JPH037599A - 遺伝子導人による再分化個体の早期検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、再分化能を有するカルスまたはカルスより再
分化を開始した植物個体を早期に検出して選抜する方法
に関する。

〔従来の技術］ 植物の品種改良、大量繁殖、有用代謝物質の生産などを
目的として、植物から各種の器官、組織および細胞など
を取り出し、それらを無菌的に増殖・育成する培養技術
が、いわゆる植物組織培養として近年広く試みられてい
る。

そして、かかる植物組織培養は、通常、植物から特定の
器官、組織、細胞などを外植片として取り出し、それを
細胞分裂を促す植物ホルモンなどを含む培地で細胞分裂
・増殖させて特定の形態をもたない細胞塊、すなわち脱
分化したカルスを形成させ、このカルスをさらに増殖さ
せた後、適当な条件下で（例えばホルモンを含まない培
地で）培養することにより不定胚、不定葉、不定根等の
何らかの形態を有する組織、器官への再分化を行わせ、
次いで完全な植物体に再生することにより行われている
。

その場合に、同じ条件下で培養を行っても総てのカルス
が再分化して植物体を再生するわけではなく再分化しな
いものも多い。そのため再分化するものと再分化しない
ものを選別する必要があり、従来は再分化し得るカルス
またはカルスから既に再分化した個体を選抜する方法と
して、 （１）多数のカルスをそのまま培養し肉眼や顕微鏡等で
観察して不定胚、不定葉、不定根等の再分化形態を有す
ることが明らかな個体を選抜する方法、 （２）再分化能のあるカルスまたは既に再分化した個体
の細胞内に選択的に高濃度で取り込まれることが知られ
ている成分の濃度を測定して再分化能の有無を調べ選抜
する方法（例えばニンジンの懸濁培養では不定胚形成能
のある個体の細胞内にグルコースが選択的に高濃度で取
り込まれることが知られており、かかる選択特性が選抜
に利用されている）、および （３）再分化能のあるカルスまたは既に再分化した個体
の細胞内で選択的に高濃度で生産されることが知られて
いる物質の量を測定して再分化能の有無を調べ選抜する
方法（例えばニンジンの懸濁培養では不定胚形成能のあ
る個体の細胞内に殿粉が選択的に高濃度で蓄積されるこ
とが知られておりかかる特性が選抜に利用されている） などが知られている。

しかしながら、上Ｕ（１）の方法は、分化能の有無に拘
らず多数のカルスをそのまま培養しなければならず、手
間や日数、多数の培養器や設備等を要し効率のよい方法
ではなかった。また、上記（２）および（３）の方法は
再分化能の有無の目安となる特定物質の検出や測定にＮ
ＭＲ等の高精度分析機器や設備が必要であり、しかも測
定に手間がかかり、場合によってはかがる測定によって
カルスが損傷されることも多く望ましい方法ではなかっ
た。

［発明の内容］ 本発明者等は、再分化能を宵するカルスまたはカルスか
らの再分化を開始した植物個体を早期にかつ簡単に検出
し選別し得る方法を求めて研究を続けてきた。その結果
、再分化しない個体では発現せず再分化能を有するカル
スやカルスからの再分化を開始した個体においてのみ発
現する遺伝子が存在すること、そしてかがる特性を有す
る遺伝子をマーカー遺伝子として使用すると再分化能を
有するカルスやカルスからの再分化を開始した個体を極
めて簡単に効率よく検出し選別することができるという
ことを見出して本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、再分化能を有するカルスまたはカ
ルスからの再分化を開始した個体においてのみ発現する
マーカー遺伝子を植物組織に導入してカルスを形成させ
、カルスの増殖培養時またはカルスからの再分化開始の
初期に該マーカー遺伝子が発現した個体を検出する方法
である。

本発明におけるマーカー遺伝子を導入する植物組織とは
、植物体自身、植物体を構成する各種器官、それらの一
部および遊離の植物細胞を包含し、カルスを形成し得る
ものをいう。本発明で使用できる植物組織としては、例
えば茎頂（植物の芽の先端の生長点）、花粉の入った朽
、花粉、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、遊離した
細胞（特に細胞の周囲を覆う細胞壁を取り除いた裸の細
胞であるプロトプラスト）等を挙げることができ、より
具体的には人参の茎やそのプロトプラスト；タバコの葉
の切片やそのプロトプラスト；イネ、コムギ、トウモロ
コシ、オオムギ等の穀類の種子やそのプロトプラスト；
果１１（ナシ、リンゴ、カンキツ類、ブドウ、ブルーベ
リー等多数）、花卉（カーネーション、クレマチス、バ
ラ、ゼラニウム、ポインセチア、ベゴニャ等極めて多数
）、観葉植物（ベンジャミーナ、ゴムツキ等多数）、野
菜（イチゴ、トマト、ワサビ、ナガイモ、オニユリ、ニ
ンニク、サトイモ、フキ、サツマイモ、ジャガイモ等多
数）、樹木（ユーカリ、ポプラ、スギ、シラカバ等）、
薬用植物（センキュウ、カラスビシャク、アカヤジオウ
、ポプラ、ダイオウ、センブリ等多数）、プランテーシ
ョン作物（バナナ、パイナツプル、アサ、サトウキビ、
綿花等）等の茎頂やそのプロトプラスト等を挙げること
ができ、かかる植物組織の入手および調製は、植物組織
培養で採用されている通常の方法によって行えばよい。

そして、本発明では植物組織中へのマーカー遺伝子の導
入をカルス形成前に行うが、マーカー遺伝子の導入は、
通常、植物から取り出された植物組織片またはそこから
分離したプロトプラストに対して行われ、導入されたマ
ーカー遺伝子は植物組織の細胞中、特にその染色体に取
り込まれる。

マーカー遺伝子の発現は、マーカー遺伝子の上流側に存
在するプロモータ領域等により司られているが、再分化
能を有するカルスまたはカルスからの再分化を開始した
個体でのマーカー遺伝子のかかる選択的な発現は、この
プロモータ領域に起因する場合（すなわちプロモータ領
域が再分化能を有する個体または既に再分化した個体に
おいてのみ特異的にそのプロモート作用を示す場合）と
マーカー遺伝子自身による場合（すなわちプロモータ領
域は再分化の有無に拘らずそのプロモート作用を有しマ
ーカー遺伝子が再分化能のあるカルスまたはカルスから
の再分化を開始した個体でのみ発現する場合）とがある
。

マーカー遺伝子としては、その発現が、例えば蛍光の発
生、特定の色素の形成、特定の細菌に対する抗菌性、特
定の薬剤に対する薬剤耐性、特定の植物ホルモンに対す
る特異な感受性、本来の植物が有しない形態的特性等と
して顕れるものが採用でき、特にその発現が簡単に検出
できかつ再分化個体を阻害しないものであるのが好まし
い。

７０モータ領域を結合したマーカー遺伝子の例としては
、土壌細菌アグロバクテリウムーリゾゲ不ス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）のＲｉ　
−プラスミドの　０ｐｅｎ　Ｒｅａｄｉｎｇ　Ｆｒａｍ
ｅ　１２　（ＯＲＦ１２）遺伝子のプロモータ領域を大
腸菌の持つβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｒｏｎ
ｉｄａｓｅ　；以下ｒ　ＧＵＳｊという）遺伝子に結合
したキメラ遺伝子と、ツバリン合成酵素のプロモータ領
域にＮＰＴＩＩ（カナマイシン耐性遺伝子）を結合した
キメラ遺伝子を直結したもの等を挙げることができ、前
記アグロバクテリウム−リゾゲネスのＲｉ−プラスミド
のＯＲＦ　ｌ　２遺伝子のプロモータ領域は再分化能を
有するカルスまたはカルスからの再分化を開始した個体
においてのみ特異的にそのプロモート作用を示すことが
実験的に確認されている。

そして、マーカー遺伝子を組み込んだキメラ遺伝子の作
成はキメラ遺伝子を植物組織の細胞およびプロトプラス
トに導入する既知の方法のいずれもが採用できる。例え
ば、キメラ遺伝子の細胞内への導入は、キメラ遺伝子自
体を植物細胞内に直接導入する方法、自己複製能力のあ
るプラスミドや７７−ジＤＮＡを改良して得られるベク
ターにキメラ遺伝子を挿入し、該ベクターを植物組織の
細胞また。はプロトプラスト内に直接導入する方法、該
ベクターを植物に対する感染能力の高い細菌に導入し植
物個体をその細菌に感染させる方法等により行うことが
できる。

キメラ遺伝子自体まｔ；はキメラ遺伝子を挿入したベク
ターを植物細胞内に導入する方法には、電気刺激により
導入する方法（エレクトロポレーション法）、マイクロ
インジェクション法、ポリエチレングリコール法、直接
塗布法が含まれる。また、キメラ遺伝子を挿入したベク
ターを植物に対す、る感染能力の高い細菌に導入し植物
個体をその細菌に感染させる際の細菌としては、ダラム
陰性土壌細菌の一種であるアグロバクテリウム・チュメ
ファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍ
ｓｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバタテリウム拳うイゾジエ
ネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎ
ｅｓ）、各種ウィルス等が挙げられる。特にアグロバク
テリウム・チュメファシエンスは上記のマーカー遺伝子
を植物細胞内に導入するのに適した細菌であり、これは
アグロバクテリウム・チュメファシエンスが極めて盲動
なベクターとしてのＴ１−プラスミドを有し、このプラ
スミドの一部のＴ−ＤＮＡ領域を植物細胞の染色体ＤＮ
Ａに導入して形質転換細胞とすることができることによ
る。

この際に、分化能のあることまたは分化しｔ；ことを示
す上記マーカー遺伝子とともに他の特性（例えば特定の
細菌に対する抗菌性、特定の有効成分を形成し得る特性
、特定の薬剤に対する耐性、特定の植物ホルモンに対す
る感受性、本来の植物と異なる形態的特性等）を発現す
る遺伝子を同時にキメラ遺伝子またはベクターに組み込
んでおくと、それらの特性を共に発現しｌ；分化個体を
得ることができる。

本発明では、上記のようにしてマーカー遺伝子を導入し
た植物組織からカルスを形成させ、形成したカルスを更
に増殖培養させる。カルスの形成およびその増殖は、通
常知られているいずれの方法によっても行うことができ
、例えば無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源と
してのＶＮ類、植物生長調節物質（オーキシン、サイト
カイニン等の植物ホルモン）等を加えて滅菌した培地で
無菌的に採取した植物組織またはプロトプラストを培養
して無定形に増殖する脱分化しｔ；カルスを形成させ（
以下「カルス誘導」という）、該形成されたカルスをオ
ーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移し
かえて更に増殖（継代培養）させる。この場合にカルス
誘導および継代培養にはオーキシンやサイトカイニン等
の植物生長調節物質が不可欠である。また、カルス誘導
を寒天等からなる固体培地で行い継代培養を液体培養で
行うとその各々が良好に行われる。

次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条
件下で培養することにより器官の再分化を誘導しく以下
「形態形成」という）、最終的には完全な植物体を再生
する。かかる形態形成は培地におけるオーキンンやサイ
トカイニン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分
の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行
うことができ、かかる再分化により通常、不定胚、不定
根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体
へと生長する。本発明では形態形成培養を既知のいずれ
の方法によっても行うことができる。

本発明において、再分化能のあるカルスまたはカルスか
らの再分化を開始した植物個体の検出および選抜は、上
記の継代培養したカルスにおけるマーカー遺伝子の発現
状態を調べることにより、および／まｔ；はカルスから
の再分化開始初期の植物個体におけるマーカー遺伝子の
発現を調べることにより行う。マーカー遺伝子の発現の
検出および選抜は植物細胞内に導入したマーカー遺伝子
の発現内容に応じて行えばよく、例えばマーカー遺伝子
が特定の色素または蛍光を生じさせるものである場合に
はその色素または蛍光の有・無や強弱を検査して選抜す
ることにより、またマーカー遺伝子が特定の細菌に対す
る抗菌性や特定の薬剤に対する耐性を付与するものであ
る場合には継代培養した植物個体または形態形成初期の
植物個体を該細菌または薬剤にさらして細菌または薬剤
に侵されずに生存しているものを集めることにより行う
。

そして、本発明によって選抜されＩ；再分化能を有する
カルスおよびカルスからの再分化を開始しｔ；植物個体
は、植物組織培養において通常採用されている方法によ
り完全な植物体に育成でき、または完全な植物体になる
前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥圧、
凍結乾燥細胞および組織等）で貯蔵、販売等を行うこと
ができる。

［発明の効果］ 本発明では再分化能を有するカルスまたはカルスからの
再分化を開始した植物個体において発現するマーカー遺
伝子を植物組織に導入して植物の組織培養を行うことに
よって、培養の初期の段階（すなわち、カルスの段階や
カルスからの再分化の開始初期の段階）で再分化能を有
するカルスおよびカルスからの再分化を開始した植物個
体を検出して選抜でき、そのため多数の培養設備やスペ
ースを要することなく植物の組織培養を行うことができ
る。

また、本発明でマーカー遺伝子として検出の容易なもの
を選択すると、高価な分析機器や装置、手間等を要する
ことなく極めて簡単にかつ効率よく再分化能を有するカ
ルスまたはカルスからの再分化を開始しｔ；個体を早期
に検出して選抜することができる。

以下に、本発明を実施例により説明するが、本発明はそ
れらに限定されない。

実施例　ｌ 土壌細菌アグロバクテリウムーライゾジェネス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）のＲｉ
−プラスミドの０ＲＦ１２遺伝子のプロモータ領域に大
腸菌の持つマーカー遺伝子であるＧＵＳ遺云子を結合し
て結合体ｌを形成した。またカリフラワーモザイクウィ
ルスの３５５プロモーター遺伝子に大腸菌の持つカナマ
イシン耐性遺伝子ＮＰＴｎ（ネオマインン・７オス７オ
・トランスフェラーゼ）を結合して結合体２を形成した
。上記結合体ｌの下流に結合体２を結合してキメラ遺伝
子を作成した。このキメラ遺伝子を大腸菌プラスミドに
戻し、トリペアレンタルメイティング法（Ｔｒｉｐａｒ
ｅｎｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ）によりダラ
ム陰性土壌細菌の一種であるアグロバクテリウム自チュ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）に挿入した。

無菌的に栽培した藩種７日日の人参の茎を約ｌ　ｃｍｌ
：　ｖ′Ｊ断し、これを抗生物質カナマイシンを２５μ
ｓ／ｍＱおよびリファンピシン１１００ＡＬ／ｍＱを含
むＬ−ｂｒｏｉで上記アグロバクテリウムを培養した液
に２分間浸漬させることにより上記のキメラ遺伝子を挿
入したアグロバクテリウム・チュメファシエンスに感染
させた。次いで合成オーキシンである２、４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（以下「２，４−ＤＪという）を１ｍｇ
／ｍＱの割合で含有するＭｕｒａｓｈｉｇｅ　−Ｓｋｏ
ｏｇ培地（以下　７ＭＳ培地」という）上で２５℃で２
日間培養した。

これを抗生物質クラ７オランヲ５００μｇ／ｍ１２ｔ７
）割合で含有するＭＳ培地に移し２５°Ｃで約１週間培
養してアグロバクテリウム・チュメファンエンスを殺し
ｔ；。更にカナマイシンを１００μｇ／ｍ（２の割合で
含むＭＳ培地で３力月培養して上記キメラ遺伝子の導入
されたカナマイシン耐性の形質転換細胞から構成される
カルスを形成しｊ；。

このカルスのＣＵＳ活性を、下記の方法により測定した
。

［ＧＵＳ活性の測定法１ リン酸ナトリウムを基にしたＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ
に基質ｍｅｔｈｙｌ　　ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ　ｇ
ｌｕｃｒｏｎｉｄｅ　（以下ｒＭＵＧ」　という）を加
えたものを準備する。エッベンドルフチューブ内のカル
スにＬｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒを加え、ガラス棒でホモ
ゲナイズする。これを遠心した後、上溝に、新たにＬｙ
ｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒを加える。さらに上記で作成し？
＝ＭＵＧ入りのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを加え、３７℃
インキュベーター内に入れた時間を０分とし、３０分後
０．２Ｍ炭酸ナトリウムを加えることにより反応をスト
ップさせる。

これを蛍光分光光度計にかけて、波長４５５ｎｍの吸光
度を測定し、あらかじめ作成した検量線によりＧＵＳ活
性を測定した。

その結果、上記カルスにおいてはＧｔｌＳ遺伝子に基づ
く特性の発現は検出されなかった。

このカルスを平均１００μｍｍ度の大きさに分割して植
物ホルモンを含まない液体のＭＳ培地に移し、２５°Ｃ
で３日間培養しｔ；ところ３日目に肉眼でやっと観察で
きる初期の不定胚が初めて形成され順次かかる不定胚の
数が増加した。その間に形成された初期の不定胚の数を
経時的に数えるとともに上記した方法によりＧＵＳ活性
を調べたところ図のＩで示した結果を得た。

また、上記３日間に亘る培養を行った時点で形成された
ＧＵＳ活性を示す初期の不定胚をＧＵｓ活性を示さない
未分化個体から分離選抜し、これを更にホルモンの入っ
ていないＭＳ培地で２５℃で３日間培養して肉眼で容易
に観察できる不定胚にし、この不定胚をアルギン酸ナト
リウムで被覆して塩化カルシウム水溶液中に１個ごと滴
下させＩ；ところ、低温、無菌状態で保存可能な人参の
カプセル化人工種子を得た。

また、比較のため、上記と同様にして人参の茎から形成
されたＧＵＳ遺伝子が導入された形質転換カルスを、上
記と同様に平均約１００μｍに分割した後、２．４−Ｄ
を１ｍｇ／ｍＱの割合で含む液体のＭＳ培地で上記と同
様に２５℃で培養したが、１２日後でも不定胚の形成が
なく、このもののＧＵＳ活性を上記と同様にして経時的
に測定しｔ；ところ図の■で示しｔ；結果を得た。

図において縦軸（ＧＵＳ活性）の１ユニツトとは、蛋白
１ｍｇ当り１分間で１ピュモルの４−ＭＵを生成する量
をいう。

上記の結果および図に示した結果から、ＣＵＳ活性は不
定胚形成（再分化）に伴って発現し且つ不定胚形成が進
むにつれて増加すること、したがってマーカー遺伝子Ｇ
ＵＳによって発現されｌ：　ｃ　ｕ　ｓ活性を調べるこ
とにより、植物個体の再分化能の有無または再分化の進
行状態を培養の初期の段階で検出できることがわかる。

実施例　２ 無菌的、１．：栽培したタバコの葉から０．５ｃｍ四方
の切片を切り出した。

このタバコ集切片を抗生物質カナマイシン２５μｇ／ｍ
Ｑおよびリファンピシン１００μｇ　／　ｍ　Ｑを含む
Ｌ−培地でアグロバクテリウムを培養した液に２分間浸
漬させることにより上記実施例１で作成したのと同じキ
メラ遺伝子を挿入したアグロバクテリウム・チュメファ
シエンスを感染させｔこ　。

これを２．４−Ｄを１ｍｇ／ｍＱの割合で含有するＭＳ
培地上で２５℃で２日間培養した。

これを抗生物質タラフオランが５００μｓ　／　ｍ　Ｑ
の割合で含有されたＭＳ培地に移し２５°Ｃで約１週間
培養してアグロバクテリウム・チュメファシエンスを殺
した。更にカナマイシンヲ１００ｍｇ／ｍ＋２の割合で
含むＭＳ培地で約１カ月培養して上記キメラ遺伝子の導
入されｔ；カナマイシン耐性の形質転換細胞から構成さ
れるカルスを形成しｔ二　。

このカルスを平均１００μｍ程度に分割してサイトカイ
ニンＢＡ（ベンジルアデニン）ｌｐｐｍを含むＭＳ培地
に移し、２５°Ｃで培養したところ第１４９目に肉眼で
やつと観察できる初期の不定芽が初めて形成され順次か
かる不定芽の数が増加した。顕微鏡観察の結果、その間
に形成された初期の不定芽独自の組織のみに青色の染色
が認められ、これによりＧＵＳの発現が認められた。

この様に植物に再分化する不定芽の組織でＧＵＳ活性が
増加することから、簡便な顕微鏡判定により分化の有無
を検査し選別できることがわかる。

実施例　３ 上記実施例１で作成したのと同じキメラ遺伝子を有する
プラスミドと抗生物質ハイグロマイシン耐性を有する遺
伝子をもつプラスミド（ｐＣＨ）の両方をエレクトロポ
ーレーション法によりイネのプロトプラストに導入した
。

これを２．４−Ｄをｌ　ｍｇ／α　の割合で含有するＭ
Ｓ培地上で２５℃培養した。更にハイグロマイシンを３
０μｇ　／　ｍ　Ｑ　　の割合で含むＭＳ培地で１ケ月
培養して上記キメラ遺伝子の導入されたノλイグロマイ
シン耐性の形質転換細胞から構成されるカルスを形成し
た。

このカルスをカナマイシン１００μｇ／ｒｎＱを含むＭ
Ｓ培地に移し、２５℃で培養したところ３５日９に肉眼
でやっと観察できる初期の不定芽が初めて形成され順次
かかる不定芽の数が増加した。

その間に形成された初期の不定芽の数を経時的に数える
とともに実施例２の方法によりＧＵＳ活性を調べｔ；と
ころ同じ結果を得た。

【図面の簡単な説明】

図は人参の茎の組織培養における植物個体の分化とマー
カー遺伝子ＧＵＳの活性との関係を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 再分化能を有するカルスまたはカルスからの再分化を開
   始した個体において発現するマーカー遺伝子を植物組織
   に導入してカルスを形成させ、カルスの増殖培養時また
   はカルスからの再分化開始の初期に該マーカー遺伝子が
   発現した個体を検出する方法。