JPH03754A - スチレン系重合体及び接着性細胞培養用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なスチレン系重合体及びその塩並びに之等
を素材とする接着性細胞培養用担体に関する。

Ｈ２ ＨＲ （ｎは１〜１０の整数）を示す。〕 をＡ＋Ｂ＝１及びＯ＜Ｂ≦１を満たす割合で有機米の技
術 生物体を構成する数百種の細胞は、外因性及び内因性の
異常に対する代謝調節、免疫応答等の諸反応に関与する
情報伝達物質を生産したり、ホルモンを始めとする多数
の生理活性物質の生産を分担しており、現在知られてい
る有用な生理活性物質の多くは、生体細胞の培養により
生産されるものである。しかして、生体外（ｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ）で培養され得る上記細胞は、■培養器壁に比較
的強く接着して存在し、該器壁との接着を阻止すると死
滅するもの、■器壁に比較的弱く接着し、弱い物理的操
作により器壁から脱離するが、生存のためには上記接着
が必要であるもの及び■器壁と弱く結合することもでき
るが、浮遊して生存できるものの３種に大別でき、有用
な生理活性物質の生産性を有する細胞は、主に生存のた
めに器壁との接着が必要な上記■及び■に属しており、
之等の細胞は接着性細胞（ａｎｃｈｏｒｇｇｅ　ｄｅｐ
ｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ）と呼ばれている。

上記接着性細胞の代表例としては肝細胞（肝実質細胞）
を挙げることができる。該肝細胞は、生体内の最大の物
質交代の場ともいうべき肝臓の重要な機能である血漿蛋
白質の合成分泌、糖新生、血糖調節（グリコーゲン代謝
）、脂質合成、尿素合成、胆汁合成分泌、解毒作用等の
全機能を担っており、また他の生体細胞に比して驚くべ
き自己増殖能を有している。しかしながら２等肝細胞の
機能等はあくまで生体内で発現され、主として血漿中の
物質により調節され、肝臓自体の多様構造乃至機構に制
御されているのであり、また肝細胞は内因性、外因性の
環境変化に非常に敏感で、細胞死に至らなくとも容易に
その代謝機能等を失い非実質化することが知られており
、従って該肝細胞を生体外で長期に亘って培養維持して
、所望の機能を発現させることは従来非常に困難であっ
た。

上記肝細胞の生体外培養における困難性は、肝細胞自体
の特性に依存するのみならず、その培養用基材（細胞接
着用担体）や細胞−担体間に存在する各種の物質や作用
に太き（影響される。即ち、従来肝細胞等の接着性細胞
の培養用担体としては、ガラスやプラスチックス製のシ
ャーレ、試験管、培養ビン等が用いられており、近年マ
イクロキャリヤーや中空糸等が報告されているが、之等
はいずれも接着性細胞の機能発現に絶対必要条件である
接着性（ａｔｔａｃｔ＋ｍｅｎｌ）と、それに引続いて
起こる細胞の伸展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、増殖性の面
で、殊に培養初期における上記接着性及び増殖性の面で
尚満足できる性能を有しておらず、高密度且つ長時間の
細胞培養には不適当なものであった。

上記接着性細胞とその培養用担体としての高分子材料と
の接着性に関与する因子としては、２等細胞と担体との
直接的作用及び両者の間・に存在する培地等を通しての
間接的作用の両者を考慮して、疎水性、イオン性、水素
結合性等の物理化学的（非特異的）相互作用及び細胞表
面の特異的レセプター活性等の生物化学的（特異的）相
互作用とが存在すると考えられる。事実、細胞の担体へ
の接着性は、上記各因子をモザイク状に分布させた不均
一構造の細胞膜を有する流動性に富む高次構造の分子集
合体である細胞が、同様の分子集合体としての担体を之
等の存在する空間において、いかに認識するかに依存し
ており、細胞−担体間の接着に関与する作用及び両者の
接点は当然に単一ではなく、細胞膜と担体との界面には
上記多種多様な相互作用点が分布している。

最近になって、接着性細胞培養用担体としての高分子材
料として、オリゴ糖、特にラクトースを側鎖に持つポリ
スチレン〔高分子論文集、　Ｍｏｌ。

４２、Ｎｏ、１１．７１９−７２４　（１９８５）、日
本化学会誌、（３）５７５−５７９　（１９８７）等参
照〕や特定のグルタミン誘導体残基を有するアミノ酸共
重合体〔特開昭６４−４７３７３号公報参照〕等参照室
された。しかしながら之等はいずれも上記生物学的（特
異的）相互作用の面からの研究に基づくものであり、細
胞と担体との多点相互作用を考慮したものではなく、特
に肝細胞の接着性及び増殖性に大きな影響を及ぼす担体
表面の親疎水性や電荷密度状態において尚改善される余
地があり、しかも肝細胞以外の各種接着性細胞に対する
接着性及び増殖性は期待できないものであった。之等に
代って各種細胞に対してより普遍的に有効であり、２等
細胞の長期に亘る培養維持及び機能発現を図り得る新し
い高分子材料の開発が斯界で切望されている。

また、上述した公知の各種高分子材料を用いる場合とい
えども、接着性細胞の培養に当っては、一般に培養液中
にウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）等の血清成分を約１０〜２
０％添加する必要があるとされているが、該血清成分の
添加利用は、該血清成分自体が高価であり、しかもこれ
は天然物である点より品質が一定しておらず、更に有用
物質生産後の除去には繁雑な操作等が必要であり、従っ
て、特に血清を含まない培地での接着性細胞の接着、増
殖に有効な上記新しい高分子材料の開発が、斯界で要望
されている現状にある。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、上記した接着性細胞の培養、特に無血
清培地での上記培養に好適であり、しかも従来公知のこ
の種高分子材料に見られる欠点をすべて解消して、殊に
細胞の接着性、伸展及び増殖性に優れ、培養細胞の機能
を充分に発現可能な新しい接着性細胞培養用高分子材料
を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段 本発明によれば、繰返し単位Ａ： 及び繰返し単位Ｂ： ＨＲ （ｎは１〜１０の整数）を示す。〕 をＡ＋Ｂ＝１及びＯＲＢ≦１を満たす割合で有し、重量
平均分子量が１万〜８万の範囲にあり且つ全繰返し単位
Ｂ中の少な（とも１／２が水素原子以外の上記Ｒ基を有
する単位であるスチレン系重合体及びその塩、並びに該
スチレン系重合体及び／又はその塩を素材とする接着性
細胞培養用担体が提供される。

本発明者らは、鋭意研究の結果、接着性細胞と担体との
間の相互作用の内では、特に担体表面の親疎水性及び電
荷密度状態が接着性細胞の接着性及び増殖性に重大な影
響を与えることを見出し、２等表面荷電と水和度とを適
度に調整すれば、細胞表面のレセプター活性等の生物化
学的作用を利用せずとも、接着性細胞を良好に接着、増
殖させ得、該細胞の長期に亘る機能発現が可能となるこ
とを見い出し、かかる特性を具備する担体として好適な
新しい高分子材料の合成に成功し、ここに本発明を完成
するに至った。

本発明重合体は、これを接着性細胞培養用担体として利
用して、上記物理化学的作用のみで、接着性細胞に優れ
た接着性と増殖性を与えることができ、しかもこの特性
は無血清培地での接着性細胞の培養により発現され、か
くして上記細胞の長期に亘る培養、増殖、維持、機能発
現を行ない得る。また本発明の接着性細胞培養用担体は
、特に肝実質細胞の無血清培地における増殖、維持に適
しており、従ってその利用によれば、ハイブリッド型人
工肝臓や六イオリアクターの開発も可能となる利点があ
る。

以下、本発明スチレン系重合体及び該重合体を利用した
本発明接着性細胞培養用担体につき、順次詳述する。

本発明重合体は、各種有機溶媒に可溶で成形性がよく、
平板状の培養担体を容易に調整可能で、また従来よりこ
の種細胞培養用培養皿としても市販されているポリスチ
レンを基幹としており、基本的には該ポリスチレンの芳
香環をアミノメチル化後、アミノアシル化することによ
り得られる。

本発明重合体のより好ましい一つの製造法としては、例
えばまず前記繰返し単位Ａを与えるスチレンモノマーと
、同繰返し単位Ｂ（但しＲは水素原子を示す）を与える
アミノメチルスチレンモノマーとを所定割合（繰返し単
位Ｂを与えるモノマー単独の場合を含む）で重合させ、
次いで得られる重合体のアミノメチレン基に、水素原子
以外の基Ｒを与えるアミノアルキルカルボン酸をカップ
リング反応させてアミノアシル基により修飾する方法を
例示できる。

本発明重合体の他の一つの好ましい製造法としては、ま
ず上記繰返し単位Ｂ（但しＲは水素原子を示す）を与え
るアミノメチルスチレンモノマーのアミノメチレン基に
、水素原子以外の基Ｒを与えるアミノアルキルカルボン
酸をカップリング反応させてアミノアシル基で修飾され
た所望のモノマーを合成し、これを単独で、或いは当該
モノマーと前記繰返し単位Ａを与えるスチレンモノマー
とを所定割合で、重合させる方法を例示できる。

上記方法において、用いられる繰返し単位Ｂ（但しＲは
水素原子を示す）を与えるアミノメチルスチレンモノマ
ーは、通常の方法に従い製造できる。例えばクロロメチ
ルスチレンをガブリエール（Ｇｓｂｒｔｅｌ）法に従い
フタルイミド化してビニルベンジルフタルイミドを得、
次いでこれをヒドラジン分解することにより製造できる
〔例えばＲｌＤ。

Ａ１１ｅｎ　ｅｌ　ｉｔ、、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、
、８３．１２６（１９７９）参照〕。

上記のごとくして得られるアミノメチルスチレンモノマ
ーのアミノメチレン基或いはこれをスチレンモノマーと
重合反応させて得られる重合体中に存在する同アミノメ
チレン基のアミノアシル基による修飾は、上記アミノメ
チレン基に、水素原子以外の基Ｒを与えるアミノアルキ
ルカルボン酸をカップリング反応させることにより実施
できる。

該反応は、予めＮ末端を保護した上記アミノアルキルカ
ルボン酸をスペーサー試薬として利用して、例えばジシ
クロへキシルカルボジイミド（Ｄ　ＣＣ）等の適当な縮
合剤を用いて、−船釣なアミド結合生成反応に従い実施
でき、該カップリング反応による修飾後、通常の脱保護
基反応に従いＮ末端保護基を脱離させることにより所望
のモノマー及び重合体を製造できる。上記修飾カップリ
ング反応に利用されるスペーサー試薬としては、具体的
にはアミノブチリル酸、アミノカプロン酸、アミノカプ
リル酸、アミノウンデカン酸等を例示でき、之等の内で
は特にアミノブチリル酸が好ましい。

また２等アミノアルキルカルボン酸のＮ末端保護基とし
ては、通常のアミノ基保護基、代表的にはｔｅｒｔ−ブ
トキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボ
ニル、０−クロロベンジルオキシカルボニル基等を例示
できる。ＤＣＣ等の縮合剤を用いる上記カップリング反
応は、例えば通常原料化合物に対して等モル量〜約４倍
モル量程度の縮合剤を用いて、適当な溶媒、例えばジク
ロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素の他、テトラク
ロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、ジオキサン、テ
トラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、ジメチ
ルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスル
ホキシド等の溶媒中で、一般に一り０℃〜６０℃程度、
好ましくは０℃〜室温程度で、数十分〜１２０時間程度
で行ない得る。上記カップリング反応後の保護基の脱離
反応は、常法に従う水素添加法、還元法、強酸によるア
シドリシス等により実施できる。

また、各モノマーの重合反応は、通常のポリスチレンの
製造と同様にして実施できる。より具体的には繰り返し
単位Ｂ（但しＲは水素原子又はアシルアミノ基であって
、該アシルアミノ基のアミノ基は保護基で保護されてい
てもよい）単独又は繰す返し単位Ａと繰り返し単位Ｂの
所定割合の混合モノマーを適当な溶媒、例えばベンゼン
、クロロベンゼン、キシレン、トルエン、ニトロベンゼ
ン等の芳香族炭化水素、四塩化炭素、メチレンクロライ
ド等のハロゲン化炭化水素、ジオキサン、テトラヒドロ
フラン等に溶解し、適当な重合開始剤、例えば２．２′
−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ベンゾイ
ルパーオキサイド（Ｂ　Ｐ　Ｏ）等をモノマー全量の１
／２００〜１／１００モル添加する。得られた反応溶液
を約−１０℃以下で凍結して減圧脱気と窒素置換とを数
回繰り返した後、常圧又は減圧下で封管し、好ましくは
３０〜９０℃、より好ましくは５０〜７０℃で２時間〜
数日間重合させる。なお、アシルアミノ基が保護基で保
護された繰り返し単位Ｂの場合、重合反応の後、必要に
応じて脱保護を行なう。重合体はエーテル、メタノール
、ヘキサン等の適当な溶媒で洗浄するか又は反応溶媒を
凍結乾燥等により除去した後、適当な酸、例えば酢酸、
蟻酸等に溶解し、エーテルで精製する。

上記いずれの方法による場合も、前記繰返し単位Ａを与
える七ツマ−と繰返し単位Ｂを与えるモノマーとの仕込
み比率はＡ＋Ｂ＝１として、０くＢ≦１、好ましくは０
．０３＜Ｂ＜０．５又はＢ＝１、より好ましくはＢが約
０．　１前後を満たす範囲又はＢ＝１とするのがよい。

上記繰返し単位Ｂ又はこれを与えるモノマー中のアミノ
メチレン基に修飾カップリング反応させるべきアミノア
ルキルカルボン酸の割合は、全アミノメチレン基の少な
くとも１／２が修飾される量、好ましくはほぼすべての
アミノメチレン基が修飾される量とするのが適当である
。

か（して、本発明のスチレン系重合体を製造できる。該
スチレン系重合体の同定確認は、赤外線吸収スペクトル
分析、薄層クロマトグラフィー等の機器分析により行な
い得る。またその分子量は、ゲルパーミュエーションク
ロマトグラフイーによる測定の結果、１万〜８万の範囲
にある。

上記で得られるスチレン系重合体は、その側鎖に存在す
るアミノ基の酸付加塩の形態として得られる場合もあり
、また通常の酸を用いて常法に従い酸付加塩の形態′と
することもできる。かかる酸付加塩を形成し得る酸とし
ては、例えば塩酸、過塩素酸等の無機酸や酢酸、蟻酸等
の有機酸を例示できる。

本発明はまた、上記スチレン系重合体及び／又はその塩
を素材とする接着性細胞培養用担体を提供するものであ
る。該担体は上記素材を適当な形状、例えば膜状、繊維
状、球状等に賦形することにより得られる。特に好まし
い上記担体の形態は膜状形態であり、これは通常の細胞
培養用シャーレ等の基板上に、本発明重合体の可溶化溶
媒溶液を流延してキャストし、その後溶媒を留去するこ
とにより調製できる。上記で用いられる重合体の可溶化
溶媒溶液としては、重合体の種類に応じて異なるが、例
えば酢酸溶液、ジオキサン溶液、ジオキサン−酢酸溶液
、エタノール−酢酸溶液、ジメチルホルムアミド溶液等
が好ましく、酸性溶媒の場合、製膜後アルカリ水により
中和し、脱イオン水で洗浄するのが適当である。

かくして得られる本発明の接着性細胞培養用担体は、そ
の利用により、無血清培地にて接着性細胞を効率よく培
養増殖維持できる。本発明担体を利用して無血清培地で
培養できる上記接着性細胞は、接着性である限り特に限
定はなく、例えばヒト胎児包皮線維芽細胞、チャイニー
ズハムスター肺線維芽細胞、チンパンジー肺線維芽細胞
、ニワトリ胚線維芽細胞、マウス転移線維芽細胞等の各
種線維芽細胞や、ヒト子宮癌細胞、ヒト胎児肺細胞、ヒ
ト腎臓癌細胞、初代サル腎臓細胞、脳下垂体腫瘍細胞、
初代ヒト肝細胞等の上皮細胞乃至之等の癌化細胞等を例
示できる。特に肝細胞は前述したように生体外培養の困
難なものであり、本発明担体の利用によれば、かかる肝
細胞の無血清培養が可能となり、これはハイブリッド型
人工肝臓やバイオリアクター等の開発に大きく貢献する
ものである。

本発明担体を利用して上記接着性細胞を培養するに当っ
ては、公知の各種培地をいずれも使用できる。該培地に
は例えばミニマムエツセンシャル（ＭＥＭ）培地、ダル
ベツコ変性イーグル培地、ウィリアムスＥ培地１、Ｌ−
１５培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等が包含される。２
等培地には、通常利用される各種の増殖因子等を添加存
在させるのが好ましく、また特に必要ではないが血清や
フィブロネクチン等を添加することも勿論可能である。

上記培地はまた例えばＨＥＰＥＳ緩衝液、ダルベツコ燐
酸緩衝液等を用いてｐ）（７〜８程度に調整するのがよ
く、該培地による細胞の培養は、通常の液体培養条件、
具体的には温度３０〜４０℃、好ましくは３７℃付近に
て、炭酸ガス培養によるのが好ましい。上記培地に対す
る細胞の播種量は、一般に培地１１１当りｌＸ１０４〜
１０５個程度とされるのが適当である。

かくして本発明担体の利用によれば、無血清培地で接着
性細胞の接着、伸展、増殖を非常に良好に実施すること
ができる。

実　　施　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため、本発明重合体
の製造のためのモノマー等の製造例を参考例として挙げ
、次いで本発明重合体の製造例を実施例として挙げる。

更に得られた本発明重合体を用いて作成した本発明担体
による細胞培養例を試験例として挙げる。

尚、各製造例で得られる物質の同定は以下の赤外線吸収
スペクトル（ＩＲ）分析及び薄層クロマトグラフィー（
Ｔ　Ｌ　Ｃ’）分析により行なった。

１、ＩＲ分析： モノマー試料はＫＢｒ錠として、ポリマーの内粉砕不可
能でＫＢｒ錠が得られないものは適当な溶媒に溶解して
フィルムとし、それぞれ日本分光株式会社製　Ａ３０２
型赤外線分光光度計により測定した。

ｎ、ＴＬｃ： 薄層担体としててメルク（Ｍｅｔｃｋ）社製シリカゲル
６０Ｆ２５４ＴＬＣプラスチツクシートを用い、下記４
種の展開溶媒を用いて実施した。

１）ＣＭＡ；クロロホルム：メタノール：酢酸（９５：
５：５） ２）ＣＭＰ；クロロホルム：メタノール：ピリジン（９
５：５：３） ３）Ｐａ；ｎ−ブタノール：酢酸：水 （４：　１　：　５上層） ４）Ｐｙ；ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水（１５
：１０：３：１２） 更にポリマーの平均分子量は、特筆しない限り、ゲルパ
ーミェーションクロマトグラフィー［カラム：スーパー
ロース６（ファルマシア社製）、展開溶媒：Ｑ、０５Ｍ
　　ＨＣｌ、流速：０，４ｘｌ／分］により求めた、ポ
リスチレン換算の重量子均分・子嚢である。

参考例　１ スチレンモノマーの精製 市販スチレン（重合禁止剤として１０〜２０ｐｐｍのｐ
−ｔ−ブチルカテコールを添加したもの、和光純薬社製
）を、５％チオ硫酸ナトリウム水溶液、脱イオン水で洗
浄し、更に１０％水酸化ナトリウム水溶液で洗い、その
後中性になるまで水洗し、次いで酸化バリウムで脱水、
窒素気流下に減圧留去してスチレンモノマーを調製した
。

参考例　２ アミノメチルスチレンモノマーの合成 （１）　市販クロロメチルスチレンモノマー（ｍ−：ｐ
−＝７：３、東京化成社製）６１．０ｇとフタルイミド
カリウム（和光紬薬社製）７４．０ｇとを、Ｎ、Ｎ’　
−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２００２Ａ’に溶解
し、５０℃にて４時間反応させ、減圧濃縮して得られる
シロップをクロロホルム２４０ｘｌに溶かし、０．２Ｎ
水酸化ナトリウム水溶液２００ｚｌで４回洗浄した。更
に水２００ｚ！で３回洗浄後、減圧濃縮し、得られるシ
ロップをメタノールで処理して結晶化させ、エーテル−
ヘキサンで洗い、乾燥して固形物を得た。

これをメタノールから再結晶してビニルベンジルフタル
イミド７６．０ｇを得た。

融点７６〜７７℃ Ｒｆ値　ＣＭＡ：０．８３　　ＣＭＰ：０．５ｓＰａ　
　：０．９２　　Ｐｙ　　：０．７５（２）　上記（１
）で得たビニルベンジルフタルイミドをエタノール２０
０ｚｌに懸濁させ、これに８０％ヒドラジン水和物（和
光紬薬社製）２５．０ｇのエタノール溶液を加えて９０
分間煮沸還流させた。減圧濃縮後、水酸化カリウム水溶
液（１：　６　（ｗ／ｖ％））６００ｚｌに溶かし、エ
ーテル抽出し、２％炭酸カリウム水溶液１６０ｚ／で４
回洗浄後、無水炭酸カリウムで脱水、濃縮し、次いで減
圧蒸留（５，０ｍｍＨｇ、　７７〜７８℃）シテ、アミ
ノメチルスチレン２３．８ｇを得た。

ｄ２Ｇ＝０．９６　　ｇ／ｘｉ Ｒｆ値　ＣＭＡ：０．０５　　ＣＭＰ：０．０７Ｐａ　
　：０．３１　　Ｐｙ　　：０．６７参考例　３ アミノアシルアミノメチルスチレンモノマーの製造 （１）　γ−アミノブチリル酸（和光紬薬社製）４．１
４ｇを脱イオン水２２ｚｌとトリエチルアミン（ＴＥＡ
）８．４ｚｌとの混液に懸濁させ、これに５−ｔ−ブチ
ルオキシカルボニル−４，６−シメチルー２−メルカプ
トピリミジン（Ｂｏｃ−８Ｄ　Ｐ。

ペプチド研究所社製）１０．６ｇのジオキサン２２１１
溶液を加えて一夜反応させた。反応液に脱イオン水７０
１１を加え、酢酸エチル８０１１で２回洗浄して未反応
のＲｏｅ−８Ｄ　Ｐを除去後、０℃に冷却し、４Ｎ−塩
酸でｐ　Ｈ２とした。析出した油状物を酢酸エチル６０
ｚ／（１回）及び３０ｙ／（２回）でそれぞれ抽出し、
０℃の５％塩酸（食塩飽和）５０１１で３回、次いで飽
和食塩水５０ｘｌで３回洗浄した。脱色炭処理後、硫酸
ナトリウムで脱水し、減圧濃縮し、エーテルフラッシュ
させ、得られた透明シロップにヘキサンを加えて冷凍し
、結晶化させた。酢酸エチル−エーテル−ヘキサンから
再結晶して、Ｎ−Ｂｏｃ−アミノブチリル酸７．２ｇを
得た。

Ｒｆ値　ＣＭＡ：０．６５　　ＣＭＰ：０．４６Ｐａ　
　：０．８４　　Ｐｙ　　：０．８３上記で得られたＮ
−Ｂｏｃ−アミノブチリル酸４．０６ｇと参考例２で得
たアミノメチルスチレンモノマー２．６６ｇとを、メチ
レンクロライド４０１！に溶解させ、０〜５℃に冷却後
、ジシクロへキシルカルボジイミド（Ｄ　ＣＣ，国産化
学社製）４．１２ｇを加え、同温度で一夜カツブリング
反応させた。反応液を濃縮し、酢酸エチル１００ｙｉを
加え、不溶物を炉去し、母液を１０％クエン酸水溶液１
００ｙＪ（３回）、゛飽和食塩水１００ｚｌ（２回）、
５％炭酸水素ナトリウム水溶液１００ｉｆ（３回）、飽
和食塩水１００ｚ／（２回）で順次洗浄し、硫酸ナトリ
ウムで脱水後、減圧濃縮して、白色結晶を得た。これを
酢酸エチルから再結晶して、ＮＢＯＣ−アミノブチリル
アミノメチルスチレンモノマー４．０ｇを得た。

元素分析値（Ｃ１８Ｈ２６Ｎ２０３として、％）実測値
：Ｃ６７，６４Ｈ８，２５Ｎ８．９６計算値：Ｃ６７，
７３Ｈ８，４６Ｎ８．７８Ｒｆ値　ＣＭＡ：０．６２　
　ＣＭＰ：０．５６（２）　６−アミノカプロン酸（和
光紬薬社製）５．２５ｇを脱イオン水２２１１とＴＥＡ
８．４ｚ／との混液に懸濁させ、これにＢｏｃ−８ＤＰ
　１０．　６ｇのジオキサン２２１１溶液を加え一夜反
応させた。

反応液に脱イオン水６０１１を加え、酢酸エチル８０１
１で２回洗浄して未反応のＢｏｃ−８Ｄ　Ｐを除去後、
０℃に冷却し、４Ｎ−塩酸でｐＨ２とした。

析出した油状物を酢酸エチル６０ｚ／（１回）及び３０
ｙＡ’（２回）でそれぞれ抽出し、０℃の５％塩酸５０
１１で３回、次いで飽和食塩水４０ｚｌで２回洗浄し、
脱色炭処理後、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮し、
得られた透明シロップエーテル−石油エーテルで処理し
て結晶化させた。エーテル−石油エーテルから再結晶し
て、Ｎ−Ｂｏｃ−アミノカプロン酸７．５ｇを得た。

Ｒｆ値　ＣＭＡ：０．４７　　ＣＭＰ：０．５３Ｐａ　
　：０．７９　　Ｐｙ　　：０．７７上記で得られたＮ
−Ｂｏｃ−アミノカプロン酸４．６４ｇと参考例２で得
たアミノメチルスチレンモノマー２．６６ｇとを、メチ
レンクロライド４０ｘｌに溶解させ、０〜５℃に冷却後
、ＤＣＣ４，１２ｇを加え、同温度で一夜カツブリング
反応させた。反応液を濃縮し、酢酸エチル１００ｚ／を
加えて不溶物を炉去し、母液を１０％クエン酸水溶液１
００ｚｌ（３回）、飽和食塩水１００ｚＡ’（２回）、
５％炭酸水素ナトリウム水溶液１００１！（３回）、飽
和食塩水１００ｚＡ’（２回）で順次洗浄し、硫酸ナト
リウムで脱水後、減圧濃縮して、白色結晶を得た。これ
を酢酸エチル−エーテル−ヘキサンから再結晶して、Ｎ
−Ｒｏｔ−アミノカプロイルアミノメチルスチレンモノ
マー５．６ｇを得た。

元素分析値（０２ＧＨ３ＯＮ２０３として、％）実測値
：Ｃ６７，８６Ｈ９，１９Ｎ８．８３計算値：Ｃ６９，
１８Ｈ８，９３Ｎ８．０７Ｒｆ値　ＣＭＡ：０．６２　
　ＣＭＰ：０．５９（３）　８−アミノカプリル酸（和
光紬薬社製）６．３８ｇを脱イオン水２２１！とＴＥＡ
８．４ｚＩとの混液に懸濁させ、これにＢｏｃ−８ＤＰ
　１０．　６ｇのジオキサン２２ｙｌ溶液を加えて一夜
反応させた。反応液に脱イオン水６０１ノを加え、酢酸
エチル８０１！で２回洗浄して未反応のＢｏｅ−８Ｄ　
Ｐを除去後、０℃に冷却し、４Ｎ−塩酸でｐＨ２とした
。

析出した油状物を酢酸エチル６０ｚｆ（１回）及び３０
ｚＪ（２回）でそれぞれ抽出し、０℃の５％塩酸５０１
！で３回、次いで飽和食塩水４０ｘｌで２回洗浄し、脱
色炭処理後、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃縮し、エ
ーテルフラッシュして結晶化させ、エーテル−ヘキサン
から再結晶して、Ｎ−Ｂｏｃ−アミノカプリル酸７．８
ｇを得た。

Ｒｆ値　ＣＭＡ：０．ｓｏ　　ＣＭＰ：０．５７Ｐａ　
　：０．８９　　Ｐｙ　　：０．８７上記Ｎ　−Ｈｏｅ
−アミノカプリル酸５．２０ｇと参考例２で得たアミノ
メチルスチレンモノマー２．６６ｇとをメチレンクロラ
イド４０１！に溶解させ、０〜５℃に冷却後、ＤＣＣ４
，１２ｇを加え、同温度で一夜カツブリング反応させ、
反応液を濃縮し、酢酸エチル１００ｚ＃を加えて不溶物
を炉去し、母液を１０％クエン酸水溶液１００ｙｊ（３
回）、飽和食塩水１００′１１（２回）、５％炭酸水素
ナトリウム水溶液１００ｙｆ（３回）、飽和食塩水１０
０ｙｊ（２回）で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後
、減圧濃縮し、エーテルフラッシュして白色結晶を得た
。酢酸エチル−エーテル−ヘキサンから再結晶して、Ｎ
−Ｂｏｃ−アミノカプリリルアミノメチルスチレンモノ
マ−４，２ｇを得た。

元素分析値（Ｃ２□Ｈ３４Ｎ２０３として、％）実測値
：Ｃ７０，５４Ｈ９，１６Ｎ７．７１計算値：Ｃ７０，
４２Ｈ９，３３Ｎ７．４７Ｒｆ値　ＣＭＡ：０．７１　
　ＣＭＰ：０．７２（４）　　　１１−アミノウンデカ
ン酸（アルドリッチ（＾１ｄｒｉｃｂ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏ、）社製）６．３８ｇを脱イオン水２２１１と
ＴＥＡ８．４ｚＡ’との混液に懸濁させ、これにＢｏｃ
−８ＤＰＩ０．６ｇのジオキサン２２１１溶液を加えて
一夜反応させた。反応液に脱イオン水６０１１を加え、
酢酸エチル８０１１で２回洗浄して未反応のＢｏｃ−８
Ｄ　Ｐを除去後、０℃に冷却し、４Ｎ−塩酸でｐＨ２と
した。析出した油状物を酢酸エチル６０ｙＪ（１回）及
び３０ｚＡ’（２回）でそれぞれ抽出し、０℃の５％塩
酸５０１！で３回、次いで飽和食塩水４０１！で２回洗
浄し、脱色炭処理後、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧濃
縮し、得られる結晶化をエーテル−ヘキサンから再結晶
して、Ｎ−Ｂｏｃ−アミノウンデカン酸８．０ｇを得た
。

Ｒｆ値　ＣＭＡ：Ｏ，ａｓ　　ＣＭＰ：Ｏ，ａｓＰａ　
　：０．７８　　Ｐｙ　　：０．８４上記Ｎ　−Ｂｏｃ
−アミノウンデカン酸６．０４ｇと参考例２で得たアミ
ノメチルスチレンモノマー２．６６ｇとをメチレンクロ
ライド４０１１に溶解させ、０〜５℃に冷却後、ＤＣＣ
４，１２ｇを加え、同温度で一夜カツブリング反応させ
、反応液を濃縮し、酢酸エチルＬｏｏｔ／を加えて不溶
物を炉去し、母液を１０％クエン酸水溶液１００ｙ／（
３回）、飽和食塩水１００ｚ７（２回）、５％炭酸水素
ナトリウム水溶液１００ｚ／（３回）、飽和食塩水１０
０ｚ！（２回）で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水後
、減圧濃縮し、得られた白色結晶を酢酸エチル−エーテ
ル−ヘキサンから再結晶して、Ｎ−Ｂｏｃ−アミノウン
デカノイルアミノメチルスチレンモノマー４．８ｇを得
た。

元素分析値（Ｃ２５Ｈ４ｏＮ２０３として、％）実測値
：Ｃ７１，７０）１９．６２　　Ｎ７．０８計算値：Ｃ
７１，９６Ｈ９，８３Ｎ６．７２Ｒｆ値　ＣＭＡ：０．
７２　　ＣＭＰ：０．７７参考例　４ ポリアミノメチルスチレン（ＡＭ−１００）の製造 参考例２で得たアミノメチルスチレンモノマー（ｍ　−
：　ｐ−＝７　：　３）　８．　８ｇと重合開始剤（２
，２’　−アゾビスイソブチロニトリル。

ＡＩＢＮ、和光紬薬社製）５５ｍｇとをベンゼン２０１
！に溶解させ、−２０℃に冷却しながら減圧脱気し、窒
素置換した。この工程を数回繰返した後、最終的に減圧
下に封管し、６０℃で重合させた。３日後、相分離した
液の上層をデカントし、下層をメチレンクロライド１０
０ｚｊに溶解させ大量のヘキサン中に投入し、析出した
ポリマーを炉取し、乾燥して目的とするポリマーを白色
粉末として得た。

元素分析値（＋Ｃ９Ｈ１□Ｎ＋。とじて、％）：ＣＨＮ 実測値ニア７、０７　９．　１４　　８．　５９計算値
：８１．２１　８．２６　１０．５３平均分子量：２．
０Ｘ１０４ 参考例　５ コポリアミノメチルスチレン−スチレンの製造（１）ス
チレン：アミノメチルスチレン＝９：１コポリマー（Ａ
Ｍ−１０）の製造 参考例１で精製したスチレンモノマー６５．６ｇと参考
例２で調製したアミノメチルスチレンモノマー９．４ｇ
とをベンゼン２００ｚＡＦに溶かし、これにＡＩＢＮ　
　０．５７ｇを加え、−２０℃で減圧脱気し、窒素置換
を数回繰返した後、減圧下に封管し、６０℃で重合させ
た。２日後、反応生成物をメタノール中に投入し、数回
メタノールにて洗浄し、乾燥して白色粉末として目的の
コポリマーを得た。

元素分析値（（−Ｃｔ　ｉＨｓ、　３Ｎ＋−８、％）二
Ｃ）ｌ　　　　　Ｎ 実測値：８９．　８３　７．７５　１．　４４計算値：
９０．９３　７．７６　１．３１極限粘度数：　〔η）
＝０．２０〜０．２３（２５℃、ベンゼン中） 粘度平均分子量：２．９〜３．５Ｘ１０４（Ｋ＝Ｌ、Ｌ
３ｘｌＯ’　　α＝０．７３）（２）スチレン：アミノ
メチルスチレン＝７：３コポリマー（ＡＭ−３０）　、
同５：５コポリマー（ＡＭ−５０）　、同３ニアコポリ
マー（ＡＭ−７０）及び同１：９コポリマー（ＡＭ−９
０）の酢酸塩の製造 参考例１で精製したスチレンモノマーと参考例２で調製
したアミノメチルスチレンモノマーとをそれぞれ所定仕
込比でモノマー合計５０ｍ、＋＋＋ｏｌずつとり、ジオ
キサン１５１１に溶かして重合管に仕込んだ。これにＡ
ＩＢＮ　　Ｏ，０４ｇを加えて冷蔵庫にて凍結させ、脱
気、窒素置換を繰返した後、減圧下に６０℃で２日間重
合させた。反応生成物を凍結乾燥してジオキサンを除い
た後、酢酸に溶かし、エーテル中に注いで精製した。尚
、ＡＭ−７０及びＡＭ−９０は一部不溶部があったが、
可溶部を以下の試験に使用した。

元素分析値（％）； ＡＭ−３０酢酸塩（Ｃ１１，９Ｈ１ｏ、ＩＮＯ，３００
，６）　　’ＣＨＮ 実測値ニア８．　　ｏｏ　　７．６５　３．　１０計算
値：８１．　７３　７．　７２　３．　２１ＡＭ−５０
酢酸塩（Ｃ９，５Ｈ１１，５ＮＯ，５０１，０）’ＨＮ 実測値ニア２．　３５　７．　９３　４．　２５計算値
ニア６．７９　７，７４　４．７１ＡＭ−７０酢酸塩（
０１０，ＩＨ１２，９ＮＯ，７０１，４）　　’ＣＨＮ 実測値：６８．　ｏｓ　　ｓ、　　０７　５．　４１計
算値ニア２．　９０　７．　７５　５．　８９ＡＭ−９
０酢酸塩（ＣＩｏ、７Ｈ１４，３ＮＯ，９０１，８）　
　’ＨＮ 実測値＝６２．　０５　７．　７９　５．　９９計算値
：６９．７７　７．７６　６．８５実施例　１ ポリアミノアシルアミノメチルスチレン塩酸塩の製造 参考例３で製造した４種のＲｏｅ−アミノアシルアミノ
メチルスチレンモノマーのそれぞれ５ｒＡｍｏｌを、ジ
オキサン３０１１に溶解させ、開始剤としてＡＩＢＮ３
．８ｍｇを加え、冷蔵庫で凍結させ、脱気、窒素置換を
繰返した後、減圧下に６０℃で７日間重合させて、ジオ
キサン中に懸濁した状態のポリマーを得た。これにメチ
レンクロライドを加えてポリマーを溶解させた後、４Ｎ
−ＨＣ＃／ジオキサンを加えて室温で４０分間攪拌して
脱保護した後、濃縮し、メタノールフラッシュし、エー
テルを添加して炉取し、乾燥した。

上記によりポリアミノブチリルアミノメチルスチレン（
ＡＭ−１００−ｍ）　、ポリアミノカプロイルアミノメ
チルスチレン（ＡＭ−１００−Ｖ）、ポリアミノ力ブリ
リルアミノメチルスチレン（ＡＭ−１００−■）及びポ
リアミノウンデカノイルアミノメチルスチレン（ＡＭ−
１００−Ｘ）のそれぞれの塩酸塩を、超吸湿性の黄色ガ
ム状物として得た。

平均分子量： ＡＭ−１００−ＩＩＩ塩酸塩：２．３Ｘ１０４ＡＭ−１
００−Ｖ塩酸塩＋２．２Ｘ１０４ＡＭ−１００−■塩酸
塩：２．８Ｘ１０４ＡＭ−１００−Ｘ塩酸塩：ｌ、３Ｘ
１０４また各ポリマーのＩＲ分析図は次の通りである。

ＡＭ−１００−ＩＩＩ塩酸塩：第１図 ＡＭ−１００−■塩酸塩：第２図 ＡＭ−１００−Ｘ塩酸塩：第３図 実施例　２ コポリアミノアシルアミノメチルスチレン−スチレンの
製造 参考例５の（１）で得たコポリマーＡＭ−１０をＤＣＣ
を用いて４種のスペーサー試薬とカップリング反応させ
た。その手順は以下の通りである。

即ち、ＡＭ−１０２，０ｇ　（アミノ含量１．０３ｎｍ
ｏｌ）をメチレンクロライド２００ｚ７に溶解させ、こ
れに参考例３の（１）〜（４）のそれぞれ前半で得られ
たＮ末端をＢｏｃ基により保護したアミノアシル酸各３
当量（６，２０ｍ　ｍｏｌ）を加えた後、０〜５℃でＤ
ＣＣｌ、２８ｇを加えて２日間カップリング反応させた
。

上記反応終了後、副生ずるＤＣＵｔｅａを消去し、反応
物を大量のメタノール中に注ぎ、飽和食塩水を加えて白
色沈澱を析出させた。この沈澱をデカントし、メタノー
ル、脱イオン水で洗浄し、消散、乾燥した。いずれのＮ
−Ｂｏｃ−アミノアシル酸を用いた場合も目的物の収量
は約９５〜９８％の範囲にあった。

次いで上記生成コポリマー１．０ｇをジオキサン１５１
１！に溶解させ、４Ｎ−ＨＣＡ’／ジオキサンを加えて
室温にて１時間放置し、その後減圧濃縮し、メタノール
フラッシュさせた。適量のメチレンクロライド（約、２
００ｚＡ’程度）にトリエチルアミン３７Ａ’を添加し
て溶解させた溶液を、上記メタノール液中に滴下し、更
に膣液に飽和食塩水を加えて、沈澱を生成させ、これを
デカントし、メタノール、次いで脱イオン水で洗浄して
消散し、乾燥して、白色粉末状の所望のアミノアシル基
で修飾されたコポリマーを得た。

アミノブチリル修飾コポリマーをｒＡＭ−１０−■」、
アミノカプロイル修飾コポリマーをｒＡＭ−１０−ＶＪ
　、アミノブチリル修飾コポリマーをｒＡＭ−１０−■
」及びアミノウンデカノイル修飾コポリマーをｒＡＭ−
１０−ＸＪとする。

各ポリマーのＩＲ分析図は次の通りである。

ＡＭ−１０−ｍ：　　　　　　　　　第４図ＡＭ−１０
−Ｖ：　　　　　　　　　第５図ＡＭ−１０−■：　　
　　　　　　第６図ＡＭ−１０−Ｘ：　　　　　　　　
　第７図実施例　３ 接着性細胞培養用担体の調製 上記実施例で得られた本発明ポリマーを用いて接着性細
胞培養用担体（膜状物）を調製した。その手順は次の通
りである。

実施例２で得られた本発明ポリマー：　ＡＭ−１０−Ｉ
Ｉ［を５％ジオキサン溶液とし、ポリスチレン培養皿に
キャスト（膜厚：約３０μｇ／ｃｍ２）し、乾燥後、紫
外線照射（照射時間３〜５分）により滅菌して培養用担
体を調製した。

試験例　１ 肝細胞の培養試験 実施例３で調製した培養用担体（以下「本発明群」とい
う）、市販のポリスチレン培養皿（以下「対照群」とい
う）及び上記対照群に５％ＦＣ３を添加した培地（以下
「比較群」という）を用いて肝細胞適合性について、イ
ヌの肝実質細胞の初代培養により、以下の通り試験を行
なった。

すなわち、各群の培養皿に、成犬より分離精製した肝細
胞を５Ｘ１０４〜１０５個／　（ｒａ　２の細胞密度と
なるように播種した。播種用培地としては１０’Ｍデキ
サメサゾン及び１０−８Ｍインスリンを含むウィリアム
スＥ培地（フロララボラトリーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｄｌｅ、）社製）を用いた。

上記肝細胞を炭酸ガス培養装置で３〜４時間培養後、培
養用培地に交換した。この培養用培地としては１０’Ｍ
デキサメサゾン、１０−”Ｍインスリン、１０’Ｍグル
カゴン、Ｌｏｎｇ／ｚｌ　ｈＥＧＦ　（アース製薬社製
）、３０ｍｇ／Ａ？プロリン及び５万Ｕ／／アプロチニ
ンを含むし一１５培地（フロララボラトリーズ社製）を
用いた。

１日後及び３日後、培地を交換し、４日後に肝細胞のＤ
ＮＡ−量と尿素合成能を下記方法により測定した。

＜ＤＮＡ量測定〉 文献（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　９２．　４９
７−５００（１９７９））に準拠してＤＮＡ量を測定し
た。

〈尿素合成能測定〉 文献（Ｃｌｉｎ、Ｃｈｅｍ、　１１．　１１３　（１９
６５）　）に準拠して尿素合成能を測定した。

本発明群及び比較群で得られた結果を、対照群に対する
相対値（％）にて、第８図及び第９図に示す。

第８図は、ＤＮＡ合成量を示す棒グラフであり、第９図
は尿素合成能を示す棒グラフである。

上記各図より、本発明担体はＦｅ２　（ウシ胎児血清）
等の血清添加なしで、肝実質細胞の接着、増殖が可能で
、かくして高いレベルで該細胞の機能を発現できること
が明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第７図は、本発明ポリマーの赤外線吸収スペ
クトル分析結果を示す図である。 第８図及び第９図は、本発明ポリマーから調製された本
発明の接着性細胞培養用担体を用いて肝細胞を培養した
結果を示すグラフである。 （以　上） 第 図 濱 図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）繰返し単位Ａ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 及び繰返し単位Ｂ： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔Ｒは水素原子又は基▲数式、化学式、表等があります
   ▼ （ｎは１〜１０の整数）を示す。〕 をＡ＋Ｂ＝１及び０＜Ｂ≦１を満たす割合で有し、重量
   平均分子量が１万〜８万の範囲にあり且つ全繰返し単位
   Ｂ中の少なくとも１／２が水素原子以外の上記Ｒ基を有
   する単位であるスチレン系重合体及びその塩。
2. （２）請求項１記載のスチレン系重合体及び／又はその
   塩を素材とする接着性細胞培養用担体。