JPH0371107B2 - - Google Patents

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JPH0371107B2
JPH0371107B2 JP63069844A JP6984488A JPH0371107B2 JP H0371107 B2 JPH0371107 B2 JP H0371107B2 JP 63069844 A JP63069844 A JP 63069844A JP 6984488 A JP6984488 A JP 6984488A JP H0371107 B2 JPH0371107 B2 JP H0371107B2
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JP
Japan
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plant organs
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plant
stirring
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Shinsaku Takayama
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02Stirrer or mobile mixing elements
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/18Flow directing inserts
    • C12M27/20Baffles; Ribs; Ribbons; Auger vanes

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  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は植物器官の大量培養法およびその培養
槽に関する。
〔従来の技術〕
植物組織の培養に用いる培養槽としては、例え
ば、通気撹拌型培養槽、エアリフト型培養槽が利
用されている他、気相培養装置(特開昭59−
45873号公報、特開昭59−45879号公報)、回転ド
ラム型培養槽(H.Tanakaら、バイオテクノロジ
ー・アンド・バイオエンジニアリング、25巻2359
ページ、1983年)、スピンフイルター型培養槽
(D.J.Styerら、プレナム・プレス刊「テイツシユ
ーカルチヤー・イン・フオレストリー・アンド・
アグリカルチヤー」、117ページ、1985年)などが
知られており、主として植物の細胞を培養する手
段として利用されてきた。しかし、植物の細胞が
通常数mm以下の集塊となり、まれに2〜3cm程度
の集塊を形成することもある程度にすぎないのに
対し、植物の器官、例えば根、茎葉、植物体など
を培養すると細胞と比較してはるかに大型に生長
し、通常でも数cm以上、時には数十cmにも達する
ことがあるので、従来報告されている培養槽はい
ずれも培養した植物器官が塊状になり、通気撹拌
を行つた場合には植物器官が強い剪断応力を受け
て生育が顕著に阻害されるので、植物の器官を効
率良く培養することは容易ではない。わずかに、
前記の培養装置の中で気相培養装置、回転ドラム
型培地装置、スピンフイルター型培養槽が良好で
あろうと考えられている程度である。
〔発明が解決しようとする課題〕
従来の培養槽を用いた場合には、いずれの培養
槽においても良く生育した植物器官が塊状になる
ことが多く、直径数cmから時には数十cmを越える
こともある。このように生育した植物器官は、塊
状になつた内部にまで酸素が供給されずに枯死し
てしまうので、植物器官を大量に培養する上で大
きな障害になつている。しかも、現在までに知ら
れている培養槽では、培養される植物器官に対し
て機械的な障害を与えずに植物器官を塊状になら
ないように効率良く培養する装置は知られていな
い。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は、植物器官の集塊を攪拌器でほぐしな
がら培養を行うことを特徴とする植物器官の培養
方法及び植物器官の集塊をほぐすための攪拌装置
を設けた植物器官の培養槽であつて、該攪拌装置
は複数の棒状攪拌端子が設けられた設けられた攪
拌軸と複数の棒状端子が設けられた邪魔部材とか
なり、該攪拌軸の攪拌端子と該邪魔部材の端子と
が攪拌軸の軸方向において交互に位置するよう設
けられている培養槽に関する。
本発明の培養槽5が第1図に例示される。攪拌
装置の攪拌軸1は棒状攪拌端子2を有している。
この端子は数は任意でよいが槽の大きさ植物器官
のほぐしたい程度によつて実験的に求めることが
できる。
ほぐし効果を高めるために培養槽には複数の棒
状端子4を有する邪魔部材3が設けられる。
攪拌軸1の棒状攪拌端子2と邪魔部材3の棒状
端子4とはお互いに接触しない位置にかつ攪拌軸
1の軸方向に交互に設けられており、空間におけ
る棒状攪拌端子2と邪魔部材3の棒状端子4の最
短距離が凡そのほぐした植物器官の大きさとな
る。
培養槽5には他に空気スパージヤー6、排気管
7、移植口8等が設けられる。
かかる装置を利用して培養を行う際、好ましく
は1〜5日毎に10〜60回/分の回転速度で20分〜
5時間作動させる。
攪拌機は槽のどこに設けてもよく、作動させる
とき以外培養液から離しておける構造が特に好ま
しく、当業者であればこれらの改良型培養槽を容
易に設計できる。
本発明の装置を用いて培養することにより植物
器官の集塊がほとんど形成されず、かつ損傷もほ
とんどなく培養することができるので効率良く多
量に植物器官を培養することができる。
本発明に用いられる植物器官としては、一般に
シダ類、裸子植物、被子植物に分類される植物の
器官であればいずれでも用いられるが、通常は、
葉、茎、芽、生長点、根、球根、胚などの植物器
官があげられるが、とくに大量に培養することが
本質的には可能であり、また大きな集塊を形成す
る特性を有している根や茎葉が望ましい。
植物器官は固体あるいは液体培養して増殖した
後、本発明の植物器官ほぐし装置を培養槽内に設
置した培養装置で培養する。もちろん、本発明の
培養装置で培養して増殖した後に、さらに本発明
の培養装置に移植してさらに培養を繰り返すこと
もできる。その際培養は例えば次のように行な
う。
植物器官を培養増殖する培地の組成は基本的に
は植物組織の培養に用いる培地であればいかなる
培地でも利用することができる。すなわち、培地
としては、10〜100g/1の糖、0.1〜10mg/1の
植物ホルモン類および窒素源、無機物、ビタミン
類などをほどよく含有するものであれば天然また
は合成培地のいずれでも用いられる。
糖としては、シユークロース、グルコース、ラ
クトース、マルトースなどが用いられる。
植物ホルモン類としては、オーキシン類(α−
ナフタレン酢酸、2,4−ジクロロフエノキシ酢
酸、インドール酢酸、インドール酪酸など)、サ
イトカイニン類(カイネチン、ベンジルアデニ
ン、ゼアチン、4PUなど)、ジベレリン類(主と
してGA3,GA4,Ga7など)、アブサイジン酸、
エチレンなどが用いられる。
窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナトリウ
ム、硝酸アンモニウム、硝酸カルシウム、硫酸ア
ンモニウム、アミノ酸類(グリシン、グルタミン
酸、リジン、アスパラギン酸など)、イーストエ
キス、肉エキス、ペプトンなどが用いられる。
無機物としては、塩化カリウム、塩化カルシウ
ム、塩化マンガン、塩化ニツケル、塩化コバル
ト、塩化アルミニウム、塩化鉄、硫酸マグネシウ
ム、硫酸ナトリウム、硫酸ニツケル、硫酸鉄、硫
酸マンガン、硫酸チタン、硫酸亜鉛、硫酸銅、リ
ン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、
ヨウ化カリウム、ホウ酸、モリブデン酸ナトリウ
ムなどが用いられる。
その他必要に応じて培地にビタミンB1、イノ
シトール、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸、塩酸
チアミン、ビオチンなどを加えてもよい。
具体的な培地としてはムラジゲ・スクーグ氏培
地、リンスマイヤー・スクーグ氏培地、ホワイト
氏培地、クノツプ氏培地などが用いられる。
培養は温度10〜35℃,照度0〜20,000ルクス、
pH3.5〜8.5で行い、培養時間は10〜100日間であ
ることが多い。
植物器官の一般的な培養方法ならびに本発明
の方法で植物器官をほぐしながら培養する方法の
工程を以下に示す。
植物器官の培養には基本的には既知の方法が用
いられる。すなわち、一般的には次のような手順
で植物器官の造成、増殖培養を行なう。まず、植
物の葉、茎、根などの組織を小片(5×5〜50×
50mm)に切断し、表面を例えば次亜塩素酸ソー
ダ、エチルアルコールなどで殺菌処理した後、無
菌水で良く洗う。このように表面殺菌した小片を
滅菌固体培地に培地2〜10ml当り小片1個の割合
で置床後、10〜35℃で20〜50日間静置培養すると
茎葉、根などの分化組織の塊が得られる。かくし
て得られる分化組織の塊を滅菌した植物組織培養
用液体培地を含むフラスコまたは培養槽に移植し
液体培養する。液体培地での培養は、例えば300
ml容エルレンマイヤーフラスコでは30〜200ml程
度の液体培地と培地100ml当り上記の組織塊を1
〜5個を移植し、10〜35℃、毎分60〜250回転の
振とう培養を行なう。培養槽を用いる場合は、例
えば3容の培養槽を用いる場合は1〜2の培
地と上記分化組織塊を培地100ml当り1から5個
を培養槽に入れ、10〜35℃で毎分0.5〜3の無
菌空気を通気しつつ培養する。このようなフラス
コまたは培養槽による液体培養により移植した分
化組織がさらに生育して移植した量の2から20倍
に生育したら、生育した分化組織を2〜20個に分
割してフラスコあるいは培養槽を用いた液体培地
に上記の方法と同様に液体培地100ml当り分割し
た組織を液体培地100ml当り1〜5個移植して同
一条件で培養する操作を繰り返して分化組織を増
殖する。このような方法を初めとして、たとえば
特開昭54−40138,特開昭55−15734,特開昭55−
118319,特開昭61−36022などの既知の方法がそ
のまま利用できる。
前期培養によつて得られる培養物を培養槽に移
植し大量培養する。
本発明に用いる植物器官ほぐし装置の一例を第
1図に示す。
以下に実施例を示す。
〔発明の実施例〕
実施例 1 ベラドンナの茎を約5cmの長さに切り、70%エ
チルアルコールで2分間、次いで次亜塩素酸ナト
リウム水溶液(有効塩素量0.5%)で100分殺菌し
た後に5〜10mmの切片に切つた。該切片を、第1
表に示したムラシゲ・スクーグ培地にN−(2−
クロロ−4−ピリジル)N−フエニル尿素を培地
1当り1mgおよび寒天を培地1当り8gの濃度で
添加した培地10mを含有する直径24mm、長さ125
mmの試験管に移植し、22℃、2500スクス連続照明
下30日間培養した。
培養30日後、生育した組織を無菌的に取り出
し、ピンセツトとメスを用いて組織から発生した
根のみを無菌的に採取した。これらの根を再度、
第2表の組成を有する新しく作成した培地100ml
を含有するコニカルビーカーに移植して、22℃で
30日間培養し、生育した根の塊を得た。この根の
塊をピンセツトとメスを用いて無菌的に分割し、
第1表の培地および前記と同様の培養方法で継代
増殖を繰り返して根のみを増殖させた。このよう
にして増殖した根を無菌的に取り出し、ピンセツ
トとメスを用いて組織から発生した根のみを無菌
的に採取した。これらの根を第2表の組成のうち
シユークロースを60.0gに変更し、さらにα−ナ
フタレン酢酸を0.3mgに変更した液体培地8を含
有する10容の本発明第1図の培養槽に培養槽当り
コニカルビーカー4本分を移植して、22℃で40日
間第1図、器官ほぐし装置を2日に1回2時間づ
つ毎分30回転でほぐし装置を運転して培養した。
その結果、根が集塊を形成することなく分枝増殖
し、培養槽全体に均一に分散して生育し、培養槽
当り3700g(乾燥重として210g)に達した。これ
に対し、ほぐし装置を内蔵しない培養槽を用いた
場合は根が液面下に浮き上がり、培養槽内部に充
満する形に生育し、集塊内部の根は枯死するに至
つた。根の生育量は培養槽当たり2400g(乾燥重
とし130g)にすぎなかつた。
第1表 ムラシゲ・スクーグ改変培地 硫酸アンモニユウム 825mg 硝酸カリウム 950mg 塩化カルシウム・2水塩 220mg 硫酸マグネシウム・7水塩 185mg リン酸第一カリウム 85mg Na2・EDTA・2水塩 18.65mg 硫酸第一鉄・7水塩 13.9mg ホウ酸 3.1mg 硫酸マンガン・4水塩 11.15mg 硫酸亜鉛・7水塩 4.3mg ヨウ化カリウム 0.415mg モリブデン酸ソーダ・2水塩 0.125mg 硫酸第一銅 0.0125mg 塩化コバルト 0.0125mg ビタミンB1 0.2mg イノシトール 50.0mg 塩化ピリドキシン 0.25mg ニコチン酸 0.25mg グリシン 1.00mg シユークロース 30.0g ナフタレン酢酸 0.1mg 第2表 ムラシゲ・スクーグ培地 硫酸アンモニウム 1,650mg 硝酸カリウム 1,900mg 塩化カルシウム・2水塩 440mg 硫酸マグネシウム・7水塩 370mg リン酸第一カリウム 170mg Na2・EDTA・2水塩 37.3mg 硫酸第一鉄・7水塩 27.8mg ホウ酸 6.2mg 硫酸マンガン・4水塩 22.3mg 硫酸亜鉛・7水塩 8.6mg ヨウ化カリウム 0.83mg モリブデン酸ソーダ・2水塩 0.25mg 硫酸第一銅 0.025mg 塩化コバルト 0.025mg ビタミンB1 0.40mg イノシトール 100mg 塩酸ピリドキノン 0.50mg ニコチン酸 0.50mg グリシン 2.00mg シユークロース 30.0g 〔発明の効果〕 本発明装置で植物器官を培養することにより、従
来の培養法では集塊を形成することが多く培養効
率の低下の原因となつていた問題点が解決され、
植物器官を培養槽内に分散させながら均一に効率
良く培養することができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の培養槽の1例を示す。 1……攪拌軸、2……棒状攪拌端子、3……邪魔
部材、4……棒状端子、5……培養槽、6……空
気スパージユー、7……排気管、8……移植口。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 植物器官の集塊を攪拌器でほぐしながら培養
    を行うことを特徴とする植物器官の培養方法。 2 植物器官の集塊をほぐすための攪拌装置を設
    けた植物器官の培養槽であつて、該攪拌装置は複
    数の棒状攪拌端子が設けられた攪拌軸と複数の棒
    状端子が設けられた邪魔部材とからなり、該攪拌
    軸の攪拌端子と該邪魔部材の端子とが攪拌軸の軸
    方向において交互に位置するよう設けられている
    培養槽。
JP63069844A 1988-03-25 1988-03-25 植物器官の培養法及びその培養槽 Granted JPH01243985A (ja)

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