JPH0376578A - 固定化酵母菌体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ビフィドバクテリウム菌の増殖促進剤などの
製造に用いることのできる固定化酵母菌体に関するもの
である。

（従来の技術） 反応の触媒として用いられる菌体又は酵素を固定化する
ことにより、これら高価な触媒を繁雑な回収操作なしに
効率的に反応に再使用することができ、かつ連続的に製
造を行うことができるため固定化菌体又は酵素の開発が
進められている。

一方、スポロボロミセス　シンギュラリスＡＴＣＣ２４
１９３菌株は、腸内有用細菌であるビフィズス菌の増殖
因子であるガラクトオリゴ糖の製造（特開昭６３−１８
５３７３）に用いることができる。このため。

スポロボロミセス　シンギコラリスＡＴＣＣ２４１９３
菌株を固定化することができれば効率的に、かつ連続的
にガラクトオリゴ糖を製造できるようになる。

従来の菌体及び酵素の固定化法としては、ジアゾ法、ペ
プチド法、アルキル化法、シリカ粒子とグルタルアルデ
ヒドによる担体架橋法、イオン結合法、グルタルアルデ
ヒドによる架橋法、ポリアクリルアミドによる包括法（
「固定化酵素」千畑一部、講談社すイエンティフィク）
などが知られている。

（発明が解決しようとする課題〉 しかしながら、スポロボロミセス　シンギュラリス＾Ｔ
ＣＣ２４１９３菌株を上記固定化法によ゛り固定化して
も、得られる固定化菌体は、その強度か弱く、連続反応
において微粒子化し、原料溶液の通液が困難となったり
、また、酵素活性の点においてもその安定性は十分なも
のではなかった。

本発明は、上記のような従来技術の欠点を解消するもの
であり、十分な強度を有し、酵素の安定性に優れた固定
化酵母菌体を提供することを技術的な課題とするもので
ある。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、このような課題を解決するために鋭意検
討した結果、スポロボロミセス　シンギュラリスＡＴＣ
Ｃ２４１９３をプロテアーゼ処理したゼラチンとグルタ
ルアルデヒドとにより固定化すれば、十分な強度を有し
、酵素の安定性に優れた固定化酵母菌体が得られること
を見出し２本発明に到達した。

すなわち１本発明は、スポロボロミセス　シンギュラリ
ス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉｎｇｕｌａｒ
ｉｓ）ＡＴＣＣ２４１９３菌株をプロテアーゼ処理した
ゼラチンとグルタルアルデヒドとで固定化してなる固定
化酵母菌体を要旨とするものである。

本発明の固定化酵母菌体は、スボロボロミセスシンギュ
ラリス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉｎｇｕｌ
ａｒｉｓ）ＡＴＣＣ２４１９３菌株をプロテアーゼ処理
したゼラチンとグルタルアルデヒドとで固定化したもの
である。

本発明に用いられる酵母菌体はスポロボロミセス　シン
ギュラリスＡＴＣＣ２４１９３であり、上記の菌体を得
るための方法としては、何ら限定されるものではなく１
例えば、乳糖を含む培地で培養するか、又は炭素源とし
てグルコース、ソルビトール、マルトース、シヨ糖、廃
糖蜜などを用いて菌体を十分増殖させた後に乳糖を添加
し、更に培養を続けβ−ガラクトシダーゼが十分誘導さ
れた後に、遠心分離、濾過などの通常用いられる方法に
よって菌体を得ることができる。

上記乳糖を含む培地の組成において、乳糖として０．１
〜３０重量％、好ましくは５〜２０重量％を、培養に用
いる窒素源９例えばペプトン、カゼイン、コーンステイ
ープリカー、肉エキス、酵母エキスなどの有機窒素源や
、硫安、塩化アンモニウム２尿素などの無機窒素源とし
て０．０１〜ｌ。

重量％、好ま１−りは、０゜５〜５重量％を、ミネラル
源として用いるリン酸塩化合物１例えばリン酸カリウム
第１塩（ＫＨ，ＰＯ，）リン酸ナトリウム第２塩水和物
（Ｎ、２ＨＰＯ４１２Ｈ２０）として０６０５〜５重量
％、好ましくは０．１〜１重量％を添加したものであり
、また、その他の成分としてビタミンなどを必要に応じ
て添加１．でもよい。

また、培養の方法としては、通常用いられる液体培地も
しくは固体培地で、静置培養１通気攪拌培養、振とう培
養のいずれの方法でもよい。培養温度、培養時間として
は９通常２０〜２８℃で１５−１２０時間が適当である
。

その後、培養液から遠心分離、濾過などの通常の方法に
より回収した菌体は、以下の固定化方法により固定化す
ればよい。

すなわち、スポロボロミセス　シンギュラリスＡＴ［Ｃ
２４１９３の湿間体をプロテアーゼで処理をしたゼラチ
ンと混合した後９グルタルアルデヒドを加えて混合する
。

本発明においてゼラチンをプロテアーゼで処理するには
１例えば。ゼラチン水溶液にプロテアーゼを加えて行え
ばよい。

本発明に用いられるゼラチンとしては２例えばウシ、ブ
タ、クジラなどの皮、骨、臆などを原料として精製され
たものがあげられ、一般にはウシの皮と骨とを起源とす
るものが多く市販されており、その起源、精製の程度に
特に限定されるものではない。このゼラチン水溶液にお
け６ゼラチン濃度としては、例えば５％（ｉｌｌ／Ｖ）
以上が適当であり、１５％（Ｗ／Ｖ）以上が好ましく、
特に２５〜３５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。また、加える
プロテアーゼ量としては２例えば１〜８０ＰＵＮ（アン
ソン−萩原変法によって測定、すなわち、３０℃で１分
間にＩＴのチロシンに相当する呈色を示す酵素活性度を
１単位と定め、これをＩ　ＰＵＮという。）／１００ｍ
ｆｆ１が適当であり、５〜５０ＰＵＮ／１００ｍＩｌが
好ましい。このときの反応時間は。

ゼラチン濃度が高く、プロテアーゼ量が少ないと長くな
り、ゼラチン濃度が低く、プロテアーゼ量が多いと短く
なり、また反応温度が高いと短く９低いと長くなる傾向
があるので、ゼラチン濃度が３０％（Ｗ／Ｖ）で、プロ
テアーゼ量が２０ＰＵＮ／１００ｍｌで、温度が５０℃
であるときは、１０〜５０分間が好ましい。

本発明に用いられるプロテアーゼとしては。

般に良く知られているエンドタイプのプロテアーゼなら
ば如何なるものでもよく、そのようなものとしてトリプ
シン、キモトリプシン、ペプシンなどの良く知られたプ
ロテアーゼがあげられる。

本発明においてプロテアーゼ処理したゼラチンを添加す
る量としては、湿菌体に対して０．１〜０．５（ｖｔ／
湿菌体ｗｔ）が適当であり、０．１〜０．３（ｗｔ／湿
菌体ｗｔ）が好ましく、またグルタルアルデヒドを添加
する量としては、湿菌体に対して０．０２　（ｗｔ／湿
菌体ｗｔ）以上が適当であり、０．０４〜０．０６　（
ｗｔ／湿菌体ｗｔ）が好ましい。このとき、ゼラチンの
量が少ないと６粒子が微粒化されやすく、ゼラチンの量
が多いと１体積が大きくなり、単位体積当りの活性が低
くなるので好ましくない。またグルタルアルデヒドの量
が少ないと、十分に架橋されず。

得られる固定化菌体がもろくなる傾向があるので好まし
くない。

このときの混合時間としては、６０分以上が適当であり
、５〜３０分が好ましい。また、混合するときの温度と
しては、酵素が失活しない温度。

すなわち、５５℃以下が適当であり、１０〜４０℃が好
ましい。

このようにして固定化させた後の処理としては。

特に限定されるものではなく１例えば、乾燥、造粒、粉
砕を順次行えばよい。

次に得られた固定化菌体で、ガラクトオリゴ糖を得るに
は９例えば、上記で得た固定化菌体を適当な大きさのカ
ラムに充填し、原料溶液を通液すればよい。

（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。

参考例１ 下記組成の培地を３０ｆ容ジャーファーメンタ−に入れ
殺菌した。

乳糖　　　　　　　　　４０００ｇ 酵母エキス　　　　　　　　６０ｇ ＫＨ２Ｐ０．　　　　　　２０ｇ Ｍ　、Ｓ　Ｏ＜　　・７Ｈｚ０　　　　１０ｇビタミン
Ｂ＋　　　　　　　　　６０ｍｇビタミンＢ［１６０ｍ
ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　２０１次に同組戊の培
地で２８℃で９６時間前培養したスポロボロミセス・シ
ンギュラス （Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｓｉｎｇｕｌａｒｉ
ｓ）ＡＴＣＣ２４１９３菌株１１を接種して、ｐＨ３，
５７，温度２８℃９通気量２０１／ｍｉｎ、インペラー
回転数４０Ｏｒ、ｐ、ｍで９６時間培養を行った。

培養終了後α−ラバル社製遠心機ＬＡＰＸ　２０２型で
遠心分離を行って湿菌体２．３ｋｇを得た。

実施例１ ゼラチン粉末（石津製薬社製、　８９１３８．ケミカル
ピュア、ウシの皮と骨とを起源）４３０ｇに、水１０７
０１０７Ｏを加え加熱溶解し、５５℃に保温した。これ
に、５７５ｍｇのプロテアーゼ５Ｐ−１０（ナガセ生化
学工業■社製）を加えて、３０分間反応させた後、１０
分間煮沸してプロテアーゼを失活させることにより、プ
ロテアーゼ処理したゼラチン１．５０ｋｇを得た。

このプロテアーゼ処理したゼラチン１．３２ｋｇを室温
下で参考例１で得た湿菌体５．５　ｋｇに加え、はぼ均
一になるまで十分混合した後、２５％グルタルアルデヒ
ド１．３８　Ｊを加え、室温下で２０分間混合した。得
られた混合物を造粒機（不二バウダル社製、　ＰＢＬＬ
ＢＴＢＲＢＸＤＳ−６０型）により造粒し、これを−晩
風乾して粉砕機（不ニパウダル社製、　ＳＡＭＰＬＢ−
ＭＩＬＬ　Ｋ　ＩＩ　Ｗ　−１）により粉砕した後、水
による傾斜で微粉末を除き、７１容の固定化菌体を得た
。

次に、実施例１で得られた固定化菌体を径１５Ｃｍのカ
ラムに７ｊ！（４０ｃｍＨ）つめ、カラム温度を５０〜
５３℃に調整し、３０％ラクトースを流速１１／ｈｒで
通液し、ガラクトオリゴ糖の合成反応を行った。

この反応を６力月間連続的に行ったが、固定化菌体は、
微粒子化されず、原料溶液をスムーズに通液することが
できた。

なお、全糖に占める三糖（ガラクトオリゴ糖）の割合を
活性の指標とし、初期の全糖に占める三糖の割合を１０
０としたときの残存活性の半減期を求めると、８７０日
と安定であった。

また、比較のため１プロテアーゼ処理したゼラチンを添
加しなかった以外は、上記と同様にして固定化菌体を得
た後、上記と同様にして固定化菌体をカラムにつめて反
応を実施したが１通液後３日経過した時点で固定化菌体
粒子が微粒子化され。

目づまりを起こした。

（発明の効果） 本発明の固定化酵母菌体は、酵素活性が長期にわたって
安定で、かつ十分な強度を有しているので、微粒子化さ
れず、原料溶液の通液が阻害されなくなり、長期にわた
り連続的にガラクトオリコ糖の製造が可能になる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）スポロボロミセスシンギュラリス （Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ
   ）ＡＴＣＣ２４１９３菌株をプロテアーゼ処理したゼラ
   チンとグルタルアルデヒドとで固定化してなる固定化酵
   母菌体。