JPH0373857A - リウマチ患者のＩｇＧ上のガラクトース欠損を測定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はプロティンＡまたはプロティンＧ及び標識レク
チンを必須の構成要素とするリウマチ診断薬に関するも
のであり、医療の分野においてリウマチの診断のために
有効に利用されるものである。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕慢性関
節リウマチ患者（以下Ｒ＾患者と略す）の血清中にはい
わゆるリウマチ因子といわれる自己抗体が存在し、これ
はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧと略す）のＦｃ部位に
存在する抗原を認識することが知られている（文献１）
。ところで、最近、ＲＡ患者の血清中のＩｇＧのＦｃ部
位における糖鎖について詳細な分析が加えられ、その結
果、該糖鎖は健常人の血清中のＩｇＧのＰｃ部位におけ
る糖鎖に比較してガラクトース含有量が著しく減少して
いることが本発明者の一部によって見出された（文献２
）。即ち、健常人血清中のＩｇＧのＰｃ部位における糖
部分は互いに構造の異なる複数の種類の糖鎖から構成・
されており、種類間の存在比率は個体間で一定であるこ
とが明らかにされた（文献３）。ところがＲＡ患者の血
清中のＩｇＧのＦｃ部位における糖部分を調べてみると
構造の異なる複数の種類の糖鎖から構成されており、種
類間の比率は健常人の場合と同様に個体間で一定となる
が、全体にガラクトースの含有量が著しく減少している
ことが判明した。更に具体的に述べれば、健常人血清中
のＩｇＧのＦｃ部位の糖部分にはガラクトースをそれぞ
れ２分子、■分子及び０分子含む三種類の糖鎖が２：２
：１の比率で存在するが、ＲＡ患者血清中のＩｇＧの糖
部分ではガラクトースを２分子含む種類の糖鎖が著しく
減少し、全体にガラク）　−スを欠損した糖鎖が大幅に
増加していることが判明したのである（文献２）。この
事実に基づけばＲＡ患者血清中のＩｇＧの糖部分には糖
鎖についての構造異常が起こっており、この構造異常を
把握することが可能となれば、それはＲＡのマーカーと
して使用することができることが知られるのである（文
献４）。

以下に列挙する文献１〜４は以上の知見をより詳細に記
述したものであり、本発明において参照される。

文献 １）　Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｈ，Ｇ、　ａｎｄ　Ｔａｎ、　
Ｅ、　Ｍ、　（１９６４）：Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ、　Ａｄｖ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、。

４：３５１ ２）　Ｍｉｚｕｏｃｈｉ＋　ｒ、ｌ　Ｔａｎｉｇｕｃｈ
ｉ＋　Ｔ、Ｉ　Ｍａｔｓｕｔａ。

Ｋ、＋　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）：　Ａｓ５ｏｃｉ
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｏｓｔｅｏａｒｔ
ｈｒｉｔｉｓｗｉｔｈ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ
　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｏｆ　
ｔｏｔａｌ　ｓｅｒｕｍ　ＩｇＧ、　Ｎａｔｕｒｅ、　
３１６＋４５２３）　　　ＭｉｚｕｏｃｈＬ　　’ｒ、
ｌ　　ｅｔ、　　ａｌ、　　（１９８２）：　　Ｊ、　
　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

廿馬工２０１６ ４）　Ｍｉｚｕｏｃｈｉ＋　Ｔ、　（１９８５）：Ｒｅ
ａｃｔａｎｔ　ｔｏ　ｒｈｅｕｍａ−ｔｏｉｄ　ｆａｃ
ｔｏｒ：ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｕ
ｇａｒ　ｃｈａｉｎｓｏｆ　ＩｇＧ　ｉｎ　ｐａｔｉｅ
ｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１７．９
７７さて、上記したところより明らかなごとく、血清中
ＩｇＧのＦｃ部位の糖部分におけるガラクトース欠損を
把握することによってＲＡの診断が可能となることは知
られているのであるが、該ガラクトース欠損の測定をど
のような診断薬によって具体的に実現するかについては
未だ知られていない。

かかる状況に鑑み、本発明者らはヒト血清中のＩｇＧの
糖部分におけるガラクトース欠損を測定するための診断
薬を提供することを本発明の解決すべき課題とした。

〔課題を解決するための手段〕

上記課題に対し、本発明者らは種々の検討を行い、その
結果、ヒト血清中にプロティンＡまたはプロティンＧを
加え、次に標識レクチンを加えることによって所定の目
的が達成されることを知り、本発明を完成するに至った
。

即ち、本発明は、プロティンＡまたはプロティンＧ及び
標識レクチンを必須の構成要素とするリウマチ診断薬に
係わるものである。

以下に本発明を更に詳細に説明する。

本発明においてリウマチとはリウマチ因子による自己免
疫疾患を言い、具体的な徴候は関節部位における朝方の
こわばりとして現れる。

本発明において用いられるプロティンＡとは５ｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ（スタフィロコッカ
ス０アウレウス）の細胞膜より単離されたタンパク質で
あり、内部構造の相似したいくつかの部分からなる分子
量４２．０００のシングルポリペプチドから構成される
ものである。

プロティンＡはＩｇＧのＦｃ部位と結合する性質があり
、この結合性によりＩｇＧの精製に使用することができ
、このこと自体は公知である。

また本発明に用いられるプロティンＧはプロティンＡ同
様、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来
のタンパク質であり、プロティンＧもＩｇＧのＰｃ部位
と結合する性質があり、この結合性によりＩｇＧの精製
に使用することができ、このこと自体は公知である。

本発明に用いられるレクチンとは糖鎖結合性蛋白質の総
称であり、当初はヒマの種子より入手されたが、植物ば
かりでなく、細菌をはじめ動物にも広く分布しており、
現在は起源の異なる各種のレクチンを入手することがで
きる。起源の異なるいずれのレクチンも構造の異なる複
数の種類の糖鎖と結合してこれを認識することができる
。例えばガラクトースを欠損したマンノース型糖鎖は起
源の異なるいずれのレクチンもこれを認識することがで
きる。従って本発明においてはレクチンは起源によって
特に限定されることはなく、いずれのレクチンを使用し
てもよい。特にコンカナバリンＡ及びレンズカリナリス
アグルチニンは本発明で使用されるレクチンとして好ま
しい例である。

レクチンの標識は標識方法として通常に行われる方法を
使用して行えばよい。従って、例えば酵素標識、放射標
識等を適宜に選択してこれを行えばよくこれらの標識方
法によって本発明は限定されない。酵素標識にあたって
は、酵素をレクチンに直接に結合してもよいし、また適
当な架橋剤、例えばビオチンとアビジンを介して結合し
てもよい。

本発明の診断薬を使用して測定を行う方法は例えば基本
的には以下のように行えばよい。まず、ニトロセルロー
ス膜にプロティンＡを固定し、ここに試料血清を加えて
反応させ、次にビオチン−コンカナバリンＡを加えて反
応させ、更に次にアビジン−パーオキシダーゼを加えて
反応し、洗浄後、パーオキシダーゼの基質液を加えて発
色させ、測定する。この測定方法において本発明診断薬
はプロティンＡ及びビオチン−コンカナバリンＡ（標識
レクチン）を必須の要素として提供しており、測定操作
の過程で使用されるその他の成分、例えば燐酸緩衝液、
ブロッキング液、ニトロセルロース膜、アビジン−バフ
オキシダーゼ、トリス緩衝液、基質溶液、反応停止液等
は測定者の便益のために診断薬のセットの中に適宜に加
えればよく、これらの添加によって本発明は限定されな
い。

プロティンＡまたはプロティンＧによってＩｇＧを精製
すること及びレクチンによって糖鎖を認識することはい
ずれも従来公知であるが、これらを一体にして診断薬と
した構成は新規であり、かつ該構成によって、従来は測
定困難とされたＲＡの診断が簡便かつ正確に行われるに
至ったことは後記実験例によって示される如くである。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ 市販されているプロティンＡ（例えばシグマ、ファルマ
シアなど）あるいはプロティンＧ（例えばシグマ、ファ
ルマシアなど）、と標識レクチン（例えばベルオキダー
ゼ標識、ビオチン標識など）（市販品としては例えばシ
グマ、生化学工業など）とを組み合わせて本発明診断薬
とした。

実施例２ 実施例１に示した構成要素以外にプロティンＡなどを固
定（結合）させる固相体（例えばニトロセルロースメン
ブレン、カップ）、ブロッキングバッファー（例えばＢ
ＳＡやゼラチンを含むリン酸バッファーやトリスバッフ
ァー）、標識酵素（例えばストレプトアビジン−ペルオ
キシダーゼなど）、酵素基質（過酸化水素水）や発色剤
（例えば４−クロロナフトール）を構成要素とし、本発
明診断薬とした。

実施例３ 固相面に結合・固定させたプロティンＡあるいはプロテ
ィンＧと、ヒト血漿、あるいは血清を反応させ、免疫グ
ロブリン（ＩｇＧ）を特異的に選択する。結合したＩｇ
Ｇに存在するＮ鎖構造を標識レクチン（例えばペルオキ
シダーゼ−レクチン）で標識し、レクチンの糖鎖構造の
特異的認識作用により、ＩｇＧ上の糖鎖構造の変化を検
出する。検出法としては、ＩｇＧ　ｌｉ鎖へのレクチン
結合量を発色などのシグナルにより定量する。

即ち、ＲＡ患者血清中に存在するＩｇＧ糖鎖構造を分析
した結果、ガラクトースが顕著に減少していることがわ
かった。そこでこのようなＡｇａｌａ−ｃｔｏｓｙｌ　
ＩｇＧと反応するレクチンをスクリーニングしたところ
、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ　Ａ）やレンズカリナリス
アグルチニン（ＬＣＡ）などのマンナース認識型レクチ
ンが顕著に反応することがわかった。

そこで、これらのレクチンを用いて、以下に示す実験例
よりＲＡ患者血清中１ｇＧについて検討した。

実験例１ 〈試　料〉 慢性関節リウマチ患者及び健常人血清を調整し実験に供
した。

く方　法〉 プロティンＡ　（２５０ｐｇ／ｄ）をリン酸バッファ（
５０ｍＭリン酸塩、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，
４）に溶解し、その１０ｍをニトロセルロース膜に結合
させる（ドツト・プロッティング）。その後、膜を乾燥
後、ブロッキングバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５％ＮＰ−４０，
２，５％ゼラチン（Ｗ／Ｖ）、　ｐＨ７，４）でブロッ
キングを行う。この膜（ＩｇＧ−ｔｒａｐｐｉｎｇ　ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ）（以下・ＩＧＧＴＭと略記）をＲＡ患
者及び健常人血清中１ｇＧ糖鎖の検討に使用した。

ＲＡ患者及び健常人血清をブロッキングバッファーで希
釈後、ＩＧＧＴＭに加え膜上にＩｇＧを結合させる（６
０分間、室温）。反応後、これらのＩＧＧＴＭを軽くリ
ンスし、５分間の洗浄後、ビオチン−ＣｏｎＡ（２０μ
ｇ／Ｍｉ）を５００１１１加え、反応させる（６０分間
、室温）。反応後、ＩＧＧＴＭを軽くリンス、５分間の
洗浄を２回繰り返し、次にストレプトアビジン−ペルオ
キシダーゼを５００ハ加え、反応させる。反応後、軽く
リンス後、５分間の洗浄を２回繰り返す。洗浄後、ＴＢ
Ｓ　（２０ＱＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　０．５Ｍ　Ｎ
ａＣ１，ｐＨ７，４）で軽くリンス後、ペルオキシダー
ゼの基質溶液（５００ｐｇ／ｍｅ）を加え、発色反応を
開始する（５〜１０分間）。反応終了後、蒸留水でＩＧ
ＧＴＭをよく洗浄した後、乾燥し、ＩＧＧＴＭ上の発色
シグナルを定量化する。定量化には、Ｄｕａｌｗａｖｅ
ｌｅｎｇｔｈ　Ｆｌｙｉｎｇ−ｓｐｏｔｓｃａｎｎｅｒ
　ＣＳ　９０００（島津）（λ＝　５４０ｐｍ）を使用
した。

〈結　果〉 （１）　　ＲＡ患者４例、健常人４例について血清中Ｉ
ｇＧ中のＣｏｎ　Ａの反応性について調べた。健常人群
では平均カウント数が（７６０３，８５）、一方、ＲＡ
患者群では（４３９０６，２２）であり、Ｒ＾患者群で
高値を示した（図１）。

（２）　　ＲＡ患者９例、健常人４例の血清中ＩｇＧ中
のＬＣＡに対する反応性について調べた。その結果、健
常人では平均カウント数が（０）、−方、ＲＡ患者群で
は（２４５０１，８）であり、ＲＡ患者群で高値を示し
た（図２）。

実験例２ 〈試　料〉 下記病名の患者及び健常人血清を調整し、実験に供した
。

慢性関節リウマチ（ＲＡ）　　　　　　　　　２０例早
期慢性関節リウマチ（Ｅ−ＲＡ）　　　　　　２７例変
形性関節炎（ＯＡ〉 早期変形性関節炎（Ｅ−ＯＡ） 全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ） 肝疾患（ＬＤ） 健常人（Ｈ） １８例 ２０例 １２例 ２９例 ８７例 〈方　法〉 ２．５μｇ／−のプロティンＡをマイクロプレートのウ
ェルに１００１１１ずっ分注しコーテイング後、ブロッ
キングバッファー（１％ＢＳＡ。

５０ｍＭリン酸塩、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，
４）　１００　ｔｄでブロッキングを行う。このウェル
にゼラチンバッフｙ　　　（５０ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ、　０．１５Ｍ　ＮａＣ１゜０．０５％ＮＰ−４０
，２，５％Ｗ／Ｖゼラチン、　ｐＨ７，４）を１００ｐ
ずつ入れ、試料ＩＩＪｌを加える。

次に再びゼラチンバッファー１００ｐずつ加え２５℃、
６０分間インキュベートした。反応後、ウオツシングバ
ッフ　ｙ　　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。

０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５％ＮＰ−４０，ｐＨ７
，４＞で洗浄し、次にビオチン−ＣｏｎＡ溶液（０，０
６２５ｕ　ｇ／−）を１００　ＩＩｌ加え２５°Ｃ１６
０分間反応させる。

反応後、ウオツシングバッフアーチ洗浄シ、次にストレ
プトアビジン−ペルオキシダーゼをｉｏｏ　＃加え２５
°Ｃ１６０分間反応させた後、ウオツシングバッファー
で洗浄後、基質液（３％ＨｚＯｚ＋　　１０ｎ十八ＢＴ
Ｓ　６■／４ａＺクエン酸バ・ンファー（ｐＨ４，２）
）を１００ｐ加え３７°Ｃ１６０分間反応させる９反応
後、アジ化ナトリウム溶液１００　ＩＪｌを加えて反応
を停止させ波長４０５ｎｍと４９０ｎｍによる吸光度を
三波長分光光度計を用いて測定した。

〈結　果〉 結果を図３に示す。

図３より以下のことが判明する。

即ち、ｃｕｔ　ｏｆｆ値を０．１４と定めた場合に測定
値がｃｕｔ　ｏｆｆ値を越えている時は確実にリウマチ
症と認めることができる。

尚、図３における各種疾患別の陽性率は表１に示す如く
である。

４゜ 表 安倍の報告（安倍達、総合臨床、　３４．１９１５（１
９８５））によれば従来のＲＡテスト（血球凝集法、ラ
テックス凝集法）ではＲＡ以外のＳＬＥ。

ＯＡ或いはＬＤに対し高い陽性率を示す。しかしながら
本発明法ではこれらに対する陽性率が極めて低く、ＲＡ
疾患に対し高い特異性を有するものである。

【図面の簡単な説明】

図１はＲＡ患者及び健常人血清中のＩｇＧをＣｏｎ　Ａ
ステインニング後のシグナル強度で比較したグラフであ
る。定量はフライングスポットスキャナーＣ５９０００
を用いて行った。 図２はＲＡ患者及び健常人血清中のＩｇＧをＬＣＡステ
インニング後のシグナル強度で比較したグラフである。 定量はフライングスポットスキャナーＣ５９０００を用
いて行った。 図３は実験例２の結果を示すグラフであり、カップ法に
よる各種疾患患者血清中のＡｇａｌａｃｔｏｃｙｌＩｇ
Ｇ量（Ａ４０５／４９００発色値）を示す図である。 図　　１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　リウマチ診断薬において、プロテインＡまたはプロ
   テインＧ及び標識レクチンを必須の構成要素とするリウ
   マチ診断薬。 ２　標識レクチンが標識ガラクトース欠損糖鎖認識レク
   チンである請求項第１項記載のリウマチ診断薬。 ３　標識ガラクトース欠損糖鎖認識レクチンがコンカナ
   バリンＡである請求項第２項記載のリウマチ診断薬。 ４　標識ガラクトース欠損糖鎖認識レクチンがレンズカ
   リナリスアグルチニンである請求項第２項記載のリウマ
   チ診断薬。