JPH0376868B2 - - Google Patents

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JPH0376868B2
JPH0376868B2 JP59500904A JP50090484A JPH0376868B2 JP H0376868 B2 JPH0376868 B2 JP H0376868B2 JP 59500904 A JP59500904 A JP 59500904A JP 50090484 A JP50090484 A JP 50090484A JP H0376868 B2 JPH0376868 B2 JP H0376868B2
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は電荷修飾ミクロポーラス膜を使用する
高分子体のブロツテイング、特に核酸及び蛋白の
ブロツテイングに関する。さらに詳しくは、本発
明はその表面上に固定マトリツクスとしてカチオ
ン電荷修飾ミクロポーラスナイロン膜を有するク
ロマトグラフ基質から成る製品であつて、該ミク
ロポーラスナイロン膜が膜全体に亘つて細孔を有
する親水性膜から成り、該細孔表面がカチオン電
荷修飾剤で修飾されて成る製品に関する。 ［従来技術］ 「Smithies、Zone Electrophoresis in Starch
Gels：Group Variations in the Serum
Proteins of Normal Human Adults」
〔Biochem.J.61：62 9641（1955）〕には、澱粉ゲ
ルはモレキユラーシーブとして役立ち、それを通
してゾーン電気泳動が起こるという記載がみられ
る。それ以来、ゲル電気泳動技術は常に確実な進
歩をとげてきた。アクリルアミドゲルや不連続緩
衝システムの導入、ゲル上で解像される蛋白複合
体の解コウ用のナトリウムドデシルサルフエート
（SDS）の使用、及びポリアクリルアミドゲル電
気泳動用不連続緩衝システムにおけるSDSの併用
などは、近代生物学の分析手段及び準備手段の発
展に対して著しい貢献をしてきた。 これらの技術の主要な目的は、与えられた実験
的処置が行なわれる期間を通して、特殊“バン
ド”が出現もしくは消滅することによつて蛋白試
料の等質性もしくは複雑性を肉視できるようにす
ることである。一次元ゲルはウイルス、バクテリ
オフアージ、赤血球ゴーストメンブラン等のよう
な比較的単純な蛋白試料だけを分析する際に適す
ることが判つている。もつと複雑なシステムでは
一層大きな解像力が要求されたので新しい二次元
ゲルシステムが開発された。現在では、最も複雑
な蛋白性試料の一つである無数のポリペプチド類
ですら、効果的に解像されるようになつた。 一つの“バンド”又は“スポツト”を既知の機
能と正しく相関させる仕事は困難であることが多
く、かつこのことは蛋白類の解像が蛋白の変性に
基づいている場合には特に困難である。それにも
かかわらず、ゲル中の特定酵素又はアンチゲン又
は糖蛋白又はホルモン受容体の確認を可能とする
多くの手段が開発されてきた。これらの方法は次
の前提条件の少なくとも一つを維持しうるという
能力に依存している：(1)ポリペプチドが電気泳動
期間中、活性を保つていること：(2)変性ポリペプ
チドの変性解除；及び(3)電気泳動期間中、検知可
能なリガンドへの追求蛋白の共有結合による架
橋。そのうえ、ゲルを実際に処理するには多くの
操作と長期のインキユベーシヨン及び洗浄工程を
伴う。このことは時間の無駄であり、かつ湿ゲル
の破損や引き裂け又は乾燥期間中のゲルのクラツ
キングのような事故を起こす傾向がしばしばみら
れる。 ゲル分析における問題点を克服するために、新
しい方法が開発された。 すなわちアガロース（agarose）ゲルから
DNAパターンをニトロセルロース膜に移動させ
るための、既に確立された方法である
“Southern−blotting”法がポリアクリルアミド
ゲルの蛋白パターンにも適用することが可能であ
ることを明らかにした多類の文献が刊行されてい
る。未処理蛋白パターンがゲルから溶離され、基
層上に固定化される。一方、該基層は“バンド”
もしくは“スポツト”を確認するためにゲルに対
して適用されてきたと同様の操作にかけられる。
しかし、エレクトロホレトグラムを固定マトリツ
クスに移動することによつて次のような利益が得
られるはずである： (1) 湿固定マトリツクスは柔軟で取り扱い容易； (2) 固定化蛋白は容易に均等に各種のリガンドに
接近しやすい（デフアレンシヤルポーラシテイ
によつてゲル中に導入される各種の制約が解除
されることに起因する）； (3) 一般的に移動分析は小量の試料で実施でき
る； (4) 処理時間（インキユベーシヨン及び洗い）が
著しく低減できる； (5) 多数のレプリカの作製が可能； (6) 移動パターンは使用にさき立ち数ケ月間貯蔵
できる； (7) この蛋白トランスフアーは複数の分析に耐え
られる。そのうえ、この移動された蛋白パター
ンは、通常ではゲル上で遂行するには極めて困
難か不可能に近い分析法を受け入れ易い。 現在では“ブロツテイング”なる用語は、核酸
や蛋白のような生物学的高分子体をゲルから固定
マトリツクスへ移動するための方法をいう。この
表現は関係する高分子体の名称と一緒にして、例
えば蛋白ブロツテイング、DNAブロツテイング
及びRNAブロツテイングのように使われる。固
定化された移動蛋白を含む生成マトリツクスは
“ブロツト”もしくは“トランスフアー”と呼ば
れ、かつこのものはリガンドによつてインキユベ
ーシヨンされうる。この操作は“オーバーレイ”
と呼ばれる一方法である。例えば、免疫−オーバ
ーレイ（immuno−overlay）、レクチンオーバー
レイ又はカルモダリン（calmodulin）オーバー
レイは、それぞれ抗体、レクチン又はカルモダリ
ンによるブロツトのインキユベーシヨンを指す。 核酸ブロツテイングの一種であるDNAブロツ
テイングは〔J.Mol.Biol.98：503〜517（1975）〕
に「Detection of Specific Sequences among
DNA Fragment Separated by Gel
Erectrophoresis」と題してSouthernらが寄稿し
た“Southern Transfer”と呼ばれる技術に基礎
を置いている。 DNAフラグメントをクロマトグラフ分離した
のちに、このDNAをゲル中で変性し、次いで該
ゲルの中和を行なう。このゲルを、緩衝液貯槽と
接触しているガーゼ心ペーパーの間に置き、ニト
ロセルロースを該ゲルの頂部に置いて、乾燥した
ブロツテイングペーパーをこのニトロセルロース
の頂部に設ける。ゲルを通過する物質流がDNA
を溶離するが、次いでDNAはニトロセルロース
に結合する。かくして、電気泳動的に分離された
DNAフラグメントパターンはニトロセルロース
上に移されて保存される。特定のラベル化した核
酸を用いて異種交配するとニトロセルロースに結
合した相補フラグメントの検出ができる。 シングルストランドRNA及びDNAは、アミノ
ベンジルオキシメチル基で置換したセルロース粉
の該アミンをジアゾ化してジアゾベンジルメチル
（DBM）−セルロースを形成させて活性化したセ
ルロース粉と共有結合させうることが、1976に発
見された。DNAはニトロセルロースと結合し難
く、“Southern Transfer”法の適用を困難もし
くは不可能にしていたので、この事実は異種交配
技術の間隙を埋めることになつた。1977年には、
〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5350〜5354
（1977）〕において“Method for Detection of
Specific RNAs in Agarose Gels by Transfer
to Diazobenzyloxymethyl−Paper and
Hybridization whih DNA Probes”と題する論
文がAlwineらによつて発表され、ここでは次の
構造式 で示されるDBM−ペーパーと呼ぶジアゾベンジ
ルオキシメチル基で変性したセルロース性・繊維
状シート（すなわち、ブロツテイングペーパー）
が作られる。このDBM−ペーパーは電気泳動的
に分離されたRNAパターンをアガロースゲルか
ら“Souther Transfer”法と類似の方法で移動
するのに使用できると発表される。ジアゾ型
（DPT−ペーパー）に活性化したアミノフエニル
チオエーテルペーパーも同様に使用されている。
いずれも共有結合的に、また非可逆的にDNA、
RNA及び蛋白と結合する。 DBM−ペーパー及びDPT−ペーパーは活性化
が必要であつてライフに限度があり、したがつて
不安定であり、その結合能力は単にニトロセルロ
ースに匹敵しうる程度であり、非可逆的に高分子
体と結合するという欠点があるので、次の段階で
の溶離が阻害され、かつ表面構造に起因する解像
の困難性を伴うという問題点をもつている。 DBMペーパーの不便さを若干でも克服する努
力がThomas（1980）によつてなされたが、高い
塩分濃度を使用してRNA及び小量のDNAフラグ
メントをニトロセルロースに移動する技術が開発
された。RNAの結合効率は、DBMペーパーの
35uｇ／cm2に比べて80uｇ／cm2であることが分つ
た。ポリアクリルアミドゲルからの高分子体の溶
離は電気泳動によつて効果的に遂行できる。しか
し、高い塩分濃度が必要なので高電流を必要と
し、実用的ではない。 DNA及びRNA研究との関連で最初に開発され
たSouthernによるブロツテイング技術は、蛋白
に適用しうる可能性があることが認められるよう
になつた。この蛋白移動技術は最初にRenartに
よつて開発されて、〔Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
76：3116〜3120（1979）〕に“Transfer of
Proteins from Gels to Diazobenzyloxymethyl
−Paper and Detection With Antisera”と題
して発表された。Renartは複合アガロース−ア
クリルアミドゲルを用いてDBMへの蛋白の移動
を遂行したが、ここでのアクリルアミド架橋は可
逆性であつた。電気泳動したのち、この架橋結合
を解いて低い％のアガロースゲルを分離し、この
ゲルから蛋白が容易に移動した。この直後に
Bowenらが蛋白ブロツテイング方法を開発して、
〔Nuc.Acids.Res.８：１−20（1980）〕に「The
Detection of DNA−Binding Proteins by
Protein Blotting」と題して発表された。ここで
はSDS−ポリアクリルアミドゲル上に分離された
DNA結合蛋白及び他のリガンド結合蛋白の分離
用にニトロセルロースが用いられた。また移動は
拡散によつた。Towbinらは〔Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 76：4350〜4354（1979）〕において、ま
たBittnerらは〔Anal.Biochem.102：459〜471
（1980）〕において、たとえ低い塩分濃度でも電気
泳動的に移動が可能であることを示した。 一般に、蛋白ブロツテイングは二段の逐次工程
から成り、いわゆるゲルからのポリペプチドの溶
離と溶離物の固定マトリツクスへの吸着から成
る。 高分子体溶離のための３種類の起動力が開拓さ
れた。一つは拡散である。ここでは、移動すべき
高分子体を含有するゲルを固定マトリツクスをな
す２枚のシート間にはさみ、この固定マトリツク
スは一方で発泡パツドとステンレス鋼スクリーン
間にはさむ。次いでこの組み合わせ体を２の緩
衝液中に沈めて、36〜48時間、放置する。このイ
ンキユベーシヨンの結果として、二つの同じレプ
リカブロツトが得られた。移動効率は75％に達し
たが、この値は二つのレプリカ間で分けなければ
ならない。マトリツクス上に吸収された高分子体
の量が所要の試験に十分であり、かつ移動時間が
長くてもよい場合には拡散によるブロツテイング
は有用である。 高分子体ブロツテイングの第２の方法は、
Southernが述べている古い方法でDNAブロツト
が遂行されたと同様に、ゲルを通して流れる液体
のマスフローに基づいている。ゲルを緩衝液貯槽
中に置く。マトリツクスをゲルにあてがい、紙タ
オルをマトリツクス上に積重ねる。このタオルは
ゲル及びマトリツクスを通して貯槽から緩衝液を
吸収する。かかる流体の動きが蛋白をゲルから溶
離する起動力として働き、蛋白は次いでフイルタ
ー中にトラツプされる。この方法は拡散法よりも
短時間で済み、かつ溶離効率が良好である。この
方法の修正法が提案されていて、ここでは両指向
性のブロツテイングができる。そのうえ、減圧法
を採用することによつて溶離時間が画期的に短縮
されることになつた。 蛋白ブロツテイングで最も広く用いられる方法
は、ゲルから蛋白を電気泳動させることに基づい
ている。このことはDNAとは反対に、蛋白が低
いイオン強度の緩衝液においてさえもニトロセル
ロースを吸着するという事実によつて可能なので
ある。そこで、非実用的な高電流を用いなくても
蛋白をゲルから電気泳動することができる。ブロ
ツテイングの電気泳動という概念は〔Cell.11：
363〜370（1977）〕に「Heterogeneity of the
Ribosomal Genes in Mice and Men」と題し
て記載がある。多数の装置デザインが報告されて
いるが、今日商業的に入手しうるものは稀であ
る。要旨は湿マトリツクスをゲル上に置いて、こ
のとき空気泡がフイルターもしくはマトリツクス
とゲル間に連行されないように確認する。次いで
マトリツクスとゲルとを“Scotch Brite”洗浄
パツド、フオームラバー又は湿ブロツテイングペ
ーパーのようなポーラスな支持パツド間にはさ
む。次いで該組み立てを、通常は非導電性の固体
グリツドで支持する。ゲルとマトリツクスとが相
互に強く保持されることが非常に重要である。こ
のようにして良好な移動を確立し、かつ蛋白バン
ドの“ゆるみ”を防止する。支持した“ゲル＋マ
トリツクスサンドイツチ”を緩衝液含有タンク中
に挿入し、２本の電極の間に置く。タンク壁に鋲
留めされている２本の電極は移動されるできゲル
の全領域に亘つて均質な電界が生ずるように配設
する。電極としては、導電性連続シートを使うこ
とができ、理論的にも当該目的に適している。グ
ラフアイトスラブ及びステンレス鋼プレートも使
用できる。しかしかかる電極を有する運転ユニツ
トは著しく高い電流が必要であるために、通常は
実用的ではない。極めて合理的で、経済的かつ効
率的なデザインは〔Ana.Biochem.102：459〜
471〕に「Electrophoretic Transfer of
Proteins and Nucleic Acids from Slab Gels
to Diazobenzyl oxymethyl Cellulose or
Nitrocellulose Sheets」と題して発表されてい
る。電界の均一性に影響する因子は、ゲルと電極
間の距離及び電極材料の密度、すなわち使用ワイ
ヤの各ストレツチ間の距離である。一般には、電
極材料の存在量が多い程、システムの電気抵抗は
低下する。そこで、溶離工程をドライブするため
に必要な合理的な電圧差を得るためには高電流が
必要になる。使用する移動用緩衝液は低いイオン
強度のもの、例えばリン酸塩緩衝液、トリス−ホ
ウ酸塩緩衝液又はトリス−グリシンのような、メ
タノール含有もしくは非含有の緩衝液が用いられ
る。メタノールは蛋白に対するニトロセルロース
の結合能力を増加させる傾向があり、かつ移動さ
れるゲルの幾何学形を安定させるが、SDSゲルか
らの蛋白の溶離効率を低下させ、高分子体を効率
良く移動させるためには溶離を長時間、一般に12
時間以上に亘つて行なわなければならない。メタ
ノールが存在しない場合には、アクリルアミドゲ
ルは膨潤する傾向があり、かつ蛋白移動間にその
まま放置するとゆがんだバンドが生ずる。 移動条件自体はゲルのタイプ、固定マトリツク
ス及び使用する移動装置並びに高分子体の種類に
依存性がある。未変性ゲル、SDSゲル、ゲルを含
むリチウムドデシルサルフエート、イソ−エレク
トロフオーカス2Dゲル（iso−electro focusing
2D gels）及びアガロースゲルはすべて蛋白ブロ
ツテイング用に使用されている。溶離される蛋白
の電荷を決めて、マトリツクスをゲルの適切な側
に配設する必要がある。例えばSDS−ゲルからの
蛋白はアニオンとして溶離するから、このマトリ
ツクスはゲルのアノード側に置く必要がある。未
変性ゲルの場合にはその逆である。電気溶離が進
行するにつれて、ゲルからの電解質もまた溶離さ
れ、これが緩衝液の導電性に寄与する結果、抵抗
の減少が起こる。移動を一定電圧にて実施する場
合には、それに応じて電流が増加し、１アンペア
以上になり、実際には５アンペアに達することも
ある。１〜５アンペアのような高電流の供給は、
電気ブロツテイングにおいて現在では商業的に可
能である。他の便法としては12Vバツテリーチヤ
ージヤーが用いられるが、これは合理的と考えら
れる。しかし、ゲル電気泳動に使用される通常の
大部分の電力供給装置では200〜250ｍＡを越すこ
とは不可能であつて、したがつて200ｍＡのよう
な最高一定電流で操作して移動中に電圧を徐々に
低下してやるほうが有利であることが判つた。 低分子量又は中間的分子量の分離蛋白はゲルか
ら効率良く溶離しないことがある。これらの蛋白
が偶然に等電点上にあるために電界中に移動する
傾向がない場合がそれである。かかる場合には、
他の緩衝条件が採用できる。 現在では、多数の固定マトリツクスが入手でき
る。ニトロセルロースはマトリツクスとして最も
広く用いられた材料であるが、ニトロセルロース
と蛋白との相互作用は複雑で、充分に理解されて
いない。例えば通常、蛋白の電気溶離を行なうPH
８では、ニトロセルロースは蛋白の吸着につれて
負に帯電する。この相互作用には親水性的影響が
役割りを演じ、実際のところマトリツクスからの
蛋白の溶離が非イオン性界面活性剤によつて行な
われる。ある種の蛋白、特に低分子量の蛋白はニ
トロセルロースとの結合が弱く、移動中又は次の
工程間で失なわれる可能性がある。かかる損失を
防止するために、移動ポリペプチドをマトリツク
スに架橋することができ、これによつて蛋白パタ
ーンを共有結合によつて安定化することが可能で
ある。ニトロセルロース膜マトリツクス中にセル
ロースアセテートが存在すると、蛋白結合能力が
低下するようにみえる。しかし、セルロースアセ
テートマトリツクスは蛋白ブロツテイング用に成
功埋に使用されている。 ニトロセルロースマトリツクスの欠点を若干で
も改良するために、他の固定マトリツクスが提案
されてきた。DBMペーパーへの移動は共有結合
した安定した蛋白パターンを生ずる。膜マトリツ
クスに比べて本質的に目があらいので、該材料上
での解像は若干低い。移動緩衝液として常用され
るグリシンもまたDBMペーパー蛋白ブロツテイ
ングを妨げる。そこでニトロセルロース、DBM
ペーパー及びその他のマトリツクス類のような、
従来使用に供されている固定マトリツクスの欠点
が改良された固定マトリツクスを開発する必要が
なお残つている。もつと大きな移動能力をもつも
のの出現も望まれている。 各種の膜がクロマトグラフイーに、また特殊な
ケースとして電気泳動技術に使用しうるというこ
とは公知である。これらについては次の文献に記
載がみられる。 米国特許第3808118号公報 同 第3829370号公報 同 第3945926号公報 同 第3957651号公報 同 第3989613号公報 同 第4043895号公報 同 第4111784号公報 同 第4158683号公報 同 第4204929号公報 同 第4243507号公報 同 第4310408号公報 同 第4311574号公報 また、ポリアミド粉末がクロマトグラフ分離に
用いられうるということも公知である。 米国特許第3418158号公報 同 第3523350号公報 米国特許第4128470号公報にはナイロン製ミク
ロポーラス膜類が、これを通してクロマトグラフ
イーが遂行されうる媒体として電気泳動及びイソ
エレクトリツク（等電点）フオーカシング
（isoelectric focusing）用に用いられうることが
開示されている。 New Engl and Nuclear社では“Gene
Screen”と称する一連の電気泳動用材料の一つ
としてブロツテイングに用いる非電荷ナイロン膜
を発売している。この材料は蛋白の結合能力につ
いてはニトロセルロースに匹敵するようにみえ
る。 ユーテイリテイ 高分子物ブロツトもしくはトランスフアー類
は、ゲルに対して開発されてきたと同様に各種の
試薬で“オーバーレイ”することができる。フイ
ルターマトリツクス類の操作は時間が掛らず、使
用試薬の観点からも安価であつて、事故も少な
い。さらに重要なことは、ゲルからマトリツクス
へ蛋白移動すると拡散バリヤーが効果的に排除さ
れるということである。そのうえ、変性蛋白がこ
れらからSDSを分離するに際して変性が解除され
ることがしばしばあり、したがつて該方法は恐ら
くさらに便利で効果的なものになりうるとみられ
る。 現在、使用されているプローベの大部分は高分
子体であつて、これらは特に検体としてのポリペ
プチドの一定ドメインによく結合する。レクチン
は糖蛋白及び抗体の検出に用いられ、またこれら
の対応アンチゲンの確認に使用されている。試験
目的の如何にかかわらず、蛋白バンドを含まない
マトリツクス空所はオーバーレイ工程間に不特定
的にプローベを吸着するので、有害なバツクグラ
ウンドの原因になる。そこで、マトリツクスの未
結合位置はブロツトをオーバーレイするのにさき
立つてクエンチングしてやらなければならない。
通常、該クエンチングは高濃度のウシ血清アルブ
ミン（BSA）又はヘモグロビン中でブロツトを、
25〜60℃で１〜12時間、インキユベーシヨンする
ことによつて遂行されている。オーバルミン
（ovalbumin）、ゼラチン及び各種の動物血清類の
ような他の物質もまた使用されうる。温度、蛋白
の選択及びクエンチ時間はマトリツクス材料と使
用プローベの種類の関数である。非イオン性界面
活性剤もまた不特定結合を低減させるためにクエ
ンチもしくは洗浄緩衝液中に含ませうる。 該ブロツトをクエンチングしたのち、これをプ
ローベと反応させる。一般に、すべての反応はク
エンチング蛋白の存在下で行なう。反応済みのブ
ロツトは、次いで緩衝液（この場合は蛋白を含ま
せる必要はない）中で十分に洗浄する。もしプロ
ーベ自体が放射性であるか、又は酵素もしくは螢
光性タツグと共役しているならば、このブロツト
は直ちにオートラジオグラフイーにかけたり、適
切な基質と反応させたり、又はUV光下で肉視す
ることができる。 プローベ・バンド複合体の存在を検知するため
に、さらに第２もしくは第３試薬が必要である場
合には、次いで各試薬を該ブロツトでインキユベ
ーシヨンしたのちに洗浄する。該オーバーレイ技
術の感度は極めて良好なので、自然界に存在する
極めて微量のウイルスアンチゲンでも検知が可能
である。そのうえ、これらの技術は各種の免疫障
害患者のヒト血清の分析にも用いられている。 ゲル上へのブロツトの利点の一つは、再使用し
たり、繰り返えして反応に掛かけることができる
ことである。一度シグナルを得て記録したら、こ
のブロツトはプローベを除いて消去できるが、最
初の蛋白パターンはマトリツクス上に残留させて
おくことができる。該消去フイルターは、該ゲル
パターンの成分をさらに特徴づけるための追加的
オーバーレイ分析に再使用ができる。“消去”は
抗体−抗原複合体を分解するためにPHを下げる
か、又は尿素もしくはSDS中でこのブロツトをイ
ンキユベーシヨンしてプローベを変性してやるこ
とによつて達成できる。詳細仕様を調べるために
プローベ・バンド複合体を選択的に分解すること
もできる。カルモダリン（calmodulin）は系か
らCa++を除くことによつてカルモダリン結合蛋
白から分解することが可能である。これらの反応
は、蛋白ブロツトが最初のシグナルを得るために
オートラジオグラフイーに掛けたあとでさえ実施
できる。 蛋白ブロツトの使用は通常は蛋白−蛋白もしく
は蛋白−リガンドの相互作用を調査するという目
的か又は免疫学的もしくは生化学的諸分析におけ
る中間段階としての固定化ポリペプチドの生産を
開拓しようという目的をもつている。これらの試
みのいずれもが蛋白ブロロツトの貴重な用途を開
発してきた。例えば次のようである。 ａ：蛋白−リガンド結合体の分析 DNA−蛋白及びRNA−蛋白相互作用が蛋白
ブロツトによつて分析されている。H3及びH4
を有するヒストンH2結合体もまた例証されて
いる。 表皮生長因子受容体が、移動膜パターンをホ
ルモンでオーバーレイすることによつて確認さ
れた。ヒト表皮状がん細胞（Ａ−431）からの
細胞膜を調製し、SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル上にランした、次いで該ゲルをDBMペーパ
ー上にエレクトロブロツトし、表皮生長因子に
続いて放射ラベル化抗体を用いて該ホルモンを
クエンチングし、オーバーレイした。150KD
における極めて特徴的なシグナルが検出され
た。 ｂ：酵素サブユニツトの検出 蛋白ブロツト上の不活性酵素の検出が行なわ
れた。例えば、ホスホジエステラーゼを２％
SDS中で５分間煮沸してSDS−ポリアクリルア
ミドゲル上にランした。蛋白は過剰のアンチ−
ホスホジエステラーゼと反応するニトロセル
ロースフイルター中にブロツトされた。次いで
該マトリツクスを活性酵素含有粗調合剤でイン
キユベーシヨンを行なつた。抗体の空席部位を
介して不活性化され、分割されたサブユニツト
に結合している活性酵素はこのマトリツクス上
に固定化された。次いでこのマトリツクスを酵
素活性のために反応させ、免疫複合体が検出さ
れた。 ｃ：モノスペシフイツク抗体の親和性的精製 ブロツト類はモノスペシフイツク
（monospecific）抗体の精製に利用されてい
る。ポリペプチドをSDS−ポリアミドゲル上に
分割し、DBM又はCNBrペーパー上にブロツ
トした。このマトリツクスを血清含有ポリクロ
ナール（polyclonal）抗体によつてオーバーレ
イした。次いで抗原−抗体複合体を含有する単
一バンドを該マトリツクスから切り取つたが、
該ストリツプを低PH（２〜３）緩衝液中でイン
キユベーシヨンしたところ、モノスペシフイツ
ク抗体が溶離した。該溶離プローベは免疫細胞
化学的病巣研究に使用することができた。 ｄ：セル−蛋白相互作用の例証 特定の全細胞−ポリペプチド相互作用を例証
するために蛋白ブロツトが使用されている。ヒ
トプラズマをSDS−ポリアクリルアミドゲル上
にランし、ニトロセルロースマトリツクスに移
した。該マトリツクスをクエンチングしたのち
に、通常のラツチじん臓細胞（NRKセル）で
インキユベーシヨンしたが、このNRKセルは
おそらくセルアタツチメント中に含まれる固定
化ポリペプチドに特異的に結合していた。この
細胞をアミノブラツクによつて染色したとこ
ろ、二つの明瞭に区別できるバンドに位置して
いることが判つた。これらのバンドはフイブロ
ネクチン及び新規発見の70K Dentityであるこ
とが判つた。 ［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は公知材料よりも一層利用価値が
あり、一層大きな吸着能力と一層良好な保持性を
有する新規固定マトリツクスを用いることにより
公知マトリツクスの有する上記のような種々の欠
点を解消して、高分子体を一層効率良く該新規固
定マトリツクスに移動させるトランスフアーが可
能であるような、そして公知の高分子ブロツテイ
ング製品よりも一層良好な能力と吸着力とを有す
る固定マトリツクス及びクロマトグラフ基質とし
ての高分子体ブロツテイング製品を提供すること
にある。 また本発明のその他の目的は電気泳動ゲルから
蛋白を固定マトリツクスに電気泳動的に移動させ
る方法の提供にあり、この固定マトリツクスは公
知のニトロセルロースよりも良好な吸着能力と保
持力とを有していて、緩衝液中に高い塩分濃度を
必要としないものである。 さらになお本発明の別の目的は、オーバーレイ
操作が効率的に実施できるような高分子ブロツテ
イング製品及びその方法を提供することにある。 ［課題を解決するための手段］］ これらの本発明の諸目的は固定マトリツクスと
して、膜の湿表面の実質的すべてに亘つて結合し
ている電荷修飾可能量のカチオン電荷修飾剤を有
する親水性ナイロンミクロポーラス膜から成る電
荷修飾ミクロポーラス膜を使用することによつて
達成できる。好ましくは、このカチオン電荷修飾
剤は分子量1000以上の水溶性有機高分子体であつ
て、これを構成する各単量体が膜表面に結合しう
るような少なくとも１個のエポキシ基と、及び少
なくとも１個の三級アミンもしくは第四級アンモ
ニウム基を有しているものである。最も好ましく
は、該有機高分子体のエポキシ基の一部が、少な
くとも１個の一級アミン基もしくは少なくとも２
個の二級アミノ基を有する脂肪族アミンから成る
か、又は少なくとも１個の二級アミノ基及びカル
ボキシルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂
肪族アミンから成る２次電荷修飾剤と結合してい
るものである。 該電荷修飾剤はまた、分子量500以下の脂肪族
ポリエポキシドから成る架橋剤を介して膜と結合
している脂肪族アミンもしくはポリアミンであつ
てもよい。 好ましいミクロポーラス膜はナイロンである。
該電荷修飾ミクロポーラス膜は強化ラミネート膜
の形態で使用してもよく、好ましくはナイロンミ
クロポーラス膜によつて含浸したポーラスな強化
ウエブの形態で使用しうる。 本発明の固定マトリツクスは、膜の湿表面の実
質的全部に亘つて結合しているカチオン電荷修飾
剤を電荷修飾に十分な量において保有しているナ
イロンミクロポーラス膜から成る親水性の電荷修
飾型ミクロポーラス膜から成る。ミクロポーラス
膜及びカチオン電荷修飾型膜は流体、例えば液体
の濾過の分野で公知である。流体濾過の分野にお
けるカチオン電荷修飾型ミクロポーラス膜、これ
らの作成方法及び用途についてはEPC公表第
0066814号公報及びEPC公表第0050864号公報に
記載がある。ここでは電子産業において用いられ
る高純度水（18megohm−cm抵抗率）の濾過用に
電荷修飾型膜を使用する記載；及び非経口液もし
くは体液の濾過用に電荷修飾型膜を使用する記載
がみられる。さらに、これらの濾過用膜は各種の
手段によつて強化しうることも公知である。 さらに、市販のナイロン製ミクロポーラスフイ
ルター膜類はPall Corp.、Glen Cove、NYから
「ULTIPORN66」及び「N66POSIDYNE」の商
標名で提供されており、後者はカチオン的に電荷
修飾したフイルター膜である。 さらに、AMF Inc.、Cuno Div.、ではカチオ
ン的に電荷修飾した型のナイロン製ミクロポーラ
スフイルター膜を「ZETAPOR」（商標名）とし
て発売している。 ここで用いる“ミクロポーラス膜”なる用語
は、好ましくは実質的に対象で等方性のポーラス
膜であつて、ポアサイズが少なくとも0.05ミクロ
ン又はそれ以上又はイニシヤルバブル点（IBP）
が水中で120psi（8.37Kg／cm2）以下のポアサイズ
を有するポーラス膜を意味する。このポアサイズ
は約1.2ミクロン以下、IBPとして約10psi（0.69
Kg／cm2）より大きくてもよい。“対象”なる用語
は、ポア構造が実質的に膜の両側で同じであるこ
とを意味する。“等方性”なる用語は膜が膜の全
般に亘つて均一なポア構造を有することを意味す
る。 膜は親水性であることが好ましい。ミクロポー
ラス膜を記載するための“親水性”なる用語は、
膜が水を吸収もしくは吸着することを意味する。
一般に、かかる親水性は充分な量の−OH基、−
COOH基、−NH2基及び／又は類似の官能基が膜
の表面上に存在する場合に生ずる。かかる官能基
は膜上への水の吸収及び／又は吸着を助長する。
固定マトリツクスのかかる親水性は本発明の必要
な一要素である。膜自体の親水性がこのミクロポ
ーラス膜への電荷修飾剤の好適な結合力を提供す
る。 好ましいミクロポーラス膜は「ナイロン」（商
標名）から作成したものである。“ナイロン”な
る用語はくり返えしのアミド基を含む共重合体及
び三元共重合体を包含するフイルム形成性ポリア
ミド樹脂を意味する。 一般に、各種のナイロン又はポリアミド樹脂類
はすべてジアミン及びジカルボキシル酸の共重合
体であるか、又はアミノ酸ラクタムのホモ重合体
であつて、その結晶性又は固体構造、融点ならび
に他の物理特性は広範に変わつている。本発明に
おいて用いられるのに適したナイロン製はヘキサ
メチレンジアミンとアジピン酸との共重合体（ナ
イロン66）、ヘキサメチレンジアミンとセバシン
酸との共重合体（ナイロン610）及びポリ−Ｏ−
カプロラクタムのホモ重合体（ナイロン６）であ
る。 一方、これらの好適なポリアミド樹脂はメチレ
ン（CH2）対アミド（NHCO）基の比が約５：
１ないし約８：１以内、さらに好ましくは約５：
１ないし約７：１の範囲のものである。ナイロン
６及びナイロン66はそれぞれ６：１の比率、ナイ
ロン610は８：１の比率である。 ナイロン重合体の銘柄は多数の入手可能であつ
て、分子量でいえば約15000〜約42000の範囲があ
り、他の諸特性も各種のものが市販されている。
重合体鎖を構成する単位の種類として最も好まし
いものはポリヘキサメチレンアジパミド、すなわ
ちナイロン66であり、分子量は約30000以上が好
ましい。添加剤を含まない重合体が一般的には好
ましいが、酸化防止剤又は類似の添加剤の添加は
ある環境の下では好ましい。 好適な膜基質は米国特許第3876738号公報に記
載の方法で作成される。他の作成方法はヨーロツ
パ特許出願第0005536号に記載されている。 さらに、例えばPall Corp.から提供の
「ULTIPORN66」（ナイロン、商標名）、
Millipore社から市販の「Durapore」（ポリビニ
リデンフルオライド、商標名）、諸社から市販の
セルロースアセテート／ナイトレート膜のいかな
るものでも本発明で使用するためのカチオン電荷
修飾用に適している。 前記米国特許及びヨーロツパ特許出願に記載の
ナイロン膜は等方性構造を有するのが特徴であつ
て、高度に有効な表面積と、狭いポアサイズ分布
及び適切なポア容積をもつた制御された大きさの
ポアから成る微細な内部ミクロ構造を有してい
る。例えば、代表的な0.22ミクロメータのナイロ
ン66膜（ポリヘキサメチレンアジパミド）は約45
〜50spi（３〜3.5Kg／cm2）のIBPを示し、5spi（0.35
Kg／cm2）（47mm直径デイスク）において70〜80
ml／分の水流速を提供し、表面積（BET、窒素
吸着）は約13m2／ｇであつて、膜厚は約4.5〜
4.75ミル（114〜120μ）である。 電荷修飾剤はミクロポーラス膜の実質的にすべ
ての湿表面に亘つて結合している。“結合”なる
用語は、電荷修飾剤（類）が膜及び／又は相互に
十分に結びついて、使用条件下では多量には抽出
されないような状態にあることを意味する。“湿
表面の実質的すべて”なる用語は、外側面及び内
部ポア表面のすべてが、膜をくぐつて流れる流体
によるか又は膜が流体中に浸漬される場合に湿さ
れることを意味する。 本発明に使用できる一つの好適な電荷修飾剤は
Ostericherらに記載があり、これら分子量が約
1000以上の水溶性有機高分子体であつて、この単
量体構造中には膜表面に結合しうるような少なく
とも１個のエポキシド置換基及びカチオン電荷サ
イトを提供しうるような少なくとも１個の三級も
しくは第四級アンモニウム基が存在している。こ
の電荷修飾剤はポリアミド−ポリアミンエピクロ
ロヒドリン型カチオン樹脂、特に次に列挙する米
国特許公報中に記載の樹脂であることが好まし
い： 米国特許第2926116号公報 米国特許第2926154号公報 米国特許第3224986号公報 米国特許第3311594号公報 米国特許第3332901号公報 米国特許第3382096号公報 米国特許第3761350号公報 このポリアミド−ポリアミンエピクロロヒドリ
ン型カチオン樹脂は「Polycup172、1884、2002
又はS2064」（Hercules社商標名）；Cascamide
Resin ｐ Ｒ−420」（Borden社商標名）；又は
「Nopcobond35」（Nopco社商標名）として市販
されている。最適なものは「Hercules R4308」
（商標名）であつて、ここでは荷電窒素原子が異
節環基の一部を形成していてメチレン部位を介し
て反応性エポキシ基を結合している。 「R4308」樹脂を構成する各単量体は次の一般
式 を有している。 一方、「Polycup172、2002」及び
「Polycup1884」樹脂を構成する各単位量体は次
の一般式 〔式中、Ｒはメチル又は水素である
（Polycup172及び2002ではＲ＝Ｈ；Polycup1884
ではＲ＝CH3〕 を有している。 最も好ましくは、分子量1000以上の水溶性有機
高分子体を電荷修飾剤として用いる場合に、この
１次電荷修飾剤のカチオン電荷を強化するか並び
に／又はこの１次電荷修飾剤のミクロポーラス表
面及び／又はそれ自体に対する結合力を強化する
ための２次電荷修飾剤を使用することである。 本発明に用いられるこの２次電荷修飾剤は次の
ものから成る群から選択される； (i) 少なくとも１個の１級アミン又は少なくとも
２個の２級アミン部位を有する脂肪族アミン
類；及び (ii) 少なくとも１個の２級アミン及びカルボキシ
ルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂肪族
アミン類。好ましくは、この２次電荷修飾剤は
次の一般式 〔式中、R1およびR2は炭素数１〜４のアルキ
ル基、ｘは０〜４の整数である。R1及びR2は
両方ともエチルであることが好ましい。〕 で示されるポリアミンである。 好適なポリアミンは次のようである： エチレンジアミン H2N−（CH2）2−NH2 ジエチレントリアミン H2N−（CH2）2−NH−（CH2）2−NH2 トリエチレンテトラミン H2N−（CH2−CH2−NH）2−CH2−CH2−NH2 テトラエチレンペンタミン H2N−（CH2−CH2−NH）3−CH2−CH2−NH2 最も好ましいポリアミンはテトラエチレンペン
タミンである。 代わりに、本発明で用いる脂肪族アミン類は少
なくとも１個の２級アミン部位及び１個のカルボ
キシルもしくはヒドロキシル置換基を有していて
もよい。かかる脂肪族アミンの例としてはγ−ア
ミノ酪酸（H2NCH2CH2CH2COOH）及び２−
アミノエタノール（H2NCH2CH2OH）が挙げら
れる。 この２次電荷修飾剤は高分子１次電荷修飾剤の
エポキシ置換基の一部分に結合することによつて
ミクロポーラス膜と結合される。 使用する１次及び２次カチオン電荷修飾剤の量
はミクロポーラス膜の陽性捕獲ポテンシヤルを強
化するのに十分な量である。かかる量は使用し
た、そのときの電荷修飾剤の種類に大いに依存性
がある。 広義には、前記１次及び２次のカチオン電荷修
飾剤は親水性ナイロンミクロポーラス膜に結合さ
れるものであつて、エポキシ置換基を介して膜構
造に結合する１次カチオン電荷修飾剤の有効量を
該膜に施工することによつて結合される。好まし
くは、該方法は(a)膜を１次カチオン電荷修飾剤の
水溶液と接触させ、かつ(b)膜を２次電荷修飾剤の
水溶液と接触させる。接触工程は次の順序、すな
わち工程(a)に続く工程(b)もしくはその逆である。
しかし、まず膜を１次カチオン電荷修飾剤と接触
させ、次いで２次電荷修飾剤と接触させることの
ほうが、抽出可能分が最小になり、最良の結果が
得られる。 本発明の他の実施態様では、前記２次電荷修飾
剤を電荷修飾剤として用いて分子量500以下の脂
肪族ポリエポキシド架橋剤を介して、このミクロ
ポーラス膜にそれが結合するようになされてもよ
い。好ましくは、このポリエポキシドは分子量約
146〜約300のジ−もしくはトリ−エポキシドであ
る。かかるポリエポキシドは25℃において約200
センチポイズ以下の粘度（未希釈時）を示す。架
橋剤として作用させる目的からみて、このエポキ
シドは、モノエポキシド類、例えばグリシジルエ
ーテル類のようなものは不適当である。同様に、
三つ以上のエポキシ基を提供するようなポリエポ
キシドはなんらの利益がなく、実際のところ、立
体障害に起因してこのポリエポキシドのカツプリ
ング反応が制約されることは理論的に明らかであ
る。さらに、カチオン的に電荷修飾したミクロポ
ーラス膜中に未反応エポキシド基が存在すると最
終製品に悪影響を与えるおそれがある。 最も好適なポリエポキシド類は次式 〔式中、Ｒは炭素原子１〜６のアルキルであり、
ｎは２〜３である〕 にて示されるものである。非エポキシ部分…
（Ｒ）…中の炭素原子数は６以下であり、したが
つて該ポリエポキシドは水もしくはエタノール・
水混合液、例えば20％エタノール以下の混合液に
可溶である。これらより炭素類の多いものは機能
的には有用ではあるが、使用に際して極性溶媒を
用いる必要があり毒性、引火性、環境汚染性の観
点から注意が必要になる。 この脂肪族アミノポリアミン電荷修飾剤は(a)こ
のカチオン電荷修飾剤の水溶液を膜と接触させ、
かつ(b)ポリエポキシド架橋剤の水溶液を膜と接触
させることによつてミクロポーラス膜と結合させ
る。接触工程は工程(a)に続く工程(b)もしくはこの
逆でありうる。かかる接触工程はまた、膜を電荷
修飾剤とポリエポキシド架橋剤との混合物の水溶
液と接触させる方法を包含する。しかし、膜をカ
チオン電荷修飾剤と接触させてから、次いで処理
膜をポリエポキシド架橋剤水溶液と接触させた時
のほうがフラツシユアウト時間を最小にしうる観
点から最も好ましい。しかし電荷修飾を最大にす
るには、膜を電荷修飾剤とポリエポキシド架橋剤
との混合物の水溶液にて接触させるのがよい。 このミクロポーラス膜をこの水溶液と接触させ
たのち、次いで収縮防止のために緊張状態で乾
燥・架橋するのがよい。 緊張状態下で膜を乾燥することは米国特許出願
第201086号に記載されている。一般的に、どのよ
うな緊張手段を用いてもよく、例えば膜をしつか
りドラムのような乾燥表面に沿つて巻いてもよ
い。２軸制御が好ましく、ひろげたフレーム中に
膜を引つ張るのが最もよい。負荷した緊張は大き
さを減少させないことが好ましい。 最終的乾燥及び架橋温度は約120℃〜140℃で行
なうことがよく、この温度では膜が劣化したり、
もろくならずに乾燥時間を最小限になしうる。 仕上がつた膜はロール巻きして常温下で貯蔵す
る。 この電荷修飾ミクロポーラス膜はまた、強化型
及び／又はラミネート型膜として使用することが
可能であり、好ましくは実質的にカチオン的に荷
電したナイロンミクロポーラス膜で一つのポーラ
スな強化ウエブを含浸させた形で使用できる。強
化ラミネート膜及びポーラスな強化ウエブについ
ては米国特許第332068号に記載がある。このよう
な含浸ウエブは十分な量の鋳込み液をポーラスな
強化ウエブ上に鋳込んでその上に鋳込み液を保持
したウエブを作つてからクエンチ液と接触させて
作るのがよい。 この強化ウエブは、鋳込みの間に鋳込み液の含
浸が最大になるように、鋳込み液によつて湿潤さ
れ、かつ高分子膜、例えば「ナイロン」の沈澱に
際してウエブに強固に接着するようになるような
多孔性材料から成る。しかし、このウエブは鋳込
み液で湿潤されうるということは、必須条件では
ない。非湿潤性ウエブである場合には、この鋳込
み液の塗膜はウエブのほとんど表面だけに限定は
されるが、しかしそれにもかかわらず、ウエブ中
への溶液の含浸及びウエブに対する膜の粘着性に
よつて膜に付着している。 例えば、かかる湿潤性及び非湿潤性強化ウエブ
は、押出しプラスチツクフイラメントネツト、ペ
ーパー及び類似の材料が包含される各種タイプの
不織布並びにネツト類から作りうる。鋳込み液に
は非湿潤性の強化ウエブは、ポリプロピレンもし
くはポリエチレンのような繊維から作られた微細
穴性不織ウエブから成ることができる。好適な湿
潤性強化ウエブのなかには、モノフイラメントも
しくはマルチフイラメントヤーンを用いた織布ウ
エブもしくは不織布ウエブから成るポリエステル
製のものがあり、この際のモノフイラメントはオ
ープンストラクチヤーであつて圧力損失の低いも
のが好ましい；ポリアミド繊維織布ウエブ、芳香
族ポリアミドやセルロース、再生セルロース、セ
ルロースエステル、セルロースエーテル、ガラス
繊維その他のような他の比較的極性のある繊維状
製品から成る織布及び不織布ウエブなどが包含さ
れる。セルロースや合成繊維フイルターペーパー
もまた、強化ウエブ並びに穴あきプラスチツクシ
ート及びオープンメツシユエキスパンドプラスチ
ツクとして使用しうる。基質が比較的あら目で著
しくオープン編み構造の場合には、たとえ繊維が
実質的に樹脂液によつて湿潤されなくても、この
基質は膜材料によつて含浸されうるのである。ポ
リプロピレンやポリエステルのような非湿潤性材
料は、これらが十分にオープン構造をとつていれ
ば、膜によつて含浸されうるのである。 含浸強化ウエブ作成のための好ましい態様は、
ポーラスな強化ウエブ上に十分量の鋳込み液を鋳
込んで、その上に鋳込み液を保有しているウエブ
を作成する。次いでウエブ中にこの塗布液が滲透
するのを助けるために液の粘度を十分に低下さ
せ、かつ形成される塗布ウエブ中のすべての連行
空気を排除するために有効な温度、圧力及び時間
の条件下でウエブ中に該塗布液をカレンダーロー
ルによつて滲透させる。かかる温度、圧力及び時
間条件は使用する強化ウエブ、鋳込み液ローラー
等のタイプに大きく依存する。かかる諸条件はウ
エブ中への液の滲透具合、最終品中のピンホール
及びバブルを観察することによつて、当業者であ
れば容易に決定することができる。次いで該塗布
ウエブを、その上に十分量の鋳込み液を鋳込み処
理して追加の塗布液を保有する塗布済みウエブを
形成させる。次いでこのウエブをクエンチ浴中で
クエンチングして含浸ウエブを形成させ、次いで
このウエブに外側膜をラミネートする。 この強化膜を作成したのち、この発明に用いる
カチオン電荷修飾ミクロポーラス膜を形成させる
ために前記した方法に従つてこれを処理すること
ができる。 このカチオン的に電荷修飾したミクロポーラス
膜は従来、ニトロセルロースやDBMペーパーが
用いられてきたと同じ態様で高分子ブロツテイン
グにおける固定マトリツクスとして使用される。
しかし、本発明の電荷修飾ミクロポーラス膜は従
来の固定マトリツクス類よりもはるかに大きな能
力を有する。例えば、本発明の電荷修飾ミクロポ
ーラス膜は少なくとも480μｇ／cm2の蛋白結合能
力を有しているが、ニトロセルロースのそれは約
80μｇ／cm2にすぎない。また本発明における固定
マトリツクスでは、ニトロセルロース使用の際に
一般的であつたような移動緩衝液中のメタノール
の使用は必須条件ではない。そのうえ、DNAに
関連して使用されるニトロセルロース固定マトリ
ツクスは緩衝液中に高濃度の塩分が必要とされる
結果、５アンペアまでの高電流が必要であつて、
この際の発熱がDNAに悪影響を与える。本発明
の電荷修飾ミクロポーラス膜を用いる際には高い
塩分濃度は必要とされず、したがつてミリアンペ
ア程度の電気泳動分析が可能である。 移動した電気泳動グラムのオーバーレイは従来
の他の固定マトリツクスにおいてなされてきたと
同じように本発明の固定マトリツクスでも実施す
ることが可能である。他のマトリツクス同様に、
このマトリツクス上に残留する潜在結合サイトは
クエンチングすることによつて非特定のバツクグ
ラウンドを最少にするようにしなければならな
い。本発明で使用する電荷修飾ミクロポーラス膜
は蛋白に対する高い親和性があるために、通常の
クエンチング方法だけでは十分ではない。本発明
の電荷修飾ミクロポーラス膜はリン酸塩緩衝塩水
（PBS）中の10％ウシ脳血清（BSA）中で一昼
夜、45〜50℃にてインキユーベーシヨン処理すれ
ば効果的にクエンチングすることが可能であるこ
とが判つた。ヘモグロビン（45〜50℃、PBS中
１％）もまたクエンチングに有効であることが判
明した。 この発明はクロマトグラフ基質からマトリツク
スへの電気泳動的移動に関連して使用すると特に
効果があるが、またクロマトグラフ基質からマト
リツクスへの高分子体の溶離に対する起動力とし
ての液の物質移動のような、運搬による移動及び
拡散による移動のようなブロツテイング技術にも
また適用される。 この発明によれば、カチオン的に電荷修飾した
該膜は単にポリアクリルアミドもしくはアガロー
ス（agarose）ゲルに由来する高分子体に対する
固定マトリツクスとして使用できるだけでなく、
また薄層クロマトグラフイーもしくは高電圧ペー
パー電気泳動の生成物のような他のクロマトグラ
フ物質や又は直接にスポツテイングを固相分析に
用いられる高分子体類を含有する溶液類に由来す
る高分子体に対する固定マトリツクスとしても使
用することができる。 次に実施例によつて本発明を詳述するが、本発
明はこれらの実施例のみに限定されるものではな
い。 実施例 Ａ ミクロポーラス膜の作成 ノミナル表面積約13m2／ｇ、イニシヤルバブ
ル点約47psi（3.3Kg／cm2）、及びFoam−All−
Over−Pintが約52psi（3.6Kg／cm2）を示すノミ
ナルレート0.22ミクロメータの代表的ナイロン
66（商標名）膜を米国特許第3876738号公報に記
載の方法に従つて、ナイロン66（商標名、
Monsanto Vydyne 66B）16重量％、メタノー
ル7.1重量％及びギ酸76.9重量％からのドープ
組成、メタノール25容量％、水75容量％のクエ
ンチ浴組成（必要に応じて米国特許第3928517
号公報記載の方法により再生）を用いて鋳込み
速度61cm／分、クエンチ浴温20℃において作成
した。浴中で回転する鋳込みドラムに塗布する
ことによつてクエンチ浴液面の直下で膜を鋳込
んでから塗布地点から約90゜の弧を描くように
ドラムからはく離した。この膜は取り上げると
浅い懸垂線状をなす自立状の膜であつた。この
均一不透明なフイルムの一部分を80〜90℃の空
気オーブン中で強制対流中で30分間、収縮に抗
するため押えつけた状態で乾燥した。 Ｂ 電荷修飾ミクロポーラス膜の作成 １ 膜試料（乾燥試料及び未乾燥試料）をポリ
アミド−ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂
（商標名、Herules1884）の４重量％固形分
溶液中に浸漬し、次いで吸収平衡に達せしめ
た。過剰樹脂を除くために処理膜試料を洗浄
し、次いでドラム上にて押えつけながら11
℃、約３分間乾燥した。 処理膜試料について次のようにフロー及び
バブル点特性を比較したが、処理及び未処理
試料について完全に同一であることが分か
り、ポア及び表面配列が維持されているのが
分つた。結果を第表に示した。 【表】 【表】 FAOP（Foam−All−Over−Point）は
ASTM Ｄ−2499−66Tに従つてIBP（Initial
Bubble Point）を決め、次いで空気が湿潤
膜試料を通して流れるまで空気圧を高め、調
節器と試料保持器間に配置されたフローメー
タで読み取つて100c.c.／minになるようにし
た。FAOPは試料膜の平均ポア直径に直接比
例する。 機械的シーブを制御する形態構造的及び液
体力学的パラメータに関し、処理膜の前記特
性が本質的に未処理ナイロン膜の特性と一致
していることが第表から分かる。 ２ 同様に作成した他の膜試料に対して同様な
特性値を比較したが、ここでは「Hercules
R4308」樹脂（商標名、ジアリル、窒素含有
化合物を基本体とする遊離ラジカル重合樹脂
であつてエピクロロヒドリンと反応させたも
の）を固形分として２重量％含むPH10.5の浴
中で処理し、さらに0.1重量％のテトラエチ
レンペンタミンで上塗りし、乾燥、架橋、水
洗い及び再乾燥した。結果を第表に示す。 【表】 処理及び未処理試料膜の表面積は本質的に
不変であつた；引張り強さは処理したものが
増加しているが、伸びは若干減少していた。
処理したシートは柔軟性が向上した；未処理
シートを折り曲げるとひび割れを起こし、か
つ引き裂けた。 実施例 実施例Ａで作つた湿潤ミクロポーラス膜２層
を一諸にラミネートし、湿気20〜25％になるよう
に乾燥した。このように湿潤し、膨潤条件下にあ
る膜は完全乾燥した膜より、さらに効果的に電荷
修飾剤を吸収することが判明した。 次いでこの２層膜を「Hercules R4308〕（商標
名）樹脂の1.25重量％溶液中に入れた。浴のPHは
10.5であつた。 当該浴は「Hercules R4308」樹脂17.17Kgを初
期の20重量％から５重量％に希釈することによつ
て調製した。次いで5N−NaOHを添加してPHを
10.5に上げた。次いでこの溶液を150000ohm−cm
抵抗以上を有するD.I.水で容量比2.5：１に希釈し
た。浴溶液の全容量は60ガロン（227L）であつ
た。 膜は水平から30゜の角度で「Hercules R4308」
の浴中に入れて、電荷修飾剤が膜中に浸透するの
をさまたげるようなバブルが膜中に包含されるの
を防いだ。この浴中で膜を76.2cm／minの速度で
121.9cm長さに亘つて処理した。 浴から取り出し、余分の水を除くために底部面
を拭きとつた。 膜を２次的電荷修飾剤浴中に導入する前に、冷
空気流中で３分間ソーキングした。 該浴は、D.I.水（少くとも150000ohm−cm抵
抗）227L中に0.0513Kgのテトラエチレンペンタミ
ンを加えることによつて調製した。PHは約９であ
つた。浸漬条件は１次電荷修飾剤の浴と同一であ
つた。次いで膜を取り上げロールの周りに巻き付
けた。湿潤膜を有する取り上げロールは少なくと
も３時間貯蔵した。次いで該ロールを121℃で３
分間、乾燥して電荷修飾剤の反応を完結させた。
次いで膜を洗い、抽出レベルをチエツクした。 実施例 実施例Ａに従つて作成したミクロポーラス
「ナイロン」（商標名）膜を「Hercules R4308」
１次電荷修飾剤（NaOHにてPHを10に調整）に
て処理し、さらにポリアミン２次電荷修飾剤にて
処理した。 第表に示すとおり、それぞれの膜のフロー特
性間にはほとんど又は全然差異がみられなかつ
た。 【表】 実施例 異なつた電荷１次修飾剤、特にポリアミド・ポ
リアミンエピクロロヒドリン樹脂候補の性能を比
較し、かつ塗布レベルとPHの最適化を行なうため
に「Hercules resins R4308」「Polycup172」（PH
4.7にて市販）及び「Polycup2002」（固形分27重
量％、PH3.0にて市販）（以上いずれも商標名）を
用いて次の試験を行なつた。結果を第表に示
す。 【表】 実施例 実施例Ａに従つて作成した「ナイロン」（商
標名）製ミクロポーラス膜であつて洗浄し、引張
つて乾燥した膜を、18megohm−cmD.I.水・高純
度エタノールの80：20混合物（PHは6.1〜6.4）を
用いて調製した１，４−ブタンジオールジグリシ
ダールエーテル溶液（固形分２重量％）中に浸漬
した。溶液から膜を引き上げ、約１分間ドレンし
た。次いで18megohm−cmD.I.水にて調製し、PH
11.2〜11.4を示すテトラエチレンペンタミン溶液
（固形分0.5重量％）中に浸漬した。膜を引き上
げ、約１分間ドレンしたのちに拡げ乍ら130℃で
５分間、乾燥した。 実施例 「ナイロン66」（商標名）16重量％、ギ酸78.04
重量％及びメタノール5.96重量％から成る鋳込み
溶液を用いてスパンボンドを行なつた
「Reemay2550 Polyester」（duPont
Corporationの商標名）から成る補強ウエブを用
いて、見掛ポアサイズ約0.65ミクロンのミクロポ
ーラス膜を有するナイロン含浸ウエブを作成し
た。このミクロポーラス膜の第１側面を、この含
浸ウエブと接触させて２層の接合部にソーキング
湿潤接触ラインを形成させ、同様にして含浸ウエ
ブの反対側面上にミクロポーラス膜の第２側面を
配置した。この３層ラミネート膜を、ラミネート
膜の両サイド上にある端縁押えつけベルトを具備
した「Teflon」（商標名）被覆鋼製ドラム上で乾
燥した。該ドラムには周囲に亘つて間隔を置いて
赤外線加熱器が配設されていた。その後、この補
強ラミネートをカチオン電荷修飾剤で実施例Ｂ
に従つて処理した。 実施例 Ａ 材料及び方法 蛋白試料の調製： 赤血球ゴーストをFairbanks、G.、Steck、
T.L.及びWallach、D.F.H.の〔（1971）、
Biochemistry 10：2606〜2617〕に準拠して麻
酔CD1マイスの心臓パンクチヤー（puncture）
上の肋膜キヤビテイ中に蓄積した血液から調製
した。 DeCamilli、P.、Ueda、T.、Bloom、F.E.、
Battenerg、E.、及びGreengard、P.（1979）
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.：76、5977〜5981
に記載の方法に従つてウシの脳皮膚ホモゲネー
トを調製した。蛋白スタンダード、蛋白Ａ及び
concanavalin Ａの放射性ヨウ素化はFraker、
P.J.、及びSpeck、J.C.（1978）〔Biochem.
Biophys、Res.Commun.：80、849〜857に記
載の方法に従つて、１，３，４，６−テトラク
ロロ−3a，6a−ジフエニルグリコールウリル
から調製したが、ただし蛋白はPBS（１mg／
ml）中に溶解した。５−mlバイオゲルＰ−２
（Bio−Gel、商品名）もしくは0.4−mlAG−１
−X8カラム上のいずれかの125I−ラベル化蛋白
からの遊離の125Iが分離された。特殊な活性が
106〜107cpm ug-1蛋白から常時、得られた。 ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析： （最終濃度として）２％（ｗ／ｖ）SDS、２
％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、10％
（ｖ／ｖ）グリセロール、0.1（ｗ／ｖ）ブロム
フエノールブルー、及び100ｍＭトリス−HCl
を含むPH6.8を示す緩衝液で安定化した。試料
を該混合物中に３分間煮沸し、次いで
Laemmli'sシステム〔Laemmli、U.K.（1970）
Nature（London）：227、680〜685〕を用いて
10％ポリアクリルアミドスラブゲル上に解像
（resolving）した。 電気泳動移動： 電気泳動を完了した後、このゲル（又はその
一部分）をScotch−Brite湿潤パツド上に置
き、その表面を冷たい（８〜10℃）移動（トラ
ンスフアー）緩衝液（15.6ｍＭトリス−120ｍ
Ｍグリシン、PH8.3、20％（ｖ／ｖ）メタノー
ルを含有するか又は含有せず）でリンスした。
PH8.3のトリス（41ｍＭ）−ホウ酸（40ｍＭ）緩
衝液もまた試験した。これら２種の緩衝システ
ム間ではなんらの差異も認められなかつた。次
いで実施例のカチオン電荷修飾ミクロポーラ
ス膜（以下CMMMと称する）又はニトロセル
ローズ（以下両方を一般的に固定マトリツクス
“IM”と称す）を移動緩衝液上に浮かべて湿潤
させゲル上に置いて、IM内部もしくは後者と
ゲル間になんらの空気泡が連行されていないこ
とを確認した。次いでこのIMをScotch−Brite
第２パツドでカバーした。Scotch−Briteパツ
ド群によつて分けられた一群のこれらのゲル−
IM集合体は同時移動用として連続的に配設す
ることができる。この集合体をプラスチツク製
グリツド間に置き、次いで該グリツドを41冷移
動緩衝液を内蔵する「Plexiglas」（商標名）製
タンク中に…アノードに向つたIM…でぴつた
りと挿入した。Anal.Biochem.（1980）：102、
459〜471に記載のものと類似の配列をなす白金
電極をタンクの広い側壁に固定した。アノード
とカソード間隔は８−cmであり、電気泳動移動
間に生じた電界は平均化しているように観察さ
れた。移動操作間中、塩類として変化した緩衝
組成物ゲルから溶離され、かくして電圧を一定
に保つと電流は増加した。標準的入力を使用
（Buchler Model ３−1500）したので、一定
の電流（200ｍＡ）で移動させ電圧を徐々に減
少させやることが、もつと実際的であるという
ことが時々観察されて分かつた。典型的な２時
間の移動では、電圧は例えば42から30ボルトに
降下した。この電圧降下は移動緩衝液とゲルと
の間の優先的平衡維持によつて回避されうるも
のである。この方法はまた、移動中のゲルの膨
潤を回避でき、この膨潤はアクリルアミド濃度
が≧10％の場合には常に存在するのである。
IMsは移動後直ちに用いることもでき、又は乾
燥してWhatman 3MMクロマトグラフイーペ
ーパーのシート間に保存して用いることもでき
る。125I−ラベル化蛋白の移動が定量化された
実験では、ゲル及びIMsの両方性、Kodak
XAR−５及びDuPont Cronex Lightning
Plus強化スクリーン（−70℃での）を使用して
ポスト移動（post−transfer）をオートラジオ
グラフイーにより測定した。この放射バンドは
ゲル及びIMsから励発され、Beckman
Biogman カウンタにより検知された。 抗体及びレクチンによるトランスフアー処
理： 不特定バツクグラウンド結合を排除するため
に、IMsはクエンチングしなければならない。
ニトロセルロースの場合では、２％（ｗ／ｖ）
BSAか、又は１％（ｗ／ｖ）ヘモグロビンの
いずれかを含む10ｍMPBS（PH7.4）中で１時
間、室温においてこのフイルターを培養すれば
充分である。CMMMのインキユベーシヨンに
は10％BSA又は１％ヘモグロビンのいずれか
を内蔵するリン酸塩緩衝液（PBS）中で45〜
50℃、12時間CMMM、IMsを培養すればクエ
ンチングとしては充分であることが判つた。ク
エンチ済みのIMsは、２％BSA又は１％ヘモ
グロビンのいずれかを含有するPBS中で適切
なリガンド（例えば抗体、蛋白Ａ、レクチン）
と室温で１時間、反応させ、次いで50〜100ml
PBSで少なくとも５回洗浄した。上記操作
に用いたすべての溶液はナトリウムアジド
（0.05％ｗ／ｖ）を含有していた。洗浄済み
IMsは前記のように−70℃でオートラジオグラ
フイーにかけた。 Ｂ 結果 １ IMsへの高分子体の結合 (a) IMSへの125I−ラベル化BSAの吸着を比
較するために接合試験を行なつた。四角な
IM材料を１時間、種々の濃度の125I−ラベ
ル化BSA（0.01〜５％ｗ／ｖ、PBS中）溶
液中でインキユベーシヨンした。 培養媒体から成る各試料中には等しいト
レーサ量（177000±6100cpm・ml-1；推定
量180ng・ml-1）の125I−ラベル化BSAが
含まれていた。インキユベーシヨン後に、
このIMsを５mlPBSで５回洗浄してカウン
トした。カウント数は結合BSA（ug・cm
-2）に変換した。 BSAが結合するCMMMの能力はニトロ
セルローズの能力を常に越えていた。この
ことはBSAの高濃度が使用された時には
特に顕著であつて、例えば５％BSAでは
IMsは480ug・cm-2に対してセルローズは
80ug・cm-2であつた。このことは第１図に
示したが、ここでCMMMは●（黒丸）
で、またニトロセルローズは〇（白丸）で
表示した。 (b) １cm2のCMMM、ニトロセルローズ、未
修飾ナイロン及び実施例の膜をヘモグロ
ビン（PBS中０〜５％）又はBSA（PBS中
０〜10％）の各種濃度においてインキユベ
ーシヨンした。各フイルター１mlを培養
し、回転（2h RT゜c）した。次いで125I−
ラベル化蛋白混合物の50μをそれぞれの
ウエル（well）中に添加した〔501＝
5000cpm IgA；5000cpm Calmodulin；
5000cpm BSA〕。このようにしてフイル
ターを25℃、１時間、インキユベーシヨン
してから１mlPBSにて５回洗浄してカウ
ントした。バツクグラウンド（85cpm）を
結果から差し引き、第１ａ図（BSA）及
び１ｂ図（ヘモグロビン）に示した。例え
ば１％BSAにおいては放射性結合蛋白の
シグナルは、ニトロセルロースCMMM、
未修飾ナイロン及び実施例の膜が用いら
れた場合に98％、48％、94％及び77％だけ
それぞれ減少した。次いでクエンチしない
IMsを約２時間、１％「Trition Ｘ−100」
（商標名、非イオン性界面活性剤）中で洗
浄し、どの程度の量の放射性蛋白が除去さ
れるかを測定した。その結果、CMMMか
らは40％が、実施例のIMからは約80％
が、未修飾膜からは92％が、またニトロセ
ルローズからは92％が除去されていること
が判明した。これらの結果は蛋白とIMsと
の相互作用に対して電荷修飾が寄与するこ
とが明示している。 (c) IMsの２cm2四角４個を使用して
50000cpmの〔32P〕にてラベル化して（in
vitro）転写したヒトβ−グロビンmRNA
〔Nucleic Acid Research、10：5429
（1982）〕を使用してハン点実験を行なつ
た。次いで洗浄中のカウントがバツクグラ
ウンドに達するまでPBSにて洗浄した。
次いでフイルターに結合しているラベル化
mRNAの量を測定した。市販のニトロセ
ルロース及びセルロースアセテートの四角
物は100cpm以下の結合量であつたが、２
個のCMMM（多孔度がそれぞれ0.45及び
0.2）では約30000cpmの結合量であつた。 ２ ゲルからフイルターへの蛋白の電気泳動的
移動 Towbinらが記載したと類似の緩衝条件
（すなわち15.6ｍＭトリス、120ｍＭグリシ
ン、20％（ｖ／ｖ）メタノール、PH8.3）を
用いて、125I−ラベル化BSA（〜200ng）の電
気泳動法による移動（30V、１時間）をIMs
について試験した。緩衝液からメタノールを
省略したところ、CMMM及びニトロセルロ
ースのそれぞれの場合において溶離がロード
の30％〜＞60％及び〜50％にそれぞれ増加し
た。しかしながらメタノールが存在しない場
合には、CMMM及びニトロセルロース使用
のそれぞれに対応して溶離が30〜＞60％増加
した。しかしメタノール不在の場合には125I
−ラベル化BSAは少なくとも５層のニトロ
セルロース（この表面にロードの15〜８％の
減少量が検出された）を通過した；しかるに
大部分の125I−ラベル化BSA（ロードの＞60
％）は最初のCMMMフイルター上に残留し
ていて、連続している各フイルター上には＜
１％が検出された。他のプロテインスタンダ
ード（Phosphorylase ｂ、fertin、
ovalbumin、carbonic anhydrase、及び
soybean trypsin inhibitor）についても同
様な結果が得られた。メタノール不在下で行
なつた125I−ラベル化BSAの移動に関する代
表的な結果を第２〜４図に示した。 第２図は種々の変量の125I−ラベル化BSA
のCMMM又はニトロセルロースへの移動を
定量化した結果を示す。125I−ラベルBSAの
濃度を４種類増加（150、300、514および
1400ngの見積り）させて10％SDS−ポリア
クリルアミドゲル上でランした。電気泳動
後、レーンの１シリーズを連続した八つの
CMMM層（●、■、▲）に移動し、かつそ
の他はニトロセルロースの連続した10個の層
（〇、□、△）に移動した。移動完了後（一
定の32V、メタノールなし、PH8.3、トリス
−ホウ酸で２時間）、このゲル類及びIMsを
カウントした。各ゲルレーン（〇、●）から
溶離したBSA量は対応するゲルポスト−ト
ランスフアーに残留している放射活性とロー
ドした放射活性間の差として算出した。未カ
ウントBSA（△、▲）は各ゲルから溶離した
放射活性と対応するCMMM又はニトロセル
ロースフイルター（□、■）上に回収された
放射活性間の差として算出した。 第３図は使用した最高ロードのBSA
（1400ng）から、八つのCMMMフイルター
（●）上への、又は10個のニトロセルロース
フイルター（〇）上への125I−ラベル化BSA
を示してある。矢印１は八つのCMMM層上
へ回収された全量を示す。矢印２はニトロセ
ルロース10層上に回収された全量を示す。 第４図は最初のCMMMフイルター、最初
のニトロセルロースフイルター及び10枚の連
続ニトロセルロース層上に回収されたBSA
の比較である。第２図に示した実験で得られ
た結果は、それぞれのBSA濃度に対して、
CMMMの全８層上に回収されたBSA量にノ
ルマライズした。該値は100％回収とした。
BSAの３種のより低濃度に対しては、最初
のCMMM層（ストリツプバー）はニトロセ
ルロース（ハツチバー）の全10層と同程度も
しくはそれ以上を吸収した。いずれの場合で
も最初のCMMM層上に回収されたBSA量は
最初のニトロセルロースフイルター（ストリ
ツプバー）上に回収されたものより著しく大
きかつた（４倍）。 第２，３及び４図は、(i)CMMMの１層又
は２層が用いられた場合にはゲル上にロード
した蛋白の80％以上をカウントすることがで
きることを示す（第２図及び第３図）；(ii)IM
結合BSAの80％（低ロード）ないし50％
（高ロード）がCMMMの最初の層上に回収
されたことを示す（第４図）；及び(iii)
CMMMの３層以上を使用しても回収率の改
善はみられなかつた（第３図）ことを示す。
ニトロセルロース10層を使用しても同様の結
果は得られなかつた（第２〜第４図）。ニト
ロセルロースを用いた場合には未カウント
125I−ラベル化BSA（おそらく緩衝液中に失
なわれた分）の量はロードの＞25％に達する
が、CMMMの場合には≦15％程度であつ
た。 ３ フイルター上の移動蛋白の保持 ひと度びCMMMに吸着されると、蛋白は
極めて良好に保持されることは次の実験によ
つて証明された。SDS−ポリアクリルアミド
上にランされた125I−ラベル化BSAは
CMMM又はニトロセルロースのいずれかに
電気泳動的に移動される。移動後、このIMs
を次の条件の一つを用いてインキユベーシヨ
ンした：(i)PBSの0.5％グルタルアルデヒド
中で15分間、(ii)25％イソプロパノール−10％
酢酸中で１時間、及び(iii)PBS単味中で１時
間。次いでIMsをPBS中で数回リンスし、次
いでPBS中の0.1％「Triton Ｘ−100」（商標
名）中で一昼夜放置して洗浄した。各IM上
のラベル量を、移動後と洗浄後の両方で測定
した。ニトロセルロースの場合では、125I−
ラベル化BSAの80％が非定着IMsから流失
した；グルタルアルデヒド又は酸性−アルコ
ール処理した後のIMs上には少なくとも1.5
〜２倍以上のカウントが保持された。
CMMMを用いた場合、元のカウントの＞65
％が定着剤なしでも保持され、定着剤を増加
するとこの値は＞90％に達した。そのうえ、
CMMMへの蛋白の保持は洗浄後のPH（2.0〜
8.3）が変動しても実際的に影響されないこ
とが判つた。 ４ トランスフアーのオーバーレイ 移動パターンをどのようなオーバーレイ技
術に使用する場合でもその前に、フイルター
上の残留している潜在的な結合サイトは、不
特定バツクグラウンドを最小にするためにク
エンチングしなければならない。CMMMは
45〜50℃において、PBS中の10％BSA中に
一昼夜、インキユベーシヨンすれば効果的に
クエンチされる。より低温（例えば37℃）、
BSAのより低濃度、又は50℃での上記溶液
によるフイルターのより短時間でのインキユ
ベーシヨンでは、これらのプロープが用いら
れるときにオーバーレイ中に高いバツクグラ
ウンドが生ずるので好ましくない。ヘモグロ
ビン（45〜50℃、PBS中１％）もまた
CMMMトランスフアーをクエンチングする
のに有効であることが判つた。 蛋白パターンのオーバーレイは抗体もしくはレ
クチンを有するCMMM又はニトロセルロースに
移動する。特に、ウシ脳皮質ホモジエネートの分
別（各25ug）を10％SDS−ポリアクリルアミド
ゲル上に移し、次いで200ｍＡでトリス−グリセ
リン緩衝液中、２時間に亘つてCMMM又はニト
ロセルロースにいずれかに電気泳動的に移動し
た。BSAでクエンチングした後、このIMsをanti
−protein（synapsin）を含む希釈（１：300）
ラビツト血清にて１時間、オーバーレイした。次
いで洗浄し、125I−ラベル化プロテインＡ（106cpm
全）で１時間インキユベーシヨンしてから再洗後
オートラジオグラフイーに処した。同様の操作を
ネズミ赤血球ゴーストの分別（各25ug）を用い
て実施したが、ヘモグロビンにてクエンチングし
たフイルター及び125I−ラベル化concanavalinA
（全５×105cpm）をプローブとして用いた。
CMMMを用いると、ニトロセルロースよりも遥
かに大きい結合能力によつてこれらの技術の感度
が一層向上する。 レクチン結合の特性を適切なハプテン類を用い
て試験した。例えば125I−ラベル化
concanavalinAのオートラジオグラフの場合で
は、各々のIMsに結合した正味の放射活性は全カ
ウントからレーンの低部上にて測定されたバツク
グラウンドを差引いて決める。この正味の
CMMM上のシグナルはニトロセルロース上のも
のより1.6倍も高かつた。100ｍＭ α−メチルグ
ルコシドを含むPBS中で最初に洗浄すると
CMMMからのシグナルの82％が、ニトロセルロ
ースからのシグナルの76％が除かれた。100ｍＡ
α−メチルマンノシドを含むPBS中での２回
目の洗浄ではCMMMで90％、ニトロセルロース
で84％と除去率が増加した。 また、アセチルコリン受容体を蛋白ブロツテイ
ングにより分析した。「Torpedo」社製の
Electric organ膜を４℃において、リチウムドデ
シルサルフエート含有のポリアクリルアミドゲル
上にランした。このエレクトロホレトグラムを
CMMMにエレクトロブロツテイングし、次いで
これをヘモグロビンによつてクエンチングしてか
ら、125I−ラベル化α−bungarotoxinでオーバー
レイした。受容体のα−サブユニツトだけがこの
トキシンと結合した。この結合は他のアセチルコ
リンアンタゴニストである非放射性α−
bungarotoxin及びtubocurarineに匹敵しうるも
のである。 発明の精神と範囲から逸脱することなしに、本
発明の方法と製品は各種の変更と修飾をなしうる
ものである。ここに開示の実施態様は本発明を詳
述する目的のものであつて、これにのみ限定され
るものではない。 ［発明の効果］ 本発明は、大きな吸着能力と良好な保持性を有
する新規固定ナイロンマトリツクスを用いること
により、ニトロセルロースなどのセルロース系な
どの従来の公知マトリツクスの有する種々の欠点
を解消して、高分子体を一層効率良く該新規固定
マトリツクスに移動させるトランスフアーが可能
であるような、新規固定ナイロンマトリツクス及
びクロマトグラフ基質とからなる高分子体ブロツ
テイング製品を提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明に用いる膜に対する125I−ラベ
ル化BSAの結合を示す説明図であり、第１ａ図
はIMsに対する125I−ラベル化蛋白の結合に対す
る種々のBSA濃度の影響を示す図であり、第１
ｂ図はIMsに対する125I−ラベル化蛋白に対する
種々の濃度のウシヘモグロビンの影響を示す図で
あり、第２図は第１図のマトリツクスへの各種の
変量の125I−ラベル化BSAの移動を定量化して示
した図であり、第３図は第１図のマトリツクスを
積層したものへの125I−ラベル化BSAの回収を示
す図であり、第４図は第１図のマトリツクスの層
上へのBSA回収の比較図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ その表面上に固定マトリツクスとしてカチオ
    ン電荷修飾ミクロポーラスナイロン膜を有するク
    ロマトグラフ基質から成る製品であつて、該ミク
    ロポーラスナイロン膜が膜全体に亘つて細孔を有
    する親水性膜から成り、該細孔表面がカチオン電
    荷修飾剤で修飾されて成る製品。 ２ 電荷修飾剤がポリアミンとエピクロロヒドリ
    ンとの反応生成物であり、該反応生成物が (i) 第３アミン基または第４級アンモニウム基お
    よび (ii) ポリアミン鎖に沿つたエポキシド基を有し、
    該エポキシド基がこの膜に結合し得るものであ
    る特許請求の範囲第１項記載の製品。 ３ 電荷修飾剤がポリアミンとエピクロロヒドリ
    ンとの反応生成物であり、該反応生成物が一つの
    ポリマー鎖を有し該鎖に沿つて (i) 第３アミン基または第４級アンモニウム基お
    よび (ii) エポキシド基を有し、ここで該エポキシド基
    がこの膜に結合し得るものである特許請求の範
    囲第１項記載の製品。 ４ 電荷修飾剤がポリアミド−ポリアミンエピク
    ロロヒドリン樹脂である特許請求の範囲第１項記
    載の製品。 ５ 電荷修飾剤がポリアミン−エピクロロヒドリ
    ン樹脂である特許請求の範囲第１項記載の製品。 ６ 電荷修飾剤が、エピクロロヒドリンと反応し
    たジアリル窒素含有物質である特許請求の範囲第
    １項記載の製品。 ７ 該ミクロポーラスナイロン膜の微細構造の実
    質的全てに結合している電荷修飾剤上のエポキシ
    ド基の一部が、次の (i) 少なくとも一つの１級アミンまたは少なくと
    も二つの２級アミンを有するポリアミンである
    脂肪族アミン類；および (ii) 少なくとも一つの２級アミンおよびカルボキ
    シルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂肪
    族アミン類 から成る群から選択された第２次電荷修飾剤に結
    合して成る特許請求の範囲第３項記載の製品。 ８ 第２次電荷修飾剤が一般式 〔式中、R1およびR2は炭素数１〜４のアルキル
    基、ｘは０〜４の整数を示す〕 にて表わされる脂肪族アミンである特許請求の範
    囲第７項記載の製品。 ９ 脂肪族アミンが一般式 にて表わされるテトラエチレンペンタミンである
    特許請求の範囲第８項記載の製品。 １０ 該ミクロポーラスナイロン膜が実質的に等
    方性で、スキがないものから成る特許請求の範囲
    第１項記載の製品。 １１ 細孔表面が、該電荷修飾剤により修飾さ
    れ、そして次の (i) 少なくとも一つの１級アミンまたは少なくと
    も二つの２級アミンを有するポリアミンである
    脂肪族アミン類；および (ii) 少なくとも一つの２級アミンおよびカルボキ
    シルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂肪
    族アミン類 から成る群から選択された第２次電荷修飾剤によ
    り修飾されて成る特許請求の範囲第２項記載の製
    品。 １２ 該電荷修飾剤中のエポキシド基の一部が第
    ２次電荷修飾剤に結合して成る特許請求の範囲第
    １１項記載の製品。 １３ 該基質がゲル電気泳動技術で用いられる電
    気泳動ゲルである特許請求の範囲第１項記載の製
    品。 １４ 該ゲルがポリアクリルアミドである特許請
    求の範囲第１３項記載の製品。 １５ 該電荷修飾剤が、次の (i) 少なくとも一つの１級アミンまたは少なくと
    も二つの２級アミンを有する脂肪族アミン類；
    および (ii) 少なくとも一つの２級アミンおよびカルボキ
    シルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂肪
    族アミン類から成る群から選択され、かつ該電
    荷修飾剤が、500以下の分子量を有する脂肪族
    ポリエポキシド架橋剤を通してミクロポーラス
    膜構造に結合して成る特許請求の範囲第１項記
    載の製品。 １６ ポリエポキシドが１，４−ブタンジオール
    ジグリシダールエーテルから成る特許請求の範囲
    第１５項記載の製品。 １７ 電荷修飾剤がテトラエチレンペンタミンか
    ら成る特許請求の範囲第１６項記載の製品。 １８ 該基質がゲル電気泳動技術で用いられる電
    気泳動ゲルから成る特許請求の範囲第１５項記載
    の製品。 １９ 膜のポアサイズが0.05〜1.2μである特許請
    求の範囲第１項記載の製品。 ２０ 電荷修飾剤が分子量1000以上の水溶性有機
    ポリマーであり、該ポリマーがその鎖に沿つて、 (i) ３級アミンまたは第４級アンモニウム基、お
    よび (ii) エポキシド基 を有するポリマー鎖を持つポリマーから成る特許
    請求の範囲第１項記載の製品。 ２１ カチオン電荷修飾剤がポリアミンとエピク
    ロロヒドリンとの反応生成物であり、該反応生成
    物が３級アミンまたは第４級アンモニウム基を有
    し、該剤が該膜ミクロ構造の実質的全てに結合さ
    れて成る特許請求の範囲第１項記載の製品。 ２２ 第２次電荷修飾剤が (i) 少なくとも一つの１級アミンまたは少なくと
    も二つの２級アミンを有する脂肪族アミン類；
    および (ii) 少なくとも一つの２級アミンおよびカルボキ
    シルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂肪
    族アミン類 から成る群から選択されて成る特許請求の範囲第
    ２０項記載の製品。 ２３ その表面上に固定マトリツクスとして親水
    性カチオン電荷修飾ミクロポーラスナイロン膜を
    有するクロマトグラフ基質から成る製品であつ
    て、該ミクロポーラスナイロン膜が該膜全体に亘
    つた微細構造を有する実質的に等方性で、スキン
    がなく、ポーラスで、親水性のナイロン製ミクロ
    ポーラス膜から成り、かつ該ミクロポーラスナイ
    ロン膜が該膜の微細構造の実質的全てに結合して
    いるカチオン電荷修飾剤の有効電荷修飾量を実質
    的にポアサイズの低下またはポアの破壊なしに含
    有して成る製品。 ２４ 電荷修飾剤がポリアミンとエピクロロヒド
    リンとの反応生成物であり、該反応生成物が (i) 第３アミン基または第４級アンモニウム基お
    よび (ii) ポリアミン鎖に沿つたエポキシド基を有し、
    該エポキシド基がこの膜に結合し得るものであ
    る特許請求の範囲第２３項記載の製品。 ２５ 電荷修飾剤がポリアミンとエピクロロヒド
    リンとの反応生成物であり、該反応生成物が一つ
    のポリマー鎖を有し該鎖に沿つて (i) 第３アミン基または第４級アンモニウム基お
    よび (ii) エポキシド基を有し、ここで該エポキシド基
    がこの膜に結合し得るものである特許請求の範
    囲第２３項記載の製品。 ２６ 電荷修飾剤がポリアミド−ポリアミンエピ
    クロロヒドリン樹脂である特許請求の範囲第２３
    項記載の製品。 ２７ 電荷修飾剤がポリアミン−エピクロロヒド
    リン樹脂である特許請求の範囲第２３項記載の製
    品。 ２８ 電荷修飾剤が、エピクロロヒドリンと反応
    したジアリル窒素含有物質である特許請求の範囲
    第２３項記載の製品。 ２９ 該ミクロポーラスナイロン膜の微細構造の
    実質的全てに結合している電荷修飾剤上のエポキ
    シド基の一部が、次の (i) 少なくとも一つの１級アミンまたは少なくと
    も二つの２級アミンを有するポリアミンである
    脂肪族アミン類；および (ii) 少なくとも一つの２級アミンおよびカルボキ
    シルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂肪
    族アミン類 から成る群から選択された第２次電荷修飾剤に結
    合して成る特許請求の範囲第２５項記載の製品。 ３０ 第２次電荷修飾剤が一般式 〔式中、R1およびR2は炭素数１〜４のアルキル
    基、ｘは０〜４の整数を示す〕 にて表わされる脂肪族アミンである特許請求の範
    囲第２９項記載の製品。 ３１ 脂肪族アミンが一般式 にて表わされるテトラエチレンペンタミンである
    特許請求の範囲第３０項記載の製品。 ３２ 細孔表面が、該電荷修飾剤により修飾さ
    れ、そして次の (i) 少なくとも一つの１級アミンまたは少なくと
    も二つの２級アミンを有するポリアミンである
    脂肪族アミン類；および (ii) 少なくとも一つの２級アミンおよびカルボキ
    シルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂肪
    族アミン類 から成る群から選択された第２次電荷修飾剤によ
    り修飾されて成る特許請求の範囲第２４項記載の
    製品。 ３３ 該電荷修飾剤中のエポキシド基の一部が第
    ２次電荷修飾剤に結合して成る特許請求の範囲第
    ３２項記載の製品。 ３４ 該基質がゲル電気泳動技術で用いられる電
    気泳動ゲルである特許請求の範囲第２３項記載の
    製品。 ３５ 該ゲルがポリアクリルアミドである特許請
    求の範囲第３４項記載の製品。 ３６ 該電荷修飾剤が、次の (i) 少なくとも一つの１級アミンまたは少なくと
    も二つの２級アミン基を有する脂肪族アミン
    類；および (ii) 少なくとも一つの２級アミンおよびカルボキ
    シルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂肪
    族アミン類 から成る群から選択され、かつ該電荷修飾剤が、
    500以下の分子量を有する脂肪族ポリエポキシド
    架橋剤を通してミクロポーラス膜構造に結合して
    成る特許請求の範囲第２３項記載の製品。 ３７ ポリエポキシドが１，４−ブタンジオール
    ジグリシダールエーテルから成る特許請求の範囲
    第３６項記載の製品。 ３８ 電荷修飾剤がテトラエチレンペンタミンか
    ら成る特許請求の範囲第３７項記載の製品。 ３９ 該基質がゲル電気泳動技術で用いられる電
    気泳動ゲルから成る特許請求の範囲第３６項記載
    の製品。 ４０ 膜のポアサイズが0.05〜1.2μである特許請
    求の範囲第２３項記載の製品。 ４１ 電荷修飾剤が分子量1000以上の水溶性有機
    ポリマーであり、該ポリマーがその鎖に沿つて、 (i) ３級アミンまたは第４級アンモニウム基、お
    よび (ii) エポキシド基 を有するポリマー鎖を持つポリマーから成る特許
    請求の範囲第２３項記載の製品。 ４２ カチオン電荷修飾剤がポリアミンとエピク
    ロロヒドリンとの反応生成物であり、該反応生成
    物が３級アミンまたは第４級アンモニウム基を有
    し、該剤が該膜ミクロ構造の実質的全てに結合さ
    れて成る特許請求の範囲第２３項記載の製品。 ４３ 第２次電荷修飾剤が (i) 少なくとも一つの１級アミンまたは少なくと
    も二つの２級アミン基を有する脂肪族アミン
    類；および (ii) 少なくとも一つの２級アミンおよびカルボキ
    シルもしくはヒドロキシル置換基を有する脂肪
    族アミン類 から成る群から選択されて成る特許請求の範囲第
    ４１項記載の製品。
JP59500904A 1983-02-07 1984-01-27 クロマトグラフ基質から固定マトリックスへの高分子体の移動 Granted JPS60501126A (ja)

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