℃での３時間の蘇生は、代謝エネルギー
状態および機能力を著しく改善し、よって凍結保存され
そして解凍された組織の総体的な質を改善する。

る。

埜ヒー史 ヒト心臓の弁尖頭を例４に記載のようにして処理した。

ただし、解凍および希釈後、全ての尖頭半片をＤＭＥＭ
　（低グルコース１０％ウシ胎児血清含有）中に入れ、
そして３７℃での６時間の解凍後インキュベーションを
与えた。このインキュベーション期間の後、尖頭半片を
例１に記載のようにして２−デオキシグルコースの取込
みについてアッセイした。結果を表Ｆに示す。

ｌニー旦 ３７℃での３時間のインキュベーションを与えた尖頭半
片と４℃での３時間のインキュベーションを与えた尖頭
半片とによる２−デオキシグルコースの取込み（ＤＰＭ
／■タンパク質）の比較。インキュベーション後、全て
の尖頭半片を凍結保存し、解凍し、希釈し、そして３７
℃での６時間の解凍後インキュベーションを与えた。こ
のインキュベーションの後、尖頭半片を２−デオキシグ
ルコースの取込みについてアッセイした。

１３．１９６　　　　　２０，８５２ １Ｌ３６４　　　　　　１７．７６０ ？３２０　　　　　　２５，２３７ ２０１．９１７　　　　　２９７，０８０１８６．４６
５　　　　　２８０．５８０Ｘ±５Ｅ＝１８０±３１％ 上のデータは、組織に３７℃での６時間の解凍後インキ
ュベーションを与えた後でさえも、凍結保存前の３７℃
での３時間のインキュベーションによる組織の蘇生が、
組織に４℃での凍結保存前インキュベーションを与えた
時に認められるよりも約２倍大きい細胞生存力を生むこ
とを示す。そのような結果は、３７℃での虚血後蘇生が
、虚血により誘導される一時的な代謝損傷およ゛び機能
の抑制からの細胞の回復を導くこと、並びに改善された
代謝状態が凍結保存、解凍および生理的温度でのインキ
ュベーション後も維持されることを示す。このように、
３７℃での蘇生処理は、代謝エネルギー状態および機能
力を著しく改善し、よって凍結保存されそして解凍され
たヒト心臓弁尖頭の総体的な質を著しく改善する。更に
それらの結果は、蘇生された組織が移植後の最初の６時
間以内では未蘇生組織を上回る著しい利点を有するであ
ろうことを示す。

班−１ 心臓弁尖頭を例２に記載のように処理する。ただし、解
凍および希釈後、同一の弁からの２つの蘇生された尖頭
半片（凍結保存前に３７℃で６時間インキュベートした
もの）をハンクス溶液で簡単に洗い、開放流路系小型熱
量計中に置き、そして１５ｄ／分の流速でハンクス溶液
を潅流させる。組織室を３７℃に維持し、そして組織に
よる放熱を２時間に渡り連続して記録する。

第２図に示されるように、解凍時の蘇生尖頭半片による
放熱量は対照の量の２倍以上である。蘇生尖頭半片につ
いての平均放熱量は２２．０３マイクロワツトであり、
一方対照の未蘇生尖頭半片の平均放熱量は１０．５４マ
イクロワツトである。放熱量は細胞の代謝エネルギー流
量と直接相互関係がある。従って、代謝エネルギー流量
および機能する組織の能力は、対照の未蘇生尖頭半片よ
りも蘇生尖頭半片の方が２倍以上大きい。これは、相対
的なエネルギー状態および機能力の尺度として２−デオ
キシグルコースの取込みを用いた時に見られる結果（即
ち例２）とぴったり一致する。このように、組織の代謝
エネルギー状態および機能力という２つの独立した測定
により、解凍後に蘇生組織が未蘇生組織よりも非常に優
れていることが決定される。

班−主 完全な心臓を調達し、例１に記載のようにして実験室ま
で輸送する。大動脈および肺動脈の弁を切り離し、組織
培養培地（例えばグルコースを含むＤＭＥＭ）中に入れ
、モして３７℃で約３〜約１２時間インキュベートする
。所望であれば、インキュベーション溶液中に抗生物質
が入っていてもよい。

インキュベーションおよび同時の蘇生後、米国特許出願
第０００．０９５号明細書（これは引用により本明細書
中に組み込まれる）に記載のプロトコールにより、弁を
凍結保存する。移植時に、そのような弁は凍結保存前に
蘇生しなかったものよりも優れた特質を有する。

要約すれば、凍結保存前の約５分〜約２４時間の組織の
蘇生は、３７℃での６〜１６時間の解凍後インキュベー
ションを与えた組織と比較した時でさえ、組織に４℃で
の凍結保存前インキュベーションを与えた時に観察され
たものよりも、約２〜３倍大きい細胞生存力をもたらす
。よって、虚血後蘇生は、虚血により生じる一時的な代
謝損傷および機能力の抑制からの細胞の回復を導く。改
善された代謝状態および機能力は、凍結保存、解凍およ
びインキュベーション後も維持される。蘇生処理は代謝
エネルギー状態および細胞機能を著しく改善し、よって
凍結保存されそして解凍された組織の総体的な質を著し
く改善する。更に、それらの結果は、蘇生された組織が
未蘇生の組織を上回る著しい利点を有するだろうことを
示す。

本発明を今まで詳細に記載したが、多くの他の態様が可
能であり、それらは特許請求の範囲内に含まれる。従っ
て、本発明の範囲はそれにより限定されるものではない
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ブレインキュベーション、凍結保存、解凍お
よび解凍後インキュベーション後の細胞のエネルギーお
よび機能状態を明らかにする。この図は、本発明の好ま
しい実施態様に従って蘇生された（３７℃でブレインキ
ュベートされた）Ｍｉ織と、凍結保存前に４℃に維持さ
れた組織との細胞のエネルギーおよび機能状態を比較し
たものである。 ブレインキュベーションのゼロ（０）時は、もとの位置
の組織に認められたものの５０％への細胞の代謝および
機能状態の仮定的低下を表わす。この低下は、ブレイン
キュベーション前の温虚血および冷虚血の総合作用によ
るものである。 第２図は、心臓弁尖頭による放熱の連続的記録を示す。 蘇生された尖頭半片（ロ）は、例２に記載のようにして
、３７゛Ｃで６時間インキュベートし、次いで凍結保存
しそして解凍した。対照の尖頭半片（＋）は、例２に記
載のようにして４℃に６時間維持し、次いで凍結保存し
そして解凍した。蘇生された尖頭は、対照の未蘇生の尖
頭の２倍より大きい量の熱を生ずる。 図面の浄！（内容に変更なし） 機能の相対レベル（％） 放熱Ｉ（フィクロつント） 手 続 補 正 書 （方式） 補正の対象 図 面 平成２年８月２０ 日 ７゜ 補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞の蘇生を最適化する方法であって、栄養培地中
   に細胞を置き、そして細胞の蘇生を最適化するのに効果
   的な温度および時間で前記細胞をインキュベートするこ
   とを含んで成る方法。 ２、前記細胞が移植可能組織を構成している、請求項１
   に記載の方法。 ３、凍結保存後の移植可能組織の生存力を最大にする方
   法であって、移植組織を凍結保存前に栄養培地中に置き
   、そしてそのような処置を必要とする患者中への移植時
   の組織の生存力を最大にするのに効果的な温度および時
   間で前記組織をインキュベートすることを含んで成る方
   法。 ４、前記移植可能組織が約２７℃〜約４２℃の範囲の温
   度でインキュベートされる、請求項３に記載の方法。 ５、前記移植可能組織が約５分〜約２４時間の範囲の期
   間インキュベートされる、請求項４に記載の方法。 ６、前記移植可能組織が約３時間〜約９時間インキュベ
   ートされる、請求項５に記載の方法。 ７、前記移植可能組織が約６時間インキュベートされる
   、請求項６に記載の方法。 ８、前記移植可能組織が約３７℃でインキュベートされ
   る、請求項４に記載の方法。 ９、移植を必要とする患者への投与に適する細胞を含ん
   で成る最適に蘇生された移植可能組織であって、凍結保
   存および解凍後に前記細胞を最適に蘇生させるのに効果
   的な時間および温度で前記細胞が凍結保存前にインキュ
   ベートされることを特徴とする組織。 １０、前記細胞が心臓組織を構成している、請求項９に
   記載の組織。 １１、前記組織が凍結保存前に約２７℃〜約４７℃の範
   囲の温度でインキュベートされる、請求項１０に記載の
   組織。 １２、前記組織が凍結保存前に約３５℃〜約４２℃の範
   囲の温度でインキュベートされる、請求項１１に記載の
   組織。 １３、前記組織が凍結保存前に約３７℃でインキュベー
   トされる、請求項１２に記載の組織。 １４、前記組織が凍結保存前に約５分〜約２４時間イン
   キュベートされる、請求項１１に記載の組織。 １５、前記組織が約３〜９時間インキュベートされる、
   請求項１４に記載の組織。 １６、前記組織が約６時間インキュベートされる、請求
   項１５に記載の組織。