JPH0369891B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、食べられるゴボウの根中の、突然変
異原性物質の突然変異原性を阻害する高分子量物
質およびその分離精製する方法に関する。 最近、発ガン性物質の殆んどは突然変異原性を
示すことや、突然変異原性物質はガン原性物質で
ある可能性が強いこともよく知られている。特に
生活に身近なAF−２（２−（２−フリル）−３−
（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド）並
びに焼肉や焼魚等のコゲ成分中に存在するTrp−
Ｐ−１（３−アミノ−１，４−ジメチル−5H−ピ
リド〔４，３−ｂ〕−インドール）並びにTrp−
Ｐ−２（３−アミノ−１−メチル−5H−ピリド
〔４，３−ｂ〕インドール）等が突然変異原性を
示し、動物に発ガン性を誘発する物質であること
が報告されている。 本発明者等は先にキヤベツジユース（キヤベツ
を機械的に破砕し過して得られた液状物）中よ
り突然変異原性物質の突然変異原性を阻害する因
子を分離精製する方法を提案した（特開昭54−
122715号および米国特許4191752号明細書参照）。 この方法は (1) キヤベツジユースを遠心する工程、 (2) その上清を超遠心する工程、 (3) その上清を陰イオン交換セルロースと接触す
る工程、 (4) 陰イオン交換セルロースに吸着しない画分を
陰イオン交換セルロースに適用する工程、 (5) 低塩濃度で溶出する活性画分を採取する工
程、 (6) 該画分をさらに分子ふるいに吸着して精製す
る工程 とを含むことを特徴とする方法である。かくして
得られた最終画分は280nmおよび404nmに特異的
な吸収スペクトルを有し、熱に安定でタンパク分
解酵素で失活する特性を有するヘム蛋白である。 このキヤベツジユース中より分離精製した阻害
因子はTrp−Ｐ−１（３−アミノ−１，４−ジメ
チル−5H−ピリド〔４，３−ｂ〕−インドール）、
Trp−Ｐ−２（３−アミノ−１−メチル−5H−ピ
リド〔４，３−ｂ〕インドール）を始めＮ−ブチ
ル−Ｎ−アセトキシニトロソアミン、ソルビン酸
と亜硝酸塩との反応生成物、２−アミノアントラ
セン、エチジウムブロマイド、トリプトフアンや
オルニチン等のアミノ酸の加熱分解産物等の代謝
により突然変異原性を発現する各種突然変異原性
物質の突然変異原性を阻害することを認めてい
る。 しかしながら、キヤベツジユースからの最終画
分は上記のとおり蛋白分解酵素の共存下において
は失活し、又ヘアダイ用のニトロアミノベンゼン
系染料（例えば４−ニトロ−オルトフエニレンジ
アミン並びに２−ニトロ−パラフエニレンジアミ
ン）の如き代謝なしに突然変異原性を発現する突
然変異原性物質の突然変異原性を阻害することが
できないのみならず、かえつて突然変異原性を著
しく増強（促進）する欠点がある。 本発明者は先にAgric.Biol.Chem.42(6)、1236〜
1238頁、1978年に、キヤベツ、ブロツコリ、シシ
トウガラシ、ナス、リンゴ、ゴボウ、エシヤロツ
ト、ジンジヤー、パイナツプルおよびミントの葉
のジユースを遠心して得られた上清は、トリプト
フアンの熱分解物の突然変異原性を阻害すること
を定性的に報告した。 これらの野菜および果物はいずれも代謝されて
突然変異原性を発現する物質による突然変異原性
を阻害する活性を示すが、本発明者のその後の研
究によれば、そのうち、ゴボウから得られた精製
された状態にある活性画分のみがニトロアミノベ
ンゼン系染料の如き代謝なしに突然変異原性を発
現する物質による突然変異原性を阻害する優れた
活性を示し、極めて特異的な作用を有することが
明らかとされた。 例えば、上記ジユースのうちゴボウジユースの
みが、代謝を受けずに突然変異原性を発現する例
えば２−ニトロ−ｐ−フエニレンジアミン、４−
ニトロ−ｏ−フエニレンジアミンの如きヘアダイ
用のニトロアミノベンゼン系染料の突然変異原性
を阻害することができ（しかしながら、その阻害
活性は低く充分満足し得る程度のものではない）、
またゴボウジユースは例えば２−ニトロ−４−ア
ミノフエノール、２−アミノ−５−ニトロフエノ
ールの如きヘアダイ用のニトロアミノベンゼン系
染料の突然変異原性を阻害するどころか却つて著
しく増大しめる（後に記述する実施例２において
本発明の高分子量物質とゴボウジユースとの比較
がなされている）。ゴボウジユースがこのように
突然変異原性を却つて増大せしめる理由は明らか
でないが、ゴボウジユース内に含まれるある種の
成分（不純物）が突然変異原性を増大せしめる原
因となつているものと考えられる。 また、本発明者の研究によれば、ゴボウと同様
にキク科に属する植物である、例えばシユンギ
ク、フキ、レタスのジユースから、ゴボウのジユ
ースからと同様にして得た水溶性物質もまたヘア
ダイ用のニトロアミノベンゼン系染料の如き代謝
なしに突然変異原性を発現する物質による突然変
異原性を阻害する活性を示さないことも明らかと
された。 なお、上記文献には、野菜および果物のジユー
スを遠心分離して得た上清が開示されているにす
ぎず、該上清液から活性成分を分離、精製する方
法従つて精製された状態にある該活性成分につい
ては記載も示唆もなされていない。 それ故、本発明の目的は、食べられるゴボウの
根が含有する突然変異原性を阻害する高分子量物
質を分離精製された状態で提供することにある。 本発明の他の目的は、代謝なしに突然変異原性
を発現する物質の突然変異原性を阻害する活性を
有する、ゴボウの根からの高分子量物質を分離精
製された状態で提供することにある。 本発明の更に他の目的は、高められた温度で処
理しても突然変異原性を阻害する活性を実質的に
低下しない上記高分子量物質を精製された状態で
提供することにある。 本発明の更に他の目的は、上記の如き高分子量
物質をゴボウから効率的に分離し且つ精製して取
得する方法を提供することにある。 本発明の更に他の目的および利点は以下の説明
から明らかとなろう。 本発明のかかる目的および利点は、本発明によ
れば、食べられるゴボウの根から抽出分離され
た、水又はアルカリ水溶液に可溶性の高分子量物
質であつて、 陰イオン交換セルローズに吸着されるが陽イオ
ン交換セルローズに吸着されず、 280〜300nmの範囲に吸収波長のピークを有し、 本文に記載した阻害効果試験に従つて突然変異
原性物質として２−ニトロ−ｐ−フエニレンジア
ミンを用いてサルモネラTA98からの復帰変異コ
ロニー数を測定した際、下記式 DM(%)＝（ａ−ｃ）−（ｂ−ｃ）／ａ−ｃ×100 ここで、ａはこの高分子量物質の非存在下にお
ける復帰変異コロニーの数であり、ｂはこの高分
子量物質の存在下における復帰変異コロニーの数
であり、そしてｃは自然突然変異コロニーの数で
ある、 で定義される突然変異阻害率(%)から50％を示す
該高分子量物質の濃度が該２−ニトロ−ｐ−フエ
ニレンジアミン１重量部に対し４〜６重量部であ
るような突然変異阻害活性を有し、 元素分析値は、 Ｈ：4.86±0.14(%)、Ｃ：48.01±0.28(%)、Ｎ：
5.53±0.41(%)およびＯ：41.60±0.55(%)を示し、 糖含量は9.55±0.25重量％であり、且つニンヒ
ドリン呈色反応は実質的に陰性である。 ゴボウの根から抽出分離された上記高分子量物
質によつて達成される。 また、本発明により提供される上記高分子量物
質は、 (a) ゴボウジユースを遠心分離することにより、
夾雑物を除去する、 (b) 得られた上清に１〜2Mのリン酸緩衝液（PH
約6.5〜約7.5）を混合し、この混合物に水溶性
の無機酸のアルカユ金属塩又はアンモニウム塩
を添加して塩析し、その後沈殿を分取する、 (c) その沈殿を約10〜約400mMのリン酸緩衝液
（PH約6.5〜約7.5）に溶解した後、その溶液を
透析する、 (d) 透析液を限外過して濃縮液を取出すか、ま
たはその濃縮液を凍結乾燥により粉末化する、 各工程及びさらに後述する工程を組合せる方法
によつて、ゴボウから分離し且つ精製して取得す
ることができる。 本発明においてゴボウとは、キク科
（Compositae）ゴボウ属（Arctium）に属する
Arctium Lappa Linne又はArctium Lappa L.
といわれるものであつて食べられるものである。 本発明において、該活性画分を分離精製する対
象として用いられるゴボウの根は、春又は秋に種
播きしその後３年以内に収穫したゴボウの根であ
り、好ましくは春に種播きしてその年の冬に収穫
するか又は秋に種播きして翌年の春に収穫したゴ
ボウの根である。これらは生のままあるいは乾燥
して用いることができる。 本発明者の研究によれば、本発明により提供さ
れるゴボウから取得される該高分子量物質は、そ
の突然変異原性の阻害活性が、高められた温度例
えば約100℃で15分間の処理によつても実質的に
低下しないという優れた特性を備えていることが
明らかにされた。 また、同様に該高分子量物質はその他の特徴と
してマンガンイオンにより、該阻害活性を大きく
低下せしめらるが、マグネシウムあるいはカルシ
ウムイオンによつては該阻害活性が実質的に低下
せしめられない性質を有していることも明らかと
された。 本発明方法により、ゴボウの根から該突然変異
性阻害物質を分離、精製するに際しては、夾雑物
を含む場合には先ずゴボウジユースを遠心分離す
ることによりその内に含まれる夾雑物を除去す
る。 ゴボウジユースは、生のゴボウの根を水洗しフ
イルターを備えたジユーサーにかけて大部分の繊
維質を除去した水溶液又は水懸濁液として取得す
るかあるいは乾燥したゴボウの根の粉末を水ある
いはリン酸緩衝液（PH約6.5〜約7.5）中に十分な
時間必要に応じ高められた温度下に懸濁させても
しくは擂潰機ですりつぶしそして大部分の繊維質
を除去し、水溶液又は水懸濁液として製造するこ
とができる。 乾燥したゴボウの根の粉末はできるだけ細かい
方がよくまたこの粉末を用いるときには通常、約
20゜〜約85℃で、約２〜24時間擂潰機ですりつぶ
し水溶液又は水懸濁液としてのジユースを製造す
るのが好ましい。 かくして製造されたゴボウジユースは夾雑物を
なお含む場合には遠心分離に付され夾雑物を除去
される。遠心分離は7000〜15000×Ｇの通常の遠
心分離であつてよく、また10万〜20万×Ｇの超遠
心分離であつてもよい。また、通常の遠心分離を
行つたのち超遠心分離を行つてもよい。 通常の遠心分離は通常30〜60分行なわれ、それ
によりジユース中の繊維質、ククロロプラストあ
るいはミトコンドリア等が除去される。また、超
遠心分離は通常１〜２時間行うのが好ましく、こ
れにより更にミクロソームあるいはリボソーム等
が除去される。 ゴボウジユースから上記のようにして夾雑物を
除去した上清に次いでリン酸緩衝溶液約（PH6.5
〜約7.5）が添加される。ゴボウ粉末にリン酸緩
衝溶液を加えてジユースを製造した場合には、場
合により更にリン酸緩衝溶液を加えなくてもよ
い。この場合も、本発明の範囲に包含されること
は理解されるであろう。 ゴボウジユースに添加されるリン酸緩衝溶液と
しては上記のとおり通常約6.5〜約7.5の範囲のも
のが好ましく用いられる。これらは通常、リン酸
の１ナトリウム塩又は１カリウム塩とリン酸の２
−ナトリウム塩又は２−カリウム塩とから成る。
好ましくはリン酸１−カリウム塩とリン酸２−カ
リウム塩から成る。 また、リン酸緩衝溶液としては通常約１〜２モ
ルの濃度のものを用いるのが便利である。 かかるリン酸緩衝溶液は、上清に対し1/20〜1/
１００容量部で添加するのが好ましい。 リン酸緩衝溶液は、リン酸緩衝溶液を添加され
た上清中においてリン酸イオンの濃度が約10〜約
400mMとなるように添加するのがよい。 得られた溶液に対し次いで塩析のために添加さ
れる塩は、水溶性の無機酸のアルカリ金属塩又は
アンモニウム塩である。無機酸としては、例えば
炭酸、硫酸、塩酸あるいはリン酸等の鉱酸があげ
られる。かかる無機酸のアルカリ金属塩又はアン
モニウム塩としては、好ましくは炭酸カリウム、
硫酸アンモニウム、、硫酸ナトリウム、リン酸カ
リウム等が用いられる。 水溶性の無機酸のアルカリ金属塩又はアンモニ
ウム塩の使用量は上清−リン酸緩衝液混合物の容
量を基準として、約30〜80重量％が好ましい。 かくして塩析された、沈殿を含む溶液はついで
該沈殿が分離される。分離には種々の手段例えば
過あるいは遠心分離等が用いられる。過は常
圧、減圧あるいは加圧下に行うことができる。遠
心分離により分離するのが望ましい。遠心分離は
上記の如き条件下に通常いわゆる通常の遠心分離
により行なわれる。 分離して取得された沈殿物は、次いで約10〜約
400mMのリン酸緩衝溶液（PH6.5〜7.5）に溶解せ
しめられ、溶液として透析に付される。リン酸緩
衝溶液は通常沈殿物１ｇ当り約５〜10mlの割合で
用いるのが望ましい。透析は、水あるいはリン酸
緩衝液等によつて行うことができるが、通常はリ
ン酸緩衝液によつて行うことが好ましい。透析に
際し用いられる透析膜はセルロース膜あるいは人
工腎臓用のセロフアン膜等である。 透析によりかくして低分子量の物質を除去せし
められた透析溶液は、次いで限外過に付され
る。 透析溶液は限外過によつて濃縮される。限外
過は透析が1/3〜1/5容量に至るまで続けるのが
望ましい。 限外過に使用し得るフイルターとしては、
PM−30、XM−50、XM−100、XM−300（アミ
コン社製）等を挙げることができるが、分子量約
300000以下の分子を通過する限外過膜のXM−
300は特に好ましい。 かくして限外過を受けた濃縮液は本発明の高
分子量物質を構成する。本発明によれば、かかる
濃縮液は、更に必要に応じ通常の凍結乾燥に付さ
れ粉末とすることもできる。 濃縮液がリン酸緩衝液を含む場合には、濃縮液
に対し約３〜５倍容量の水を加えて再度限外過
に付すことが望ましい。 上記本発明方法により食べられるゴボウの根か
ら抽出分離された本発明の高分子量物質は、後に
記述する阻害効果試験に従つて測定した突然変異
阻害率によつて、充分な突然変異阻害活性を有す
ることが評価された。 本発明方法によれば、上記本発明方法に対し、
さらに部分的な変更を加えることにより、一層純
度の優れた状態で本発明の高分子量物質を製造す
ることができる。 このような変更は、透析液を限外過に付す前
に陽イオン交換体によつて処理し、処理液を限外
過に付す工程である。本発明の高分子量化合物
は陽イオン交換体に吸着されないので、この工程
によつて陽イオン交換体に吸着される不純物が除
去される。陽イオン交換体としては、陽イオン交
換基としてカルボキシル基、スルホン酸基あるい
はリン酸基等を有するセルロース、デキストラン
系交換体例えばCM−セルローズ、Ｐ−セルロー
ズ、CM−セフアデツクス、SP−セフアデツクス
あるいはCM−セフアロース等（フアルマシア社
あるいはワツトマン社製）が用いられる。 また、このような変更の他の一つは、上記限外
過して得られた濃縮液（限外過前に陽イオン
交換体により処理した場合あるいは処理しなかつ
た場合のいずれでもよい）を、約10〜約400mM
のリン酸緩衝液（PH約6.5〜約7.5）で希釈して再
度限外過に付す工程である。この再度限外過
は、好ましくは２〜３回行なわれ、その度に1/3
〜1/5容量に濃縮されリン酸緩衝液で限外過に
付す前の容量に希釈される。この再度の限外過
により、低分子量から相当に高分子量の物質（約
300000以下）までの不純物が相当程度の量除去す
ることができる。 この再度の限外過を実施した際には、得られ
た濃縮液を水によつて透析することが必要であ
り、それによつて本発明の高分子量物質をリン酸
塩を含まない溶液として得ることができる。 また、このような変更の更に他の一つは、限外
過又は再度限外過して得られた濃縮液を、ト
リクロル酢酸で処理して沈殿せしめる工程であ
る。この系から沈殿を分離することにより、濃縮
液から不純物主として糖に由来する不純物を除去
することができる。分離された沈殿は、次いで水
に懸濁され、水によつて透析されて含有するトリ
クロル酢酸を除去され、本発明の高分子量物質を
純度の高い状態で与える。上記工程において、ト
リクロル酢酸はそれを添加する濃縮液100c.c.に対
し１〜10ｇの割合で用いることができる。また、
生成した沈殿の分離は、例えば遠心分離、過等
によつて行うことができる。 本発明方法によれば、上記(a)〜(d)から成る方法
に、さらに上記３ツの変更のいずれか１つ又はそ
れ以上を組合せて実施することにより、極めて純
度の高い状態で本発明の高分子量物質が取得され
る。このような変更を加えて製造した本発明の高
分子量化合物は、水に対するよりもアルカリ水溶
液に対してより溶解し易い性質を示す。 本発明により提供される濃縮液又は粉末状の形
態にある、精製された状態の、高分子量物質は、
そのままであるいは適宜他の薬学的に許容され得
る担体又はアジユバントと一緒にされて人間又は
人間以外の他の動物に投与される。 本発明によれば、それ故、本発明の高分子量物
質を適宜薬学的に許容され得る担体又はアジユバ
ントと一緒に含んで成る薬学的組成物又は該組成
物から成る薬剤が同様に提供される。 担体又はアジユバントとしては通常当業者に周
知の例えば賦形剤（例えば、コーンスターチ、バ
レイシヨでんぷんの如きでんぷん類；乳糖、ジヨ
糖の如き糖類；硫酸カルシウム、リン酸カルシウ
ムの如き無機塩）、滑剤（例えば、ステアリン酸
マグネシウム、タルク）、崩壊剤（例えば、カル
ボキシメチルセルロース、セルロース、寒天等）、
カプセル用被包剤（例えばゼラチン）等をあげる
ことができる。 薬剤の形態としては、例えば錠剤、顆粒剤、糖
衣剤、粉剤、シロツプ、溶液又はカプセル剤等が
用いられる。 本発明の高分子量物質は、上記形態のものにあ
つては経口投与により投与するのが好ましい。ま
た、本発明の高分子量物質は、外用投与（皮膚塗
布）に用いることもできる。この場合には、軟膏
例えば油溶性基材例えばワツクスを用いた軟膏、
水含有エマルジヨン、水溶液等の形態で用いるの
が好ましい。 本発明によれば、本発明の高分子量物質を、突
然変異原性物質を摂取する前又は摂取した後の動
物に、単独であるいは上記組成物又は薬剤の形態
で、突然変異が生じるのを予防するのに有効な量
で投与し、該動物に突然変異原性物質により突然
変異が生じるのを予防する方法が提供される。投
与量は医者あるいは薬剤士等の専門家が投与すべ
き対象動物に対し適宜決めることができるが、通
常約100〜2.5ｇ／Kg体重／日等である。 本発明の活性画分は食物として食せられている
ゴボウの根が含有する成分であることから理解さ
れるとおりその毒性は問題にならない。 突然変異原性物質の摂取とは該物質に摂取する
ことはもちろん該物質に接信することを包含す
る。 本発明の高分子量物質は、代謝を受けずに突然
変異性を発現する物質はもちろん代謝を受けたの
ち突然変異性を発現する物質（突然変異原性物
質）により生じる突然変異の予防に極めて優れて
いる。特に、代謝を受けずに突然変異原性を発現
する物質に対しては、同じゴボウ根由来の成分で
あるにもかかわらず、ゴボウジユースとは全く異
なる優れた効果を発現する点で特異的でありまた
驚くべきことである。 上記代謝を受けずに突然変異原性を発現する突
然変異原性物質としては例えば２−ニトロ−ｐ−
フエニレンジアミン、４−ニトロ−ｏ−フエニレ
ンジアミン、２−アミノ−４−ニトロフエノー
ル、２−アミノ−５−ニトロフエノール、又はそ
れらの塩例えば硫酸塩等を挙げることができる。 また、代謝を受けたのち突然変異原性を発現す
る突然変異性物質としては例えばｐ−フエニレン
ジアミン、ｏ−フエニレンジアミン、２，４−ジ
アミノアニソール又はそれらの塩例えば硫酸塩を
挙げることができる。 本発明により提供される、凍結乾燥により得ら
れた高分子量物質は、何れの形態の薬剤とするに
も便利であり、また、水又はアルカリ水溶性に可
溶性でかつ安定な無臭、褐色の粉末であつて、保
存安定性が特に優れている。 本発明の高分子量物質が示す突然変異阻害活性
は、本発明者の研究によれば、突然変異原性物質
によつて発現される突然変異性を該物質に直接作
用するように該高分子量化合物が働いて阻害する
ように、発現されると考えられた。 それ故、本発明の高分子量物質は、特に突然変
異原性物質を摂取する可能性のある動物あるいは
明らかに摂取した動物に対し、突然変異性が発現
されないように予防的に使用することが望まし
い。 以下、実施例により、本発明方法による高分子
量物質の分離・精製する方法並びに本発明の高分
子量物質の突然変異阻害活性およびその他の特性
を更に詳細に説明する。 実施例 １（比較例） (1) ゴボウからの活性高分子量物質の分離・精
製： 冬に収穫したゴボウの根（5000ｇ）を水洗後、
ジユーサー（東芝JC−540A）により破砕し、約
3400mlのゴボウジユースを得た。 このジユース3400mlを9000×Ｇで30分遠心分離
し、褐色の透明な上清2200mlを得た。 この上清に1Mのリン酸緩衝液（PH6.8、リン酸
２−カリウムとリン酸１−カリウムとから成る。
以下同じ）を１／20量（容量）を混合した。次に
この混合物1100mlにその重量に対して80％量の硫
安を添加して塩析を行なつた。その後この塩析混
合物を9000×Ｇで15分間遠心分離して、沈殿物を
80ｇ得た。 この沈殿物60ｇを50mMリン酸緩衝液（PH6.8）
を用いて溶解し、全量を600mlとした。 この液を４℃において前記のリン酸緩衝液（PH
6.8）にて透析し、透析液696mlを得た。 次にこの透析液の464mlをメンブランフイルタ
ーXM−300（アミコン社製）を用いて限外過し
て１／３容量に濃縮した。この濃縮液に50mMリ
ン酸緩衝液（PH6.8）を加えて全量を200mlとし
て、再び上記と同じフイルターを用いて限外過
して濃縮をし、その濃縮液140mlを得た。 このうちの70mlの限外過濃縮液を凍結乾燥器
（セントラル科学社製、FDX−１−54）を用いて
−54℃で、24時間、凍結乾燥を行ない、高分子量
物質を乾燥粉末として450mg得た。 (2) 活性高分子量物質の紫外線吸収特性 凍結乾燥粉末の水溶液について測定した紫外線
吸収曲線を第１図に示した。第１図において、縦
軸は吸光度であり、横軸は波長（nm）を示して
いる。 本発明の活性画分は第１図から明らかなとお
り、280nm〜300nmの範囲に吸収波長のピーク
（極大波長約290nm）を有している。 (3) 活性高分子量物質の陰イオン交換樹脂および
陽イオン交換樹脂に対する吸着性 上記(1)の方法で得られた濃縮液27mlをDEAE−
セルローズ（陰イオン交換セルローズ）のクロマ
ト用カラムに送入した。その条件はカラムサイズ
2.5×12cm、溶出速度36ｍ／hr、溶出量10ml／試
験管とした。溶出緩衝液は50mMのリン酸緩衝液
に溶解した50mMの塩化カリウムから順次濃度を
上げて2Mの塩化カリウムまでの範囲内で溶出を
行つて前記吸着性を調べた。 その結果、DEAE−セルローズカラムに吸着せ
ずに溶出した画分には阻害活性を示す画分は検出
されなかつた。 又、同様に上記濃縮液７mlをCM−セルローズ
（陽イオン交換セルローズ）のカラムクロマトに
送入した。その条件はカラムサイズ2.5×７cm、
溶出速度40mg／hr溶出量5.8ml／試験管とした。
溶出緩衝液は50mMリン酸緩衝液に溶解した
50mMの塩化カリウムから順次濃度を上げて
0.1Mの塩化カリウムまでの範囲内で溶出を行つ
て、前記吸着性を調べた。 その結果、CM−セルローズカラムに吸着せ
ず、全て溶出した。その溶出曲線は添付図面の第
２図の通りである。第２図中のピークの上に付し
た横線は、その巾のフラクシヨンが変異原性阻害
活性を有していることを示している。尚、溶出し
た画分について後述する阻害効果試験を行つた結
果、突然変異阻害率は、88％を示した。これは後
述する第１表の乾燥粉末の水溶液（乾燥粉末を12
mg／mlで含む）の量が500μl／プレートの突然変
異阻害率（87.4％）とほぼ一致した。 この変異阻害率の結果からも本発明の活性高分
子量物質は強いアニオン性基を具備した高分子電
解質であることを認めた。 (4) 活性高分子量物質の阻害効果 (a) 阻害効果試験は、ジメチルスルフオキシド
0.02mlに溶解した当該突然変異原性物質に前述
の(1)の方法の各工程で得られた画分又は当該最
終画分（本発明の高分子量物質を含む画分）
0.5mlを加え37℃30分間反応させた。尚、対照
として各分画試料の代りにリン酸緩衝液を0.5
mlに混合し同様の反応を行なつた。 その後該反応系中を無菌化するため、100℃
にて10分間加熱処理した。 加熱処理後、ソフトアガー（0.6％Difco−
Agar）３mlを加え、サルモネラTA98（ヒスチ
ジン要求性）の菌液0.1mlを加えて、後記の選
択用寒天培地へ流し、37℃２日間培養し、ヒス
チジン非要求性の復帰変異コロニー数を数え
る。 又、前記突然変異原性物質が、代謝により初
めて突然変異性を発現するもの（例えば２−ア
ミノアントラセン、エチジウムブロマイド、
Trp−Ｐ−１並びにTrp−Ｐ−２等）を用いた
場合については、前記方法において後述の如く
調整して得られるＳ−9mixを前記ソフトアガ
ーへ0.3ml追加する外は同様にして調べた。Ｓ
−9mixは次のようにして調製した。即ちSD系
ラツトを用い、PCBにより薬物代謝酵素活性
を高めた肝ホモジネートを得た後、この肝ホモ
ジネートを遠心分離処理により肝ミクロゾーム
画分（Ｓ−９）を得る。 得られた肝ミクロゾームを以下の組成からな
る無機塩を加えることによつて該Ｓ−9mixを
調製した。 Ｓ−９に加えられる無機塩： 肝ミクロゾーム ３ml 0.25Mリン酸緩衝液 ４ml 0.16M MgCl₂ 0.5ml 0.66M KCl 0.5ml 0.05M Ｇ−６−Ｐ 1.0ml 0.04M NADP 1.0ml 選択用寒天培地： MM（X20） 50ml 40％Glucose 10ml 0.8％Difco nutrient broth 10ml ビオチン（100μg／ml） １ml アガー 15ｇ 蒸留水 930ml MM（X20）の組成： （NH₄）₂SO₄ 2.0％ KH₂PO₄ 20.0％ MgSO₄・7H₂O 0.2％ クエン酸ナトリウム 1.0％ KOHにてPH7.0に調整 阻害効果の活性は、上記と同様にして突然変
異原性物質に対する本発明の高分子量物質の濃
度を種々変えて行つた阻害効果試験によつて求
めた突然変異性を50％阻害するに必要な高分子
量物質の量（mg／プレート）を求めて表わし
た。 (b) ２−ニトロ−ｐ−フエニレンジアミン
（80μg／プレート）に対する突然変異性阻害効
果 乾燥粉末（本発明の活性高分子量物質）の突
然変異阻害効果に及ぼす濃度依存性を第１表に
示す。

【表】 以上の結果から明らかなように、本発明の高分
子量物質はその濃度依存性を示す（第１表）が、
いずれにしても２−ニトロパラフエニレンジアミ
ンに対して良好な阻害効果を示した。 本発明の高分子量物質（最終画分）が種々の突
然変異原性物質による突然変異性に及ぼす阻害効
果を第２表に示した。

【表】 ニレンジアミン
40 ＋ 56.9

【表】 第２表の結果は本発明の高分子量物質の特に顕
著な阻害効果を示している。すなわち、前記文献
に報告されている植物であるキヤベツやブロツコ
リーのジユース中に存在する阻害因子は、代謝を
経て突然変異性を発現する突然変異原性物質（エ
チジウムブロマイド、２−アミノアンスラセン、
Trp−Ｐ−１、Trp−Ｐ−２）のみに阻害効果を
示す反面、代謝を経ずして突然変異性を発現する
ニトロアミノベンゼン系染料の一部（２−ニトロ
パラフエニレンジアミン、４−ニトロオルソフエ
ニレンジアミン等）には阻害効果を示さないのに
対し、本発明の高分子量物質は、前記何れの突然
変異原性物質に対しても、第２表の如き顕著な阻
害効果を発現し、その作用効果の特異性は著し
い。 (5) 活性高分子量物質の耐熱性 次に、本発明の高分子量物質の耐熱性について
調べた。即ち、本発明の最終画分（凍結乾燥粉末
の水溶液）を100℃15分間還流加熱処理し次いで
室温まで冷却したものと、加熱処理をしない該最
終画分（水溶液）の、各500μlを第３表に示す濃
度の各突然変異原性物質と混合し37℃で30分間反
応せしめた。 次に前述(4)と同様に阻害効果試験を行つた。そ
の結果を第３表に示す。

【表】 上記のとおり、本発明の高分子量物質は加熱し
ても安定で且つ失活せず、しかも良好な阻害効果
を発現することが確認された。 (6) 活性画分の多価金属イオンに対する安定性更
に、本発明の高分子量物質（最終画分）の各種多
価金属イオンに対する安定性について調べた。 即ち、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化
カルシウムのそれぞれを、本発明の高分子量物質
（最終画分の凍結乾燥粉末の水溶液）に対して得
られる溶液中の濃度（最終濃度）が10mMになる
ように混合溶解した。これらの各溶液を37℃で30
分間処理した。 その後、それらの反応混合物500μlを第４表に
示す濃度の各突然変異原性物質と混合し、そして
37℃30分間反応した。反応後前述(4)と同様に阻害
効果試験を行つた。 その結果を第４表に示す。

【表】

【表】 以上のとおり、本発明の最終画分は塩化マグネ
シウム、塩化カルシウムに対しては極めて安定で
はあるが、塩化マンガンによつて、突然変異性の
阻害活性を大きく低下されるという特異性を具備
することが確認された。 実施例 ２ (1) ゴボウからの活性高分子量物質の分離・精
製： 春に収穫したゴボウの根（5000ｇ）を水洗後、
ジユーサー（東芝JC−540A）により破砕し、約
3400mlのゴボウジユースを得た。 このジユース3400mlを9000×Ｇで30分遠心分離
し、褐色の透明な上清2600mlを得た。 この上清に、1Mのリン酸緩衝液（PH6.8）を
１／20量（容量）を混合した。 次にこの混合物1500mlにその重量に対して80％
重量の硫安を添加して塩析を行なつた。その後こ
の塩析混合物を9000×ｇで15分間遠心分離して、
沈殿物90ｇを得た。 この沈殿物90ｇを50mMリン酸緩衝液（PH6.8）
を用いて溶解し全量を1000mlとした。 この液を４℃において前記リン酸緩衝液（PH
6.8）にて透析（セルロース膜）し、透析液1162
mlを得た。 次にこの透析液962mlを、あらかじめ50mMリ
ン酸緩衝液（PH6.8）で平衡化したCM−セルロー
ズ（ワツトマン製、wet volume500ｇ）に加え、
室温下５分間充分撹拌後、減圧過した。CM−
セルローズに吸着しなかつた画分としての液が
880ml得られた。 次に、この液の800mlをメンブランフイルタ
ーXM−300（アミコン社製）を用いて限外過し
て１／４容量に濃縮した。この濃縮液に50mMリ
ン酸緩衝液（PH6.8）を加えて全量を800mlとし再
び前記と同じフイルターを用いて限外過して濃
縮し、同操作をさらに２度くり返した。限外過
濃縮後、濃縮液（以下、最終限外過溶液とい
う）200mlを得た。このうちの130mlの限外過濃
縮液に最終濃度が２％になるようにトリクロル酢
酸を、室温、撹拌下徐々に添加した。その溶液を
室温で、10分撹拌した後生成した沈殿物を、9000
×ｇで15分間遠心分離して沈殿物4.5ｇを得た。 この沈殿物を130mlの水に再懸濁した。この沈
殿物を水を用いて透析し、脱塩することによつ
て、透析液約160mlを得た。これを凍結乾燥器
（セントラル科学社製、FDX−１−54）を用い
て、−54℃で48時間凍結乾燥を行ない、乾燥粉末
730mg（本発明の高分子量物質）を得た。 (2) 活性高分子量物質の紫外線吸収特性 実施例１(1)の活性高分子量物質と同様に280nm
〜300nmの範囲に吸収波長のピーク（極大波長約
290nm）を有している。 (3) 活性高分子量物質の陰イオン交換セルローズ
および陽イオン交換セルローズに対する吸着性 実施例１(1)に活性高分子量物質と同様に陰イオ
ン交換セルローズに吸着されるが陽イオン交換セ
ルローズに吸着されない性質を有していた。 (4) 活性高分子量物質の阻害効果 (a) 阻害効果試験は実施例１の(4)(a)に記載したと
同様にして行つた。 (b) ２−ニトロ−ｐ−フエニレンジアミン
（200μg／プレート）に対する突然変異阻害効
果 前記(1)の方法の各工程で得られた各画分につい
て求めた、突然変異性を50％阻害するに必要な各
画分の乾燥重量は、第５表に示したとおりであ
る。

【表】 また、乾燥粉末（本発明の活性高分子量物質）
の突然変異阻害効果に及ぼす濃度依存性を第６表
に示す。

【表】 以上の結果から明らかなように、本発明の高分
子量物質（凍結乾燥粉末）の阻害活性は、9000×
Ｇ上清（対照）の阻害活性の約15倍に、また塩析
後透析液の約２倍に高められ（第５表）、そして
本発明の当該最終画分はその濃度依存性を示す
（第６表）が、いずれにしても２−ニトロパラフ
エニレンジアミンに対して良好な阻害効果を示し
た。 本発明の活性高分子量物質（最終画分）が種々
の突然変異原性物質による突然変異性に及ぼす阻
害効果を第２表に示したと同じ突然変異原性物質
について、Ｓ−9mix添加した場合としない場合
とについて検討した。第２表に示した結果と同様
の結果が得られた。 (5) 活性高分子量物質耐熱性および多価金属イオ
ンに対する安定性 これらの性質は実施例１の活性高分子量物質と
同様であつた。 (6) 活性高分子量物質の固有粘度 該最終画分を、１％NaOH水溶液に溶解し、
１mg／ml、0.8mg／ml、0.5mg／mlおよび0.25mg／
mlの各濃度に調製した。この溶液0.5mlを採り、
キヤノンマニングセミミクロ粘度計No.100（蕪木科
学器械工業(株)）を用いて25±0.1℃における落下
時間を測定することにより粘度を求めた。別に対
照実験として１％NaOH水溶液の落下時間を測
定した。結果を第８表に示した。 該最終画分の各濃度における粘度値から、最少
自乗法によつて還元粘度（ηsp／ｃ）と濃度(C)と
の関係を示す直線を求め、濃度零に外挿して固有
粘度を求めた。該最終画分の固有粘度〔η〕は
37.0ml／ｇと求められた。 第 ８ 表 最終画分濃度（mg／ml） ηsp※／ｃ １ 37.35 0.8 37.23 0.5 37.67 0.25 36.78 (7) 活性高分子量物質の元素分析 該最終画分の元素分析の結果を第９表に示し
た、なお、元素分析はＨ，ＣおよびＮについて行
ない、その他は酸素原子として算出したものであ
る。

【表】 (8) 活性高分子量物質のカルボキシル基 テトラメチルシラン（TMS）を内部標準物質
として最終画分（固体）の¹³C−NMRスペクト
ルを測定した（Instrument：JEOL FX−100、
日本電子(株)製；Attachment closs
polarization／Magic Angle Spinning（CP／
MAS）unit）。 その結果、173.68，144.64，127.97，72.32およ
び31.09ppm（δTMS）を極大値とする広巾のシグ
ナルが見られた（¹³C Resonance Frequency＝
25.05MHz、Contact Time＝1.0ms）。 上記173.68ppmのシグナルはカルボキシル基の
存在を示している。 また、最終画分20mgをＮ／100NaOH（＝
1000、和光純薬(株)製）20mlに溶解させ、容量分析
用Ｎ／100H₂SO₄（＝1000、和光純薬(株)製）を
用いて、電位差滴定（逆滴定）を行つた。その結
果Ｎ／100H₂SO₄を13ml要した。 上記滴定量をカルボキシル基のみによるとする
と、最終画分は3.5eq／10³ｇのカルボキシル基を
有していると算出された。 (9) 活性高分子量物質の熱分解生成物 最終画分３mgを、590℃で、キユーリポイント
パイロライザー（Curie Point Pylolyzer；日本
分析工業製、JHP−２型）によつて熱分解し、
GC−Mass（日本電子製、JGC−20KPおよび
JEOL−D300）によりその熱分解物の同定を行つ
た。GC（ガスクロマトグラフイー）は、FFAP
（Free fatty acid polyester）を固定相液体とす
る0.25mmφ×80ｍのキヤピラリーカラム（Wall
coated open tubular Capillary Columm，ガス
クロ工業(株)製）を用い、10℃／minの昇温速度で
50〜180℃の温度範囲の条件下で行つた。 また、Massのイオン化電圧は70eVで行つた
（以下同じ）。 その結果、主成分としてCO₂、フエノール、ト
ルエン、ベンゼン、クレゾールおよびスチレンの
存在を確認した。 (10) 活性高分子量物質の還元分解 最終画分１ｇとラネ−Ni4ｇを４％NaOH溶液
100mlに溶解し、オートクレーブ中でH₂ガス100
Kg／cm²の圧力下に、100℃、6hrの条件下で、最終
画分を還元分解した。反応後、室温まで放冷し、
反応混合物をスペクトル用ジクロルメタンで抽出
し、前記と同じ機器のGC−Massにより、生成物
の同定を行つた。 GCは、シリコンSE−30を固定相液体とする
0.25mmφ×50ｍのキヤピラリーカラム（Wall
coated open tubular Capillary Column、ガス
クロ工業(株)製）を用い、10℃／minの昇温速度で
100〜250℃の温度範囲の条件下で行つた。 その結果主成分として安息香酸、フタリド
（phthalide）、３−フエニルプロパノールが検出
された。 (11) 活性高分子量物質の酸化分解 最終画分500mgに、ジアゾメタンエーテル溶液
５mlを添加し、室温下、30分反応した。反応後、
固形物をロ過、分取し、ジクロルメタンで数回洗
浄した。 その固形物を、S.Larsson等（Acta.Chem.
Scad.25647（1971））の方法に準じて過マンガン酸
カリウムによつて酸化分解した。 酸化分解生成物をクロロホルム：アセトン＝
１：１（容量比）で抽出した。ボウ硝で１晩乾燥
後、溶媒除去することによつて残渣を得た。 この残渣を0.5mlのメタノールに溶解した。 上記メタノール溶液を上記と同じ機器のGC−
Massにより生成物の同定を行つた。その結果、
安息香酸が検出された。 GCはGas−Chrom Ｑ上の15％FFAP（Packed
Column，Applied Science社製）を分配剤とす
る2.0mmφ×２ｍの充填カラムを用い、６℃／
minの昇温速度で50〜200℃の温度範囲で行つた。 (12) 活性高分子量物質の糖含量 最終画分の凍結乾燥粉末10mgを50mMリン酸緩
衝液10mlに加熱溶解した得られた水溶液につい
て、フエノール硫酸法（M.Dubolis.et.al.Anal.
Chem.，28，350（1956））で糖を定量した結果、
溶液１ml当り95.7μgの糖を含んでいた。従つて凍
結乾燥粉末中の総糖含量は9.55重量％と算出され
た。 (13) 活性高分子量物質の、ニンヒドリン呈色反
応 最終画分の凍結乾燥粉末を50mMリン酸緩衝液
（PH6.8）に溶解した溶液（１mg／ml）0.2mlに、
35％濃塩酸0.2mlを加え、110℃で２時間加水分解
を行つた。50℃で溶媒を減圧除去し、乾燥残渣を
得た。 この乾燥残渣を、50mMリン酸緩衝液（PH6.8）
１mlに溶解し、シリカゲル薄層板（Wakopure
Chemical Industries Ltd）上でｎ−プロパノー
ル：水＝64：36（容量比）によつて展開せしめた。
ニンヒドリンによつて呈色を試みたがシリカゲル
薄層板上に呈色するものは認められなかつた。 ニンヒドリン呈色反応は、アミノ酸の呈色反応
として知られている。 実施例 ３ 実施例２の(1)で得られた最終画分（凍結乾燥粉
末）６mgを50mMのリン酸緩衝液（PH6.8）１ml
に溶解した。この溶液を用いて、実施例１の(4)に
記載した方法に従い、第10表に記載した種々の突
然変異原性物質に対する突然変異阻害効果を求め
た。結果を第10表に合せて示した。 比較のため、実施例２の(1)における9000×Ｇ上
清画分（0.5ml／プレートで使用）についても同
様の試験を行つた。結果を第10表に合せて示し
た。

【表】 ことを示している。
上記の結果から、代謝を受けて突然変異原性を
発現する突然変異原性物質であるｏ−フエニレン
ジアミン、ｐ−フエニレンジアミンおよび２，４
−ジアミノアニソールに対しては、本発明の活性
高分子量物質も9000×Ｇの上清液も同様に突然変
異原性の発現を阻害するが、代謝されずに突然変
異原性を発現する突然変異原性物質である２−ア
ミノ−４−ニトロフエノールおよび２−アミノ−
５−ニトロフエノールに対しては、本発明の活性
高分子量物質は突然変異原性の発現を阻害するが
9000×Ｇの上清液は逆に突然変異原性を大巾に促
進することがわかる。 以上、要するに本発明の高分子量物質は、前述
の諸結果から明らかなように、強いアニオン性基
を有し、且つ280nm〜300nmの範囲に吸収波長の
ピークを有する高分子量物質であり、そして、マ
ンガンイオンにより阻害活性を大きく低下する特
性を持ち熱に著しく安定で多くの突然変異原性物
質特に代謝を受けずに突然変異性を発現する突然
変異原性物質の突然変異原性を阻害する高い阻害
活性を有する。 本発明の高分子量物質の構造の全ぼうは明らか
ではないが、上記各分析結果から明らかなとお
り、炭素、水素、窒素および酸素を含有して成つ
ており、ベンゼン環、糖構造およびカルボキシル
基を有するという構造的な特徴を有している。

【図面の簡単な説明】

添付図面の第１図は、本発明の活性高分子量物
質の紫外線吸収曲線である。同第２図は本発明方
法により得られた活性高分子量物質を含む溶液を
陽イオン交換セルローズに通じた際の溶出曲線で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (i) 食べられるゴボウの根から抽出分離され
   た、水又はアルカリ水溶液に可溶性の高分子量
   物質であつて、 (ii) 陰イオン交換セルローズに吸着されるが陽イ
   オン交換セルローズに吸着されず、 (iii) 280〜300nmの範囲に吸収波長のピークを有
   し、 (iv) 本文に記載した阻害効果試験に従つて突然変
   異原性物質として２−ニトロ−ｐ−フエニレン
   ジアミンを用いてサルモネラTA98からの復帰
   変異コロニー数を測定した際、下記式 DR（％）＝（ａ−ｃ）−（ｂ−ｃ）／ａ−ｃ×100 ここで、ａはこの高分子物質の非存在下にお
   ける復帰変異コロニーの数であり、ｂはこの高
   分子物質の存在下における復帰変異コロニーの
   数であり、そしてｃは自然復帰変異コロニーの
   数である、 で定義される突然変異阻害率（％）が50％を示す
   該高分子量物質の濃度が該２−ニトロ−ｐ−フエ
   ニレンジアミン１重量部に対し４〜８重量部であ
   るような突然変異阻害活性を有し、 (v) 元素分析値は、 Ｈ：4.86±0.14(%)、Ｃ：48.01±0.28(%) Ｎ：5.53±0.41(%)及びＯ：41.60±0.25(%) を示し、 (vi) 糖含量は9.55±0.25重量％であり、且つ (vii) ニンヒドリン呈色反応は実質的に陰性であ
   る、 ゴボウの根から抽出分離された上記高分子量物
   質。 ２ 突然変異阻害率が約100℃で15分間の熱処理
   によつて実質的に低下しない、特許請求の範囲第
   １項に記載の高分子量物質。 ３ 突然変異阻害率がマンガンイオンにより大き
   く低下する、特許請求の範囲第１項に記載の高分
   子量物質。 ４ (i) 食べられるゴボウの根から抽出分離され
   た、水又はアルカリ水溶液に可溶性の高分子量
   物質であつて、 (ii) 陰イオン交換セルローズに吸着されるが陽イ
   オン交換セルローズに吸着されず、 (iii) 280〜300nmの範囲に吸収波長のピークを有
   し、 (iv) 本文に記載した阻害効果試験に従つて突然変
   異原性物質として２−ニトロ−ｐ−フエニレン
   ジアミンを用いてサルモネラTA98からの復帰
   変異コロニー数を測定した際、下記式 DR(%)＝（ａ−ｃ）−（ｂ−ｃ）／ａ−ｃ×100 ここで、ａはこの高分子量物質の非存在下に
   おける復帰変異コロニーの数であり、ｂはこの
   高分子物質の存在下における復帰変異コロニー
   の数であり、そしてｃは自然復帰変位コロニー
   の数である、 で定義される突然変異阻害率(%)が50％を示す該
   高分子量物質の濃度が該２−ニトロ−ｐ−フエニ
   レンジアミン１重量部に対し４〜８重量部である
   ような突然変異阻害活性を有し、 (v) 元素分析値は、 Ｈ：4.86±0.14(%)、Ｃ：48.01±0.28(%) Ｎ：5.53±0.41(%)及びＯ：41.60±0.55(%)を
   示し、 (vi) 糖含量は9.55±0.25重量％であり、且つ (vii) ニンヒドリン呈色反応は実質的に陰性であ
   る、 ゴボウの根から抽出分離された上記高分子量物
   質を薬学的に許容される担体又は補助薬と一緒に
   含有してなる、突然変異阻害剤として使用される
   組成物。