JPH0374323A

JPH0374323A - リポソームの保存方法

Info

Publication number: JPH0374323A
Application number: JP20994989A
Authority: JP
Inventors: Jiro Yamaguchi; 山口　治朗; Mitsunori Ono; 光則小野
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1989-08-14
Filing date: 1989-08-14
Publication date: 1991-03-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はリポソームの保存方法に関し、更に詳しくハ、
リポソーム分散液にアミノアルカンスルホン酸を添加し
た保存方法に関する。

（発明の背景）リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｎ−＋ｅ）　　は、脂質２分
子膜からなる閉鎖小胞体である。天然の生体膜は、脂質
の２分子膜構造をとっていると言われており、このリポ
ソームは生体膜のモデル膜としてその物理化学的性質の
研究に広く用いられている。また、リポソームは内部の
水層や膜内に種々の物質を閉じ込めることが出来、細胞
と融合したり、細胞に取り込！れたりするので、生体内
へ物賀ヲ送りこむキャリヤーとして利用される。

リポソームを利用した研究は、生物学、医学、薬学など
広範な分野にわたっており、酵素や制ガン剤を運ぶキャ
リヤーとしての利用、免疫学分野での利用、細胞との相
互作用、ドラッグデリバリ−システムとしての利用端・
が研究されている。

リポソームは上述したように、極めて広範な利用分野を
有するが、その問題点として膜構造の脆弱性が指摘され
ている。

即ち、膜形成物質である脂質の化学的または物理的変化
により膜の配向が乱れ、内包物の漏出、リポソームどう
しの会合、凝集が起こり、やがて沈殿を生成してしｌう
現象である。

そこでリポソーム膜の強化法として、従来多糖で被覆し
たリポソームの製法（特開昭６１−６りｒｏｉ号ンや水
素結合によって構造強化されたリン脂質（日本化学会誌
！６２頁、ｌりｒ７年）また脂質にアスコルビン酸エス
テルを混合する方法（特開昭６０−２３／６０８’号）
保存液の外部浸透圧を高くする方法（％開閉ｘ、ｚ−、
ｚｏｉｒｉｒ号）などが提案されてきたが、いずれも内
包物の漏出抑制という観点が主体であり、実用する場合
にもつとも重要となる保存液中での凝集抑制には技術的
な進歩が見られていなかった。

最近、プロピレングリコール、グリセリン等を用いるリ
ポソーム製造法（特開昭６Ｏ−７９３２）が開示された
が、この方法は繁雑であり、かつ脂質類、コレステロー
ル等金高温（４０−／　Ｊ　Ｏ’Ｃ）下でそれらの多価
アルコールに分散するものであり、内包物として使用で
きるものは著しく限定されるなどの問題を有していた。

更にこの方法で作製したりポンームでは、一般に未封入
物を除去するために透析、ゲル濾過、遠心分離など金行
うため、最初用いた多価アルコールは大部分除去されて
し１う。そのため残留多価アルコールによって最終的に
得られるリポソーム分散液が分散性の面で安定化される
事は実質的に期待できない。

上記のように、現在１での所封入部材を有するリポソー
ムを液状で安定に保存する方法が見出されてい耽い。

（発明が解決しようとする課題）従って本発明の目的は、膜構造が強化され、保存時の凝
集が少ないリポソームの保存方法全提供することにある
。

（課題を解決するための手段）上記の目的全達成するために、本発明は以下の各項に示
す構成からなる。

（１）封入部材を有するリポソーム分散液中にアミノア
ルカンスルホン酸を添加することを特徴とするりポンー
ムの保存方法。

（２）前記リポソームがリン脂質及び／又は糖脂質とコ
レステロールからなるリポソームであることを特徴とす
る上記（１）のリポソームの保存方法。

（３）前記リポソーム分散液中に添加するアミノアルカ
ンスルホン酸の量がリポソーム分散液ｌＯＯ容量部あた
り（７，２ないし１５重量部であることを特徴とする上
記（１）のリポソームの保存方法。

本発明者等は、内包物の漏出、リポソーム粒子の凝集と
いう観点で、リポソームの膜構造を強化する方法を鋭意
研究した結果、リポソーム分散液に、アミノアルカンス
ルホン酸を添加することにより、凝集が大きく抑制でき
ることを見出した。

特に驚くべきことは、上記特開昭６０−７９３２などで
用いられているプロピレングリコールやグリセリンなど
の多価アルコールを添加した場合に比べて格段に凝集が
抑制されることを見出したことにより本発明を完成した
。

本発明において用いることの出来るアミノアルカンスル
ホン酸とは、未置換のアミノ基を有するアルカンスルホ
ン酸であって２０°Ｃにおいて水−タ　− に３％以上の溶解度を有し、□セルを形成しないもので
ある。アルカン部分の炭素数はｒ以下、特にｔ以下であ
ることが好ましい。

次に化合物の具体例をあげるがこれに限定されるもので
ない。

化合物例（１）　　Ｎｌ２−ＣＨ２−ＣＨ２−８Ｏ３Ｈ（２）　
　Ｎｌ２　　ＣＨ２ＣＨ２・ＣＨ３−８Ｏ３Ｈ（３）　
　ＣＨ３−ＣＨ−ＣＨ２−８０３ＨＨ２（４）　　Ｎｌ２　　ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２
−８０３Ｈ（５）　　（ＣＨａ　）　２−Ｃ−Ｃ）１２
−８Ｏ３ＨＨ２これらのアミノアルカンスルホン酸の添加時の形態は特
に制限は無く、固体の１３−１又は水溶液の形態で添カ
ロしてもよい。

本発明におけるリポソーム膜形成脂質には特に６− 制限はなく、リポソーム金形成するものであれば、天然
または合成の脂質が使用可能である。

その例として、ホスファチジルコリン、ホスファチジル
エタノールアミンホスファチジン酸、ホスファチジルセ
リン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグ
リセロールスフィンゴミエリン、カルシオリピンおよび
これらを常法に従って水素添加したものが挙げられ、こ
れらを適当に組合せて用いることもできる。

さらにリポソーム膜の構成酸分には所望によりコレステ
ロール等の膜構造強化剤や電荷付与物負（例えはステア
リン酸、オレイン酸、リノール酸、リルン酸、ジセチル
リン酸、ステアリルアミン）を添加することもできる。

本発明に使用される封入部材としては親水性薬物と親油
性薬物のいずれかあるいは両者を同時に用いることがで
きる。このような親水性薬物としては例えばアドリアマ
イシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、／−β−
アシビノフ２シルントシン、プレオマイシン、シスプラ
チン等の抗がん剤、インターフェロン等の抗ウィルス剤
、アミノ配糖体（例えば、ゲンタマイシン）、β−ラク
タム化合物（例えばスルペニシリン、セフオチアム、セ
フメノキシム）等の抗生物質、ＴＲＨ、リュウグロライ
ド、インスリン等のペプチドホルモン剤、リゾチーム、
アスパラギナーゼ、グリコシダーゼ等の酵素剤、ムラミ
ルジペプチド、ムラミルトリペプチド等の免疫賦活剤、
イムノグロブリン、各種トキシン等の蛋白質があげられ
る。

親油性薬物の例としては、アンサマイトシンのような抗
ガン剤や、Ｔ　Ｍｌ）　−１，Ａ　（Ｇａｎｎ　７４１
（，２）／Ｆ２−ｔｙｒ＜ｔｙｇ３））、ＭＴＰ−ＰＥ
（特開昭タＰ−／１３３１り）のような免疫賦活剤、リ
ン脂質誘導体（特開昭タデ−／６３３ｔｙ）があげられ
る。

その他薬物以外のものでも、マーカー、あるいはプラス
ミド、ＤＮＡ、　　ＲＮＡ等生体内に投与して有用なも
のであれば特に制限されることはない。

次に封入液は水を媒体とし、これに適宜の水溶性物質を
溶解した水溶液が用いられる。場合によっては単に水に
薬物を溶解したものであってもよい。水溶性物質として
は、種々の緩衝液（例、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液
）、各種塩類（例、塩化ナトリウム、リン酸−ナトリウ
ム、リン酸二ナトリウム）、糖類（例、グルコース）、
アミノ酸類（例、ｌ−アルギニン）などを単独または混
合して用いることができる。

この封入液中には、必要に応じて、保存剤（例、パラベ
ンン等を加えておいてもよい。

本発明に用いられる封入部材’ｒ［するリボソームは公
知の方法によって調製される。

すなわちポルチクスイング法（Ａ、Ｄ。

Ｂａｎｇｈａｍ　Ｊ　、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、／　３、
．２３１（７Ｙ／、ｊ）、７＝ケー’／ヨ７法（Ｃ，Ｈ
ｕａｎｇ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｉ　、３１１１／Ｌ（／Ｐ１．デ）
〕、プレベシクル法（Ｈ，Ｔｒａｕｂｌｅ、Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉ、Ｒｅｓ。

Ｐｒｏｇ、Ｂｕｌｌ　　、、　　？　　、　　２　７　
３　　（／　　５ン　７　／　ン　」　、　　エタノー
ル注入法［５−Ｂａｔｚｒｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、２　！Ｐ！　、／　ｏ／
　ｚ　（／　Ｙ７３）〕、フレンチプレス押出法［Ｙ、
Ｂａｒｅｎｈｏｌｌｚ、。

−ターＦＥＢ８．Ｌｅｔｔ、、ｙｙ、２ｔｏ（ｔ　！Ｐｙｙ）
）。

コール酸除去法ＣＹ、Ｋａｇａｗａ、Ｊ、ＢｉｏＩ。

Ｃｈｅｍ、、　　２４Ａ　Ａ　、夕！７７（／り７／）
〕、〕トリトンＸ−７００パッチ法　Ｗ　、Ｊ　、Ｇｅ
ｒｒｉｔｓｅｎ。

Ｅｕｒ、Ｊ−Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｉ　！　、２　タタ（
／９７１）〕。

Ｃａ２＋融合法〔Ｄ　、　ＰａＰａｈａｄｊｏｐｏｕｌ
ｏｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　３ｙ　
ｌＬｔ、ｘｉ　ｖ　３（１７７タ）〕、エーテル注入法
ＣＤ、Ｄｅａｍｅｒ　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、、４１４
ｔ３　．６２７（ｌり７ｔ　）　）　、アニーリング法
〔ＲｏＬａｗａｃｚｅｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ−Ａｃｔａ。

ｌψ３，３／３Ｃ／り７６）〕、凍結融解融合法［Ｍ、
Ｋａｓａｈａｒａ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、、ｚ夕
２゜ｑ３ｒｔａ（ｉｙ７７）’Ｊ　、Ｗｙ０７Ｗｘ−ｒ
ルジョン法［８，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｊ、Ｃｏ１１ｏ
ｉｄＩｎｔｅｒｆａｃｅ　　Ｓｃｉ、、６２　、／　Ｉ
Ｉり（ｌｙ７７））。

逆相蒸発法（Ｆ、５ｚｏｋａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃ　ｒ　−Ｕ　ＳＡ　＋　７タ、４ｔ／り！（／ｊ７
７、Ｓ’））。

高圧乳化法（Ｅ−Ｍａｙｈｅｗ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　７７　、ｔ　、　／　ｌり（／　ｙｉａ　
））の他、−／　θ 特開昭４Ｏ−７Ｆ３コ、同６０−７り３３、同１Ｏ−７
り３ψ、同６０−／２／２７、同６２−ｌり２１３／に
記載の方法等、多くの方法が知られているが、本発明で
は上記のいずれの調製法を用いてもよくまたこれらに限
定されるものではない。

上記の方法で調製されたリポソーム液はその普＼未封入
の部材を含んだ状態で、アミノアルカンスルホン酸ヲ添
加して保存してもよい。

他方、リポソーム内部に封入されなかった部材を除去し
た後に、アミノアルカンスルホン酸ヲ添加して保存して
もよい。更にアミノアルカンスルホン酸を添加した後に
、リポソーム内部に封入されなかった部材を除去し、除
去後に更にアミノアルカンスルホン酸を加えて保存して
もよい。未封入部材の除去の方法としては、透析法、ろ
過法（例、ゲル濾過）、遠心分離法等が挙げられる。

アミノアルカンスルホン酸の添加量はリポソーム分散液
１０θ容量部あたり０．２〜／！重量部である。より好
壕しくＯ，Ｓ〜７重量部である。

リポソーム分散液中の脂質量に対しては少くとも等モル
添加する。これらの量より少ないと凝集防止効果が少な
く、また多いと実用上種々問題をひきおこす（例、析出
）。

次に実施例をあげて本発明の作用効果をさらに具体的に
説明する。

実施例１下記の組成を有するリポソームを逆相蒸発法（Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、８ｃｉ、ＵＳＡ、７ｊ　（Ｙ　
）ｔｔ／９１ｔ（／９７ｇ’）、特開昭１１−／／Ｉｌ
ｌ／！号）により作製した。封入部材としてはカルボキ
シフルオレセインを用いた。各ψ夕μｍｌの卵黄ホスン
アチジルコリン、コレステロール全クロロホルム。２０
ＣＣに溶解した溶液を、容ｉ′夕ＯＱＣ，用のナス型フ
ラスコに入れた。ロータリーエバポレーターを用いて溶
媒を留去し、フラスコ内壁に薄膜を形成させた。

ついでジエチルエーテル２０ＣＣｆ加えて脂質を溶解し
、更にＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ）］＝＝７　、１　）　３
ｃｃ’ｌ加えたそして、ナスフラスコ内の気相ｉＮ２ガ
スで置換した後にナスフラスコｆ２０’ｃに保ちながら
、均一なげんたく液ができる１で、約！分間プローブ型
の超音波照射を行った。

次にロータリーエバポレーターで２００〜コ！０Ｃの減
圧下、ジエチルエーテルの大部分を留去した。このよう
にしてできたゲル状脂質ｆ２０秒間ボ゛ルテツクスで混
合した後、２０−２！″Ｃの減圧下、溶媒を完全に除去
した。これにＨＥＰＥＳ緩衝液ｔ、ｚｃｃを加えた。２
０　Ｃで、２０分間超音波照射を行なった０８ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ　　←Ｂでゲル濾過後、各フラクションについ
て平均粒径（株式会社　日科機製；コールターＮ−１−
サブミクロン粒子アナライサー使用）とリン脂質濃度（
和光製ニリン脂質測定用キット使用）全測定した。そし
て平均粒径０．２μの７ラクシヨンを用いリン脂質濃度
をコ、ｊＸＩＯ’μに調整した。

その調整液、ｔＣＣに表１に示すように、本発明の化合
物例１．３の粉末を各０．２ｇを加えて溶解させた。そ
して溶解後、粒径測定と外観々察を行なった。

また同じ試料液を！０Ｃでｌケ月冷蔵保管後同ｌ　３− じく粒径測定と外観測定を行なった。比較として、無添
加のもの、グリセリン、プロピレンクＩＪコールをそれ
ぞれｔ）、ｚｃｃ添加したものについて同様に調べた。

結果を表１に示す。

−／４Ｉ− 表／の結果から、本発明の方法を用いることにより、無
添加や、多価アルコール添加の場合に比べて、リポソー
ムの凝集が殆んど無く平均粒径も殆んど変化しないこと
がわかった。

ホスファチジルコリン／コレステロール／シセチルホス
フエートからなるリポソームでも同様の効果が見られた
。

（発明の効果）本発明の方法は脂質を水性液中に分散させた時に形成さ
れるリポソーム金液状で保存する際の凝集を抑制するの
に有効である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）封入部材を有するリポソームを調製後、そのリポ
ソーム分散液にアミノアルカンスルホン酸を添加するこ
とを特徴とするリポソームの保存方法。
（２）前記リポソームがリン脂質及び／又は糖脂質とコ
レステロールからなるリポソームであることを特徴とす
る請求項１記載のリポソームの保存方法。
（３）前記リポソーム分散液中に添加するアミノアルカ
ンスルホン酸の量がリポソーム分散液１００容量部あた
り０．２ないし１５重量部であることを特徴とする請求
項１記載のリポソームの保存方法。