JPH0372882A - 合成二本鎖ｄｎａ配列の構築 - Google Patents
合成二本鎖ｄｎａ配列の構築Info
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- JPH0372882A JPH0372882A JP2117806A JP11780690A JPH0372882A JP H0372882 A JPH0372882 A JP H0372882A JP 2117806 A JP2117806 A JP 2117806A JP 11780690 A JP11780690 A JP 11780690A JP H0372882 A JPH0372882 A JP H0372882A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は組換えＤＮＡの技術分野に関し、より詳しく
は遺伝子のような二本鎖ＤＮＡ配列の構築方法に関する
。
は遺伝子のような二本鎖ＤＮＡ配列の構築方法に関する
。
原核細胞および真核細胞における外来のタンパク質の生
産は、遺伝子の発現に適する調節配列を担持するプラス
ミド（ベクター）に適当な遺伝子を挿入し、次いで適当
な宿主細胞へのこれらの発現ベクターをトランスフェク
ションすることを必要とする。
産は、遺伝子の発現に適する調節配列を担持するプラス
ミド（ベクター）に適当な遺伝子を挿入し、次いで適当
な宿主細胞へのこれらの発現ベクターをトランスフェク
ションすることを必要とする。
遺伝子は、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎ：ｎ ：
Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ（１９８２）、
Ｍａｎｉａｔｉｓら、に記載されるような標準的遺伝子
クローニング技法によって得られている。このような技
法は、クロモシームからの直接的な遺伝子の単離（米国
特許第４．７０７．４５５号）またはｇｇＲＮＡ中間体
を介する間接的な遺伝子の単離を必要とする。
Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ（１９８２）、
Ｍａｎｉａｔｉｓら、に記載されるような標準的遺伝子
クローニング技法によって得られている。このような技
法は、クロモシームからの直接的な遺伝子の単離（米国
特許第４．７０７．４５５号）またはｇｇＲＮＡ中間体
を介する間接的な遺伝子の単離を必要とする。
また、ＤＮＡ化学、機器および酵素学の進歩は、特異的
なりＮＡオリゴヌクレオチドから試験内における遺伝子
の合成を可能にした。合成遺伝子の潜在力は、それらの
クローニングした天然の相対物を凌駕する数々の利点を
有する。それらは、−般に、解読フレーム中にイントロ
ン領域を含まないので真核性遺伝子よりも遥かに簡潔で
ある。また、それらは、一般に遺伝子が単離されたとき
存在する大きなりＮＡ非翻訳配列を含まない、さらに、
遺伝子コードにおける縮重のためアミノ酸コドンは、宿
主によって利用される最適コドンにマツチするように選
ぶことができ、より高いレベルのタンパク質産生をもた
らす。特異なりＮＡ制限酵素部位は、遺伝子の設計の一
部となりうるか、またはその遺伝子の末端に付加するこ
とができ、そしてこれが発現ベクター中に遺伝子をクロ
ーン化するための手段をもたらし、しかも宿主へのその
導入によりその遺伝子のスクリーニングを可能にする。
なりＮＡオリゴヌクレオチドから試験内における遺伝子
の合成を可能にした。合成遺伝子の潜在力は、それらの
クローニングした天然の相対物を凌駕する数々の利点を
有する。それらは、−般に、解読フレーム中にイントロ
ン領域を含まないので真核性遺伝子よりも遥かに簡潔で
ある。また、それらは、一般に遺伝子が単離されたとき
存在する大きなりＮＡ非翻訳配列を含まない、さらに、
遺伝子コードにおける縮重のためアミノ酸コドンは、宿
主によって利用される最適コドンにマツチするように選
ぶことができ、より高いレベルのタンパク質産生をもた
らす。特異なりＮＡ制限酵素部位は、遺伝子の設計の一
部となりうるか、またはその遺伝子の末端に付加するこ
とができ、そしてこれが発現ベクター中に遺伝子をクロ
ーン化するための手段をもたらし、しかも宿主へのその
導入によりその遺伝子のスクリーニングを可能にする。
その上、プロモーター、エンハンサ−および翻訳調節シ
グナルのような遺伝子調節配列は、宿主におけるタンパ
ク質の生産を制御する目的にかなう遺伝子中で都合よく
設計される。
グナルのような遺伝子調節配列は、宿主におけるタンパ
ク質の生産を制御する目的にかなう遺伝子中で都合よく
設計される。
試験管内での化学合成遺伝子についての各種の手順が多
種多様な遺伝子の構築に使用されてきた。
種多様な遺伝子の構築に使用されてきた。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １６
（１９８８） ４２８７〜４２９８ページ、 Ｇｒｏｇ
ｅｒら、を参照のこと。これらの手順の殆どは、遺伝子
の二つのＤＮＡ鎖を含んでなるオリゴヌクレオチドの調
製と究極的には完全な二本鎖遺伝子を与えるためにそれ
らを一緒に結合することを必要とする。最も広範に使用
される手順は、アニール化しそして一緒に結合（連結）
したとき、完全な遺伝子を構成する一連の短い重複オリ
ゴヌクレオチド（鎖長、それぞれ約４０ヌクレオチド）
の二つの鎖の化学合成を必要とする。
（１９８８） ４２８７〜４２９８ページ、 Ｇｒｏｇ
ｅｒら、を参照のこと。これらの手順の殆どは、遺伝子
の二つのＤＮＡ鎖を含んでなるオリゴヌクレオチドの調
製と究極的には完全な二本鎖遺伝子を与えるためにそれ
らを一緒に結合することを必要とする。最も広範に使用
される手順は、アニール化しそして一緒に結合（連結）
したとき、完全な遺伝子を構成する一連の短い重複オリ
ゴヌクレオチド（鎖長、それぞれ約４０ヌクレオチド）
の二つの鎖の化学合成を必要とする。
例えば、４００塩基対（ｂｐ）の比較的小さい遺伝子を
化学合成するには、この通常の手順では合計８００塩基
（４００Ｘ２鎖）が合成されることを必要とする。これ
は、それぞれ４０塩基の２０個のオリゴヌクレオチドを
個別に合成することによって行うことができる。次に、
これらがゲル電気泳動および／または高性能液体クロマ
トグラフィーにより精製されるだろう。精製後、これら
の２０個の一本鎖オリゴヌクレオチドの各々はリン酸化
され、−緒に混合されそして加熱され、次いで徐々に冷
却される。この処理は、−本領オリゴヌクレオチドをそ
れらの相同な相手とのアニーリングをもたらす。この混
合物にＤＮＡリガーゼが添加され、こうして完全な遺伝
子を形成するための二本鎖ＤＮＡ配列（ｄｓＤＮＡ）セ
グメントが連結される。
化学合成するには、この通常の手順では合計８００塩基
（４００Ｘ２鎖）が合成されることを必要とする。これ
は、それぞれ４０塩基の２０個のオリゴヌクレオチドを
個別に合成することによって行うことができる。次に、
これらがゲル電気泳動および／または高性能液体クロマ
トグラフィーにより精製されるだろう。精製後、これら
の２０個の一本鎖オリゴヌクレオチドの各々はリン酸化
され、−緒に混合されそして加熱され、次いで徐々に冷
却される。この処理は、−本領オリゴヌクレオチドをそ
れらの相同な相手とのアニーリングをもたらす。この混
合物にＤＮＡリガーゼが添加され、こうして完全な遺伝
子を形成するための二本鎖ＤＮＡ配列（ｄｓＤＮＡ）セ
グメントが連結される。
連結反応は、一般に、予定したサイズ（すなわち、４０
０ｂｐ）のＤＮＡ断片が得られたことを確認するために
ゲル電気泳動によって特性決定されている。しかしなが
ら、アニーリングおよび連結段階におけるオリゴヌクレ
オチド混合物の複雑さのため、正確な配列を有する適正
な遺伝子を与えるように新な遺伝子が組み立てられてい
る正しいサイズの断片を得ることは必ずしも確実でない
。従って、合成遺伝子はＤＮＡ配列決定による特性決定
のためにプラス逅ドにクローニングされる。この配列が
正しくない場合には、その遺伝子を修正するかまたは前
記の全工程を再び実施しなければならない。その遺伝子
が正しい配列を有する場合には、次に、それを遺伝子の
調節シグナルに関して適正な配向をもつ別のプラスごド
にサブクローニングしなければならない。次に、合成遺
伝子がタンパク質生産に使用される。
０ｂｐ）のＤＮＡ断片が得られたことを確認するために
ゲル電気泳動によって特性決定されている。しかしなが
ら、アニーリングおよび連結段階におけるオリゴヌクレ
オチド混合物の複雑さのため、正確な配列を有する適正
な遺伝子を与えるように新な遺伝子が組み立てられてい
る正しいサイズの断片を得ることは必ずしも確実でない
。従って、合成遺伝子はＤＮＡ配列決定による特性決定
のためにプラス逅ドにクローニングされる。この配列が
正しくない場合には、その遺伝子を修正するかまたは前
記の全工程を再び実施しなければならない。その遺伝子
が正しい配列を有する場合には、次に、それを遺伝子の
調節シグナルに関して適正な配向をもつ別のプラスごド
にサブクローニングしなければならない。次に、合成遺
伝子がタンパク質生産に使用される。
この発明の課題は、遺伝子のような二本鎖ＤＮＡ配列の
前述の生産が多種多様な反応、クローニングおよび単離
工程を必要とすることにある。
前述の生産が多種多様な反応、クローニングおよび単離
工程を必要とすることにある。
この発明は、従来法の多くの欠点を除去するような特定
の二本鎖ＤＮＡ配列の合成方法を提供する。この方法は
、次の各工程を含んでなる。
の二本鎖ＤＮＡ配列の合成方法を提供する。この方法は
、次の各工程を含んでなる。
Ａ）合成すべき二本鎖ＤＮＡ配列を同定する工程、
Ｂ）ｉ）デオキシウリジンを含むヌクレオチド配列ゼの
ような薬剤耐性遺伝子（ａｍｐ）を含んでなる一本鎖Ｄ
ＮＡベクターを提供する工程、Ｃ）ｉ）５’およびＪ末
端を有し、ｉｉ）合成すべき二本１ｉ Ｄ Ｎ Ａ配列
のうちの一の一本鎖を有する第一のフラグメントに従う
ヌクレオチド配列を有しモして山） ａ）前記−本領Ｄ
ＮＡベクターのヌクレオチド配列に少なくとも部分的に
相補的で、かつｂ）３′末端の相補性が５′およびＪ両
末端上にプライムするのに十分である追加のヌクレオチ
ドプライムするのに十分である追加のオリゴヌクレオチ
ドを合成する工程、 Ｄ）前記−本領ベクターに前記第一のオリゴヌクレオチ
ドフラグメントをハイブリダイゼーションしてヘテロニ
重鎮を形成する工程、 Ｅ）ブライマーとして前記第一のオリゴヌクレオチドの
Ｊ末端を使用して前記−本領ＤＮＡベクターに対するデ
オキシウリジンを含まない第二の相補鎖を合成すること
により二本鎖ベクターを形成する工程、 Ｆ）酵素ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ｕｎｇ”）を含
むＥ・コリー（Ｅ、 ｃｏｌｉ）株を、前記二本鎖ＤＮ
Ａベクターでトランスフェクションする工程、Ｇ）前記
ｕｎｇ”、 ａｍｉｐｍミル耐性クローニングリーのコ
ロニーから前記第一のオリゴヌクレオチドを含有する二
本鎖ＤＮＡベクターを選抜する工程、Ｈ）工程Ｇ）で選
抜されたベクターでｄＵＴＰａｓｅおよびウラシルＮ−
グリコシラーゼ欠失Ｅ・コリー株（ｄｕｔ−、ｕｎｇ−
）をトランスフェクションする工程、 ■）工程Ｈ）でトランスフェクションしたＥ・コリーか
ら（ｉ）ヌクレオチド配列中にデオキシウリジンおよび
（ｉｉ ）前記第一のオリゴヌクレオチドを含む一本鎖
ベクターを単離する工程、Ｊ）ｉ）５’およびＪ末端を
有し、ｉｉ）工程Ｃ）ｉ）で選択的に合成すべき二本鎖
ＤＮＡ配列と同一の一本鎖の第二のフラグメントに従う
ヌクレオチド配列を有し、モしてｉｉｉ） ａ）第一〇
合成オリゴヌクレオチドフラグメントのご末端上のヌク
レオチド配列に相補的である５′末端とｂ）第一の合成
オリゴヌクレオチドフラグメントのＪ末端上の追加の配
列と同一である「末端とに追加のヌクレオチド配列を有
する第二のオリゴヌクレオチドを合成する工程、 Ｋ）工程Ｄ）からＧ）までを繰り返し、第一〇合成オリ
ゴヌクレオチドフラグメントを有するフレーム中にＩ）
のベクター中の第二のオリゴヌクレオチドを挿入する工
程、ならびに Ｌ）工程Ａ）で同定される完全な特定の二本鎖ＤＮＡ配
列の合成が終了するまで、追加のオリゴヌクレオチドフ
ラグメントについて工程Ｋ）次いで工程Ｄ）からＪ）ま
でを繰り返す工程。
ような薬剤耐性遺伝子（ａｍｐ）を含んでなる一本鎖Ｄ
ＮＡベクターを提供する工程、Ｃ）ｉ）５’およびＪ末
端を有し、ｉｉ）合成すべき二本１ｉ Ｄ Ｎ Ａ配列
のうちの一の一本鎖を有する第一のフラグメントに従う
ヌクレオチド配列を有しモして山） ａ）前記−本領Ｄ
ＮＡベクターのヌクレオチド配列に少なくとも部分的に
相補的で、かつｂ）３′末端の相補性が５′およびＪ両
末端上にプライムするのに十分である追加のヌクレオチ
ドプライムするのに十分である追加のオリゴヌクレオチ
ドを合成する工程、 Ｄ）前記−本領ベクターに前記第一のオリゴヌクレオチ
ドフラグメントをハイブリダイゼーションしてヘテロニ
重鎮を形成する工程、 Ｅ）ブライマーとして前記第一のオリゴヌクレオチドの
Ｊ末端を使用して前記−本領ＤＮＡベクターに対するデ
オキシウリジンを含まない第二の相補鎖を合成すること
により二本鎖ベクターを形成する工程、 Ｆ）酵素ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ｕｎｇ”）を含
むＥ・コリー（Ｅ、 ｃｏｌｉ）株を、前記二本鎖ＤＮ
Ａベクターでトランスフェクションする工程、Ｇ）前記
ｕｎｇ”、 ａｍｉｐｍミル耐性クローニングリーのコ
ロニーから前記第一のオリゴヌクレオチドを含有する二
本鎖ＤＮＡベクターを選抜する工程、Ｈ）工程Ｇ）で選
抜されたベクターでｄＵＴＰａｓｅおよびウラシルＮ−
グリコシラーゼ欠失Ｅ・コリー株（ｄｕｔ−、ｕｎｇ−
）をトランスフェクションする工程、 ■）工程Ｈ）でトランスフェクションしたＥ・コリーか
ら（ｉ）ヌクレオチド配列中にデオキシウリジンおよび
（ｉｉ ）前記第一のオリゴヌクレオチドを含む一本鎖
ベクターを単離する工程、Ｊ）ｉ）５’およびＪ末端を
有し、ｉｉ）工程Ｃ）ｉ）で選択的に合成すべき二本鎖
ＤＮＡ配列と同一の一本鎖の第二のフラグメントに従う
ヌクレオチド配列を有し、モしてｉｉｉ） ａ）第一〇
合成オリゴヌクレオチドフラグメントのご末端上のヌク
レオチド配列に相補的である５′末端とｂ）第一の合成
オリゴヌクレオチドフラグメントのＪ末端上の追加の配
列と同一である「末端とに追加のヌクレオチド配列を有
する第二のオリゴヌクレオチドを合成する工程、 Ｋ）工程Ｄ）からＧ）までを繰り返し、第一〇合成オリ
ゴヌクレオチドフラグメントを有するフレーム中にＩ）
のベクター中の第二のオリゴヌクレオチドを挿入する工
程、ならびに Ｌ）工程Ａ）で同定される完全な特定の二本鎖ＤＮＡ配
列の合成が終了するまで、追加のオリゴヌクレオチドフ
ラグメントについて工程Ｋ）次いで工程Ｄ）からＪ）ま
でを繰り返す工程。
以下、この発明をより具体的に説明する。
この方法の工程Ａ）からＩ）までは、第１図に略図とし
て示されている。ここでは、−本領ＤＮＡ配列の一部の
デオキシチミジンが置き代えられたデオキシウリジンを
含む一本積ＤＮＡプラス果ド（ｓｓＤＮＡ）鋳型１が示
されている。この鋳型は、ファージの複製開始点（示し
ていない）を含んでなるプラスミドから誘導される。こ
のようなプラスミドは、時にはファージ壽ドと称される
。ファージの複製開始点の例は、バクテリオファージの
ｒｉファージ遺遺伝子領領域ｆｌ（ＩＣ））である。こ
の領域は、−本鎖ＤＮｋの合成およびパッケージングの
ための複製開始点を含む。
て示されている。ここでは、−本領ＤＮＡ配列の一部の
デオキシチミジンが置き代えられたデオキシウリジンを
含む一本積ＤＮＡプラス果ド（ｓｓＤＮＡ）鋳型１が示
されている。この鋳型は、ファージの複製開始点（示し
ていない）を含んでなるプラスミドから誘導される。こ
のようなプラスミドは、時にはファージ壽ドと称される
。ファージの複製開始点の例は、バクテリオファージの
ｒｉファージ遺遺伝子領領域ｆｌ（ＩＣ））である。こ
の領域は、−本鎖ＤＮｋの合成およびパッケージングの
ための複製開始点を含む。
これらのプラス泉ドから一本鎖デオキシウリジン含有Ｄ
ＮＡを生産する方法は、当該技術分野で周知である。一
般に、このような方法は次の工程を包含する。
ＮＡを生産する方法は、当該技術分野で周知である。一
般に、このような方法は次の工程を包含する。
１）ｆｌファージ遺遺伝子領領域ｆｌ（ＩＣ））（ｓｓ
ファージ複製開始点）を有するプラスミドまたはファー
ジミドを提供する工程、 ２ ） ｉ ） ｄＵＴＰａｓｅとウラシルＮ−グリ
コシラーゼが欠失し、そして１ｉ）Ｆ’要素を含むＥ・
コリー株に、前記プラスミドを移す工程、 ３）工程２）から得られるＥ・コリーをヘルパーファー
ジで感染して種々のパーセントのウラシル塩基を含有す
る１）のプラスミドの一本［ＤＮＡ異形（ｓｓＰ）を形
成する工程、ならびに４）感染Ｅ・コリーによって生産
されるウラシル含有−本領ブラスミド（ｓｓ Ｐ ）を
単離する工程。
ファージ複製開始点）を有するプラスミドまたはファー
ジミドを提供する工程、 ２ ） ｉ ） ｄＵＴＰａｓｅとウラシルＮ−グリ
コシラーゼが欠失し、そして１ｉ）Ｆ’要素を含むＥ・
コリー株に、前記プラスミドを移す工程、 ３）工程２）から得られるＥ・コリーをヘルパーファー
ジで感染して種々のパーセントのウラシル塩基を含有す
る１）のプラスミドの一本［ＤＮＡ異形（ｓｓＰ）を形
成する工程、ならびに４）感染Ｅ・コリーによって生産
されるウラシル含有−本領ブラスミド（ｓｓ Ｐ ）を
単離する工程。
使用できるプラス果ドの例としては、ｐ Ｋ Ｈ１２５
、ｐＵＣＦ １ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｇｅｎｅｓ
ｃｒｉｂｅ） 、ｐＴ ２１８Ｒ。
、ｐＵＣＦ １ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｇｅｎｅｓ
ｃｒｉｂｅ） 、ｐＴ ２１８Ｒ。
ｐＴ Ｚ１８Ｕ、 ｐＴ Ｚ１９Ｕ（Ｕ、Ｓ、 Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ）ならびニｐＶＴＬＯｏ、 ｐＶＴ
ｌｏｌ、ｐＶＴ１０２、ｐＶＴ１０３（Ｖｅｒｎｅｔ
ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ）が挙げられる。
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ）ならびニｐＶＴＬＯｏ、 ｐＶＴ
ｌｏｌ、ｐＶＴ１０２、ｐＶＴ１０３（Ｖｅｒｎｅｔ
ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ）が挙げられる。
第１図ではまた、特定のＤＮＡ配列の一本鎖部分を含む
オリゴヌクレオチド２が示されている。
オリゴヌクレオチド２が示されている。
オリゴヌクレオチド２は、特異な制限部位Ｒ１ならびに
５ｓＤＮＡ鋳型１の一部のＤＮＡ配列に相補的である５
′およびＪ末端における追加のＤＮＡ配列を含んでなる
。オリゴヌクレオチド２は、５ｓＤＮＡ鋳型１にハイブ
リダイゼーションされる（工程Ｄ）。結果は３で示され
る。オリゴヌクレオチド２の相補性領域４が、５ｓＤＮ
Ａ鋳型にハイブリダイゼーションされている。オリゴヌ
クレオチドの非相補性領域５は、５ｓＤＮＡ鋳型１にハ
イブリダイゼーションしないためループを形成する。
５ｓＤＮＡ鋳型１の一部のＤＮＡ配列に相補的である５
′およびＪ末端における追加のＤＮＡ配列を含んでなる
。オリゴヌクレオチド２は、５ｓＤＮＡ鋳型１にハイブ
リダイゼーションされる（工程Ｄ）。結果は３で示され
る。オリゴヌクレオチド２の相補性領域４が、５ｓＤＮ
Ａ鋳型にハイブリダイゼーションされている。オリゴヌ
クレオチドの非相補性領域５は、５ｓＤＮＡ鋳型１にハ
イブリダイゼーションしないためループを形成する。
このオリゴヌクレオチドのＪ末端は、５ｓＤＮＡ鋳型ｌ
に相補性を有する第二のＤＮＡ鎖６を合成するためのプ
ライマーとして役立つ。この相補鎖の合或は、第１図に
略式的に示されるようにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
およびｄＣＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウフラグ
メント）ならびにＤＮＡリガーゼの存在下で常法により
行われる。合成の結果物は、スクリーニングの目的で挿
入されたオリゴヌクレオチドをブラッヶトで示す制限部
位Ｒ２を有するｄｓＤＮＡ配列６である。
に相補性を有する第二のＤＮＡ鎖６を合成するためのプ
ライマーとして役立つ。この相補鎖の合或は、第１図に
略式的に示されるようにｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
およびｄＣＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウフラグ
メント）ならびにＤＮＡリガーゼの存在下で常法により
行われる。合成の結果物は、スクリーニングの目的で挿
入されたオリゴヌクレオチドをブラッヶトで示す制限部
位Ｒ２を有するｄｓＤＮＡ配列６である。
このオリゴヌクレオチド２を有するｄｓＤＮＡ６は、デ
オキシウリジン１を含む鎖が分解されているＥ・コリー
ｕｎｇ＋株にトランスフェクシジンされる。挿入された
オリゴヌクレオチド２を含有するＤＮＡ鎖はＥ・コリー
によって保持複製され、単離され、次いで制限酵素開裂
（Ｒ１および／またはＲ２）によって見い出されそして
ＤＮＡ配列決定がなされる。この新な５ｓＤＮＡ鋳型は
、この発明の方法における次のＤＮＡ合威合成用として
収集されたクローンから調製される。
オキシウリジン１を含む鎖が分解されているＥ・コリー
ｕｎｇ＋株にトランスフェクシジンされる。挿入された
オリゴヌクレオチド２を含有するＤＮＡ鎖はＥ・コリー
によって保持複製され、単離され、次いで制限酵素開裂
（Ｒ１および／またはＲ２）によって見い出されそして
ＤＮＡ配列決定がなされる。この新な５ｓＤＮＡ鋳型は
、この発明の方法における次のＤＮＡ合威合成用として
収集されたクローンから調製される。
前述の記載は、前記方法の一の周期を包含する。
第二、第三および第四のまたは必要なだけ多くの周期を
実施して特定の二本鎖ＤＮＡ配列の合成を完了する。
実施して特定の二本鎖ＤＮＡ配列の合成を完了する。
各周期後、クローンが単離され、次いでＲ１において制
限酵素で切断することにより挿入されたオリゴヌクレオ
チドフラグメントについてプラスミドが検査される。さ
らに、挿入されたフラグメントのサイズは、Ｒ２位で制
限酵素により切断することで検査することができる。Ｒ
２は挿入されたオリゴヌクレオチドフラグメントの両側
に近接する。各周期では、Ｒ２制限フラグメントの長さ
が挿入されたフラグメントの長さだけ正確に増大する。
限酵素で切断することにより挿入されたオリゴヌクレオ
チドフラグメントについてプラスミドが検査される。さ
らに、挿入されたフラグメントのサイズは、Ｒ２位で制
限酵素により切断することで検査することができる。Ｒ
２は挿入されたオリゴヌクレオチドフラグメントの両側
に近接する。各周期では、Ｒ２制限フラグメントの長さ
が挿入されたフラグメントの長さだけ正確に増大する。
この発明の方法は、特定部位の突然変異誘発による関連
オリゴヌクレオチドの挿入およびＥ・コリー中で遺伝子
のような特定の二本鎖ＤＮＡ配列（ｄｓＤＮＡ）を構築
するための遺伝子増幅の新規かつ非自明な方法で組み合
わされる。ＨＩＶ−Ｉｔａｔ遺伝子の構築は、この新規
方法の例として使用される。この方法は、一般に全ての
ｄｓＤＮＡ配列の合成に適用可能である。
オリゴヌクレオチドの挿入およびＥ・コリー中で遺伝子
のような特定の二本鎖ＤＮＡ配列（ｄｓＤＮＡ）を構築
するための遺伝子増幅の新規かつ非自明な方法で組み合
わされる。ＨＩＶ−Ｉｔａｔ遺伝子の構築は、この新規
方法の例として使用される。この方法は、一般に全ての
ｄｓＤＮＡ配列の合成に適用可能である。
以下の例においし実証されるように、この方法は直接遺
伝子およびタンパク質発現について役立つ調節配列を含
有するプラスミドによる遺伝子の直接合成をもたらす。
伝子およびタンパク質発現について役立つ調節配列を含
有するプラスミドによる遺伝子の直接合成をもたらす。
これは、発現ベクターへの完全な遺伝子をサブクローン
する必要をなくする。
する必要をなくする。
この方法の説明にはプラスミドｐＫＨ１２５（第２図）
が使用される。それは、ファージ複製開始点（ｆｌ（Ｉ
Ｇ））、抗生物質選択マーカー（ａｍｐ）およびバクテ
リア複製開始点（ｏｒｉ）を含む。このプラスミドはま
た、ｌａｃ ＺアルファーＤＮＡ配列内に複数クローン
グ部位（ｓｃｓ）も含む。このプラスミドはこの共同発
明者の一人によって調製された。しかしながら、５ｓＤ
ＮＡフ１−ジ複製開始点を含有するどのようなプラスミ
ドもこの発明に有用であろう。
が使用される。それは、ファージ複製開始点（ｆｌ（Ｉ
Ｇ））、抗生物質選択マーカー（ａｍｐ）およびバクテ
リア複製開始点（ｏｒｉ）を含む。このプラスミドはま
た、ｌａｃ ＺアルファーＤＮＡ配列内に複数クローン
グ部位（ｓｃｓ）も含む。このプラスミドはこの共同発
明者の一人によって調製された。しかしながら、５ｓＤ
ＮＡフ１−ジ複製開始点を含有するどのようなプラスミ
ドもこの発明に有用であろう。
挿入遺伝子合成（第１図の工程Ａ）からＧ）まで〕では
、特定ｄｓＤＮＡの一本鎖を含んでなる大きいオリゴヌ
クレオチド、あるいは−本鎖鋳型上のある領域に対する
塩基対について設計された短い配列に取り囲まれたそれ
らの特定フラグメントが、試験管内で鋳型に対して段階
的にハイブリダイゼーシゴンされる。
、特定ｄｓＤＮＡの一本鎖を含んでなる大きいオリゴヌ
クレオチド、あるいは−本鎖鋳型上のある領域に対する
塩基対について設計された短い配列に取り囲まれたそれ
らの特定フラグメントが、試験管内で鋳型に対して段階
的にハイブリダイゼーシゴンされる。
挿入されたオリゴヌクレオチドを含有するプラスミドは
、変異に冨む工程Ｂ）、Ｅ）およびＦ）により非常に単
純化されている。 ｄｌｌＴＰａｓｅおよびウラシルＮ
−グリコシラーゼにおいて突然変異を伴うＥ・コリー（
ｄｕｔ−ｕｎｇ−）株は、工程Ｄ）で前記オリゴヌクレ
オチドフラグメントがハイブリダイゼーシゴンされる工
程Ｂ）の５ｓＤＮＡ鋳型を増幅するのに使用される。そ
の結果は、そのＤＮＡ配列の任意の位置でデオキシチミ
ジンについて置換されたデオキシウリジンを含有する５
ｓＤＮＡ鋳型の生産である。この鋳型に対する相補鎖は
、ブライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用し、そし
て通常の４種のヌクレオチド（ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ。
、変異に冨む工程Ｂ）、Ｅ）およびＦ）により非常に単
純化されている。 ｄｌｌＴＰａｓｅおよびウラシルＮ
−グリコシラーゼにおいて突然変異を伴うＥ・コリー（
ｄｕｔ−ｕｎｇ−）株は、工程Ｄ）で前記オリゴヌクレ
オチドフラグメントがハイブリダイゼーシゴンされる工
程Ｂ）の５ｓＤＮＡ鋳型を増幅するのに使用される。そ
の結果は、そのＤＮＡ配列の任意の位置でデオキシチミ
ジンについて置換されたデオキシウリジンを含有する５
ｓＤＮＡ鋳型の生産である。この鋳型に対する相補鎖は
、ブライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用し、そし
て通常の４種のヌクレオチド（ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ。
ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ ）を使用して試験管内で合成
される。
される。
この工程によって行われるウラシルＮ−グリコシレート
含有Ｅ・コリー（ｕｎｇ”）へのプラスごドのトランス
フエフシランは、デオキシウリジンを含有するプラスミ
ド鎖の選択的な分解をもたらす。
含有Ｅ・コリー（ｕｎｇ”）へのプラスごドのトランス
フエフシランは、デオキシウリジンを含有するプラスミ
ド鎖の選択的な分解をもたらす。
この工程は、通常のヌクレオチドを用いて試験管内で調
製されるオリゴヌクレオチド配列を含有するｄｓＤＮＡ
プラスミドを大幅に増幅する。この遺伝子増幅を使用す
る突然変異プラスミドの頻度は、約３０％以上である。
製されるオリゴヌクレオチド配列を含有するｄｓＤＮＡ
プラスミドを大幅に増幅する。この遺伝子増幅を使用す
る突然変異プラスミドの頻度は、約３０％以上である。
しかしながら、突然変異誘発によるプラスミドへの短い
配列の挿入は、完全な遺伝子を構築するのに多数回の突
然変異誘発を要するであろう。便宜上、オリゴヌクレオ
チドは１４０塩基に近づけられる。鋳型とのバイブリダ
イゼーションに役立つ各末端で約２０ｂｐの鋳型との相
同性が必要であると仮定すれば、この方法の各周期〔工
程Ａ）からＧ）まで］では１００個のヌクレオチドを挿
入することができる。４周期は、約ｉ５．ＯＯＯｍ一の
タンパク質をコードしうる４００ｂｐのｄｓＤＮＡ配列
の合成をもたらすであろう。各周期には約４日かかるの
で、このような遺伝子の完全な合成、特性決定および発
現には１箇月未満かかる。最新の手順は、同等サイズの
遺伝子合成と特性決定に１箇月を超える期間を要する。
配列の挿入は、完全な遺伝子を構築するのに多数回の突
然変異誘発を要するであろう。便宜上、オリゴヌクレオ
チドは１４０塩基に近づけられる。鋳型とのバイブリダ
イゼーションに役立つ各末端で約２０ｂｐの鋳型との相
同性が必要であると仮定すれば、この方法の各周期〔工
程Ａ）からＧ）まで］では１００個のヌクレオチドを挿
入することができる。４周期は、約ｉ５．ＯＯＯｍ一の
タンパク質をコードしうる４００ｂｐのｄｓＤＮＡ配列
の合成をもたらすであろう。各周期には約４日かかるの
で、このような遺伝子の完全な合成、特性決定および発
現には１箇月未満かかる。最新の手順は、同等サイズの
遺伝子合成と特性決定に１箇月を超える期間を要する。
この方法は、殆どいかなる長さの遺伝子にも適用可能で
ることが当業者によって理解されるであろう。より大き
なオリゴヌクレオチドの伸張をすることが可能であるの
で、この方法の適用可能性は同様に拡がるであろう。
ることが当業者によって理解されるであろう。より大き
なオリゴヌクレオチドの伸張をすることが可能であるの
で、この方法の適用可能性は同様に拡がるであろう。
オリゴヌクレオチドのこの合或は、通常の自動化方法を
使用して実施することができる。
使用して実施することができる。
この発明の方法を実施するのに必要な化学薬品および備
品を含む実験室技法は、常用されており、そして先に引
用したＭａｎｉａｔｉｓ らとＫｕｎｋｅｌ らの両文
献に記載されている。
品を含む実験室技法は、常用されており、そして先に引
用したＭａｎｉａｔｉｓ らとＫｕｎｋｅｌ らの両文
献に記載されている。
以下の例でこの発明の有用性を具体的に説明する。
：ＨＩＶ−１ｔａｔ の４
（、ｔａｔ遺伝子合戒合成イン
合成ｔａｔ遺伝子は、遺伝子コードの既知の縮重を使用
して、第３図のボールドタイプで示されるＨＩＶ−１単
離Ｂ）（１０の生来のコドンを第３図の生来のコドン上
にオーブンタイプで示される別のコドンに転化すること
によって設計された。遺伝子８７コドンのうち合計３３
個を再設計し、ヌクレオチド配列として生来の遺伝子に
対して６２％の相同性を有する合成遺伝子をもたらした
。合成遺伝子の再設計したコドンは、強化した遺伝子発
現のための好ましいＥ・コリーとマツチしていた。さら
に、幾つかのコドンは遺伝子の特徴を表示する新な制限
部位（第３図のＮｃｏｌ、 ＢｓｔＸｌ。
して、第３図のボールドタイプで示されるＨＩＶ−１単
離Ｂ）（１０の生来のコドンを第３図の生来のコドン上
にオーブンタイプで示される別のコドンに転化すること
によって設計された。遺伝子８７コドンのうち合計３３
個を再設計し、ヌクレオチド配列として生来の遺伝子に
対して６２％の相同性を有する合成遺伝子をもたらした
。合成遺伝子の再設計したコドンは、強化した遺伝子発
現のための好ましいＥ・コリーとマツチしていた。さら
に、幾つかのコドンは遺伝子の特徴を表示する新な制限
部位（第３図のＮｃｏｌ、 ＢｓｔＸｌ。
５ａｃｌおよび５ａｃｌＩ）を形成する。これらの部位
は、この例で使用されるｐＫＨ１２５においても特有の
ものである。これらの部位は、この発明の方法の各周期
後にクローンをスクリーニングする目的で合成ｔａｔ遺
伝子中に組み込んだ。この遺伝子コードを使用して翻訳
した場合、合成ｔａｔ遺伝子配列は生来の遺伝子由来の
ものと同一タンパク質配列をもたらす。
は、この例で使用されるｐＫＨ１２５においても特有の
ものである。これらの部位は、この発明の方法の各周期
後にクローンをスクリーニングする目的で合成ｔａｔ遺
伝子中に組み込んだ。この遺伝子コードを使用して翻訳
した場合、合成ｔａｔ遺伝子配列は生来の遺伝子由来の
ものと同一タンパク質配列をもたらす。
■０合合成ａｔ遺伝子の構築
挿入突然変異誘発による合成ｔａｔ遺伝子調製に関する
オリゴヌクレオチド（オリゴ）構築の全スキームを第４
図に示す。第３図に示される２６１ｂｐの合成ｔａｔ遺
伝子配列は、オリゴヌクレオチド合成のために第４図に
示される３種のフラグメント ｔａｔｌ、ｔａｔ２およ
びｔａｔ３に分割した。
オリゴヌクレオチド（オリゴ）構築の全スキームを第４
図に示す。第３図に示される２６１ｂｐの合成ｔａｔ遺
伝子配列は、オリゴヌクレオチド合成のために第４図に
示される３種のフラグメント ｔａｔｌ、ｔａｔ２およ
びｔａｔ３に分割した。
ｔａｔｌ、ｔａｔ２およびｔａｔ３のＤＮＡ配列は、第
４ａ図に示されている。
４ａ図に示されている。
合成ｔａｔ遺伝子の構築に関するオリゴヌクレオチドフ
ラグメントの設計に使用される手法は第５図に示されて
いる。オリゴヌクレオチドフラグメント（第４および５
図のオリゴ１）は、その５′末端上にｐＫＨ１２５のｌ
ａｃ Ｚαフラグメント遺伝子（Ｚｌ）由来の２０塩基
を介して（第３．４および５図）近接しそしてそのＪ末
端上にｐＫＨ１２５の１ａｃＺαフラグメント遺伝子（
Ｚ２）由来の２０塩基を介して近接しているｔａｔ遺伝
子の一の鎖の最初の１／３のＤＮＡ配列（ｔａｔｌ）を
含むように合成した。
ラグメントの設計に使用される手法は第５図に示されて
いる。オリゴヌクレオチドフラグメント（第４および５
図のオリゴ１）は、その５′末端上にｐＫＨ１２５のｌ
ａｃ Ｚαフラグメント遺伝子（Ｚｌ）由来の２０塩基
を介して（第３．４および５図）近接しそしてそのＪ末
端上にｐＫＨ１２５の１ａｃＺαフラグメント遺伝子（
Ｚ２）由来の２０塩基を介して近接しているｔａｔ遺伝
子の一の鎖の最初の１／３のＤＮＡ配列（ｔａｔｌ）を
含むように合成した。
オリゴｌとそれに続く全のオリゴフラグメントは通常の
自動化技法で合成した。ｐＫＨ１２５の１ａｃＺα遺伝
子は、プラスミドｐＫＨ１２５（第２図）に担持される
Ｅ・コリーβ−ガラクトシダーゼのαフラグメントをコ
ードする。
自動化技法で合成した。ｐＫＨ１２５の１ａｃＺα遺伝
子は、プラスミドｐＫＨ１２５（第２図）に担持される
Ｅ・コリーβ−ガラクトシダーゼのαフラグメントをコ
ードする。
このプラスミドは、ｆｌ（ＩＣ）、アンピシリンマーカ
ー（ＡＭＰ）、Ｅ・コリー複製開始点（ＯＲＩ）および
複数クローニング部位（Ｍ ＣＳ ）をも含む。Ｚｌお
よびＺ２で指定されたオリゴ１の部分（第３および４図
）は、ｐＫＨ１２５のＩａｃ Ｚα遺伝子内領域に相補
性を有するように設計されているので、一本鎖ｐＫＨ１
２５上のそれらの領域に直接ハイプリダイゼーシッンす
ることが可能である（第６図）。 ｔａｔｌで指定され
たオリゴ１の部分は、合成ｔａｔ遺伝子の最初の１７３
の一の鎖を含んでなり、かつｐＫＨ１２５の一全での領
域と相補性を示さない。従って、−本ｔＪｊｐＫＩ−１
１２５とオリゴ１の混合によってｔａｔｌ遺伝子はＺｌ
と２２によって固定された大きなループを形成する（第
１および６図）。
ー（ＡＭＰ）、Ｅ・コリー複製開始点（ＯＲＩ）および
複数クローニング部位（Ｍ ＣＳ ）をも含む。Ｚｌお
よびＺ２で指定されたオリゴ１の部分（第３および４図
）は、ｐＫＨ１２５のＩａｃ Ｚα遺伝子内領域に相補
性を有するように設計されているので、一本鎖ｐＫＨ１
２５上のそれらの領域に直接ハイプリダイゼーシッンす
ることが可能である（第６図）。 ｔａｔｌで指定され
たオリゴ１の部分は、合成ｔａｔ遺伝子の最初の１７３
の一の鎖を含んでなり、かつｐＫＨ１２５の一全での領
域と相補性を示さない。従って、−本ｔＪｊｐＫＩ−１
１２５とオリゴ１の混合によってｔａｔｌ遺伝子はＺｌ
と２２によって固定された大きなループを形成する（第
１および６図）。
プラスミドは一本鎖状態（鋳型類ともいう）で調製され
ており、そして本明細書で既に検討したようにデオキシ
チミジンの代わりにデオキシウリジンを含んでいる。オ
リゴ１を、組換えＤＮＡの常法を用いて５ｓ−ｐＫＨ１
２５にハイブリダイゼーションした。このプラスミドに
対する相補鎖は、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグ
メントと共に標準デオキシヌクレオチド（ｄＵＴＰは含
まない）を使用して試験管内で台底した。得られたプラ
スミドは、鋳型領内にデオキシウリジンを含み（第１図
）、相補鎖上にｔａｔｌ遺伝子を含んでいた。
ており、そして本明細書で既に検討したようにデオキシ
チミジンの代わりにデオキシウリジンを含んでいる。オ
リゴ１を、組換えＤＮＡの常法を用いて５ｓ−ｐＫＨ１
２５にハイブリダイゼーションした。このプラスミドに
対する相補鎖は、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグ
メントと共に標準デオキシヌクレオチド（ｄＵＴＰは含
まない）を使用して試験管内で台底した。得られたプラ
スミドは、鋳型領内にデオキシウリジンを含み（第１図
）、相補鎖上にｔａｔｌ遺伝子を含んでいた。
この二本鎖（ｄｓ）プラスミドを酵素ウラシルＮ−グリ
コシラーゼ（ｕｎｇ”）を含むＥ・コリー７８１株にト
ランスフェクションしたところ、デオキシウリジン含有
鋳型類は宿主Ｅ・コリーによって分解された。こうして
、相補鎖含有ｔａｔｌの増幅をもたらした。
コシラーゼ（ｕｎｇ”）を含むＥ・コリー７８１株にト
ランスフェクションしたところ、デオキシウリジン含有
鋳型類は宿主Ｅ・コリーによって分解された。こうして
、相補鎖含有ｔａｔｌの増幅をもたらした。
Ｅ・コリーｔａｔｌクローンを、アンピシリンとＸＧＡ
Ｌを含有するＬＢプレート上で白色コロニーとして選択
した。幾つかのコロニーを、次のような制限分析および
電気泳動によってｔａｔｌ挿入部を有するプラスミドの
存在について検査した。これらのコロニーからＤＮＡク
ローニングの常法に従いミニ調製物として単離し、次い
で制限酵素Ｎｃｏｌで消化した。プラスミド中のＮｃｏ
１部位（第１図のＲ１および第３図）の存在がｐＫＨ１
２５におけるｔａｔｌ挿入部の特徴を表示するものであ
る。６個のクローンに由来するプラスミドをＮｃｏｌに
より直鎖状にし、さらにＤＮＡ配列決定によってそれら
を特性決定し、ｌａｃ Ｚαフラグメント内でρＫＨ１
２５にｔａｔｌが挿入されていることを確認した。
Ｌを含有するＬＢプレート上で白色コロニーとして選択
した。幾つかのコロニーを、次のような制限分析および
電気泳動によってｔａｔｌ挿入部を有するプラスミドの
存在について検査した。これらのコロニーからＤＮＡク
ローニングの常法に従いミニ調製物として単離し、次い
で制限酵素Ｎｃｏｌで消化した。プラスミド中のＮｃｏ
１部位（第１図のＲ１および第３図）の存在がｐＫＨ１
２５におけるｔａｔｌ挿入部の特徴を表示するものであ
る。６個のクローンに由来するプラスミドをＮｃｏｌに
より直鎖状にし、さらにＤＮＡ配列決定によってそれら
を特性決定し、ｌａｃ Ｚαフラグメント内でρＫＨ１
２５にｔａｔｌが挿入されていることを確認した。
これらのｔａｔｌのポジティブなプラスミドの一つを、
ｐＫ Ｈ１２５＋ｔａｔ １から得られたｐＴＡＴ １
として指定した。それを使用してオリゴ２（ｔａｔ２）
による遺伝子合成第二の周期用の一本鎖鋳型を調製した
。
ｐＫ Ｈ１２５＋ｔａｔ １から得られたｐＴＡＴ １
として指定した。それを使用してオリゴ２（ｔａｔ２）
による遺伝子合成第二の周期用の一本鎖鋳型を調製した
。
第二のオリゴヌクレオチドフラグメント（第４および５
図のオリゴ２）は、オリゴ１を調製したｔａｔ遺伝子鎖
の第二のＤＮＡ配列１／３を含むように台底した。オリ
ゴ２は、その５′末端にｔａｔｌのＪ末端から最後の２
０塩基を介して近接させ、そしてそのＪ末端に２２から
２０塩基を介して近接させた。従って、オリゴ２は、そ
れがｐＴＡＴ １に挿入された場合にそのｔａｔ２領域
がｔａｔｌと連続する配列を形成しうるように設計した
。
図のオリゴ２）は、オリゴ１を調製したｔａｔ遺伝子鎖
の第二のＤＮＡ配列１／３を含むように台底した。オリ
ゴ２は、その５′末端にｔａｔｌのＪ末端から最後の２
０塩基を介して近接させ、そしてそのＪ末端に２２から
２０塩基を介して近接させた。従って、オリゴ２は、そ
れがｐＴＡＴ １に挿入された場合にそのｔａｔ２領域
がｔａｔｌと連続する配列を形成しうるように設計した
。
オリゴ２は、オリゴ１について先に記載したように一本
鎖ｐＴＡＴ １にハイブリダイゼーションした。ｐＴＡ
Ｔ １に対する相補鎖は先に記載したように試験管内で
台底した。トランスフェクション後、クローンを選抜し
、次いで前記のようなミニ調製物としてプラスミドを調
製した。クローンを制限酵素ＢｓｔＸＩで消化（第３図
および第１図のＲ１）し、ＢｓｔＸ Ｉ制限部位を含む
ｔａｔ２挿入部について検査した０選抜したクローン由
来のプラスミドは、ａ、ｂおよびＣと指定し、そしてＢ
ｓｔＸ Ｉで直鎖状にした。さらに、これらのプラスミ
ドをＰｖｕＩ［で消化した（第１図のＲ２）。クローン
１および工由来のプラスミドは０．４６ ｋｂ Ｐ ｖ
ｕ Ｕフラグメントを与えるが、一方、クローン由来の
プラスミドは０．３８ Ｋｂのフラグメントを与えた。
鎖ｐＴＡＴ １にハイブリダイゼーションした。ｐＴＡ
Ｔ １に対する相補鎖は先に記載したように試験管内で
台底した。トランスフェクション後、クローンを選抜し
、次いで前記のようなミニ調製物としてプラスミドを調
製した。クローンを制限酵素ＢｓｔＸＩで消化（第３図
および第１図のＲ１）し、ＢｓｔＸ Ｉ制限部位を含む
ｔａｔ２挿入部について検査した０選抜したクローン由
来のプラスミドは、ａ、ｂおよびＣと指定し、そしてＢ
ｓｔＸ Ｉで直鎖状にした。さらに、これらのプラスミ
ドをＰｖｕＩ［で消化した（第１図のＲ２）。クローン
１および工由来のプラスミドは０．４６ ｋｂ Ｐ ｖ
ｕ Ｕフラグメントを与えるが、一方、クローン由来の
プラスミドは０．３８ Ｋｂのフラグメントを与えた。
クローン主および互のより大きなＰｖｕＩＩフラグメン
トがｔａｔ２挿入部の存在に起因していた。クローン主
および互に由来するプラスミド中のｔａｔ２挿入部の存
在は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
トがｔａｔ２挿入部の存在に起因していた。クローン主
および互に由来するプラスミド中のｔａｔ２挿入部の存
在は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
これらの適正なりローン（ａ）の一つに由来するプラス
壽ドを、ｐＴＡＴ ２と指定し、第三の最後の遺伝子合
成周期用の５ｓＤＮＡ鋳型を調製するのに使用した。次
に、第三のオリゴヌクレオチド（オリゴ３、第４および
５図）を、オリゴ１および２を調製したｔａｔ遺伝子鎖
の最後の１／３のＤＮＡ配列（ｔａｔ３）をほぼ含有す
るように台底した。オリゴ３は、その５′末端でｔａｔ
２のＪ末端から２０塩基を介して近接し、そしてそのＪ
末端でＺ２から２０塩基を介して近接されていた。遺伝
子合成の第三の周期を実施した。１０個のクローンに由
来するプラスミドをｔａｔ３挿入部について検査した。
壽ドを、ｐＴＡＴ ２と指定し、第三の最後の遺伝子合
成周期用の５ｓＤＮＡ鋳型を調製するのに使用した。次
に、第三のオリゴヌクレオチド（オリゴ３、第４および
５図）を、オリゴ１および２を調製したｔａｔ遺伝子鎖
の最後の１／３のＤＮＡ配列（ｔａｔ３）をほぼ含有す
るように台底した。オリゴ３は、その５′末端でｔａｔ
２のＪ末端から２０塩基を介して近接し、そしてそのＪ
末端でＺ２から２０塩基を介して近接されていた。遺伝
子合成の第三の周期を実施した。１０個のクローンに由
来するプラスミドをｔａｔ３挿入部について検査した。
これらのプラスミドの２個が５ａｃＩ［（第１図のＲ１
）による消化で直鎖状になった。
）による消化で直鎖状になった。
さらに、これらの２つのプラスミドをＰｕｖＩ［（第１
図のＲ２）で消化した。これらのプラスミドは、より大
きなＰｕｖＩＩフラグメント（０，４６に対して０．５
４Ｋｂ）を与えた。こうしてｔａｔ遺伝子の全鎖長を完
成するｔａｔ３挿入部の存在は、ＤＮＡ配列決定によっ
て確認された。
図のＲ２）で消化した。これらのプラスミドは、より大
きなＰｕｖＩＩフラグメント（０，４６に対して０．５
４Ｋｂ）を与えた。こうしてｔａｔ遺伝子の全鎖長を完
成するｔａｔ３挿入部の存在は、ＤＮＡ配列決定によっ
て確認された。
〔発明の効果］
この発明の方法は、遺伝子のような二本鎖ＤＮＡ配列（
ｄｓ Ｄ Ｎ Ａ ）の構築に関して常法を凌駕する次
の各利点を提供する。
ｄｓ Ｄ Ｎ Ａ ）の構築に関して常法を凌駕する次
の各利点を提供する。
適正な二本鎖ＤＮＡ配列または遺伝子アセンブリーの精
度は、それが９９％を越えるオリゴヌクレオチド直接突
然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ ら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｅｎｚ ５ｏｌｏ ＋ １５４．３６７〜３８２ペ
ージ。
度は、それが９９％を越えるオリゴヌクレオチド直接突
然変異誘発法（Ｋｕｎｋｅｌ ら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｅｎｚ ５ｏｌｏ ＋ １５４．３６７〜３８２ペ
ージ。
１９８７）精度と同等である。
ただ−本のｄｓＤＮＡ鎖に対応する２〜３の長いオリゴ
ヌクレオチドを合成および精製しさえすればよい。
ヌクレオチドを合成および精製しさえすればよい。
ＤＮＡ構築物の配列は、次の構築周期で使用すべき鋳型
を検査することによって各周期を検査することができる
（工程Ｋから）。
を検査することによって各周期を検査することができる
（工程Ｋから）。
ｄｓＤＮＡ合或の終合成に、遺伝子はその発現に適する
調節配列を有するプラスミドで直接構築することができ
るのでそれをサブクローニングする必要がない。
調節配列を有するプラスミドで直接構築することができ
るのでそれをサブクローニングする必要がない。
構築の間に錯誤が起った場合には、°サブクローニング
することなく突然変異誘発によってそれを修正すること
ができる。
することなく突然変異誘発によってそれを修正すること
ができる。
ｄｓ Ｄ Ｎ Ａがｆｌ開始点を有するプラスミド中に
存在するので、ある遺伝子がプラスミド遺伝子発現系を
有する翻訳フレーム外で構築され、たとえその合成遺伝
子産物（タンパク質）が宿主細胞に対して毒性を示す場
合に起こる可能性のある問題点を避けることができる（
この遺伝子は、その後突然変異誘発によってフレーム中
に入れることができる）。
存在するので、ある遺伝子がプラスミド遺伝子発現系を
有する翻訳フレーム外で構築され、たとえその合成遺伝
子産物（タンパク質）が宿主細胞に対して毒性を示す場
合に起こる可能性のある問題点を避けることができる（
この遺伝子は、その後突然変異誘発によってフレーム中
に入れることができる）。
この方法は効率がよい（各周期に約４日かければよい）
。
。
各周期で調製される二本鎖ＤＮＡ配列のサイズ（ＤＮＡ
の塩基数）は、現在および将来の合成化学的な自動化Ｄ
ＮＡシンセサイザーの限界に制限されるにすぎない。
の塩基数）は、現在および将来の合成化学的な自動化Ｄ
ＮＡシンセサイザーの限界に制限されるにすぎない。
遺伝子を発現ベクター中で合成することができるので、
遺伝子産物（タンパク質）を発現および活性について直
接分析することができる。
遺伝子産物（タンパク質）を発現および活性について直
接分析することができる。
遺伝子は、プラスミドに既存の第二の遺伝子（例えば、
β−ガタトドサイド）とフレーム内での遺伝子融合物と
して直接合成することができるので新規なキメラ遺伝子
を作出することができる。
β−ガタトドサイド）とフレーム内での遺伝子融合物と
して直接合成することができるので新規なキメラ遺伝子
を作出することができる。
合成遺伝子はサブクローニング工程を要することなく特
定部位の突然変異誘発によって直接変性することができ
、タンパク質の構造−機能〜研究を都合よく行うことが
できる。
定部位の突然変異誘発によって直接変性することができ
、タンパク質の構造−機能〜研究を都合よく行うことが
できる。
遺伝子部分、あるいは遺伝子のエクソン、あるいはタン
パク質の機能領域またはタンパク質ドメインの単一また
は組み合わせに対応するキメラ遺伝子を都合よく合成し
、そして発現する。
パク質の機能領域またはタンパク質ドメインの単一また
は組み合わせに対応するキメラ遺伝子を都合よく合成し
、そして発現する。
酵素、生化学薬品、医薬品、ワクチン、診断試薬または
農産品として使用できるタンパク質をコードする遺伝子
の一部またはキメラ遺伝子を、都合よく合成することが
でき、そして発現することができる。
農産品として使用できるタンパク質をコードする遺伝子
の一部またはキメラ遺伝子を、都合よく合成することが
でき、そして発現することができる。
広範な突然変異または欠失もしくは挿入を含有する別の
方法によって得られる合成遺伝子または天然遺伝子を、
長いオリゴヌクレオチドを使用する突然変異誘発によっ
て都合よく修復することができる。
方法によって得られる合成遺伝子または天然遺伝子を、
長いオリゴヌクレオチドを使用する突然変異誘発によっ
て都合よく修復することができる。
第１図はこの発明の方法を略図的に図示したものであり
、 第２図はｐ Ｋ Ｈ１２５の適切な遺伝子部分を示し、
第３図は生来のＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子とその合成遺伝
子を示し、 第４図はＨＩＶ−Ｉｔａｔ遺伝子を構築するために設計
されるオリゴヌクレオチドを示し、第４ａ図はｐＫＨ１
２５に連続的に挿入するために特別に設計された末端を
有するＨＩＶ−ｒｔａｔ遺伝子の３つの独立した部分を
示し、 第５図はｐＫＨ１２５でｔａｔを構築するための手順を
示し、そして 第６図はＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子配列部を示すオリゴヌ
クレオチドとへテロ二重鎖を形成している一本鎖ｐＫＨ
１２５を示す。
、 第２図はｐ Ｋ Ｈ１２５の適切な遺伝子部分を示し、
第３図は生来のＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子とその合成遺伝
子を示し、 第４図はＨＩＶ−Ｉｔａｔ遺伝子を構築するために設計
されるオリゴヌクレオチドを示し、第４ａ図はｐＫＨ１
２５に連続的に挿入するために特別に設計された末端を
有するＨＩＶ−ｒｔａｔ遺伝子の３つの独立した部分を
示し、 第５図はｐＫＨ１２５でｔａｔを構築するための手順を
示し、そして 第６図はＨＩＶ−１ｔａｔ遺伝子配列部を示すオリゴヌ
クレオチドとへテロ二重鎖を形成している一本鎖ｐＫＨ
１２５を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の各工程を含んでなる特定の二本鎖ＤＮＡ配列の
合成方法： Ａ）合成すべき二本鎖ＤＮＡ配列を同定する工程、 Ｂ）ｉ）デオキシウリジンを含むヌクレオチド配列およ
びｉｉ）ファージの複製開始点およびｉｉｉ）バクテリ
アの複製開始点、ならびにｉｖ）β−ラクタマーゼのよ
うな薬剤耐性遺伝子（ａｍｐ）を含んでなる一本鎖ＤＮ
Ａベクターを提供する工程、Ｃ）ｉ）５′および３′末
端を有し、ｉｉ）合成すべき二本鎖ＤＮＡ配列のうちの
一の一本鎖を有する第一のフラグメントに従うヌクレオ
チド配列を有しそしてｉｉｉ）ａ）前記一本鎖ＤＮＡベ
クターのヌクレオチド配列に少なくとも部分的に相補的
で、かつｂ）３′末端の相補性が５′および３′両末端
上にプライムするのに十分である追加のヌクレオチド配
列を有する第一のオリゴヌクレオチドを合成する工程、 Ｄ）前記一本鎖ベクターに前記第一のオリゴヌクレオチ
ドフラグメントをハイブリダイゼーションしてヘテロ二
重鎖を形成する工程、 Ｅ）プライマーとして前記第一のオリゴヌクレオチドの
３′末端を使用して前記一本鎖ＤＮＡベクターに対する
デオキシウリジンを含まない第二の相補鎖を合成するこ
とにより二本鎖ベクターを形成する工程、 Ｆ）酵素ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ｕｎｇ＾＋）を
含むＥ・コリー（￥Ｅ￥、￥ｃｏｌｉ￥）株を、前記二
本鎖ＤＮＡベクターでトランスフェクションする工程、
Ｇ）前記ｕｎｇ＾＋、ａｍｐ耐性クローニングのＥ・コ
リーのコロニーから前記第一のオリゴヌクレオチドを含
有する二本鎖ＤＮＡベクターを選抜する工程、 Ｈ）工程Ｇ）で選抜されたベクターでｄＵＴＰａｓｅお
よびウラシルＮ−グリコシラーゼ欠失Ｅ・コリー株（ｄ
ｕｔ＾−、ｕｎｇ＾−）をトランスフェクションする工
程、 Ｉ）工程Ｈ）のトランスフェクションした Ｅ・コリーから（ｉ）ヌクレオチド配列中にデオキシウ
リジンおよび（ｉｉ）前記第一のオリゴヌクレオチドを
含む一本鎖ベクターを単離する工程、Ｊ）ｉ）５′およ
び３′末端を有し、ｉｉ）工程Ｃ）ｉ）で選択的に合成
すべき二本鎖ＤＮＡ配列と同一の一本鎖の第二のフラグ
メントに従うヌクレオチド配列を有し、そしてｉｉｉ）
ａ）第一の合成オリゴヌクレオチドフラグメントの３′
末端上のヌクレオチド配列に相補的である５′末端とｂ
）第一の合成オリゴヌクレオチドフラグメントの３′末
端上の追加の配列と同一である３′末端とに追加のヌク
レオチド配列を有する第二のオリゴヌクレオチドを合成
する工程、Ｋ）工程Ｄ）からＧ）までを繰り返し、第一
の合成オリゴヌクレオチドフラグメントを有するフレー
ム中にＩ）のベクター中の第二のオリゴヌクレオチドを
挿入する工程、ならびに Ｌ）工程Ａ）で同定される完全な特定の二本鎖ＤＮＡ配
列の合成が終了するまで、追加のオリゴヌクレオチドフ
ラグメントについて工程Ｋ）次いで工程Ｄ）からＪ）ま
でを繰り返す工程。 ２、合成すべき特定の二本鎖ＤＮＡ配列が一の遺伝子を
含んでなる請求項１記載の方法。３、オリゴヌクレオチ
ドフラグメントが挿入される一本鎖ベクターがＤＮＡ調
節遺伝子配列およびタンパク質発現遺伝子配列のすべて
を含む請求項２記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US34966689A | 1989-05-10 | 1989-05-10 | |
| US349666 | 2003-01-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0372882A true JPH0372882A (ja) | 1991-03-28 |
Family
ID=23373435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2117806A Pending JPH0372882A (ja) | 1989-05-10 | 1990-05-09 | 合成二本鎖ｄｎａ配列の構築 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0397463A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0372882A (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5137814A (en) * | 1991-06-14 | 1992-08-11 | Life Technologies, Inc. | Use of exo-sample nucleotides in gene cloning |
| USRE39031E1 (en) * | 1992-04-29 | 2006-03-21 | Biomerieux | RNA amplification method requiring only one manipulation step |
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-
1990
- 1990-05-09 JP JP2117806A patent/JPH0372882A/ja active Pending
- 1990-05-09 EP EP19900304978 patent/EP0397463A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0397463A2 (en) | 1990-11-14 |
| EP0397463A3 (en) | 1991-03-06 |
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