JPH0376596A - モノクローナル抗体及びその用途 - Google Patents
モノクローナル抗体及びその用途Info
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- JPH0376596A JPH0376596A JP1211258A JP21125889A JPH0376596A JP H0376596 A JPH0376596 A JP H0376596A JP 1211258 A JP1211258 A JP 1211258A JP 21125889 A JP21125889 A JP 21125889A JP H0376596 A JPH0376596 A JP H0376596A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- calpastatin
- type
- specificity
- human
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、カルパスタチン（以下、Ｃ３と略記する）に
対して特異性を有する新規なモノクローナル抗体及びそ
の用途に関し、更に詳しくはＣ８の新規な測定試薬に関
する。
対して特異性を有する新規なモノクローナル抗体及びそ
の用途に関し、更に詳しくはＣ８の新規な測定試薬に関
する。
Ｃ８はカルパインの特異的阻害剤であり、他のシスティ
ンプロテアーゼやセリンプロテアーゼには全く阻害作用
を示さない。Ｃ３はカルパインと同様に動物組織に広く
分布しており、両者は細胞内に共存する。Ｃ８の分布量
は臓器型で１１０にＤａ 、赤血球型で７０ ＫＤａで
ある。
ンプロテアーゼやセリンプロテアーゼには全く阻害作用
を示さない。Ｃ３はカルパインと同様に動物組織に広く
分布しており、両者は細胞内に共存する。Ｃ８の分布量
は臓器型で１１０にＤａ 、赤血球型で７０ ＫＤａで
ある。
最近、浅田ら（特願昭６３−２０７２８３号）により、
ヒト臓器型Ｃ８のｃＤＮＡがクローニングされ、その全
−次構造が決定された。その結果、臓器型Ｃ８では分子
量１４にＯａの相同性のあるドメインＩ〜■が４つ繰返
した構造をもち、更にそのＮ末端側にドメインＬが結合
していることが示された。また、赤血球型Ｃ８ではドメ
イン■〜■から構成され、ドメインＩ７及びドメインＩ
を含んでいないことが示された。
ヒト臓器型Ｃ８のｃＤＮＡがクローニングされ、その全
−次構造が決定された。その結果、臓器型Ｃ８では分子
量１４にＯａの相同性のあるドメインＩ〜■が４つ繰返
した構造をもち、更にそのＮ末端側にドメインＬが結合
していることが示された。また、赤血球型Ｃ８ではドメ
イン■〜■から構成され、ドメインＩ７及びドメインＩ
を含んでいないことが示された。
一方、ボントレモリ （Ｐｏｎｔｒｅｍｏｌｉ）ら〔バ
イオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ
コミスニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ
旧ｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎｓ 。
イオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ
コミスニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ
旧ｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎｓ 。
第１５７巻、第８６７頁（１９８８）：］は、本態性高
血圧患者の赤血球中にｃｓが欠乏ｊ７でいることを示し
、赤血球のイオン輸送の異常、更にはＣ８の生理的役割
についての重要性が注目されている。
血圧患者の赤血球中にｃｓが欠乏ｊ７でいることを示し
、赤血球のイオン輸送の異常、更にはＣ８の生理的役割
についての重要性が注目されている。
すなわち、赤血球、組織、体液中のｃｓ量を測定するこ
とは臨床検査医学」二、非常に重量であり、その簡便で
迅速な測定方法の確立が望まれていた。
とは臨床検査医学」二、非常に重量であり、その簡便で
迅速な測定方法の確立が望まれていた。
近年、Ｃ８抗原量の測定は高野ら〔ジャーナル オブ
アプライド バイオケミストリー（Ｊ、 Ａｐｐｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第６巻、第１１７頁（１９８４））
により、ヒト赤血球より精製したＣ８を抗原として作威
したウザギ抗血清を用いたサンドイッチＥＩＡ法が報告
されている。一方、前記ボントレモリは赤血球由来ｃｓ
を抗原とし、抗ＣＳモノクローナル抗体を作威し、赤血
球由来Ｃ８をウェスタン ブロッティング法で測定して
いる（前記文献参照）。
アプライド バイオケミストリー（Ｊ、 Ａｐｐｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第６巻、第１１７頁（１９８４））
により、ヒト赤血球より精製したＣ８を抗原として作威
したウザギ抗血清を用いたサンドイッチＥＩＡ法が報告
されている。一方、前記ボントレモリは赤血球由来ｃｓ
を抗原とし、抗ＣＳモノクローナル抗体を作威し、赤血
球由来Ｃ８をウェスタン ブロッティング法で測定して
いる（前記文献参照）。
上記、高野らの方法は、赤血球由来のヘモグロビンを除
くための前処理操作を必要としており、測定系の特異性
、操作性において問題があった。また、ボントレモリら
の方法では、彼らのモノクローナル抗体の性状は全く不
明であり、ウェスタン ブロッティング法を用いた半定
量法であり、その特異性、操作性、定置性に問題があっ
た。
くための前処理操作を必要としており、測定系の特異性
、操作性において問題があった。また、ボントレモリら
の方法では、彼らのモノクローナル抗体の性状は全く不
明であり、ウェスタン ブロッティング法を用いた半定
量法であり、その特異性、操作性、定置性に問題があっ
た。
更に両方法とも赤血球由来Ｃ８を抗原として作成された
抗体を用いており、臓器型ｃｓ及び赤血球型Ｃ３を分別
定量すゐことは不可能であった。
抗体を用いており、臓器型ｃｓ及び赤血球型Ｃ３を分別
定量すゐことは不可能であった。
本発明は、上記従来技術の測定法の課題を克服するため
になされたものであり、その目的は、特異性、反応性の
明確なモノクローナル抗体を提供し、更に、それを用い
て臓器型ｃｓ及び／又は赤血球型Ｃ８の特異的な測定試
薬を提供することにある。
になされたものであり、その目的は、特異性、反応性の
明確なモノクローナル抗体を提供し、更に、それを用い
て臓器型ｃｓ及び／又は赤血球型Ｃ８の特異的な測定試
薬を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はモノクロー
ナル抗体に関する発明であって、Ｃ８に特異的に反応す
るものであることを特徴とする。
ナル抗体に関する発明であって、Ｃ８に特異的に反応す
るものであることを特徴とする。
そして、本発明の第２の発明はｃｓ測定試薬に関する発
明であって、被検試料中のヒト臓器型Ｃ８及び／又はヒ
ト赤血球型ｃｓを特異的に分別測定する試薬において、
上記第１の発明のモノクローナル抗体を構成成分とする
ことを特徴とする。
明であって、被検試料中のヒト臓器型Ｃ８及び／又はヒ
ト赤血球型ｃｓを特異的に分別測定する試薬において、
上記第１の発明のモノクローナル抗体を構成成分とする
ことを特徴とする。
本発明者らは、前述した課題を解決するため鋭意研究を
重ねた結果、細胞融合によりｃｓに対する特異性の明確
なモノクローナル抗体を取得するこよに成功し、本モノ
クローナル抗体を用いることで臓器型ｃｓ及び／又は赤
血球型Ｃ８の特異的で高感度でかつ簡便な測定が可能で
ああことを見出し、本発明を完成するに至った。
重ねた結果、細胞融合によりｃｓに対する特異性の明確
なモノクローナル抗体を取得するこよに成功し、本モノ
クローナル抗体を用いることで臓器型ｃｓ及び／又は赤
血球型Ｃ８の特異的で高感度でかつ簡便な測定が可能で
ああことを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明において抗原となる臓器型ｃｓ及び赤血球型Ｃ８
は遺伝子工学により組換え体により生産され、例えば熱
処理、イオン交換クロマトグラフィー等の方法で精製す
ることにより取得することができる（特願昭６３−２０
７２８３号） また、赤血球型Ｃ５はそれ自体公知の方
法により、ヒト、動物赤血球より精製することにより取
得することができる〔高野ら、ジャーナル オブ バイ
オケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第９２巻、第
２０２１頁（１９８２）］。
は遺伝子工学により組換え体により生産され、例えば熱
処理、イオン交換クロマトグラフィー等の方法で精製す
ることにより取得することができる（特願昭６３−２０
７２８３号） また、赤血球型Ｃ５はそれ自体公知の方
法により、ヒト、動物赤血球より精製することにより取
得することができる〔高野ら、ジャーナル オブ バイ
オケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第９２巻、第
２０２１頁（１９８２）］。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法に
よって製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細
胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブ
リドーマをクローン化し、Ｃ８に対し特異性を示す抗体
を産生ずるクローンを選択することによって製造される
。
よって製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細
胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブ
リドーマをクローン化し、Ｃ８に対し特異性を示す抗体
を産生ずるクローンを選択することによって製造される
。
抗体産生細胞は例えば上記Ｃ３抗原により免疫された動
物からの牌細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用で
きる。免疫される動物としてはマウス、ラット、ヤギ、
ウサギ等が利用される。上記Ｃ８をフロイントのアジュ
バントと混合し、動物の免疫用として使用する。免疫は
動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２０
０μｇ２〜３週間に１回、３〜７週間投与することによ
って行われる。最終免疫より３〜５日後、免疫動物から
抗体産生細胞を分取する。骨髄腫細胞としてはマウス、
ラット、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は例
えばＧ、ケラ−（Ｇ、 Ｋ６ｈｌｅｒ）ネーチ−？ −
（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）
に記載の方法、又はこれに準する方法によって行われる
。
物からの牌細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用で
きる。免疫される動物としてはマウス、ラット、ヤギ、
ウサギ等が利用される。上記Ｃ８をフロイントのアジュ
バントと混合し、動物の免疫用として使用する。免疫は
動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２０
０μｇ２〜３週間に１回、３〜７週間投与することによ
って行われる。最終免疫より３〜５日後、免疫動物から
抗体産生細胞を分取する。骨髄腫細胞としてはマウス、
ラット、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は例
えばＧ、ケラ−（Ｇ、 Ｋ６ｈｌｅｒ）ネーチ−？ −
（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）
に記載の方法、又はこれに準する方法によって行われる
。
この際３０〜５０％ポリエチレングリコール（分子量１
０００〜４０００）を用い、３０〜４０℃の温度下、約
１〜３分間程度反応させることによって行われる。細胞
融合によって得られたハイブリドーマはスクリーニング
に付される。すなわちスクリーニングは抗原として上記
臓器型Ｃ３又は赤血球型Ｃ３を用いて酵素抗体法等によ
って行われる。
０００〜４０００）を用い、３０〜４０℃の温度下、約
１〜３分間程度反応させることによって行われる。細胞
融合によって得られたハイブリドーマはスクリーニング
に付される。すなわちスクリーニングは抗原として上記
臓器型Ｃ３又は赤血球型Ｃ３を用いて酵素抗体法等によ
って行われる。
得られた抗体産生ハイブリドーマはクローニングに付さ
れる。すなわち、当該ハイブリドーマを例えば限界希釈
法によってクローニングを行ってクローンを得る。
れる。すなわち、当該ハイブリドーマを例えば限界希釈
法によってクローニングを行ってクローンを得る。
得られたクローンは次いで目的とする特異性を有するモ
ノクローナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニング
に付され、例えば酵素抗体法等によって行われる。選ば
れたクローンは例えばあらかじめブリスタン（２，６，
１０，１４テトラメチルペンタデカン）を投与したＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモ
ノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この
腹水からのモノクローナル抗体の回収はイムノグロブリ
ンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレン
グリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル
ろ適法、アフィニティークロマトグラフ法等を応用する
ことで容易に達成される。かくして得られたＣ５に特異
的なモノクローナル抗体は、生体由来の試料、例えば血
液、赤血球、尿、組織中の臓器型Ｃ３及び／又は赤血球
型Ｃ８の測定に極めて好適である。この測定のために、
モノクローナル抗体そのもの又はそれからの相応する免
疫学的特性を有するフラグメント、例えばＰａｂ’フラ
グメント等を使用することができる。
ノクローナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニング
に付され、例えば酵素抗体法等によって行われる。選ば
れたクローンは例えばあらかじめブリスタン（２，６，
１０，１４テトラメチルペンタデカン）を投与したＢＡ
ＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモ
ノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この
腹水からのモノクローナル抗体の回収はイムノグロブリ
ンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレン
グリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル
ろ適法、アフィニティークロマトグラフ法等を応用する
ことで容易に達成される。かくして得られたＣ５に特異
的なモノクローナル抗体は、生体由来の試料、例えば血
液、赤血球、尿、組織中の臓器型Ｃ３及び／又は赤血球
型Ｃ８の測定に極めて好適である。この測定のために、
モノクローナル抗体そのもの又はそれからの相応する免
疫学的特性を有するフラグメント、例えばＰａｂ’フラ
グメント等を使用することができる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。
発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ モノクローナル抗体の作製
（１）抗原の精製
ヒト臓器型Ｃ８は浅田らの方法（特願昭６３２０７２８
３号）により組換え体大腸菌〔微工研菌寄第１０１８８
号（ＦＥＲＭ Ｐｌ ０１８８） Ｂ、Ｃｏ１１
ＪＭＩ ０９／ＰＨＣ３１８１）から精製した。一方、
ヒト赤血球型Ｃ３は高田らの方法〔ジャーナル オブバ
イオケミストリー、第９２巻、第２０２１頁（１９８２
）］によりヒト赤血球より精製した。
３号）により組換え体大腸菌〔微工研菌寄第１０１８８
号（ＦＥＲＭ Ｐｌ ０１８８） Ｂ、Ｃｏ１１
ＪＭＩ ０９／ＰＨＣ３１８１）から精製した。一方、
ヒト赤血球型Ｃ３は高田らの方法〔ジャーナル オブバ
イオケミストリー、第９２巻、第２０２１頁（１９８２
）］によりヒト赤血球より精製した。
（２） マウスの免疫
臓器型Ｃ８をフロイントの完全アジュバントと１：１（
ｖ／ｖ）の割合でよく混合し、マウス１匹当り臓器型Ｃ
５が５０μｇとなるように腹腔内に免疫した。初回免疫
から１４日後に臓器型Ｃ８をフロイントの不完全アジュ
バントと１：１（ｖ／ｖ）の割合でよく混合し、マウス
１匹当り臓器型Ｃ８が５０μｇとなるように腹腔内に免
疫した。更にモの１４日後、臓器型Ｃ８をマウス１匹当
り２０μｇ尾静脈より投与した。
ｖ／ｖ）の割合でよく混合し、マウス１匹当り臓器型Ｃ
５が５０μｇとなるように腹腔内に免疫した。初回免疫
から１４日後に臓器型Ｃ８をフロイントの不完全アジュ
バントと１：１（ｖ／ｖ）の割合でよく混合し、マウス
１匹当り臓器型Ｃ８が５０μｇとなるように腹腔内に免
疫した。更にモの１４日後、臓器型Ｃ８をマウス１匹当
り２０μｇ尾静脈より投与した。
（３）細胞融合及びクローニング
最終免疫の３８後にマウス膵臓を取出し、その牌細胞と
マウスミエローマＰ３Ｕ１とをｌＯ：１の割合で混合し
前記ネーチャー記載のケラ−らの方法を用いて細胞融合
を行った。
マウスミエローマＰ３Ｕ１とをｌＯ：１の割合で混合し
前記ネーチャー記載のケラ−らの方法を用いて細胞融合
を行った。
次の９６穴マイクロタイタープレートに植え込み、ＨＡ
Ｔ （ヒボキサンチンｌＸｌ０−’Ｍ。
Ｔ （ヒボキサンチンｌＸｌ０−’Ｍ。
アミノプテリン４Ｘ１０−１Ｍ、チミジン１．６Ｘ １
０−’Ｍ）を含んだＤＭＥＭ−１０％ＦＣ８培地（ＨＡ
Ｔ培地）で１０〜１７日間培養後、ＨＴ （ヒボキサン
チンｌＸ１０−’Ｍ、チミジン１．６ Ｘ １０−’Ｍ
）を含んだＤＭＥＭ１０％ＦＣ３培地（ＨＴ培地）に移
し、更にＤＭＥＭ−１０％ＦＣ３培地で培養した。増殖
の見られた穴の培養土消印の抗体価を酵素抗体法により
測定し、抗体産生能のあった穴のハイブリドーマを限界
希釈法によりクローニングを行い、クローン株を得た。
０−’Ｍ）を含んだＤＭＥＭ−１０％ＦＣ８培地（ＨＡ
Ｔ培地）で１０〜１７日間培養後、ＨＴ （ヒボキサン
チンｌＸ１０−’Ｍ、チミジン１．６ Ｘ １０−’Ｍ
）を含んだＤＭＥＭ１０％ＦＣ３培地（ＨＴ培地）に移
し、更にＤＭＥＭ−１０％ＦＣ３培地で培養した。増殖
の見られた穴の培養土消印の抗体価を酵素抗体法により
測定し、抗体産生能のあった穴のハイブリドーマを限界
希釈法によりクローニングを行い、クローン株を得た。
〔４〕 スクリーニング法
ハイブリドーマ及びクローンが増殖したウェルの培養上
清を分取し、ＥＬＩＳＡ法により各クローンの産生ずる
モノクローナル抗体の臓器型Ｃ８及び赤血球型Ｃ８に対
する反応性を検討した。
清を分取し、ＥＬＩＳＡ法により各クローンの産生ずる
モノクローナル抗体の臓器型Ｃ８及び赤血球型Ｃ８に対
する反応性を検討した。
マイクロタイタープレートに臓器型Ｃ８又は赤血球型Ｃ
８を別々に各０．５μｇ１５０μｌ／ウェルとなるよう
に分注し、４℃で１８時間静置して、両Ｃ８を固相に吸
着させた。
８を別々に各０．５μｇ１５０μｌ／ウェルとなるよう
に分注し、４℃で１８時間静置して、両Ｃ８を固相に吸
着させた。
１０ｍＭリン酸緩衝食塩水（Ｐ Ｂ Ｓ 、 ｐＨ７，
４）２００μｌで３回洗浄した後、１％ウシ血清了ルブ
ミン（ＢＳＡＪを含むＰＢＳを１００μｌ／ウェル加え
、３７℃で１時間静置し、各ウェルの未吸着部分をブロ
ックした。次いで、試料である培養上清を５０μｌ／ウ
ェル加え、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗
浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ （カ
ベル社）を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃で１時間反
応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．０１％過酸化
水素、０．５５ｍｇ／ｄＡ ＢＴ Ｓ ［２，２’ ７
ジノージ（３−エチルベンゾチアゾリン−スルホネート
）ヘーリンガーマンハイム社〕を含む０．１Ｍクエン酸
−水酸化ナトリウムバッファー（ｐＨ４，０）を加え、
波Ｊ％、４１０ｎｍでの吸光度を測定１７だ。
４）２００μｌで３回洗浄した後、１％ウシ血清了ルブ
ミン（ＢＳＡＪを含むＰＢＳを１００μｌ／ウェル加え
、３７℃で１時間静置し、各ウェルの未吸着部分をブロ
ックした。次いで、試料である培養上清を５０μｌ／ウ
ェル加え、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗
浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ （カ
ベル社）を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃で１時間反
応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．０１％過酸化
水素、０．５５ｍｇ／ｄＡ ＢＴ Ｓ ［２，２’ ７
ジノージ（３−エチルベンゾチアゾリン−スルホネート
）ヘーリンガーマンハイム社〕を含む０．１Ｍクエン酸
−水酸化ナトリウムバッファー（ｐＨ４，０）を加え、
波Ｊ％、４１０ｎｍでの吸光度を測定１７だ。
本発明により、臓器型Ｃ８及び赤血球型Ｃ８に対する各
モノクローナル抗体の特異性を検討した。この結果、臓
器型Ｃ８には反応するが赤血球型Ｃ８には反応しないモ
ノクローナル抗体を産生ずるクローン株ＣＳＬ１７が得
られた。また、両Ｃ８共に反応性を示すモノクローナル
抗体を産生ずるクローン株ＣＳＬＩ−３及びＣＳＬ５−
１２が得られた。
モノクローナル抗体の特異性を検討した。この結果、臓
器型Ｃ８には反応するが赤血球型Ｃ８には反応しないモ
ノクローナル抗体を産生ずるクローン株ＣＳＬ１７が得
られた。また、両Ｃ８共に反応性を示すモノクローナル
抗体を産生ずるクローン株ＣＳＬＩ−３及びＣＳＬ５−
１２が得られた。
これらクローン株はＨｙｂｒｉｄｏｍａｃ Ｓ Ｌ ４
−７と表示し微工研菌寄第１０９１４号（ＦＥＲＭＰ−
Ｉ Ｑ ９１４） ＨｙｂｒｉｄｏｍａＣ３Ｔ−１３
と表示し微工研菌寄第１０９１３号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１０９１３） ＨｙｂｒｉｄｏｍａＣＳＬ５−１２と
表示し微工研菌寄第１０９１５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
０９１５）として各々工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。
−７と表示し微工研菌寄第１０９１４号（ＦＥＲＭＰ−
Ｉ Ｑ ９１４） ＨｙｂｒｉｄｏｍａＣ３Ｔ−１３
と表示し微工研菌寄第１０９１３号（ＦＥＲＭ Ｐ−
１０９１３） ＨｙｂｒｉｄｏｍａＣＳＬ５−１２と
表示し微工研菌寄第１０９１５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
０９１５）として各々工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。
（５）モノクローナル抗体の作製
７週令のＢＡＬＢ／ｃマウスにブリスタン（アルドリッ
チ社）０．５ｍｊ！を腹腔内に投与し、１週間後、培養
、増殖させたクローン株１〜９Ｘ１０’個／マウスを腹
腔内に接種した。
チ社）０．５ｍｊ！を腹腔内に投与し、１週間後、培養
、増殖させたクローン株１〜９Ｘ１０’個／マウスを腹
腔内に接種した。
１０〜１４日後にマウスより腹水を採取した。
（６） モノクローナル抗体の精製
上記（５）によって得られた腹水を５０ｍＭＩＪン酸バ
ッファー（ｐ）１７．４）で２倍希釈した後、等量の飽
和硫酸アンセニウムを加え、沈殿画分を分取した。この
画分をなるべく中通の］ニ記リン酸バッファー゛に溶解
させ、同じバッファーに対して透析した。このサンプル
をＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけ、精製モノクロー
ナル抗体ＣＳＬ４−７、ＣＳＬＩ−３、ＣＳＬ５−１２
を得た。
ッファー（ｐ）１７．４）で２倍希釈した後、等量の飽
和硫酸アンセニウムを加え、沈殿画分を分取した。この
画分をなるべく中通の］ニ記リン酸バッファー゛に溶解
させ、同じバッファーに対して透析した。このサンプル
をＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけ、精製モノクロー
ナル抗体ＣＳＬ４−７、ＣＳＬＩ−３、ＣＳＬ５−１２
を得た。
（７）モノクローナル抗体の性質
イムノグロブリン・サブクラスはオフタロニー法により
、分子量は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により測定した。
、分子量は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により測定した。
方Ｃ８への特異性はヒト臓器型Ｃ３とヒト赤血球型Ｃ３
への反応性は前述ＥＬ Ｉ ＳＡ法により測定した。結
果を表１に示す。
への反応性は前述ＥＬ Ｉ ＳＡ法により測定した。結
果を表１に示す。
なお、ＣＳＬＩ−３とＣＳＬ５−１２は、ウエゲナー（
Ｗａｇｅｎｅｒ）らの競合ＥＬＩＳＡ法〔ジャーナル
オブ イムノロジカル メソッズ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｌＭｅｔｈｏｄｓ）、第６８巻、第２６９頁（１９８
４） ］により赤血球型Ｃ８分子上の異なる抗原認識部
位と反応していることが明らかとなった。
Ｗａｇｅｎｅｒ）らの競合ＥＬＩＳＡ法〔ジャーナル
オブ イムノロジカル メソッズ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｌＭｅｔｈｏｄｓ）、第６８巻、第２６９頁（１９８
４） ］により赤血球型Ｃ８分子上の異なる抗原認識部
位と反応していることが明らかとなった。
実施例２ モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥ
ＩＡ法による臓器型Ｃ３の 特異的測定法 実施例１により得たモノクローナル抗体ＣＳＬ４−７と
ＣＳＬＩ−３を用いて臓器型Ｃ３の特異的測定法を検討
した。
ＩＡ法による臓器型Ｃ３の 特異的測定法 実施例１により得たモノクローナル抗体ＣＳＬ４−７と
ＣＳＬＩ−３を用いて臓器型Ｃ３の特異的測定法を検討
した。
（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）！識モノ
クローナル抗体ＣＳＬＩ−３の調製ＨＲＰ ５ ｍｇを
１−の蒸留水に溶かし、０．１Ｍ過ジヨウ素酸） ＩＪ
ウム０．２ｍｊ！を加えて室温で２０分間反応させた後
、１ｍＭ酢酸ナトリウムバッフｙ （ｐ）１９．５）
０．０２ｉを加えてｐＨ９〜９．５にすると同時にモノ
クローナル抗体ＣＳＬＩ−３Ｌｏｎｇ／−［０，０１Ｍ
炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９，５）に対して透析
したもの〕を加える。室温で２時間反応させた後、水素
化ホウ素ナトリウム４■／ｍｊｌ’を０．１ｍｊ！加え
て４℃で２時間反応させる。これをセファデックスＧ２
００カラムでゲルろ過し、０．１ Ｍ ＮａＣｌを含む
０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７，５で溶出
させ、ＨＲＰ標識ＣＳＬＩ−３モノクロ一ナル抗体を分
取した。
クローナル抗体ＣＳＬＩ−３の調製ＨＲＰ ５ ｍｇを
１−の蒸留水に溶かし、０．１Ｍ過ジヨウ素酸） ＩＪ
ウム０．２ｍｊ！を加えて室温で２０分間反応させた後
、１ｍＭ酢酸ナトリウムバッフｙ （ｐ）１９．５）
０．０２ｉを加えてｐＨ９〜９．５にすると同時にモノ
クローナル抗体ＣＳＬＩ−３Ｌｏｎｇ／−［０，０１Ｍ
炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９，５）に対して透析
したもの〕を加える。室温で２時間反応させた後、水素
化ホウ素ナトリウム４■／ｍｊｌ’を０．１ｍｊ！加え
て４℃で２時間反応させる。これをセファデックスＧ２
００カラムでゲルろ過し、０．１ Ｍ ＮａＣｌを含む
０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７，５で溶出
させ、ＨＲＰ標識ＣＳＬＩ−３モノクロ一ナル抗体を分
取した。
（２） サンドイッチＥＩＡ測定系
９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルにＰＢＳに
溶解したモノクローナル抗体ＣＳＬ４−７ （２０，ｕ
ｇ／ｍｌ）を１００μｊ２ずつ添加し、４℃１晩インキ
ユベートし、溶液を捨てた後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
溶液を２００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時
間ブロッキングを行った。ＰＢＳでよく洗浄し、試料５
０μｌを加え、続いて１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈し
たＨＲＰ標識ＣＳ（３） ｉ、 ｉ −３モノクロ一ナル抗体液５０μｌを加え、
室温で２時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、０
．０１％過酸化水素、１■／ｍ７！０−フェニレンジア
ミンを含む０．１Ｍクエン酸バッファ （ｉ））１４
．５） ０，１ｒｎ１．を加え、室温で２０分間反応
させた後、Ｉ Ｎ Ｈ２ＳＯ，の０．１−を加え波長４
９２ｎｍでの吸光度を測定した。
溶解したモノクローナル抗体ＣＳＬ４−７ （２０，ｕ
ｇ／ｍｌ）を１００μｊ２ずつ添加し、４℃１晩インキ
ユベートし、溶液を捨てた後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
溶液を２００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時
間ブロッキングを行った。ＰＢＳでよく洗浄し、試料５
０μｌを加え、続いて１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈し
たＨＲＰ標識ＣＳ（３） ｉ、 ｉ −３モノクロ一ナル抗体液５０μｌを加え、
室温で２時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、０
．０１％過酸化水素、１■／ｍ７！０−フェニレンジア
ミンを含む０．１Ｍクエン酸バッファ （ｉ））１４
．５） ０，１ｒｎ１．を加え、室温で２０分間反応
させた後、Ｉ Ｎ Ｈ２ＳＯ，の０．１−を加え波長４
９２ｎｍでの吸光度を測定した。
測定系の感度、特異性
上記の測定系の感度及び特異性を検討するため、ヒト臓
器型Ｃ８及びヒト赤血球型Ｃ８を標準液として測定した
。その結果表２に示すように、本測定系はヒト臓器型Ｃ
８を感度１ ｎｇ／−で測定できるのに対しヒト赤血球
型Ｃ８は測定不可能であり、ヒト臓器型Ｃ８に特異的な
高感度で簡便な測定方法である、−とが示された。
器型Ｃ８及びヒト赤血球型Ｃ８を標準液として測定した
。その結果表２に示すように、本測定系はヒト臓器型Ｃ
８を感度１ ｎｇ／−で測定できるのに対しヒト赤血球
型Ｃ８は測定不可能であり、ヒト臓器型Ｃ８に特異的な
高感度で簡便な測定方法である、−とが示された。
実施例３ モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥ
ＩＡ法による臓器型Ｃ８及 び赤血球型Ｃ３全体量の特異的測定 法 実施例１により得た七ツクローナル抗体Ｃ８し５−１２
とＣＳＬＩ−３を用いてＣ８全体量の特異的測定法を検
討した。
ＩＡ法による臓器型Ｃ８及 び赤血球型Ｃ３全体量の特異的測定 法 実施例１により得た七ツクローナル抗体Ｃ８し５−１２
とＣＳＬＩ−３を用いてＣ８全体量の特異的測定法を検
討した。
（１）ＨＲＰ標識モノクローナル抗体ＣＳＬＩ３の調製
実施例２と同様に行った。
（２）サンドイッチＥｉＡ測定系
実施例２と同様に、ＣＳＬ４−７の代りにＣＳＬ５−１
２を用いて行った。
２を用いて行った。
（３）測定系の感度及び特異性
実施例２と同様に行った。その結果表３に示すように本
測定系はヒト臓器型Ｃ８及びヒト赤血球型Ｃ８共に感度
１ｎｇ／ｄで測定可能であり、ヒ）Ｃ３全体量を特異的
に高感度で、簡便に測定できる方法であることが示され
た。
測定系はヒト臓器型Ｃ８及びヒト赤血球型Ｃ８共に感度
１ｎｇ／ｄで測定可能であり、ヒ）Ｃ３全体量を特異的
に高感度で、簡便に測定できる方法であることが示され
た。
実施例４ モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥ
ＩＡ法による赤血球型Ｃ３ の特異的測定法 実施例１により得たモノクローナル抗体ＣＳＬ４−７、
ＣＳＬ５−１２、ＣＳＬＩ−３を用いて、赤血球型Ｃ８
の特異的測定法を検討した。
ＩＡ法による赤血球型Ｃ３ の特異的測定法 実施例１により得たモノクローナル抗体ＣＳＬ４−７、
ＣＳＬ５−１２、ＣＳＬＩ−３を用いて、赤血球型Ｃ８
の特異的測定法を検討した。
（１） ＣＳ Ｌ ４−７固定化カラムの作製モノク
ローナル抗体ＣＳＬ４−７をＢｒＣＮ活性化セファロー
ス４Ｂ（ファルマシア社）に常法により固定化し、ミニ
カラム（容量１ｍｆ；ピアス社）に充てんし、ＰＢＳで
平衡化した。
ローナル抗体ＣＳＬ４−７をＢｒＣＮ活性化セファロー
ス４Ｂ（ファルマシア社）に常法により固定化し、ミニ
カラム（容量１ｍｆ；ピアス社）に充てんし、ＰＢＳで
平衡化した。
（２）ＨＲＰ標識モノクローナル抗体ＣＳＬＩ３の調製
実施例２と同様に行った。
（３）赤血球型Ｃ３特異測定法
試料をあらかじめ上記（１）で作製したＣＳＬ４−７抗
体カラムを通し、素通り画分を集め、これを試料液とし
て実施例３と同様に行った。
体カラムを通し、素通り画分を集め、これを試料液とし
て実施例３と同様に行った。
（４）測定系の感度及び特異性
上記測定系の感度及び特異性を検討するため、ヒト臓器
型Ｃ８及びヒト赤血球型Ｃ３を標識液として測定した。
型Ｃ８及びヒト赤血球型Ｃ３を標識液として測定した。
その結果、表４に示すように、本測定系はヒト赤血球型
Ｃ８を感度１ｎｇ／ｍｉで測定できるのに対しヒト臓器
型Ｃ３は吸着除去されて微量のため測定不可能であり、
ヒト赤血球型Ｃ３に特異的な高感度で簡便な測定法であ
ることが示された。
Ｃ８を感度１ｎｇ／ｍｉで測定できるのに対しヒト臓器
型Ｃ３は吸着除去されて微量のため測定不可能であり、
ヒト赤血球型Ｃ３に特異的な高感度で簡便な測定法であ
ることが示された。
以上詳細に説明した通り、本発明によりＣ３に対する特
異性の明確なモノクローナル抗体が提供された。本発明
のモノクローナル抗体を利用することで臓器型Ｃ３及び
／又は赤血球型Ｃ８の特異的で高感度で簡便な測定が可
能となり、本態性高血圧症をはじめとする疾患の診断、
生体におけるＣ８の役割の解明等に非常に有用である。
異性の明確なモノクローナル抗体が提供された。本発明
のモノクローナル抗体を利用することで臓器型Ｃ３及び
／又は赤血球型Ｃ８の特異的で高感度で簡便な測定が可
能となり、本態性高血圧症をはじめとする疾患の診断、
生体におけるＣ８の役割の解明等に非常に有用である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、カルパスタチンに特異的に反応するものであること
を特徴とするモノクローナル抗体。 ２、該モノクローナル抗体が、下記の性質を有するＣＳ
Ｌ１−３である請求項１記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量：１５００００ （ｂ）Ｉｇサブクラス：ＩｇＧ＿１ （ｃ）特異性：ヒト臓器型カルパスタチン及びヒト赤血
球型カルパスタチンに特異性を示す ３、該モノクローナル抗体が、下記の性質を有するＣＳ
Ｌ５−１２である請求項１記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量：１４５０００ （ｂ）Ｉｇサブクラス：ＩｇＧ＿１ （ｃ）特異性：ヒト臓器型カルパスタチン及びヒト赤血
球型カルパスタチンに特異性を示し、請求項２記載のＣ
ＳＬ１−３とは抗原認識部位を異にする ４、該モノクローナル抗体が、下記の性質を有するＣＳ
Ｌ４−７である請求項１記載のモノクローナル抗体。 （ａ）分子量：１５５０００ （ｂ）Ｉｇサブクラス：ＩｇＧ＿１ （ｃ）特異性：ヒト臓器型カルパスタチンにのみ特異性
を示し、ヒト赤血球型カルパスタチンには反応性を示さ
ない ５、被検試料中のヒト臓器型カルパスタチン及び／又は
ヒト赤血球型カルパスタチンを特異的に分別測定する試
薬において、請求項１記載のモノクローナル抗体を構成
成分とすることを特徴とするカルパスタチン測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01211258A JP3102484B2 (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | モノクローナル抗体及びその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP01211258A JP3102484B2 (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | モノクローナル抗体及びその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0376596A true JPH0376596A (ja) | 1991-04-02 |
| JP3102484B2 JP3102484B2 (ja) | 2000-10-23 |
Family
ID=16602933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP01211258A Expired - Fee Related JP3102484B2 (ja) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | モノクローナル抗体及びその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3102484B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH068288U (ja) * | 1992-07-08 | 1994-02-01 | ティーディーケイ株式会社 | テープカセット収納用ケース |
| JP3000720U (ja) * | 1994-02-03 | 1994-08-16 | 有限会社サンエイ | レンタルショップ用ビデオケース |
-
1989
- 1989-08-18 JP JP01211258A patent/JP3102484B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3102484B2 (ja) | 2000-10-23 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |